一种NK细胞冻存方法与流程

本发明属于细胞培养。更具体地，涉及一种nk细胞冻存方法。

背景技术：

1、细胞免疫治疗是针对自身免疫细胞能力低下的恶性肿瘤患者进行的一种新型补充疗法，包括基于t细胞的嵌合抗原受体t细胞(car-t)疗法、肿瘤浸润淋巴细胞(tils)疗法，基于nk细胞的嵌合抗原受体nk细胞(car-nk)疗法和自体细胞免疫疗法(cik)，还有基于其他免疫细胞如单核吞噬细胞，包括树突状细胞和巨噬细胞的输注治疗。其中，自然杀伤细胞(nature killer cell，nk细胞)作为机体天然免疫的重要细胞，在机体抗肿瘤、抗病毒感染、免疫调节中发挥着重要作用。它可以像t细胞一样通过工程化改造后靶向治疗肿瘤，还能够进行同种异体来源的nk细胞输注治疗，弥补了t细胞自体来源受限和异体免疫排斥的缺点。研究证实，输注异体nk细胞的患者不会发生严重的移植物抗宿主病(graftversushost disease，gvhd)[1]。

2、在临床应用中常常需要对nk细胞进行冷冻保存，由于nk细胞数量的稀少性，如何在冻存过程中提高nk细胞的存活率，并维持其对肿瘤的杀伤活性，是将其应用于肿瘤免疫治疗的关键。

3、[1]曹腾宇等,nk细胞免疫治疗恶性肿瘤的研究进展[j].临床输血与检验,2024,2(26):267-273.

技术实现思路

1、发明人发现间充质干细胞碎片能够调控nk细胞的生长和免疫功能，试验表明，经过特殊手段处理的间充质干细胞碎片能够促进nk细胞的扩增并影响其对肿瘤细胞的杀伤能力，该实验成果申请人已经同日进行了专利申请并记载在相关申请中。在这过程中，发明人意外发现，经电刺激间充质干细胞碎片培养的nk细胞在常规手段冷冻保存后表现出令人惊讶的冻存效果，故由此得到本发明。

2、一方面，本发明提供一种nk细胞冻存方法，包括在冻存前先采用添加了间充质干细胞碎片的基础培养基培养nk细胞的步骤。

3、在本发明其中一个实施方式中，在所述培养基中，所述间充质干细胞碎片的浓度为10～200μg/ml；优选地，所述间充质干细胞碎片的浓度可以是10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、22μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml、60μg/ml、65μg/ml、70μg/ml、75μg/ml、80μg/m l、85μg/ml、90μg/ml、95μg/ml、100μg/ml、110μg/ml、120μg/ml、125μg/ml、130μg/ml、140μg/ml、150μg/ml、160μg/ml、170μg/ml、180μg/ml、190μg/ml或200μg/ml。

4、本发明其中一个较为优选的实施方式中，所述间充质干细胞碎片的浓度为10μg/ml、100μg/ml或200μg/ml。

5、在本发明其中一个实施方式中，所述基础培养基还添加了1.0～2.5mg/l的叶酸和1～50μg/ml的il-2。

6、在本发明其中一个实施方式中，所述基础培养基为scgm培养基。

7、在本发明其中一个实施方式中，所述间充质干细胞碎片由以下步骤制备而成：

8、取间充质干细胞，置于50～200mv/mm的电流下刺激1～3h，收集细胞，将细胞置于超声频率为20～50khz的条件下粉碎3～10min，离心，收集沉淀，即得细胞碎片。

9、在本发明其中一个实施方式中，所述电流强度为150mv/mm，刺激时间为1.5h。

10、在本发明其中一个实施方式中，所述超声频率为35khz，粉碎时间为10min。

11、在本发明其中一个实施方式中，所述方法还包括：将培养的nk细胞与冻存液混合后置于液氮中冻存的步骤。

12、在本发明其中一个实施方式中，所述冻存液包含以下成分：dmso5％～12％、右旋糖酐0.5～2％、人血白蛋白1～3％和余量的生理盐水。

13、在本发明其中一个实施方式中，所述冻存液包含以下成分：dmso5％、右旋糖酐0.5％、人血白蛋白1％和余量的生理盐水。

14、本发明具有以下有益效果：

15、本发明首次发现在nk细胞培养阶段加入电刺激的间充质干细胞培养后进行冻存能够有效提高冻存效果，经试验证明，冻存6个月后nk细胞的存活率仍然保持在80％以上，cd3-cd56+表型细胞比例无明显下降，且仍然保持着较高的肿瘤杀伤活性。

技术特征：

1.一种nk细胞冻存方法，其特征在于，包括在冻存前先采用添加了间充质干细胞碎片的基础培养基培养nk细胞的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述基础培养基中，所述间充质干细胞碎片的浓度为10～200μg/ml。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基础培养基还添加了1.0～2.5mg/l的叶酸和1～50μg/ml的il-2。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基础培养基为scgm培养基。

5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞碎片由以下步骤制备而成：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述电流强度为150mv/mm，刺激时间为1.5h。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述超声频率为35khz，粉碎时间为10min。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将培养的nk细胞与冻存液混合后置于液氮中冻存的步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述冻存液包含以下成分：dmso 5％～12％、右旋糖酐0.5～2％、人血白蛋白1～3％和余量的生理盐水。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述冻存液包含以下成分：dmso5％、右旋糖酐0.5％、人血白蛋白1％和余量的生理盐水。

技术总结
本发明属于细胞培养技术领域。更具体地，涉及一种NK细胞冻存方法，所述NK细胞冻存方法包括在冻存前先采用添加了间充质干细胞碎片的培养基培养NK细胞的步骤。本发明首次发现在NK细胞培养阶段加入电刺激的间充质干细胞碎片培养后再进行冻存能够有效提高冻存效果。经试验证明，冻存6个月后NK细胞的存活率仍然保持在80％以上，CD3‑CD56+表型细胞比例无明显下降，且仍然保持着较高的肿瘤杀伤活性。

技术研发人员：请求不公布姓名
受保护的技术使用者：广东德力泰生物医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/17