专利名称：鲤微生态制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种以干酪乳杆菌和节杆菌活体菌粉制成的微生态制剂及其制备方法。该微生态制剂做为一种饵料添加剂，可广泛用于鲤鱼及其它淡水吃食鱼类的人工养殖。
在鱼类病害防治方面，传统的方法是化学疗法或用抗生素类药物，但由于耐药性的产生、抗菌素在鱼体内的积累等已影响了水产品的质量，甚至造成了对人类健康的危害。为此，国内外都在研究生物防治或生态防治技术，以求解决上述问题。国外已有人提出人的养生素，即用活的或死的参与调整人体肠道菌保持肠道生态平衡，促进生长发育，从而间接防治疾病，增进健康。目前国内外在人畜防病治病和保健方面利用乳杆菌，双歧杆菌等开发出一批新的微生态制剂，取得良好效果。在水产养殖方面，也有人用蜡样芽胞杆菌作为鳗鲡开口饵料，提高了鱼苗成活率。但在饵料中添加生态制品的研究报道很少，实际中广泛应用的仍然是以维生素、氨基酸、矿物质等为主要成分的饵料添加剂。
本发明是根据微生态学原理，从正常鲤肠道分离出干酪乳杆菌和节杆菌经传代驯化、发酵繁殖、浓缩干燥制成活体菌粉，并以此为鲤及其它淡水吃食鱼类人工饵料的添加剂，通过鱼类摄食带有活菌制剂的饵料，将活菌体回归鱼体，调整鱼的肠道菌群，使鱼体在最佳状态下生长发育，从而实现防病治病和促进鱼体生长、增重的功效。
本发明提供的两种菌株均是正常鲤肠道内的优势菌。经中科院微生物研究所鉴定，其中一种是干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Laecto-bacillus casei subsp rhamnosus)，系革兰氏阳性、杆状、单个、成对、成链、无鞭毛、无荚膜及芽胞，兼性厌氧，在Lbs培养基上生长良好，15～45℃生长，37℃最佳，PH值4.0以下、8.0以上生长不良，无内外毒素，编号JY31；另一种是节杆菌(Arthrobater sp)的一个菌种，系革兰氏阳性、杆状、老细胞球状、兼性厌氧、无内外毒素、无芽胞、无鞭毛及荚膜，在NB培养基上生长良好，15～38℃生长，37℃生长最佳。PH值5.0以下8.0以上生长不良，编号JY10。这两株菌已于1994年3月26日送中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号0211(JY10)和0212(JY31)。
本发明所称的鲤微生态制剂，是以JY31和JY10菌株的至少一种活体菌粉组成。混合菌粉中，JY31和JY10的活菌量的最好比例是11。其制备方法是将JY31和JY10菌株分别接种于不同营养的培养基上培养，进行传代驯化，然后将驯化的菌种再分别接种于不同的发酵液中发酵培养，经浓缩干燥制成活体菌粉。活体菌粉可以测定数量，使之达到一定的指标，然后将两种菌粉按照11的活菌数量比例混合，进行包装。
JY31和JY10菌株的菌种传代驯化可分别先在标准的Lbs，NB琼脂斜面培养基上接种，然后再分别移种于标准的Lbs，NB肉汤培养基，接种量为0.1～1%,22～40℃条件进行，培养时间为24小时。
JY31菌粉的制备可以通过如下步骤完成(1)将JY31种子液接种于豆芽汤发酵液中发酵，条件是22～40℃、压力0.1mpa、搅拌30-50rpm/分，30～36小时培养，使活菌数达到20～30亿/ml；(2)将发酵液放出，经高速离心机(16000rpm)处理取得菌泥；(3)用含有5%奶粉的无水碳酸钙吸附菌泥水分，充分混合，在60-80℃烤箱内干烤30分钟，再混合、干烤、反复多次获得干燥菌粉。
JY10菌粉的制备是通过如下步骤完成(1)将JY10种子液接种于豆芽汤发酵液中发酵培养，条件是22～38℃，压力0.1mpa，搅拌60～100rpm/分，培养时间24～36小时，使发酵液的活菌数达到20～30亿/ml；(2)将发酵液放出，经高速离心机(16000rpm)处理取得菌泥；(3)用含5%奶粉的无水碳酸钙吸附菌泥水分，充分混合，在60～80℃烤箱内干烤，反复混合、干烤、制得干燥菌粉。
上述所说的JY31发酵液可以是在5%(以干黄豆计算)的豆芽汤中加入NaCl1%、酵母膏0.3%，KaHPO40.1%，NaH2PO40.01%、PH值为6-7，最佳6.5；而JY10发酵液可以是在5%(以干黄豆计算)的豆芽汤中加入NaCl10.5%，葡萄糖1%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，PH值为6.5～8，最佳7.5。
本发明是从9批27尾鲤鱼54个标本里分离出的32株革兰氏阳性杆菌选育出的2株优势菌。用JY31，JY10菌粉添加制成的饵料，不仅能使鲤鱼及其它淡水吃食鱼增重率、能量同化率、生态生长率提高，饵料系数、耗氧率下降，而且对提高鱼体免疫水平及抗病力有积极作用，具有防病治病的效果。
本发明实施例如下实施例一JY31与JY10培养基实验。选用标准需氧培养基NB、Emb sb和标准厌氧培养基Bs、Lbs分别在培养罐中进行对比培养试验，结果是JY10以NB培养基为最佳，JY31以Lbs培养基为最佳。
实施例二JY31与JY10培养基实验。分别选择Lbs和NB标准培养基，PH值分别设定6，0，6，5，7，0，7，5，8，0进行培养对比试验。结果是JY31在PH6.0～7.0范围内都有生长，最佳PH值为6.5；JY10在PH6.5～8.0范围内都有生长，最佳PH值为7.5。
实施例三JY31与JY10最佳培养温度实验。选择Lbs(JY31)和NB(JY10)标准培养基，PH值分别为6.5和7.5设定22℃，37℃，40℃分别对JY31和JY10进行培养对比试验。结果是两株菌的最适温度均为37℃，但JY31菌株在40℃条件时仍可有一定数量的生长。
实施例四本发明应用实验。菌粉活菌量JY31为10亿/g，JY10为10亿/g，按照11活菌数量比例混合，每10g混合菌粉用2000ml水稀释混匀，喷洒在50kg鱼饵料上，充分混合并阴干投喂。选择三个鱼场投喂，进行鱼体增重、生长抗病能力影响实验。
第一实验点碧流河水库网箱养鲤。共4组80尾实验鱼，对照4组80尾。
第二验点南关岭鱼场，池塘养鲤。共4组80尾实验鱼，对照4组80尾。
第三验点抚顺市大伙房水库网箱养鲤，共3组60尾实验鱼，对照3组60尾。
1.对鱼体增重、促长作用第一实验点增重率实验组为43%，对照组为30.3%；饵料系数实验组为2.07，对照组为2.83；能量同化率实验组为25%，对照组19.3%；组织生长率实验组为65%，对照组为48.3%。
第二实验点增重率实验组为49%，对照组为29%；饵料系数实验组为1.89，对照组为3.01；能量同化率实验组为37.4%，对照组为24.6%；生态生长效率实验组为23%，对照组为10.7%；组织生长率实验组为60.3%，对照组为43.4%。
第三实验点增重率实验组为149%，对照组134%；饵料鱼数实验组为2.9，对照组为3.64；能量同化率实验组33.3%，对照组为25.4%；生态生长效率实验组为19.3%，对照组为13.5%；组织生长率实验组为58%，对照组为53.2%。
2.对抗病力的影响①中性粒细胞吞噬功能(以肠炎菌感染)未感染实验组吞噬率69.83±1.47吞噬指数2.96±0.1对照组吞噬率57.4±1.14吞噬指数2.55±0.07经感染实验组吞噬率77.5±1.29,吞噬指数3.66±0.36对照组吞噬率70.3±0.59,吞噬指数3.25±0.34②巨噬细胞吞噬功能未感染实验组63.01±4.64对照组53.44±1.14感染后实验组70.2±4.1对照组55.5±1.14③E玫瑰花环率未感染Ea(%)Et(%)实验组25.5±0.7135.25±1.5对照组23.67±2.538.5±0.71感染后Ea(%)Et(%)实验组25.17±2.04 32.0±1.83对照组10.5±0.7119.0±1.473.对各项生理，生化指标的影响①RBC数，Hb含量，血浆总蛋白量，血糖量，实验组均高于对照组；血脂量和红细胞性，实验组低于对照组。
②肌肉含水率，实验组低于对照组肌肉含蛋白质率和含脂率，实验组高于对照组。
权利要求
1.一种鲤微生态制剂，其特征在于该制剂是由干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus Casei Subsp rhamnosus. 编号JY31)菌株和节杆菌(Arthrobacter sp编号JY10)菌株至少一种的活体菌粉组成。
2.根据权利要求1所述的鲤微生态制剂，其特征在于混合菌粉中的JY31和JY10的活菌量比为11。
3.根据权利要求1所述的鲤微生态制剂，其制备方法的特征在于将JY31菌株和JY10菌株分别接种于培养基上培养菌种，然后将培养的菌株种液分别接种于发酵液中进发酵培养，经浓缩、干燥分别制成活体的菌粉。
4.根据权利要求3所述的鲤微生态制剂的制备方法，其特征在于将取得的活体菌粉测定数量，然后将JY31和JY10定量后的菌粉按11比例混合，进行包装。
5.根据权利要求3所述的鲤微生态制剂的制备方法，其特征在于JY31，JY10菌株的种液培养基分别是标准的Lbg琼脂斜面，Lbg肉汤和NB琼脂斜面、NB肉汤。
6.根据权利要求3所述的鲤微生态制剂的制备方法，其特征在于JY31菌粉的制备是通过如下步骤完成(1)将JY31种子液接种于豆芽汤发酵液中发酵，条件是22-44℃，压力0.1mPa，搅拌30-50rpm/分，30-36小时培养，使活菌数达到20-30亿/ml；(2)将发酵液放出，经高速离心机离心处理取得菌泥；(3)用含用5%奶粉的无水碳酸钙吸附菌泥水分，充分混合，于60-80℃烤箱内烤30分钟，再混合，干烤，反复多次获得干燥菌粉。
7.根据权利要求3所述的鲤微生态制剂的制备方法，其特征在于JY10菌粉的制备是通过如下步骤完成(1)将JY10种子液接种于豆芽汤发酵液中发酵培养，条件是22-40℃，压力0.1mPa，搅拌60-100rpm/分，24-36小时，使发酵液活菌数达到20-30亿/ml；(2)将发酵液放出，经高速离心机离心处理取得菌泥；(3)用含5%奶粉的无水碳酸钙吸附菌泥水分，充分混合，在60-80℃烤箱内干烤，反复混合，干烤，制得干燥菌粉。
8.根据权利要求3或6所述的鲤微生态制剂的制备方法，其特征在于所说的发酵液是在5%的豆芽汤中加入NaCl 1%，酵母膏0.3%，KaHPO40.1%，NaH2PO40.01%，PH值为6-7。
9.根据权利要求3或7所述的鲤微生态制剂的制备方法，其特征在于所说的发酵液是在5%的豆芽汤中加入NaCl 0.5%，葡萄糖1%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，PH值为6.5-8。
全文摘要
本发明涉及一种干酪乳杆菌和节杆菌体制成的鲤微生态制剂及其制备方法。这两种菌均是从正常鲤肠道内分离获得的正常优势细菌，经工厂化繁殖制成大量的活体菌粉。使用时，将菌粉稀释喷撒混合在饵料中，鲤及其它淡水吃食鱼类摄入这些带有活菌的饵料，不仅能够调整鱼肠道内的菌群，使鱼体在最佳状态下生长发育，促进鱼体生长、增重，并且具有防病治病的功效。经试验，该制剂可使鲤鱼增产25％以上，饵料系数降低0.75。
文档编号A23K1/16GK1100271SQ9411019
公开日1995年3月22日 申请日期1994年4月12日 优先权日1994年4月12日
发明者桂远明, 王斌, 何函锋, 吴垠, 康白, 孔庆友 申请人:大连水产学院