一种防治豆科植物根腐病的生防制剂

本发明涉及农业生物，具体为一种防治豆科植物根腐病的生防制剂。

背景技术：

1、大豆属于重要的经济作物，含有丰富植物蛋白质，用来做各种豆制品、榨取豆油、酿造酱油和提取蛋白质。豆渣或磨成粗粉的大豆也常用于禽畜饲料。大豆生产中受到多种病害侵害。大豆疫病又叫大豆疫霉根腐病，由大豆疫霉侵染导致的卵菌病害，是一种传播速度快，危害面积大，不易防治的多循环土传病害。是大豆生产上的危险性病害，被公认为是继大豆胞囊线虫病害之后的第二大严重大豆病害。

2、由大豆疫霉根腐病引起的苗期死株率轻则10％，重则80-90％，大田发生该病甚至造成局部地块绝产。目前利用甲霜灵进行化学防治作为其主要手段，但是防治效果不理想，同时大豆疫霉对甲霜灵的抗药性问题也日益严重。利用土壤微生物防治病害是综合防治土传病害的重要措施之一，生物防治技术具有环境友好、安全、不易产生抗药性和高效等多种优点，是实现农业可持续的有效方法之一，利用生物制剂来防治根腐病是目前的研究热点。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种防治豆科植物根腐病的生防制剂，具备使用生防制剂防治豆科植物根腐病不产生农药残留，生防制剂配比简单经济适用等优点，解决了上述技术的问题。

3、(二)技术方案

4、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种防治豆科植物根腐病的生防制剂，所述生防制剂由棘孢木霉菌和哈茨木霉菌组成，所述棘孢木霉菌和哈茨木霉菌取自出现根腐病症状的豆科植物。

5、优选的，生防制剂还包括制备方法，所述制备方法为：

6、步骤一、收集作物主产区中大豆病株根部组织和根际土壤，冷藏保存带回实验室；

7、步骤二、分离病株组织中的真菌：去离子水冲洗病株组织3-5遍，洗去表面灰尘，使用次氯酸钠溶液或酒精浸泡组织1min，再用去离子水清洗组织3遍，洗去残留的消毒液，用滤纸吸干组织表面水分，在无菌条件下，将组织切成2mm×2mm大小的样块，直接接种至pda培养基上，28℃培养2-3d；

8、步骤三、纯化菌落：使用平板划线法纯化结合不同的培养基筛选分离菌落，待分离的微生物菌落长出后，挑取单菌落边缘的菌块，直接转移至新的pda培养基上；或直接挑取形态不同的菌落边缘部分的培养基块，接种至wa培养基上，在培养箱中恒温培养5-7d，再次挑取菌落边缘的培养基块，转移至pda培养基上培养，重复转接多次，得到纯化菌落；

9、步骤四、形态学鉴定：菌株纯化后，使用5mm的打孔器打成菌饼，并接种在pda培养基中央，28℃恒温培养，观察菌落生长速度和形态特征；挑取少量培养基块转接于无菌的去离子水中，制备悬液，将悬液滴于载玻片上，在电子显微镜下镜检，观察菌丝体形态、大小和颜色以及产孢结构，参照《真菌鉴定手册》进行形态学鉴定；

10、步骤五、分子生物学鉴定：使用通用引物内源转录间隔区its1(tccgtaggtgaacctgcgg)和its4(tcctccgcttattgatatgc)对真菌的its进行扩增，使用高通量测序技术对真菌的its测序，将得到的its片段与genebank数据库进行同源性比对，并下载genbank中高相似度菌株基因序列，使用临接法(neighborjoining)绘制系统进化树，对分离所得的真菌进行分子生物学鉴定；

11、步骤六、使用平板对峙法对病原菌与生防菌两两之间分别进行拮抗实验：分别将纯化的病原菌和生防菌转移至pda培养基上，28℃恒温培养，5d后，使用打孔器切取直径为5mm的菌块，分别将病原菌块和生防菌块接种至pda培养基的两侧，28℃继续培养7d，使用十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算体外抑制率，评价生防菌的体外抑制效果。

12、优选的，所述步骤二分离病株组织真菌还使用稀释平板法，所述稀释平板法为：将根际土壤过30-50目筛，称取0.2g土壤溶于50ml灭菌的去离子水中，将悬浊液置于摇床，120rpm震荡20min，静置10min后，吸取0.2ml上清液均匀涂布于pda培养基上，28℃培养2-3d。

13、优选的，所述步骤二分离病株组织真菌还使用土粒平板法，所述土粒平板法为：将根际土壤过50-80目筛，称取0.005g土壤均匀撒在pda培养基上，28℃培养2-3d。

14、优选的，所述步骤六中拮抗实验表达式为：

15、

16、优选的，所述步骤六还包括盆栽评价生防制剂防效方法：幼苗生长至三叶期后，使用下胚轴创伤接种法接种病原菌和生防菌，设置空白对照，只接种病原菌、同时接种生防菌和病原菌的pdb培养液，培养3周，评价病害严重指数。

17、优选的，所述步骤二中次氯酸钠溶液纯度为10％，所述酒精纯度为75％。

18、优选的，所述步骤三中培养箱恒温温度为28℃。

19、优选的，所述步骤三中重复转接次数为2次-3次。

20、优选的，所述稀释平板法稀释250倍。

21、与现有技术相比，本发明提供了一种防治豆科植物根腐病的生防制剂，具备以下有益效果：

22、1、本发明通过制备生防制剂的过程中使用的都是物理和生物学方法，如收集病株组织和土壤、分离纯化菌落、形态学和分子生物学鉴定等，没有使用任何化学农药或其他化学物质，保证了最终产品的无农药残留，棘孢木霉菌和哈茨木霉菌通过多种机制来抑制病原真菌，包括产生抗生素、竞争营养、分泌抑制物质，能够有效地减少病原真菌对豆科植物的侵害，同时不会产生农药残留问题，达到了使用生防制剂防治豆科植物根腐病不产生农药残留的有益效果。

23、2、本发明通过生防制剂的原料来源于豆科植物病株中分离得到的真菌，这些真菌在豆科植物根腐病的病株中广泛存在，不需要额外购买成本高昂的原材料，从而降低了生产成本，，在拮抗实验中验证了生防制剂对病原菌的抑制效果，保证了每种真菌在生防制剂中的比例是有效，达到了生防制剂配比简单经济适用的有益效果。

24、3、本发明通过防制剂由两种豆科植物根腐病病株中分离得到的真菌组成，这些真菌通过竞争营养、产生抗生素或其他抑制物质等方式，有效抑制病原真菌的生长和扩散，根据步骤六描述的平板对峙法拮抗实验，生防制剂能够显著抑制病原菌的生长，模拟实际种植条件下的应用效果。通过评估病害严重指数，可以直观地看到生防制剂在减少豆科植物根腐病发生方面的显著效果，同时制备过程中采用的形态学和分子生物学鉴定，以及稀释平板法和土粒平板法分离方法，保证了生防制剂中菌种的纯度和效力达到了该生防制剂对豆科植物根腐病效果显著的有益效果。

技术特征：

1.一种防治豆科植物根腐病的生防制剂，其特征在于：所述生防制剂由棘孢木霉菌和哈茨木霉菌组成，所述棘孢木霉菌和哈茨木霉菌取自出现根腐病症状的豆科植物。

2.根据权利要求1所述的一种防治豆科植物根腐病的生防制剂，其特征在于：生防制剂还包括制备方法，所述制备方法为：

3.根据权利要求2所述的一种防治豆科植物根腐病的生防制剂，其特征在于：所述步骤二分离病株组织真菌还使用稀释平板法，所述稀释平板法为：将根际土壤过30-50目筛，称取0.2g土壤溶于50ml灭菌的去离子水中，将悬浊液置于摇床，120rpm震荡20min，静置10min后，吸取0.2ml上清液均匀涂布于pda培养基上，28℃培养2-3d。

4.根据权利要求3所述的一种防治豆科植物根腐病的生防制剂，其特征在于：所述步骤二分离病株组织真菌还使用土粒平板法，所述土粒平板法为：将根际土壤过50-80目筛，称取0.005g土壤均匀撒在pda培养基上，28℃培养2-3d。

5.根据权利要求2所述的一种防治豆科植物根腐病的生防制剂，其特征在于：所述步骤六中拮抗实验表达式为：

6.根据权利要求5所述的一种防治豆科植物根腐病的生防制剂，其特征在于：所述步骤六还包括盆栽评价生防制剂防效方法：幼苗生长至三叶期后，使用下胚轴创伤接种法接种病原菌和生防菌，设置空白对照，只接种病原菌、同时接种生防菌和病原菌的pdb培养液，培养3周，评价病害严重指数。

7.根据权利要求2所述的一种防治豆科植物根腐病的生防制剂，其特征在于：所述步骤二中次氯酸钠溶液纯度为10％，所述酒精纯度为75％。

8.根据权利要求2所述的一种防治豆科植物根腐病的生防制剂，其特征在于：所述步骤三中培养箱恒温温度为28℃。

9.根据权利要求1所述的一种防治豆科植物根腐病的生防制剂，其特征在于：所述步骤三中重复转接次数为2次-3次。

10.根据权利要求3所述的一种防治豆科植物根腐病的生防制剂，其特征在于：所述稀释平板法稀释250倍。

技术总结
本发明涉及农业生物技术领域，且公开了一种防治豆科植物根腐病的生防制剂，所述生防制剂由棘孢木霉菌和哈茨木霉菌组成，所述棘孢木霉菌和哈茨木霉菌取自出现根腐病症状的豆科植物。本发明通过制备生防制剂的过程中使用的都是物理和生物学方法，如收集病株组织和土壤、分离纯化菌落、形态学和分子生物学鉴定等，没有使用任何化学农药或其他化学物质，保证了最终产品的无农药残留，棘孢木霉菌和哈茨木霉菌通过多种机制来抑制病原真菌，包括产生抗生素、竞争营养、分泌抑制物质，能够有效地减少病原真菌对豆科植物的侵害，同时不会产生农药残留问题，达到了使用生防制剂防治豆科植物根腐病不产生农药残留的有益效果。

技术研发人员：田汝美,李娜娜,丛韫喆,李蕾蕾
受保护的技术使用者：山东省农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/10/31