一种山桐子疏松愈伤组织诱导的方法与流程

本发明涉及植物组织培养与快速繁殖领域，具体来说，特别是一种山桐子疏松愈伤组织诱导的方法。

背景技术：

1、山桐子(idesia polycarpa maxim.)为大风子科(flacourtiaceae)山桐子属(idesia)落叶乔木，又称山梧桐、半霜红、油葡萄等，其富含丰富的营养成分、亚油酸、亚麻酸、不饱和脂肪酸、酚类、黄酮类、稀有元素等有益成分，具有改善人体血脂代谢，软化血管，抗血栓等功效。山桐子是一种纯天然的木本食用油。

2、山桐子资源评价体系匮乏、良种选育及繁育技术不成熟、苗期雌雄难辨、实生苗性状不稳定、重要性状基因待挖掘等问题突出，致使山桐子产业发展滞后，严重影响山桐子产业高质量发展。

3、自然状态下山桐子的繁殖主要依靠雀鸟传播，这种方法种子发芽长出幼苗的偶然性极大，因山桐子种子的种皮坚硬，表面有层蜡质，休眠期不易被打破。如何提高良种繁育技术，实现山桐子重要性状基因挖掘的同源转化及功能验证，利用分子育种技术实现山桐子优质、高效育种迫在眉睫。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，提供一种山桐子疏松愈伤组织诱导的方法。本发明具有能够有效地提高山桐子的繁殖系数，缩短其生长周期，同时为山桐子重要性状基因的遗传转化奠定基础的特点。

2、本发明的技术方案：

3、一种山桐子疏松愈伤组织诱导的方法，以山桐子种子无菌萌发后获得的初生根状茎为外植体材料，然后通过组织培养诱导获得紧实的愈伤组织，经进一步诱导形成疏松愈伤组织，具体包括以下步骤：

4、(1)初生根状茎外植体的获得：取山桐子种子经消毒处理后，添加ga3于水浴锅中水浴加热处理，再在无菌环境下将种子播种于以棉花为支撑物的培养瓶中，置于暗室培养，萌发获得初生根状茎外植体；

5、(2)诱导紧实愈伤组织：将步骤(1)中的初生根状茎外植体接种于诱导紧实愈伤组织培养基，置于光照培养箱内进行光照培养，光照培养箱内的培育条件为22±3℃、光照强度2100-2500lx和光照周期11-13h/d，培养8-30d后初生根状茎增大，颜色由白绿色变为浅黄色，得到紧实愈伤组织；

6、(3)诱导疏松愈伤组织：将步骤(2)中的紧实愈伤组织接种于的改良的ms培养基中培养，ph＝5.2-5.6，置于光照培养箱内进行光照培养，光照培养箱内的培育条件为22±3℃、光照强度2100-2500lx和光照周期11-13h/d，培养8-30d后诱导形成疏松愈伤组织。

7、前述步骤(1)中，消毒处理方法是将山桐子种子先用浓硫酸浸泡6-10min，浓硫酸使用量以淹没种子为宜，浸泡后以水清洗至无残留浓硫酸。

8、具体的说，前述步骤(1)中，消毒处理方法是将山桐子种子先用浓硫酸浸泡8min，浓硫酸使用量以淹没种子为宜，浸泡后以水清洗至无残留浓硫酸后，

9、前述步骤(1)中，ga3的浓度为180-220mg/l，水浴温度为35-45℃，水浴加热1.5-2.5h，ga3使用量以淹没种子为宜。

10、具体的说，前述步骤(1)中，ga3的浓度为200mg/l，水浴温度为40℃，水浴加热2h，ga3使用量以淹没种子为宜。

11、前述步骤(2)中，诱导疏松愈伤组织：将步骤(2)中的紧实愈伤组织接种于的改良的ms培养基中培养，ph＝5.2-5.6，置于光照培养箱内进行光照培养，光照培养箱内的培育条件为22±2℃、光照强度2500lx和光照周期12h/d，培养10d后诱导形成疏松愈伤组织。

12、前述步骤(2)中，诱导紧实愈伤组织培养基由ms+1.0mg/l的6-ba+1.0mg/l的naa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂组成，ph＝5.8。

13、前述步骤(3)中，诱导疏松愈伤组织：将步骤(2)中的紧实愈伤组织接种于的改良的ms培养基中培养，ph＝5.2-5.6，置于光照培养箱内进行光照培养，光照培养箱内的培育条件为22±2℃、光照强度2500lx和光照周期12h/d，培养10d后诱导形成疏松愈伤组织。

14、前述步骤(3)中，改良的ms培养基是由ms+1.0mg/l的6-ba+1.0mg/l的naa+10～25g/l蔗糖+5g/l琼脂组成，ph＝5.4。

15、具体的说，前述步骤(3)中，改良的ms培养基是由ms+1.0mg/l的6-ba+1.0mg/l的naa+15g/l蔗糖+5g/l琼脂组成，ph＝5.4。

16、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

17、由于山桐子属于多年生高大乔木，良种选育与创制困难，种子存在休眠，偶然性极大，营养繁殖种性退化、病虫害严重、生长周期长、繁殖系数低等问题，无法满足市场需求。本发明通过初生根状茎诱导疏松愈伤组织，在疏松愈伤组织诱导阶段，疏松愈伤组织诱导率高达81.48％、增值倍数达到5.8；该方法能为后续的种苗繁育提供大量的试验材料，同时为分子育种以及重要性状基因功能同源验证奠定了良好的基础，旨在实现山桐子良种创制、工厂化育苗与规模化生产提供技术支撑。

技术特征：

1.一种山桐子疏松愈伤组织诱导的方法，其特征在于：以山桐子种子无菌萌发后获得的初生根状茎为外植体材料，然后通过组织培养诱导获得紧实的愈伤组织，经进一步诱导形成疏松愈伤组织，具体包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的山桐子疏松愈伤组织诱导的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，消毒处理方法是将山桐子种子先用浓硫酸浸泡6-10min，浓硫酸使用量以淹没种子为宜，浸泡后以水清洗至无残留浓硫酸。

3.根据权利要求1或2所述的山桐子疏松愈伤组织诱导的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，消毒处理方法是将山桐子种子先用浓硫酸浸泡8min，浓硫酸使用量以淹没种子为宜，浸泡后以水清洗至无残留浓硫酸后。

4.根据权利要求1所述的山桐子疏松愈伤组织诱导的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，ga3的浓度为180-220mg/l，水浴温度为35-45℃，水浴加热1.5-2.5h，ga3使用量以淹没种子为宜。

5.根据权利要求1或4所述的山桐子疏松愈伤组织诱导的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，ga3的浓度为200mg/l，水浴温度为40℃，水浴加热2h，ga3使用量以淹没种子为宜。

6.根据权利要求1所述的山桐子疏松愈伤组织诱导的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，诱导疏松愈伤组织：将步骤(2)中的紧实愈伤组织接种于的改良的ms培养基中培养，ph＝5.2-5.6，置于光照培养箱内进行光照培养，光照培养箱内的培育条件为22±2℃、光照强度2500lx和光照周期12h/d，培养10d后诱导形成疏松愈伤组织。

7.根据权利要求1所述的山桐子疏松愈伤组织诱导的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，诱导紧实愈伤组织培养基由ms+1.0mg/l的6-ba+1.0mg/l的naa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂组成，ph＝5.8。

8.根据权利要求1所述的山桐子疏松愈伤组织诱导的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，诱导疏松愈伤组织：将步骤(2)中的紧实愈伤组织接种于的改良的ms培养基中培养，ph＝5.2-5.6，置于光照培养箱内进行光照培养，光照培养箱内的培育条件为22±2℃、光照强度2500lx和光照周期12h/d，培养10d后诱导形成疏松愈伤组织。

9.根据权利要求1所述的山桐子疏松愈伤组织诱导的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，改良的ms培养基是由ms+1.0mg/l的6-ba+1.0mg/l的naa+10～25g/l蔗糖+5g/l琼脂组成，ph＝5.4。

10.根据权利要求1或9所述的山桐子疏松愈伤组织诱导的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，改良的ms培养基是由ms+1.0mg/l的6-ba+1.0mg/l的naa+15g/l蔗糖+5g/l琼脂组成，ph＝5.4。

技术总结
本发明公开了一种山桐子疏松愈伤组织诱导的方法。该方法以山桐子种子无菌萌发后获得的初生根状茎为外植体材料，通过组织培养诱导获得浅黄色的紧实愈伤组织，经进一步诱导形成疏松愈伤组织。本发明具有能够有效地提高山桐子的繁殖系数，缩短其生长周期，同时为山桐子分子育种中基因功能验证与遗传同源转化奠定基础。

技术研发人员：刘剑东,胡艳,王丽敏,王晓敏,罗晓青,周玉飞
受保护的技术使用者：贵州省亚热带作物研究所
技术研发日：
技术公布日：2025/4/10