一种侏儒蛤精子玻璃化超低温冷冻保存方法

本发明涉及海洋生物，特别涉及一种侏儒蛤精子玻璃化超低温冷冻保存方法。

背景技术：

1、精子超低温冷冻保存技术自上世纪50年代首次成功以来，经过半个多世纪的发展，目前在动物种质资源保护和遗传育种研究中发挥重要作用。目前，传统精子超低温冷冻保存方法（非程序性和程序性超低温冷冻）已在水产养殖中被广泛应用，包括海水双壳贝类牡蛎、贻贝和扇贝等，但该方法需借助相关冷冻装置或仪器来完成超低温冷冻步骤，耗时、耗力。本申请的精子玻璃化超低温冷冻，是将样品处理后直接放入液氮进行冷冻保存，不需借助冷冻装置或仪器便可快速完成冷冻过程，更省时、省力、方便、简单和较低的生产成本，便于在遗传育种生产实践中推广应用。目前，该方法在海水双壳贝类中还没有报道。

2、此外，目前研究的经济海水双壳贝类，由于其繁殖周期较长，并且其大部分时间都生长在海上不好管理，对于该方法的应用和研究具有一定的困难。因此，选择一个适合的模式生物进行研究非常重要。侏儒蛤具备双壳贝类特征，已作为海水双壳贝类模式生物。目前，以侏儒蛤为研究对象，开展的研究结果已应用于经济海水双壳贝类中，如yang and guo（polyploid induction by heat shock-induced meiosis and mitosis inhibition inthe dwarf surfclam, mulinia lateralissay. aquaculture, 2006）开发海水双壳贝类多倍体繁育方法，wang等人（functional characterization of cfap206 for bivalveciliogenesis by rnai and crispr/cas9 technologies. frontiers in marinescience, 2022, 9: 864037）运用基因编辑技术开展双壳类纤毛发生功能的研究，guo等人（full-length transcriptome analysis provides insights into larval shellformation in mulinia lateralis. frontiers in marine science, 2023, 9: 1111241）进行双壳贝类幼虫贝壳形成机制的研究。同时，与其它海水双壳贝类相比，侏儒蛤不仅具有性成熟周期短（大约3个月）的特点，而且侏儒蛤整个生命周期养殖方法和基因组均已由本实验室建立完成。因此，侏儒蛤是研究海水双壳贝类精子玻璃化冷冻理想材料。同时，本申请人已开发了侏儒蛤非程序性超低温冷冻保存方法，本发明的玻璃化超低温冷冻方法在保证冻融后精子质量的前提下，较之前的方法更加省时，省力以及易于标准化操作。

技术实现思路

1、针对现有技术的上述缺陷，本发明提出一种侏儒蛤精子玻璃化超低温冷冻保存方法，以解决上述背景技术提出的问题。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种侏儒蛤精子玻璃化超低温冷冻保存方法，包括如下步骤：

4、（1）取处于繁殖期的侏儒蛤，依次用阴干和变温刺激使其自然排放精子，过滤，离心，获取高密度精子，置于冰上保存；

5、（2）将步骤（1）获得的高密度精子与冷冻保护液混合，置于冰上，得混合精子溶液；所述冷冻保护液的成分由二甲基亚砜、辅酶q10和聚蔗糖组成；

6、（3）将混合精子溶液转入冷冻管后直接浸入液氮中保存。

7、优选地，步骤（1）中所述阴干为侏儒蛤在20~24℃下阴干60~90min。

8、优选地，步骤（1）中所述变温刺激为将侏儒蛤置于26~27℃海水中自然排精子。

9、优选地，精子过滤是使用24µm筛绢网过滤。

10、优选地，步骤（1）所述高密度精子的密度为1~1.5×108个/ml。

11、优选地，受精过程需用到的卵子是使用90µm筛绢网过滤，直接采集直接使用，无需经过冷冻保存，卵子的密度为1×104个/ml。

12、优选地，步骤（2）中高密度精子与冷冻保护液按体积比1：1混合。

13、优选地，步骤（2）所述置于冰上的时间为15~20min。

14、优选地，步骤（2）冷冻保护液的制备方法为每100ml过滤海水中融入16ml二甲基亚砜、0.003g辅酶q10和10g聚蔗糖，搅拌均匀即得冷冻保护液。

15、优选地，混合精子溶液浸入液氮中保存后的解冻方法为在50~60ºc水浴锅中解冻60~64s。

16、优选地，解冻后混合精子溶液和卵子按数量比1000:1的比例混合受精。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

18、（1）本发明提供的侏儒蛤精子玻璃化超低温冷冻保存方法，在温度50~60ºc下解冻60~64s后，发现该方法有助于冻融后最大限度保持精子结构完整性和细胞器功能性，维持良好的生理生化指标，同时，发现d形幼虫率达到80%以上，实现了直接将样品放入液氮进行长期保存的冷冻方法。

19、（2）现有技术贝类精子冷冻保存方法中（专利申请号：cn202311267468.2），在加入冷冻保存液后，精子和冷冻保护液的混合液注入0.25ml冷冻麦管，然后将冷冻麦管置于距离液氮面4cm处10min，之后将冷冻麦管浸入液氮中长期保存。在这个过程中，需要购买冷冻装置装液氮，4cm高度架子放于冷冻装置中，架子长度有限，决定放置的冷冻麦管数目有限（如4cm架子长30cm，放麦管数20-25根）。实验中，在转入液氮前，将麦管置于冷冻装置降温，损耗了精子样本活力，并且每个样本的保存量仅有0.25ml，单个样本保存量少，不便于养殖场在生产实践过程开展大批量操作，并且实验过程操作复杂，导致冷冻样本效率降低。而本申请通过对保存液组分选择适当，并且目前只有这三种药品组合才能实现玻璃化冷冻，而这个方法目前全世界在贝类中都没有报道。该方法样本处理后，不仅能直接放入液氮中进行长期储存，并且属于一步冷冻方法，不需要冷冻装置、4cm架子进行预冷冻过程，避免其它外界因素导致精子样本活力降低及精子结构损伤（放入液氮前，其它实验操作步骤越多，精子活力会越来越弱，精子结构受损程度会越来越强）；而且该方法不受高度架子长度的限制，只要有足够多液氮罐，就能大批量保存样本于液氮罐中储存，实验操作简单、方便，节约生产成本和时间，可以在生产实践中进行标准化操作，进而提高精子样本活力和冷冻保存效率。该方法还能大量保存单个样本，目前用2ml冷冻管保存，单个样本最少的能保存0.4ml，最多的能保存1.6ml，可在遗传育种生产实践中大批量保存冷冻样本，进而提高生产实践中所保种样本的冷冻保存效率。

技术特征：

1.一种侏儒蛤精子玻璃化超低温冷冻保存方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种侏儒蛤精子玻璃化超低温冷冻保存方法，其特征在于，步骤（1）中所述阴干为侏儒蛤在20~24℃下阴干60~90min。

3.根据权利要求1所述的一种侏儒蛤精子玻璃化超低温冷冻保存方法，其特征在于，步骤（1）中所述变温刺激为将侏儒蛤置于26~27℃海水中自然排精子。

4.根据权利要求1所述的一种侏儒蛤精子玻璃化超低温冷冻保存方法，其特征在于，精子过滤是使用24µm筛绢网过滤。

5.根据权利要求1所述的一种侏儒蛤精子玻璃化超低温冷冻保存方法，其特征在于，步骤（1）所述高密度精子的密度为1~1.5×108个/ml。

6.根据权利要求1所述的一种侏儒蛤精子玻璃化超低温冷冻保存方法，其特征在于，步骤（2）中高密度精子与冷冻保护液按体积比1：1混合。

7.根据权利要求1所述的一种侏儒蛤精子玻璃化超低温冷冻保存方法，其特征在于，步骤（2）所述置于冰上的时间为15~20min。

8.根据权利要求1所述的一种侏儒蛤精子玻璃化超低温冷冻保存方法，其特征在于，混合精子溶液浸入液氮中保存后的解冻方法为在50~60ºc水浴锅中解冻60~64s。

9.根据权利要求8所述的一种侏儒蛤精子玻璃化超低温冷冻保存方法，其特征在于，解冻后混合精子溶液和卵子按数量比1000:1的比例混合受精。

技术总结
本发明公开了一种侏儒蛤精子玻璃化超低温冷冻保存方法，涉及海洋生物技术领域。所述保存方法包括如下步骤：（1）取处于繁殖期的侏儒蛤，依次用阴干和变温刺激使其自然排放精子，过滤，离心，获取高密度精子，于冰上保存；（2）将步骤（1）获得的高密度精子与冷冻保护液混合，置于冰上，得混合精子溶液；所述冷冻保护液的成分由二甲基亚砜、辅酶Q10和聚蔗糖组成；（3）将混合精子溶液转入冷冻管后直接浸入液氮中保存。经研究发现，在温度50~60ºC下解冻60~64s后，发现D形幼虫率达到80%以上，实现了直接将样品放入液氮进行长期保存的冷冻方法。

技术研发人员：刘一兵,徐镇,黄晓婷,杨祖晶,包立随
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2025/1/13