两种生防菌协同使用提高烟草青枯病防效的方法

本发明属于烟草病害防治，具体涉及一种利用两种生防菌协同作用提高烟草青枯病防效的方法。

背景技术：

1、烟草是重要的经济作物，在其生长过程中易受到多种病害的侵染，严重影响了烟草生产的产量和质量，造成了巨大经济损失。烟草青枯病是发生最为严重的土传细菌性病害，由茄科劳尔氏菌（ ralstoniasolanacearum）引起。目前青枯病的防治仍是烟草生产中一大难题，主要采用农业防治和化学防治，但防效差、污染重，易产生抗药性。生物防治由于其绿色环保、可持续性好而受到了人们的重视。

2、印度梨形孢（ piriformosporaindica）是一种植物根部内生真菌，具有促生、抗逆和抗病的重要作用，能够通过调节防御酶活性和防御相关基因的表达、影响激素代谢途径而减轻多种植物病害的发生。枯草芽孢杆菌（ bacillussubtilis）是一种广泛应用的生防细菌，通过与植物病原菌的拮抗作用、竞争作用等达到抑菌效果，从而防治多种植物病害。张成省等（张成省, 孔凡玉, 刘朝科, 等. 枯草芽孢杆菌tpb55挥发物对烟草的防病促生效应. 中国生物防治, 2009, 25 (03) : 245-249.）研究发现枯草芽孢杆菌tpb55对烟草赤星病、烟草黑胫病等有防治作用。但是，中国专利cn 116622537 a研究表明枯草芽孢杆菌tpb55的发酵液及浓缩液对青枯劳尔氏菌几乎没有抑制作用。

3、目前，关于印度梨形孢和枯草芽孢杆菌tpb55协同使用对烟草青枯病的防控研究尚未见报道。

技术实现思路

1、发明人在研究过程中发现，印度梨形孢和枯草芽孢杆菌tpb55在特定条件下共同作用于烟草时，能够产生协同作用从而显著提高烟草对青枯病的抗性，同时还可以提高烟草的农艺性状。

2、本发明的技术方案具体如下：

3、两种生防菌协同使用提高烟草青枯病防效的方法，其中生防菌为印度梨形孢和枯草芽孢杆菌tpb55。

4、在上述方法中，两种生防菌协同使用的具体操作为：先将印度梨形孢定殖于烟草根部，再接种枯草芽孢杆菌tpb55。需要说明的是，发明人在试验过程中发现，二者的接种顺序极为重要，当先接种枯草芽孢杆菌tpb55再接种印度梨形孢时，用青枯病菌处理后，烟草迅速表现出明显的萎蔫症状，防控效果极差。

5、优选地，在上述方法中，将印度梨形孢定殖的方法为：取4~5片真叶期的烟苗，用印度梨形孢孢子悬浮液对烟苗进行灌根处理后共培养2~3周；接种枯草芽孢杆菌tpb55的方法为：用枯草芽孢杆菌tpb55菌悬液对烟草进行灌根处理。其中，当枯草芽孢杆菌tpb55菌悬液的浓度为1×107~1×109cfu/ml，且印度梨形孢孢子悬浮液的浓度为1×106个/ml时，印度梨形孢孢子悬浮液与枯草芽孢杆菌tpb55菌悬液的施用体积比为1:2~3时效果较佳。

6、另外，试验数据还表明，灌根时所用枯草芽孢杆菌tpb55菌悬液的浓度是影响两种生防菌协同作用，进而影响防控效果的关键因素，当菌悬液浓度过高或过低时，防控效果均显著下降。故在上述方法中，枯草芽孢杆菌tpb55菌悬液的最佳浓度为1×108cfu/ml。

7、优选地，在上述方法中，枯草芽孢杆菌tpb55菌悬液可以通过以下方法制备：将枯草芽孢杆菌tpb55接种至na固体培养基上28~30℃培养，取种龄为24h的枯草芽孢杆菌tpb55的种子液接入nb液体培养基中，180r/min，28~30℃培养12~16h。

8、本发明对印度梨形孢和枯草芽孢杆菌tpb55协同提高烟草青枯病防效的机理进行了探究，表明二者至少通过以下途径提高烟草青枯病防效：

9、a). 诱导增强超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, sod）、过氧化物酶（peroxidase, pod）活性；

10、b). 降低丙二醛（malonic dialdehyde, mda）含量；

11、c). 诱导病程相关蛋白基因 pr-1b、pr2表达。

12、另外，本发明的实验结果表明，印度梨形孢和枯草芽孢杆菌tpb55在本发明方法条件下，不仅能够显著提高烟草对青枯病的抗性，还能显著提高烟草的农艺性状（包括最大叶宽、最大叶长、叶面积、株高、茎围、鲜重和干重等）。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

14、本发明首次发现印度梨形孢和枯草芽孢杆菌tpb55菌悬液在特定条件下处理烟草后具有协同作用，能够显著提高烟草对青枯病的抗性，同时还能显著提高烟草的农艺性状，这对烟草的病害防治和产量提高均具有重要意义。

15、本发明提供的生物防治方法通过诱导增强sod、pod活性、降低mda含量以及诱导病程相关蛋白基因表达等途径提高烟草青枯病防效，相对于化学防治，其更绿色环保，且可持续性好。

技术特征：

1.两种生防菌协同使用提高烟草青枯病防效的方法，其特征在于，所述生防菌为印度梨形孢和枯草芽孢杆菌tpb55。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，先将印度梨形孢定殖于烟草根部，再接种枯草芽孢杆菌tpb55。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述印度梨形孢定殖的方法为：取4~5片真叶期的烟苗，用印度梨形孢孢子悬浮液对烟苗进行灌根处理后共培养2~3周。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，接种所述枯草芽孢杆菌tpb55的方法为：用枯草芽孢杆菌tpb55菌悬液对烟草进行灌根处理。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌tpb55菌悬液的浓度为1×107~1×109cfu/ml，所述印度梨形孢孢子悬浮液的浓度为1×106个/ml，且所述印度梨形孢孢子悬浮液与枯草芽孢杆菌tpb55菌悬液的施用量为1:2~3。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌tpb55菌悬液的浓度为1×108cfu/ml。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌tpb55菌悬液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌tpb55接种至na固体培养基上28~30℃培养，取种龄为24h的枯草芽孢杆菌tpb55的种子液接入nb液体培养基中，180r/min，28~30℃培养12~16h。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述印度梨形孢与枯草芽孢杆菌tpb55协同作用，至少通过以下途径提高烟草青枯病防效：

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烟草包括云烟87。

10.一种用于烟草青枯病防治的生物制剂，其特征在于，以生防菌为印度梨形孢和枯草芽孢杆菌tpb55为活性成分。

技术总结
本发明公开了两种生防菌协同使用提高烟草青枯病防效的方法，其中两种生防菌为印度梨形孢和枯草芽孢杆菌Tpb55，具体为：先将印度梨形孢定殖于烟草根部，再接种特定浓度的枯草芽孢杆菌Tpb55。本发明首次发现用印度梨形孢和枯草芽孢杆菌Tpb55在特定条件下处理烟草后具有协同作用，能够显著提高烟草对青枯病的抗性，同时还能显著提高烟草的农艺性状，对提高烟草青枯病防效和促进烟草生长均具有重要意义。

技术研发人员：孙文秀,李伟,师晶,刘萌,张成省
受保护的技术使用者：长江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/17