专利名称：苏云金杆菌芽孢形成基因的制作方法
公知苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)因为在其芽孢形成过程中产生晶体包涵体，在现在被用于大多数生物杀虫剂，该晶体包涵体包括一个或多个与内毒素，对许多昆虫宿主具有毒性包括鳞翅目、鞘翅目、双翅目昆虫的幼虫。
由于对于苏云金杆菌作为生物杀虫剂的应用的巨大兴趣，对于苏云金杆菌中杀虫蛋白质以及编码蛋白质的基因的确认做了大量工作。然而对于芽孢形成途径中牵涉的基因知之甚少。芽孢形成基因不仅涉及芽孢形成而且与晶体产生有关。多数杀昆虫晶体蛋白仅在芽孢形成过程中表达。因而涉及芽孢形成途径的基因的确认和特征描述将提高对于晶体产生和芽孢形成循环的认识和操纵能力，进而有力地提高苏云金杆菌作为生物杀虫剂的效力。
考虑到苏云金杆菌产品的应用，用重组苏云金杆菌生产活芽孢相当不利。所有商品苏云金杆菌菌株产生芽孢，和杀虫蛋白相组合，释向周围环境，而且芽孢可能具有优越的杀虫性能，它们具有高度耐受的结构，在极端气候环境下仍能在土壤中存活。
不产芽孢的或寡产芽孢的苏云金杆菌在生物杀虫剂中的应用可能防止或消除这些存活芽孢的释放，并使苏云金杆菌生物杀虫剂成为和传统杀虫剂相比具有更强吸引力的替代产品。甚至，文献提出一些cry基因的过表达发生于不产芽孢的菌株。例如，发现在芽孢杆菌属菌株芽孢形成突变株中，cryIII A基因表达升高。
枯草杆菌在芽孢形成过程发生的形态和生理变化得到深入研究。一般说来一但芽孢形成开始，细胞将经历一些形态学阶段而且芽孢形成也涉及细菌中生物合成活性的根本改变。芽孢形成开始时，染色体浓缩。在第II阶段，发生了细胞分裂产生了大小不同的姐妹细胞，其中较小的细胞是子细胞，被称为前芽孢或原芽孢。较大的细胞称为母细胞。在第III阶段，母细胞吞没了前芽孢，导致了包绕处于母细胞内的前芽孢的双层膜形成。在第IV阶段，前芽孢的内、外膜之间形成修饰的细胞壁，被称为外层(cortex)，然后在第V阶段，芽孢外被沉积在前芽孢的外膜上。第VI阶段定义为芽孢的完全成熟。在此阶段，芽孢发育了它的特征性质对于辐射、热、溶菌酶、和有机溶剂的抗性。最后，在第VII阶段母细胞溶胞，成熟芽孢释放。游离芽孢具有折光性在光镜下很容易地观察到。
通过制造允许正常营养生长，但阻断芽孢形成的突变而认识芽孢形成所需基因。至少已确定了参与芽孢形成过程的枯草杆菌的100个芽孢形成基因。依据在何阶段阻断芽孢形成，这些基因被命名为spo0、spoII、spoIII等。枯草杆菌中参与芽孢形成晚期事件的基因被鉴定为spoV基因，在数据中已被鉴定的有spoVA、B、D、Ea、Eb、G、Id、J和R。大写字母指这样的基因座，它含有提供相同类型的突变但作图谱时，在不同的染色体位置上。枯草杆菌的芽孢形成和基因表达和控制在Errington，Jeffrey，Baccillus Substilis SproulationRegulation of Gene Expression and Control of Morphogensis，Microbio Rev.57(1-33)中得到进一步讨论，在此引入作为参考。
已知本发明首次从苏云金杆菌宿主中分离了第V阶段芽孢形成基因。本基因被命名为spoVBt1，在核苷酸水平上与枯草杆菌spoVJ具有65.5％同源性，而且，转座子Tn917被用于spoVBt1的鉴定工具。
这一新的spoVBt1基因及相关spoV DNA序列(见下面定义)被用于将外源DNA稳定导入细菌的方法中。本发明spoV序列与位于细菌染色体上的芽孢形成基因片段基本同源。该细菌片段包含一芽孢形成基因，它被用作外源DNA和spoV序列染色体整合的位点。
令人惊讶的是，发现如果spoVBt1基因和其他spoV DNA序列发生突变，如点突变，不仅外源DNA整合到细菌染色体上，而且受体细菌将形成突变芽孢。
发明概述本发明涉及具有SEQ ID NO.1所示核酸序列的分离的spoVBt1基因。本发明进一步涉及分离的spoV DNA序列选自i)上述鉴定的分离的spoVBt1基因；ii)编码SEQ ID NO.2所示苏云金杆菌芽孢形成蛋白的核苷酸序列；iii)编码与SEQ ID NO.2所述蛋白基本一致的苏云金芽孢形成蛋白的核苷酸序列；iv)在严格杂交条件下与i)，ii)，iii)序列的互补链杂交的核苷酸序列和v)上述i)，ii)，iii)，iv)的截短的核苷酸序列，其中所述截短序列包括至少300个核苷酸更优选500个核苷酸。
本发明进一步涉及包含上述定义的spoV DNA序列，与编码至少一种杀虫晶体蛋白的DNA序列相关的DNA片段。所述spoV DNA序列的密码子包含与苏云金杆菌染色体DNA中出现序列基本同源，并可重组的核苷酸序列。该DNA片段可整合到宿主苏云金杆菌的染色体上。与spoV DNA序列基本同源的苏云金杆菌染色体片段用作该DNA片段的整合位点。以此方法，本发明包括细菌中晶体基因含量的升高。
本发明亦包含一种DNA片段，它包含可操作地连结到编码至少一种杀虫晶体毒素蛋白的DNA序列的突变的spoV DNA序列，其中，所述突变的spoV DNA序列的密码子包含与苏云金杆菌染色体DNA中出现的芽孢形成基因序列基本同源的核苷酸序列，因而在棒状杆菌宿主中，DNA片段能够插入细菌染色体芽孢形成基因座并复制并进一步表达杀虫晶体毒素蛋白，其中所述宿主是不产芽孢的或寡产芽孢的。
特别地，本发明与重组苏云金杆菌菌株相关，其中毒素晶体蛋白由转化宿主表达，但其中芽孢释放到周围环境中，此外，本发明亦与一种制备不产芽孢或寡产芽孢的杀虫晶体蛋白产生苏云金杆菌菌株方法有关。包括a)获得包括与至少一个但不多于三个杀虫晶体蛋白编码序列可操作连接的突变spoV DNA序列的DNA片段；b)将所述片段导入能够芽孢形成的苏云金杆菌，c)使DNA片段与宿主苏云金杆菌染色体芽孢形成基因的基本同源核苷酸片段之间发生同源重组，其中所述DNA片段稳定整合于苏云金杆菌染色体，并破坏了芽孢形成过程以及，d)分离稳定转化的不产芽孢或寡产芽孢苏云金杆菌宿主转化体，其中所述稳定转化宿主能够表达导入的杀虫晶体蛋白序列。
本发明的另一目的包括对转化的苏云金杆菌宿主的转导，包括将转化的宿主暴露于转导噬菌体；让所述噬菌体在所述宿主中复制，其中，整合到所述苏云金杆菌宿主染色体上的一至三个外源杀虫晶体蛋白编码DNA序列参入噬菌体，并且将杀虫晶体蛋白编码DNA序列从噬菌体中导入受体苏云金杆菌，其中所述导入外源晶体蛋白编码DNA序列稳定整合到所述受体的染色体并在受体中表达。取决于DNA片段，受体苏云金杆菌可以是亦可以不是不产芽孢的或寡产芽孢的。
关于这一点，本发明包括一种方法，应用苏云金杆菌染色体芽孢形成基因片段作为DNA片段染色体整合的位置，该DNA片段包含至少一种杀虫晶体蛋白编码基因，优选一至3个杀虫晶体蛋白编码基因，其中所述一个或多个基因稳定整合到苏云金杆菌染色体上。
本发明进一步涉及一种广谱杀虫剂组合物包括按照本发明的杀虫有效量的转化的苏云金杆菌和一种可接受的载体。
本发明另一个目标是苏云金杆菌宿主的遗传操作，其中，应用所述宿主进行致病性昆虫的防治，提供对环境更安全的生物杀虫剂，其中存活芽孢不被释放入周围环境中。
本发明进一步的目的包括保护作物的方法，包括向需要防治的栖息地施用本发明的组合物。
从下面描述和附图，本发明的其他方面对于本领域技术人员是显而易见的。
图1描述由SEQ ID NO.1描述的分离的spoVBt1基因预测，并相应于SEQ ID NO.2的氨基酸序列。
图2描述了被Tn917所间断的spoVBt1基因，以及用于测序的寡核苷酸的位置。
图3描述了质粒pSB901、pSR322和pSB140。
图4描述了质粒pSB210图5描述了质粒pSB1207。
图6描述了质粒pSB1209。
图7描述了质粒pSB1218。
图8描述了质粒pSB1219。
图9描述了质粒pSB1220。
图10描述了质粒pSB139。
图11描述了质粒pSB210.1。
图12描述了质粒pSB32。
图13描述了质粒pSB219。
图14描述了质粒pSB458。
图15描述了质粒pSB1221。
实施例I中详细描述了从苏云金杆菌HD1Mit9∷Tn917分离和纯化芽孢形成基因。SEQ ID NO.1出示了核苷酸序列。由此推断的蛋白产物的分子量计算为36.7 kDa。该芽孢形成基因被称为spoVBt1。在核苷酸序列下显示了预测的氨基酸序列，推测的核糖体结合位点包括SEQID NO.1的459至470位。预测的转录终止子茎-环(Stem-loop)结构包括1415位至1424位以及1431位至1440位。
本发明亦包括那些编码SEQ ID NO.2的蛋白质的核苷酸序列。本领域技术人员懂得一种氨基酸经常被两种或更多密码子所编码，例如氨基酸亮氨酸被下列密码子核酸序列编码TTA、TTG、CTT、CTA、CTG和CTC。编码同一氨基酸的密码子被认为是同义密码子。
本发明还进一步包含编码与SEQ ID NO.2所述蛋白基本一致的芽孢形成蛋白的核苷酸序列。术语与SEQ ID NO.2所述蛋白基本一致意味着蛋白是阶段V芽孢形成蛋白，而且氨基酸序列与SEQ ID NO.2一致性程度优选至少为80％，更优选的一致性程度是85％，最优选的一致性程度是95％。编码阶段V芽孢形成基因的核苷酸序列包含那些参预了芽孢形成过程晚期事件的基因。例如，那些参预芽孢外被蛋白沉积的基因，出芽过程进展的基因，进行性获得对有机溶剂、热及溶菌酶抗性的基因，诸如此类。
本发明之内容中，两个氨基酸序列彼此具有至少85％一致性，它们具有至少85％相同或保守取代的氨基酸残基。
出于本发明的目的，保守取代可以发生于下列集团之内部的氨基酸残基(i)丙氨基，丝氨酸或苏氨酸；(ii)谷氨酸和天门冬氨酸；(iii)精氨酸和赖氨酸；(iv)天冬酰胺和谷氨酰胺；(v)异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸；和(vi)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
本发明还进一步包括互补于在严格条件下和上面所公开任一核酸序列杂交之序列的核酸序列。在“严格条件下”与第二核苷酸序列“杂交”的第一核苷酸序列，当第二序列结合于支持物，第一和第二序列在含0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠的2×标准柠檬酸盐溶液中于65℃保温，然后于50℃用含0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠的0.5×标准柠檬酸盐溶液洗涤时，基本上不与第二序列分离。
特别的，SEQ ID NO.1描述的spoVBt1基因是与芽孢形成过程后期相关的基因。关于本发明的核苷酸序列，在其统称spoV DNA序列之前提下，更具体地鉴定为i)具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的spoVBt1基因；ii)编码SEQ ID NO.2所示苏云金杆菌芽孢形成蛋白的核苷酸序列；iii)编码与SEQ ID NO.2所示蛋白质基本一致的苏云金杆菌芽孢形成蛋白的核苷酸序列；iv)在严格条件下，与i)、ii)、iii)之互补链杂交的核苷酸序列；和v)上述之i)、ii)、iii)、iv)之截短的序列，其中截短的序列包含至少300个核苷酸，优选的是至少500个核苷酸。
截短的spoV DNA序列最优选至少500个核苷酸，特别优选的是SEQ ID NO.1的488至1404位(含)碱基。这一特别序列在此称为(t)spoVBt1-1。
因此，本发明，提供了一种DNA片段，它包含以上定义的spoV DNA序列或于此后定义的突变spoV DNA序列。该突变序列与其他编码外源或外来蛋白的DNA序列可操作地连结。例如在一优选的实施例中，可以在spoV DNA序列之外包括，编码杀虫晶体蛋白的序列。优选地，DNA片段将包含一至三个杀虫蛋白编码基因。这些基因包括但不限于cryIA(a)、cryIA(b)、cryIA(c)、cryIB、cryIC、cryIC(b)、cryID、cryIE、cryIF、cryIG、cryIH、cryIIA、cryIIB、cryIIIA、cryIIIB、cryIIIC、cryIVA、cryIVB、cryIVC、cryIVD、cryV基因，其混合物，以及由这些cry基因的部分构建的序列。特别的，晶体蛋白编码DNA序列包括cryIA(b)、cryIA(c)、cryIC、cryIIA和cryIE。由任一基因的部分构建的序列包括杂种晶种编码蛋白其中包括两或三个不同的晶体编码毒素结构域。这些杂种基因是本技术领域已知的，可以包括例如一个晶体编码基因的结构域I和结构域II，以及另一晶体毒素编码基因的结构域III。特别优选cryIC的结构域III。杂种G27就这样一个例子，其中该基因包括cryIE的结构域I和II，以及cryIC的结构域III。G27蛋白在Bosch et al.，Biotechnology 12915-918(1994)中得到进一步描述，其内容在此引入作为参考。然而，技术人员可想象多种毒素的组合，包含杂种毒素编码基因，这些组合被引入本发明。术语外来或外源蛋白质或基因是技术术语指一个从宿主细胞之外来源的，转移到宿主细胞的基因。
按照本发明，最优选的宿主包括苏云金杆菌的亚种，特别是thuringiensis，kurstaki，dendrolimus，galleriae，entomocidus，aizawai，morrisoni，tolworthi和israelensis各亚种，最优选B、thuringiensiskurstaki。
DNA片段可进一步包括革兰氏阴性菌的复制起点。可以应用任一能在一个或多个革兰氏阴性菌的种或肠杆菌属，亚硝化单胞菌属，假单胞菌属，沙雷氏菌属，根瘤菌属，和固氮杆菌属的菌株中起作用的其他菌株的复制起点。DNA片段克隆至革兰氏阴性菌如大肠杆菌以及转化苏云金杆菌之后，仅存的外源杀虫DNA序列将是那些整合到染色体之上的。因为革兰氏阴性菌复制起点不能在苏云金杆菌宿主中起作用，除非DNA片段整合到宿主染色体上，DNA片段转化的宿主不能复制及表达晶体毒素编码基因。
DNA片段可进一步包括其他核酸序列包括选择性标志。一般说来，可用于突变体或重组体生物之选择或检测的药物抗性、化学抗性、氨基酸营养缺陷型或原养型或其他表型改变等选择性标志均可采用。
优选的DNA片段包括来自革兰氏阴性细菌的复制起点和选择性标志。
其他可以参入DNA片段的序列包括但不限于在宿主细胞中能够指导晶体毒素编码序列的转录和转译的调节序列，例如启动子，操纵基因，阻遏子，增强子序列，核糖体结合位点，转译起始或终止位点等。具体例子包括cryIC启动子，cryIA(c)终止子和ermC启动子。另外，可包括所要求spoVBt1基因的邻接序列。这些序列包括启动子序列，下游增强子序列等。
本发明适用的spoV DNA序列基本上与苏云金杆菌染色体的一段核苷酸片段同源。一般说来，该片段是芽孢形成基因的一部分，由于它与细菌DNA的同源性重组，被用作本发明DNA片段整合到宿主DNA的整合位点。本发明的DNA片段可从以环状，闭合DNA片段的形式提供，其中同源性重组可借助于单重交换事件(siugle-cross over event)而发生，亦可从以线性DNA片段而提供，其中同源性重组可借助于双重交换事件(double-cross over event)而发生。因而基本同源的DNA序列可以是一或二翼侧DNA序列。spoV DNA序列与细菌染色体的一个片段同源，其范围是大约15-1600个核苷酸碱基，更优选为200-1200碱基。本领域技术人员将承认，在整合位点，发生多重插入。
在此所用的术语核苷酸序列的同源性指不同核苷酸分子序列间相似程度。因而100％同源的两个核酸分子具有一致的核苷酸分子。基本同源的核苷酸序列或片段是，片段的序列至少90％优选95％一致。同源重组被定义为普通重组，它发生于两个具有相当范围的同源区的序列之间，序列可以在不同分子上。
本发明的DNA片段可由噬菌体或载体荷载，优选的载体是质粒，特别是在此公开的质粒以及于1995年5月19日公开的PCT国际申请WO9425611(全文在此引入作为参考)中的质粒。此外，DNA片段可以用革兰氏阴性菌穿梭质粒来荷载。合适的载体包括任一在革兰氏阴性菌中，酵母中，或任何革兰氏阳性菌之外的单细胞宿主内自我复制的载体。这些穿梭载体是本技术领域所公知的。
转化受体苏云金杆菌吸收外源DNA的过程，可通过本领域已知技术完成，包括转染，电穿孔，转导或接合。特别优选的方法包括电穿孔和转导。宿主分离可通过选择转化宿主上选择性标志来完成。采用已知方法扩增转化宿主。
因而优选的本发明的实施方案是一个制备表达一至三个外源杀虫晶体蛋白编码基因的转化苏云金宿主的方法，其中包括a)获得DNA片段，包括1)任选地来自革兰氏阳性菌的复制起点；2)spoVBt1 DNA序列，它选自i)具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列之spoVBt1基因；ii)编码SEQ ID NO.2所述蛋白之核苷酸序列；iii)编码与SEQ ID NO.2所述蛋白基本一致之苏云金杆菌芽孢形成蛋白之核苷酸序列；iv)在严格条件下，与i)、ii)、iii)之互补链杂交的核苷酸序列；和v)上述i)、ii)或iv)之截短核苷酸序列，其中截短的序列包括至少300个核苷酸和3)编码一至三个杀虫晶体蛋白的DNA序列；b)将所述片段导入苏云金杆菌宿主；c)使该DNA片段和芽孢形成基因的基本同源的核苷酸序列在宿主苏云金杆菌染色体上发生同源重组，其中DNA片段稳定地整合到苏云金杆菌染色体上；和d)分离稳定转化的苏云金杆菌转化体，其中稳定转化的苏云金杆菌能够产生外源杀虫晶体蛋白。
本发明也包括转化的棒状杆菌宿主及其由于扩增所述转化体形成的子代。
一个或多个芽孢形成基因的突变可引起突变体芽孢的形成。在此所用的突变体芽孢包括来自不产芽孢或寡产芽孢菌株的芽孢。不产芽孢苏云金杆菌是由于这些菌株不能形成芽孢而未形成芽孢。此外，寡产芽孢苏云金杆菌菌株是那些能够形成芽孢，然而由于多种原因芽孢不能存活，但是由于对热、冷或有机溶剂敏感，暴露于以上因素时不能存活。经常地，寡产芽孢苏云金杆菌产生本技术领域称为灰期芽孢(phasegrey spores)的芽孢。
基因突变可通过多种本领域技术人员所熟知的方法来进行，包括化学诱变，点突变，缺失，插入突变，包括使用转座子等。
本发明的一个实施方案是一种利用本发明的DNA片段间断编码芽孢形成基因的染色体DNA的方法。在这一方面，该DNA片段包括突变的spoV DNA序列。
突变spoV DNA序列是本发明的spoV DNA序列其中该序列用点突变，缺失，或插入而改变。点突变一般被理解为任一涉及单个核苷酸的突变、包括得到或失去一个核苷酸导致移码突变，以及转换和颠换突变。点突变可发生于多个密码子。优选的点突变包括制造终止密码子以及可用以破坏核糖体结合位点和甲硫氨酸起始密码子。这些终止子可发生于整个基因的任一位置，然而，它们并不间断本发明DNA片段和基本同源的染色体芽孢形成基因座之间的同源重组过程。
因而，本发明的另一实施例是分离的突变的spoV DNA序列，它选自i)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；ii)编码SEQ ID NO.2所述苏云金杆菌蛋白之核苷酸序列；iii)编码与SEQ ID NO.2所述蛋白基本一致之苏云金杆菌芽孢形成蛋白之核苷酸序列；iv)在严格条件下，与i)、ii)、iii)序列之互补链杂交的核苷酸序列；和v)上述i)、ii)iii)或iv)之截短核苷酸序列，其中截短的核苷酸序列的部分包括至少300个核苷酸，其中上述i)、ii)iii)、iv)或v)的核苷酸序列具有一个或多个点突变，插入，或缺失。
突变的spoV DNA序列可包括1至25个终止密码子，虽然多于25或少于25的数目均可采用。一个具体的本发明的突变spoV DNA序列是SEQ ID NO.1的spoVBt1序列的部分，包括核苷酸序列的465至1256位(含)，且其中表I中的核苷酸发生改变。一般说来，应该在SEQID NO.1或相关spoV DNA序列的1404位之前构建有终止密码子，以防在受体宿主细胞内回复野生型芽孢。此外，突变的spoV DNA序列编码的肽应少于306个氨基酸。最优选的，终止密码子应构建在SEQ IDNO.1或相关spoV DNA序列的1256位核苷酸之前。
表1核苷酸# 原始密码子 改变为465 G T475 T A487 T A492 A T873 G T881 C A1243T A1254A T这一具体的突变的spoV DNA序列被称为(m)spoVBt1-8突变的spoV DNA序列可以包括上述点突变或与序列465至1254位非突变的密码子基本同源的序列。
该突变的spoV DNA序列也包括spoV DNA序列，它的核酸序列具有外源插入，例如，该插入可包括2至15个核苷酸，然而，可应用更多的核苷酸。
优选的突变spoV DNA序列是那些序列，其中该序列是SEQ IDNO.1的突变序列，而且所述突变由在核苷酸1404位之前的一至二十五个点突变组成，或者是那些包含SEQ ID NO.1的465至1265位碱基的截短的突变核苷酸序列，所述点突变在一至二十五之间。
优选的DNA片段包括上面定义的突变的spoV DNA；以及一至三个杀虫晶体蛋白编码基因。
进一步优选的DNA片段包括上面定义的突变spoV DNA；以及一个杀虫晶体蛋白编码基因；以及来自革兰氏阴性细菌的复制起点。
因而本发明的另一优选的实施方案是制备具有突变体芽孢的产生杀虫晶体蛋白苏云金杆菌菌株的方法包括a)获得DNA片段，包括1)来自革兰氏阳性菌的复制起点；2)突变spoV DNA序列，它选自i)具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列之spoVBt1基因；ii)编码SEQ ID NO.2所述蛋白之核苷酸序列；iii)编码与SEQ ID NO.2所述蛋白基本一致之苏云金杆菌芽孢形成蛋白之核苷酸序列；iv)在严格条件下，与i)、ii)、iii)之互补链杂交的核苷酸序列；和v)上述i)、ii)、iii)或iv)之截短核苷酸序列，其中截短序列包括至少300个核苷酸；和3)编码至少一个杀虫晶体毒素蛋白的DNA序列；b)将所述片段导入形成芽孢的苏云金杆菌宿主；c)使DNA片段和宿主苏云金杆菌染色体的芽孢形成基因的基本同源的核苷酸序列发生同源重组，其中包含突变spoV DNA序列的DNA片段稳定地整合到苏云金杆菌宿主染色体上；和d)分离稳定转化的苏云金杆菌转化体，其中稳定转化的苏云金杆菌能够产生突变芽孢和能够产生外源晶体毒素蛋白。
宿主染色体上的基本同源芽孢形成基因片段优选spoVBt1染色体片段。
也提供了上述产生的转化的苏云金杆菌宿主。
本方法进一步包括采用转化的寡产芽孢或不产芽孢宿主。
转导是用病毒介导宿主DNA从一个宿主细胞(供体)转移到另一细胞(受体)。当噬菌体在供体细胞中复制时，有些子代病毒粒子包容了噬菌体DNA之外的宿主DNA片段。这些病毒粒子可吸附于一个新的宿主细胞，以常规的方式导入它们的DNA。在本发明中，已用本发明的DNA片段转化的宿主菌株可以进一步用噬菌体转导。参入了噬菌体的宿主(供体)DNA与受体染色体的同源区进行重组，所以基因可以稳定地遗传。这一般是本领域技术人员所指的普遍性转导。噬菌体是本领域技术人员已知的，包括所有能够感染苏云金杆菌菌株的所有的噬菌体，例如CP-51和CP-51ts45和其所有的衍生物。本发明中，优选受体细胞来自Bt kurstaki。
因而，本发明的另一方面是一种转导转化苏云金杆菌的方法，转化的苏云金杆菌由上述方法之一种制备，包括a)将本发明的苏云金杆菌用转导噬菌体处理；b)使噬菌体在宿主中复制，其中，整合到宿主染色体上的一至三个外源晶体蛋白编码基因参入至噬菌体上，或使噬菌体在宿主苏云金杆菌中复制，其中突变的spoV DNA序列和整合到宿主染色体上的一至三个外源晶体蛋白编码基因参入到噬菌体上，以及c)由噬菌体将外源晶体蛋白编码序列导入受体苏云金杆菌菌株。
其中所述导入外源晶体蛋白编码DNA序列稳定地参入受体苏云金杆菌染色体，而且在所述受体中表达，或者其中突变spoV DNA序列和所述外源晶体蛋白的编码序列稳定地参入受体苏云金杆菌染色体，而且外源晶体蛋白在所述受体中表达，其中受体产生突变芽孢。
突变spoV DNA序列和外源晶体蛋白编码DNA序列优选参入到芽孢形成基因染色体片段上。
待参入宿主染色体的DNA片段包括，优选截短的突变spoV DNA序列包括具有一至二十五个点突变的SEQ ID NO.1的465至1265位核苷酸，和晶体毒素编码DNA cryIA(b)、cryIA(c)、cryIIA或cryIE以及由其片段构建的序列。
本发明也提供了上述得到的转导菌株。
取决于导入转化宿主的DNA片段所采用的spoV DNA序列，受体苏云金杆菌可以成为寡产芽孢的或不产芽孢的。最优选的染色体整合位置是受体苏云金杆菌的spoVBt1核苷酸片段。然而，其他芽孢形成基因片段亦可同样用作染色体位置。优选的芽孢形成基因片段包括那些与spoV DNA基本同源的片段。
本发明的DNA片段稳定地参入宿主染色体被定义为在多个世代中，DNA片段保持在宿主染色体中。
本发明进一步涉及杀虫组合物，优选杀虫组合物中，将转化的苏云金杆菌中或所述棒状杆菌产生的蛋白作为活性成分。本发明的组合物包括编码一个或多个杀虫Cry蛋白的不产芽孢或寡产芽孢苏云金杆菌，而且以杀虫有效量施用。杀虫有效量的确定，依赖于这样一些因素而变动如具体的Cry蛋白，具体的待防治的昆虫，具体的要处理的植物，以及施用杀虫活性组合物的方法。
本发明的组合物可以包含大约106至大约1013个微生物每克。杀虫浓度依赖于具体配方的载体。组合物包含0.1至99％转化宿主或其子代以及0至99.9％的固体或液体载体。
本发明的杀虫组合物可同农用载体共同配制。配制的组合物可以是粉剂、颗粒物质、水或油中的悬浮剂，乳剂或作为可湿粉剂的形式。合适的农用载体可是固体或液体，是本领域技术人员所公知的。在此所用的农用载体包括所有的佐剂，如湿润剂，展布剂，乳化剂，分散剂，发泡剂，抑制剂，pentrant，表面活性剂，溶剂，增溶剂，缓冲剂，粘着剂等。都是杀虫剂配制技术中所常用的。是杀虫剂配制技术人员所熟知的。
包含不产芽孢或寡产芽孢的苏云金杆菌菌株及一种或多种液体或固体佐剂的制剂以本领域技术人员熟知的方法制备。
本发明的组合物采用传统方法，施用于需防治的栖息地，典型地是需保护的植物的叶子。这些应用方法是本领域熟知的。本组合物的制剂可以每英亩喷洒108至1016芽孢。对于寡产芽孢和不产芽孢组合物，芽孢可以出现，但是不成熟也不存活。本组合物最好是对植物喷雾，并且其后再次施用。本发明领域所保护的植物包括但不限于谷类，水果，豆类作物，油料作物，蔬菜，落叶及针叶树，甜菜作物，观赏植物。本组合物可有效地防治鳞翅目、鞘翅目、双翅目昆虫。
本发明的另一实施方案是一种使用苏云金杆菌染色体芽孢形成基因片段作为DNA片段染色体整合的位置，所述片段包含一至三个杀虫晶体蛋白编码基因其中所述基因稳定整合到苏云金杆菌染色体上。
染色体基因片段优选与DNA片段上的大约15至大约1600核苷酸基本同源，DNA片段包含编码苏云金杆菌芽孢形成蛋白的DNA序列。
稳定地整合优选造成苏云金杆菌及其任一子代为寡产芽孢或不产芽孢菌株。
棒状杆菌优选为Baccillus thuringiensis kurstaki菌株。
本发明的方法使用了遗传工程和分子克隆的技术，这都是本领域技术人员所熟知的，使用可购得的仪器，且包含于Maniatis，et al.，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory(1991)。
参见下列具体的，非限定性实施例，本发明得到更详尽的说明。实施例1苏云金杆菌spoV BtI基因的鉴别和克隆A. 负载转座子Tn917质粒PLTV1的制备从枯草杆菌PY1177菌株中分离质粒pLTV1。该菌株在含0.5％葡萄糖和Tet10(10μg/ml)的TBAB平板(3.3％Difco Tryptose BloodAgan Base)上培养过夜。从单菌落中的细胞用于接种10ml含0.5％葡萄糖和Tet10(10μg/ml)的LB(1％Bacto Typtone，0.5％BactoYeast Extract，0.5％NaCl， pH 7.0)细胞于37℃振荡温育5小时。18,500xg，4℃离心10分钟，用10ml SET缓冲液(20％蔗糖，50mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，50mM Tris HCl pH8.0)洗涤。沉淀重悬于含2mg/ml溶菌酶和0.4mg/ml RNase A(Boehringer MannbeimBiochemicals，Indianapolis，IN)的500μl SET溶液中。细胞悬液于37℃温育10分钟，加入1ml溶胞混合物(1％十二烷基硫酸钠(SDS)，200mM NaOH)，然后加入725μl预冷的中和缓冲液(1.5M醋酸钠，pH4.8)。然后将混合物冰浴20分钟，18,500xg，4℃离心10分钟，上清转移至一新管中，使用Mini Qiagen Plasmid Kit(Qiagen Inc.，Chatsworth CA)分离质粒DNA。B.将pLTV1转移至大肠杆菌GM2163中除非特别指出，大肠杆菌和苏云金杆菌分别生长于37℃和30℃。
在转化苏云金杆菌之前，质粒pLTV1需在dcm(-)宿主细胞中进行调整。这通过将pLTV1转移至dcm(-)大肠杆菌GM2163(NewEngland Biolabs，Inc.，Beverly，MA)而完成。通过将单菌落接种到30mlSOB培养基(2％Bacto Typtone，0.5％Bacto Yeast Extract，0.06％NaCl，0.05％KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4)而制备感受态E.coli GM1203。细胞于37℃、300rpm温育过夜。将装于2L三角瓶中的200ml SOB培养接种8ml过夜培养基，37℃，300rpm温育至OD550为0.3。培养物冰浴15分钟，4,000xg，4℃离心5分钟，沉淀温和地重悬于64ml转化缓冲液I(1.2％RbCl，0.99％MnCl2·4H2O，30mM醋酸钾(pH5.8)，0.25％CaCl2·2H2O，15％甘油)。冰浴15分钟之后，细胞再次于4,000xg离心，最终重悬于16ml转化缓冲液2(10mM MOPS pH7.0，0.12％RbCl，1.1％CaCl2·2H2O，15％甘油)中。大约50μl感受态细胞和4μl DNA在1.5ml Eppendorf管中混合，冰浴1分钟。该细胞和DNA的混合物(从枯草芽孢杆菌PY1177菌株中分离的pLTV1)转移至预冷的0.2cm裂隙电极池(0.2cm gapelectrode cuvette)中，使用高压基因脉冲仪(Gene Pulser)电穿孔装置，电穿孔条件是25μF，2.5kV和200Ω。将细胞立即转移至1mlSOC培养基(2％Bacto Typtone，0.5％Bacto Yeast Extract，0.06％NaCl，0.05％KCl，20mM葡萄糖)于37℃、225rpm振荡温育1小时。细胞于含Amp75(75μg/ml)的LB琼脂上铺平板，并于37℃温育过夜。pLTV1质粒是使用Mini Qiagen Plasmid Kit从转化的Ecoli GM2163中分离的。C. pLTV1转移至苏云金杆菌Cry-B中苏云金杆菌菌株HD1mit9被用于转座子诱变。该菌株从PurdueUniversity Dr Arthur I.Aronson处获得。它是苏云金杆菌KurstakiHD1亚种的不含晶衍生物，仅含有一个4-mDa质粒。
从E.coli中分离的pLTVI质粒在HD1mit9中不稳定。使得来自GM2163的质粒DNA转化至CryB中，CryE是苏云金杆菌的质粒经处理的晶体阴性菌株(Stahly，D.P.，Dingmann，D.W.，Bulla，L.A.and Aronson，A.I.，Biochem.Biophys.Res.Com.84581-588，1978)。为制备感受态细胞，CryB在LB平板上过夜生长。用单菌落接种1升三角瓶中的100ml BHIS培养基(3.7％脑心浸出液，0.5M蔗糖)。培养物于37℃振荡，直至OD600为0.2-0.3。细胞转移至预冷250ml瓶中，6,500xg，4℃离心7分钟。沉淀用100ml冰冷HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙基硫酸])/蔗糖洗涤溶液(5mM HEPES，pH7.0，0.5M蔗糖)洗涤1遍，10ml冰冷HEPES/蔗糖洗涤溶液洗涤2遍。细胞重悬于含10ml HEPES/蔗糖溶液和2.5ml 50％甘油的溶液中。感受态苏云金杆菌细胞和10μl质粒pLTV1 DNA在预冷的0.2cm裂隙电极基因脉冲池中混合，在基因脉冲池穿孔装置中用电流处理(Bio-RaclLaboratories，Richmond，CA)。CryB电穿孔的参数是1.05kV，25μF，Ω＝∞。电穿孔后，细胞立即转移至装在125mL三角瓶的5ml BHIS中，于30℃，250rpm培养。生长3小时后，细胞转移至含Tet10的LB琼脂平板上。平板于30℃温育过夜，被称为CryB(pLTV1)的转化体在新的LB Tet10平板上重新划线。D.从苏云金杆菌Cry-B菌株中分离质粒pLTV1
CryB(pLTV1)在LB Tet10平板上划线。培养物生长过夜。将单菌落于SA平板(1×Spiziens盐，1％酪蛋白水解物，0.5％葡萄糖，0.005mM MnSO4·H2O，1.5％Bacto琼脂)于37℃温育3-4小时。1×Spizizen盐含0.2％(NH4)2SO4，1.4％K2HPO4，0.6％KH2PO4，0.1％二水柠檬酸钠，0.02％MgSO4·7H2O(Anagnostopoulos andSpizizen，1961)。从平板上移取细胞，重悬于100μl TESL(100mMTris HCl pH8.0，10mM EDTA，20％蔗糖，2mg/ml溶菌酶)，37℃温育30-60分钟。向管中加入200μl裂解溶液(200mM，1％SDS)，室温温育5分钟。加入150μl冰冷的pH4.8的3M醋酸钾溶液之后，悬液于小型离心机中，18,500xg，4℃离心20分钟。上清液转移至新管中与1ml 100％的乙醇混合。悬液置于20℃1小时，于4℃，18,500xg离心30分钟。质粒DNA用70％乙醇洗涤，真空干燥，重悬于20μl TE中。E. pLTV1转移至苏云金杆菌HD1mit9菌株中从CryB(pLTV1)中分离的质粒pLTV1导入HD1mit9菌株。制备苏云金HD1mit9细胞(Dr.Arthur I.Aronson，Purdue University)的感受态，且按上述用于CryB的方法转化。用从CryB(pLTV1)中分离质粒同样的方法从HD1mit9细胞中分离该质粒。然而，对于HD1mit9的电穿孔参数为1.2kV，3μF，Ω＝∞。用限制性酶切和聚合酶链式反应(PCR)证实pLTV1质粒在HD1mit9转化体中的存在。每一实验结果用琼脂糖凝胶电泳分析。按制造商描述的条件，用EcoRI(PharmaciaBiotechnology Piscataway NJ)酶切从HD1mit9中分离的pLTV1 DNA(1μg)。用于PCR反应的LacNHS1(SEQ ID NO.3)和LacNHS2(SEQ ID NO.4)，是在PCR-Mate 391型DNA合成仪(AppliedBiosystems，Foster City，CA)上合成的。引物序列(5′ -3′)SEQ ID NOLacNHS1 GGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGC 3LacNHS2 CCAGACCAACTGGTAATGGTAGCGACCGGC 4一苏云金杆菌单菌落重悬于15μl无菌水中，于沸水中水浴10分钟，然后离心5分钟。每一PCR反应含2μl煮沸细胞的上清液，1×PCR缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.3，500mM KCl，15mMMgCl2，0.1％(wt/vol))，200μm三磷酸脱氧核苷酸(dNTP’s；1.25mM dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，1μm LacNHS1引物，1μm LacNHS2引物，2.5单位AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)。反应在热循环仪(Perkin-ElmerCetus)上进行25个循环每一循环包括94℃1分钟(变性)，55℃2分钟(杂交)，72℃3分钟(延伸)。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳1.5kb PCR产生片段的合成表明该克隆载有pLTV1质粒。F.Tn917插入文库的制备为制备文库，HD1mit9(pLTV1)生长于含Tet10的LB平板上。用两至三个菌落接种含Ery0.15的10ml Penassay液体培养基(1.75％Difco抗生素培养基3)。于30℃，300rpm生长90分钟之后，培养物中抗生素的浓度增至Ery1，Lm25。当培养物达到0.5 OD595时，将一份100μl培养物加到新的10ml含Ery1，Lm25的Penassay液体培养基。39℃，300rpm生长16小时后，用10ml含Ery1，Lm25的Penassay液体培养基以1∶15稀释，于39℃温和振荡培养至OD5952.0。离心沉淀细胞(4,000xg，4℃)，重悬于含Ery1和30％甘油的500μl Penassay液体培养基中，于干冰中冷冻。将文库的稀释液(10-3和10-4)涂布Penassay Ery5平板，39℃温育16小时。将单菌落涂布含不同抗生素(Tet10，Lm25和Ery5)的LB平板，于30℃生长过夜。那些只在LB Lm25和LBEry5)但不在LBTet10上生长的单菌落含Tn917插入。这些菌落于CYS平板(1％Casitone，0.5％葡萄糖，0.2％Bacto YeastEntract，0.1％KH2PO4，0.5mM MgCl2，0.05mM MnCl2，0.05mMZnSO4，0.05mM FeCl2，0.2mM CaCl2，1.5％Bacto agar)，并镜检其芽孢形成能力。多于1×104个菌落用于筛选转座子插入。获得了63个含染色体插入的菌落。仅有3个菌落(5％的插入突变体)是芽孢形成缺陷的。对芽孢形成突变体作进一步分析。
为鉴定营养缺陷型和柠檬酸循环缺陷菌将苏云金杆菌芽孢形成突变体在微量葡萄糖和微量乳酸平板上生长1-2天，并将其生长状况与HD1mit9相比较。微量葡萄糖琼脂由1×盐溶液[1升5.6g K2HPO4，2.4g KH2PO4，1.2g(NH4)2SO4，0.4g醋酸钠，pH 7.0]，0.005mMFeCl2，0.96％葡萄糖，0.0002mM MnCl2，0.00012％硫胺素B11.5％Bacto琼脂。微量乳酸培养基含0.2％乳酸盐，和25mM谷氨酸盐代替了葡萄糖和醋酸钠。这三个芽孢形成突变体在微量葡萄糖和乳酸盐培养基上生长良好，表明它们不是营养缺陷型，也无柠檬酸酶的缺陷。G.从苏云金杆菌芽孢形成突变体中分离DNA芽孢形成突变体菌株HDl mit9∷Tn917，在2ml LB中于200rpm生长过夜。过夜培养物用于接种100ml LB(10％接种)。细胞于300rpm生长至0.7-1.0 OD600，离心收集(3,840xg，5分钟，4℃)，重悬于5ml TES(25mM Tris HCl pH8.0，25mM EDTA，25％蔗糖)。细胞悬液和0.55ml溶于TES的10mg/ml溶菌酶溶液混合，于37℃温育60分钟。加入SDS，使其重量/体积比为2％，然后于50℃温育15分钟。悬液与1.52ml SM NaCl混合，50℃温育5分钟。样品于0℃温育1小时，于18,500xg，4℃离心10分钟。上清液转移至新管中。为把DNA从蛋白质中纯化出来，用苯酚和氯仿处理上清液。首先与5ml TE平衡的苯酚混合，50℃温育15分钟。然后与5ml苯酚/氯仿(1∶1)混合，最后与5ml氯仿混合。每一步中，经离心(4,000xg，5分钟)使水相从有机相中分离。加入4.6ml异丙醇并离心(18,500xg，30分钟，4℃)沉淀DNA。空气干燥的DNA沉淀溶于2ml TE中，并于-20℃贮存。H.邻近转座子插入的染色体DNA的克隆克隆了苏云金杆菌染色体DNA并保持于E.coli DH5α(GibcoBRL，Grand Island，NY)，或HB101(New England Biolabs，Inc)菌株中。限制性酶，T4DNA连接酶，和反应缓冲液购自New EnglandBiolabs，Inc.，Pharmacia Biotechnology(Piscataway，NJ)，或GibcoBRL。感受态大肠杆菌细胞如下步骤制备菌株于LB琼脂平板培养16-18小时。用几个菌落接种1L锥形瓶中的100ml LB。液体培养物于37℃，300rpm生长。当培养物达到0.2 OD600时，置冰上15分钟，于5,500xg，4℃离心10分钟。细胞重悬于50ml 0.05M CaCl2，冰浴20分钟，如上述条件下离心。感受态细胞重悬于含20％甘油的50mMCaCl2中，并装入小离心管中(100μl每管)。
按下述步骤，用限制性酶消化苏云金杆菌染色体DNA(11-14μg)。反应含30-50单位的溶于1x反应缓冲液的酶，37℃温育过夜。10x反应缓冲液包括REact 2(500mM Tris-HCl，pH8.0，100mMMgCl2，500mM NaCl)，REact3(500mM Tris-HCl，pH8.0，100mM MgCl2，1M NaCl)，及NEB3(500mM Tris-HCl，pH8.0，100mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇(DTT)，1M NaCl)，REact2，REact3，NEB3分别用于XbaI，EcoRI，和BspEI酶。于70℃加热40分钟使酶失活。经消化的DNA于100μl体积中，用16单位T4DNA连接酶和20μl5x连接酶缓冲液(50mM MgCl2，25％(wt/Vol)聚乙二醇8000，5mM ATP，5mM DTT，250mMTris-HCl pH7.6)于16℃温育过夜。连接混合物用于转化100μl大肠杆菌HB101感受态细胞。于含Amp75的LB琼脂上生长16小时后，分离氨苄抗性转化菌落。从HB101转化体中提取质粒DNA，转移至大肠杆菌DH5α或GM2163，然后用限制性核酸内切酶消化而分析。I.确定spoVBt1的核苷酸序列克隆的基因的两条链都采用表I所列出，在PCR-Mate DNA 391型合成仪上合成的引物进行测序。寡核苷酸的位置如图2所示。按制造商提供的条件，用Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit(United StaRes Biochemical，Cleveland，OH)对克隆的苏云金染色体片段测序。spoVB 1的序列如SEQ ID NO.1所示。spoVBt1基因产物的分子量是36.7kDa。
表2用于苏云金杆菌spoVBt1基因测序的引物引物 序列(5′ -3′) SEQ ID NOMS1 GAGAGATGTCACCGTCAAG 5MS2 CCCTGTACCTGGATTCCC 6MS3 GGGAATCCAGGTACAGGG 7MS4 CCATCCCAACAAGCTTCCC 8MS5 GGGAAGCTTGTTGGGATGG 9MS6 CCTGTCCCCCTTGTAAATGC 10MS7 GCATTTACAAGGGGGACAGG 11MS8 CGCCGTCTACTTACAAGCAGC12MS9 GGTGGTGGGACTATGGAG 13MS10 CTCCATAGTCCCACCACC 14MS11ACGAGGAGGAGAGAAGGAC 15MS11BGTCCTTCTCTCCTCCTC16MS12ACGAAGTGTACGGTCTGG17MS12BCACGATGCATCG 18MS13ACGAAAGAGGCTGAATGG19MS13BGGGCGGTATGTACGG 20MS13CCCGTACATACCGCCC 21MS14 GCATCAAATCCATACTCGATATTCC22MS14ACGAGTATGGATTTTTGATGCTCG 23MS16 GGACACGATCCTAATTCAGC 24MS16AGCTGAATTAGGATCGTGTCC 25J.芽孢形成突变体菌株HD1mit9∷Tn917芽孢的特征鉴定比较了突变体和野生型HD1mit9芽孢对于热，溶菌酶，和有机溶剂的抗性特征。野生型和突变体菌株生长于100ml CYS培养基。达到稳定期后48小时收获培养物。将已芽孢形成的培养物经受各种处理，用0.1％蛋白胨梯度稀释，铺LB琼脂平板，于30℃温育过夜。计数由出芽芽孢产生的菌落，确定芽孢对盐、溶菌酶，和有机溶剂的抗性。热处理培养物用0.1％无菌蛋白胨以1∶10稀释并分成两等份。一份于55℃温育。另一份于65℃温育45分钟并偶然搅拌。溶菌酶处理培养物用含250μg/ml溶菌酶的0.1％蛋白胨稀释至1∶100，于37℃温育15分钟。有机溶剂处理样品用甲苯、1-辛烷和氯仿用下述步骤处理。1毫升培养物用7ml 0.1％丙酮和2ml有机溶剂混合。培养物涡旋振荡1分钟就丙酮处理而言。培养物在丙酮中1∶10稀释，室温温育15分钟。突变体芽孢对热和有机溶剂敏感对溶菌酶抗性。芽孢形成突变体菌株产生芽孢的相对抗性，按最大抗性和最小抗性为以下顺序溶菌酶、热、甲苯、氯仿、丙酮、和1-辛烷。实施例2 染色体整合A. spoVBt1 DNA序列和突变的spoV DNA序列的制备按实施例1之描述制备spoVBt1 DNA序列。采用亲本spoVBt1作为模板，用引物MS18，MS19A，MS19B，和MS20来PCR扩增突变spoV基因。引物被设计为含有几个点突变，这样，破坏了推断的核糖体结合位点。和起始密码子，并且在spoVBt1序列中引入了多个终止密码子。突变的spoV DNA序列对应于SEQ ID NO.1的465至1256位，并有表1所示改变。具体的突变的spoV DNA序列被称为(m)spoVBt1-8。
引物 序(5′ -3′)SEQ ID NO.
MS18 GATGTGATTGTAAGGAACAATCGAAGCGATAGAAAAAC 26MS19A GATCTTGTATGAGAGTAAATCGGCCATACAGC 27MS19B GCTGTATGGCCGATTTACTCTCATACAAGCTC 28MS20 CTATACAGCATGTTAATGATCCC 29为获得(m)spoVBt1-8基因，涉及了两个PCR反应。扩增了两个基因片段，它们分别是该序列的3′端一半和5′端一半，它包含32bp的重叠区，该重叠区在每条DNA链上分别对应于MS19A和19B。用引物MS18和MS19B扩增5′端一半，用引物MS19A和MS20扩增3′端一半。将两个片段混合，变性和退火。整个(m)spoVBt1-8基因用引物MS18和MS20扩增。B.晶体基因在spoV基因Bt1位点和(t)spoVBt1-1的染色体整合。
使用pSB1209质粒(图6)，将晶体基因整合至苏云金杆菌染色体上。
构建质粒pSB901(图3)以提供红霉素抗性基因ermC。ermC基因作为HindIII/ClaI片段从pIM13枯草杆菌质粒中分离，参见Moned etal，J.Bacteriol.167138-147(1986)。将ermC HindIII/ClaI片段连接于用HindIII和Acc酶切的pUC18。为了用来自pSB901的ermC基因取代pSB322上的四环素抗性基因(tetr)，用AvaI消化pBR322，用大肠杆菌聚合酶I的Klenow片段处理线性化载体以产生平头末端。Klenow处理之后，用HindIII消化pBR322，从tetr基因片段上纯化出大片段。质粒pSB901用SmaI消化然后用HindIII处理，然后纯化载有ermCSmaI-HindIII片段的片段。ermC基因连接于pBR322大片段以产生pSB140(图3)。
引物序列(5′ -3′) SEQ ID NO.
KK14AGCTTGCGGCCGCGTCGACCCCGGGCCATGGGGGCCCG 30KK14B AATTCGGGCCCCCATGGCCCGGGGTCGACGCGGCCGCA 31MS17GCGAAAGAAAACAACAATC 32采用PCR引物MS14(SEQ ID NO.22)和MS17(SEQ IDNO.32)从苏云金杆菌HD73菌株扩增(t)spoVBt1-1基因。使用DNA聚合酶I Klenow片段将916bp的PCR产物两端钝化，克隆到pUC18质粒的SmaI位点上。(t)spoVBt1-1对应于SEQ ID NO.1的488至1404位残基。生成的质粒叫做pSB1207(图5)。
用E.coRI和HincII限制性酶从pSB1207上分离(t)spoVBt1-1基因，并用Klenow片段钝化。用HindIII线性化pSB210，用Klenow钝化，用小牛肠道碱磷酶(CIP)脱磷酸。分离的(t)spoVBt1-1连接到线性化pSB210质粒上。生成的质粒称为pSB1209(图6)。不同的芽孢形成基因被克隆到pSB1209的ApaI和NotI位点上，并于spoVBt1位点上整合到苏云金杆菌染色体上。C.使用(m)spoVBt1-8片段的晶体基因在spoVBt1位点的染色体整合。
使用PCR技术，从苏云金杆菌HD73扩增(m)spoVBt1-8片段。使用Klenow片段，钝化0.8kb PCR产物的两个末端，于SmaI位点克隆进pUC19。生成质粒称为pSB1218(图7)。
(m)spoVBt1-8片段从pSB1218的KpnI和BamHI位点上分离。用T4DNA聚合酶钝化两个末端，在MscI位点上克隆进质粒pSB210。生成的质粒为pSB1219(图8)和pSB1220(图9)。克隆的(m)spoVBt1-8片段可以与ermC在pSB210(pSB1219)中方向相同亦可与ermC开放阅读框架(pSB1220)方向相反。编码CryIC/CryIE杂种晶体蛋白的G27基因采用下列步骤克隆进pSB1219为构建pSB210.I质粒(
图11)，将磷酯酶C plc基因加入pSB210。苏云金杆菌菌株ATCC 10792的plc基因的DNA序列从Genbank(Accession Bumber×14178)获得，由Lechher et al描述[Lechner，M.，et al.，Mol Microbiol.3621-626(1989)]采用Phos1和Phos4，用PCR法从HD73总DNA扩增plc区。
引物序列(5′-3′) SEQ ID NOPhos1GGAACGCTACATACTAGTGATAGAGTAG 33Phos4GCTTGTACACCGCAACTGTTTTCGCATG 34PCR产物克隆到pUC18的SmaI位点以构建pSB139(
图10)。plc靶区域从pSB139上以2.2kb平头末端KpI，BamHI片段分离，凝胶纯化，连接到用MscI和BamHI消化，按制造商的指导用Geneclean Kit(Bio101)纯化的pSB210上，生成的质粒称为pSB210.1(
图11)。
载有来自苏云金杆菌aizawai亚种的全型CryIA(b)基因的质粒pSB32(
图12)被ApaI和NotI切开，释出含有cryIA(b)基因的4.2kb片段。该质粒亦含有pBlueScript KS+控制cryIA(b)基因表达的cryIC启动子和cryIA(c)终止子。分离的cryIA(b)片段连接到用ApaI和NotI切开的pSB210.1上，产生含有cryIA(b)、pic、和ermC基因的pSB219(
图13)。
含有G27毒素编码区的3.9kb ApaI/NotI片段连接到来自pSB219的6.3kb ApaI/NotI片段。生成的质粒称为pSB458(
图14)。
用ApaI和NotI消化pSB458得到G27，在ApaI/NotI位点连接到pSB1219。生成的质粒叫做pSB1221(
图15)。该质粒用于当同源spoVBt1区的位点上发生突变时，经下述转化过程在同源spoVBt1区将G27整合到苏云金杆菌染色体上其它的结晶基因也被克隆在pSB1219和pSB1220的ApaI和NotI位点，并且接着当在该位点发生突变时，被在同源的spoVBt1区被整合入苏云金杆菌染色体中。D.苏云金杆菌的转化为制备感受态HD73和W4D23苏云金杆菌细胞，菌株于37℃，300rpm于50ml BHIS培养基(50％脑心浸出液肉汤，50％1M蔗糖)中生长。至OD600值为0.2-0.3。W4D23是HD73的晶体阴性衍生体。细胞连续用1体积，1/2体积，1/4体积冰冷HEPES/蔗糖溶液洗涤。最后，细胞重悬于1/20体积的HEPES/蔗糖溶液。苏云金杆菌感受态细胞(40μ1用0.1cm池，200μl用0.2cm池与5-20μl DNA(2-10μg)于预冷的电极基因脉冲池中混合，在基因脉冲池穿孔仪中经电流处理。电穿孔参数为对于0.1cm池0.9kV，3μF和Ω＝600，对于0.2cm池，为1.25kV，3μF和Ω＝600。细胞立即转移到400μl或1.8ml BHIS中，于37℃，250rpm生长4小时。在此期间，载体pSB1221通过细菌染色体上同源性spoVBt1序列和整合载体之间同源性重组(单重交换)插入到染色体上。这样导致了两个spoV Bt1基因形成，每一基因位于整合DNA片段的一侧。生长4小时之后，细胞转移至含有合适抗生素的LB琼脂平板上。平板于30℃温育过夜，转化子于新鲜平板上重新划线。使用引物PG2和PG4来扩增0.3kb片段以通过PCR证实ermC的存在。通过PCR扩增的1261bp片段证实pSB1221整合到spoVBt1染色体基因座上，这一片段产生于不包含在pSB1221整合载体之内的spoVBt1的上游部分和pSB1221的pBR322之间，其中前者采用MS12A引物，后者采用pBR4引物。结果表明晶体编码蛋白参入了苏云金杆菌染色体。
引物序列(5′-3′) SEQ ID NOPG2 GAAATCGGCTCAGGAAAAGG 35PG4 AGCAAACCCGTATTCCACG36PBR4GCACGATCATGCGCACCC 37当贮存于液体或固体细菌培养基时，生长两周之内，由pSB1221的整合引起的突变体芽孢不回复为野生型，亦不自动降解。实施例3将整合的DNA移至另一苏云金杆菌宿主普遍性转导通过重源性重组，在供体菌株的整合载体的DNA片段和受体菌株染色体中二者的同源性片段之间发生整合。含有整合载体的供体菌株于30℃，10ml LB Ery5平板上生长过夜(16-18小时)。大约100ml过夜培养物用于接种10ml含0.4％甘油的LB培养基。培养物于30℃，300rpm温育至OD600为1-2。为用噬菌体CP-51＋S45(从Dr.CurtisB.Thorne，University of Massachusetts at Amherst处获得)感染细胞，不同量的噬菌体裂解液，从1×105至5×106空斑形成单位(PFU)，加进已于50℃预平衡的3ml噬菌体(PA)软琼脂(0.8％营养肉汤，0.5％NaCl，0.02％MgSO4·7H2O，0.015％CaCl2·2H2O，pH6.0，0.5％Bacto Agar)中的2×107细胞之中，凝固后，于30℃温育16小时。上层琼脂，在其细胞层上有数百个空斑，将其收集在3至6mlPA培养基中。噬菌体裂解液于16℃保存3-4小时，离心(4,000xg，5分钟，16℃)，上清液用0.45μm滤器(UMR Scientific)过滤除菌。噬菌体裂解液于16℃长期贮存。噬菌体裂解液滴度约为1×109至1×1010PFU/ml。
就普遍性转导而言，G27杀虫基因，红霉素标志基因和spoVBt1-8移至正常情况下含有CryIA(c)，IA(b)和IA(c)基因的BtKurstaki的未突变染色体基因座上。受体菌株于10ml LB中，在30℃生长16-18小时，用2-3ml过夜培养物接种200ml LB，于30℃，300rpm生长至1OD600。离心细胞(7,520xg，4℃，15分钟)以大约2×109菌落形成单位(CFU)/1ml浓度重悬于LB(约浓度100倍)。转导混合物，约含有8×108受体细胞和来自噬菌体裂解液的4.9×108至8×108PFU，于37℃，250rpm温育30分钟。细胞/噬菌体悬液铺于HA Millipore膜上(Millipore Corporation，Bedford MA)，放在含Ery0.15LB平板上，37℃温育3-4小时，然后将膜转移到含Ery5的LB平板上，37℃温育18-20小时，使用上述PCR方法，及镜检改变的芽孢表型，证实转导的分离物。每一分离物的蛋白质的量用SDS Page以及针对T.ni和S.exigua的生物测试确定。显示出分离物产生了135Ka杀虫晶体蛋白。
序列表(1)普通资料(i)申请者Shahabi Reynoso，MitraYamamoto，TakashiCooper，Nicole H.
Kalman，Sue S.
(ii)发明题目苏云金杆菌芽孢形成基因(iii)序列号37(iv)通讯地址(A)地址SANDOZ AGRO， INC。
(B)街道975 California Avenue(C)城市Palo Alto(D)州CA(E)国家USA(F)邮编94304(v)计算机可读形式(A)介质类型Floppy disk(B)计算机IBM PC compatible(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(vi)目前申请资料(A)申请号US(B)提交日(C)分类(viii)律师/代理人信息(A)姓名Marcus-Wyner，Lynn(B)注册号34,869(C)文献/案卷号133-0724(ix)电信信息(A)电报415/354-3588(B)电传415/857-1125(2)SEQ ID NO1资料
(i)序列特征(A)长度1662碱基(B)类型核酸(C)股型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假想序列非(iv)反义链非(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位于474..1427(D)其他资料/密码子－起始＝474(xi)序列描述SEQ ID NO1CAGGTGAAAT GAAATCTTCG TTACGAAGTG TACGGTCTGG TTGAATAGAT ATCTCCATAT60TTTTCAATGG ATTAGGAATG TTTAGAAAAT GATGCATTCT ATTTAGTACA ATAAATACAC120GATGCATCGT TTTTTCTGAG TAATGTCGAT TCGTTTTAAA TCGGAAAAGT AATCTTCGTA180GTCTTTTGTA CAAAGTGTAG CCCATATATT ACTGGAAGGG AGCTTTTTGT TTTTTTCTAA240CCAATGTCCG AAGTCTTCAA CGTCATAAAC ATAACGTTTA ATAGTTGAGG GTTTTCGGCC300TTTATTCAAT AAAAAAATAG AAAAGGCTTG TATTGTATCA TGGAATTCCG TTGTCTCCAT360AGTCCCACCA CCTTAATTAT TTCTTATATT ATAGCAAACT TTTCTGAAAA TAGGCATTTA420CAAGGGGGAC AGGAATAATA ATATTTGGTG AGTGGATAAA ATGAGGTGAT TGT ATG 476Met1GAA CAA TCG ATG CGA AAG AAA AAC AAC AAT CAA ATT AAT ATT GTG TTA 524Glu Gln Ser Met Arg Lys Lys Asn Asn Asn Gln Ile Asn Ile Val Leu5 10 15AAC CAT CGA AAG AAA ATT TCT TTG CCA GCC GCA GAA AAT AAA ACG GTA 572Asn His Arg Lys Lys Ile Ser Leu Pro Ala Ala Glu Asn Lys Thr Val20 25 30ATT TCA AAT GAA ACT GCA ATT AAA CAT GAA ATG CTG CAG AGA ATT GAA 620Ile Ser Asn Glu Thr Ala Ile Lys His Glu Met Leu Gln Arg Ile Glu35 40 45GAA GAG ATG GGG AAG CTT GTT GGG ATG GAT GAT ATA AAA AAG ATA ATA 668Glu Glu Met Gly Lys Leu Val Gly Met Asp Asp Ile Lys Lys Ile Ile50 55 60 65AAA GAA ATA TAT GCT TGG ATT TAT GTG AAT AAA AAA AGA CAA GAG AAG 716Lys Glu Ile Tyr Ala Trp Ile Tyr Val Asn Lys Lys Arg Gln Glu Lys70 75 80GGA TTG AAG TCA GAG AAG CAA GTA CTT CAT ATG CTG TTT AAA GGG AAT 764Gly Leu Lys Ser Glu Lys Gln Val Leu His Met Leu Phe Lys Gly Asn85 90 95CCA GGT ACA GGG AAG ACA ACT GTT GCT AGA ATG ATA GGG AAA TTG CTG 812Pro Gly Thr Gly Lys Thr Thr Val Ala Arg Met Ile Gly Lys Leu Leu100 105 110TTT GAG ATG AAT ATT CTA TCG AAA GGC CAC TTG GTT GAA GCT GAA CGT 860Phe Glu Met Asn Ile Leu Ser Lys Gly His Leu Val Glu Ala Glu Arg115 120 125GCT GAT CTT GTA GGA GAG TAC ATC GGC CAT ACA GCT CAA AAA ACA AGA 908Ala Asp Leu Val Gly Glu Tyr Ile Gly His Thr Ala Gln Lys Thr Arg130 135 140 145GAC TTA ATA AAA AAA GCA ATG GGA GGT ATT TTG TTT ATT GAT GAG GCG 956Asp Leu Ile Lys Lys Ala Met Gly Gly Ile Leu Phe Ile Asp Glu Ala150 155 160TAT TCT TTA GCT CGA GGA GGA GAG AAG GAC TTT GGA AAA GAA GCA ATT 1004Tyr Ser Leu Ala Arg Gly Gly Glu Lys Asp Phe Gly Lys Glu Ala Ile165 170 175GAT ACG CTT GTA AAA CAT ATG GAA GAT AAA CAA CAT GGT TTT GTA TTG 1052Asp Thr Leu Val Lys His Met Glu Asp Lys Gln His Gly Phe Val Leu180 185 190ATT TTA GCT GGA TAT TCA AGA GAG ATG AAT CAC TTT CTT TCA TTA AAT 1100Ile Leu Ala Gly Tyr Ser Arg Glu Met Asn His Phe Leu Ser Leu Asn195 200 205CCA GGG CTG CAA TCT CGT TTT CCA TTT ATT ATT GAA TTT GCG GAT TAC 1148Pro Gly Leu Gln Ser Arg Phe Pro Phe Ile Ile Glu Phe Ala Asp Tyr210 215 220 225TCG GTA AAT CAG TTG TTG GAA ATT GGG AAA AGA ATG TAT GAA GAT CGT 1196Ser Val Asn Gln Leu Leu Glu Ile Gly Lys Arg Met Tyr Glu Asp Arg230 235 240GAA TAT CAG TTA TCG AAA GAG GCT GAA TGG AAA TTT AGG GAT CAT TTA 1244Glu Tyr Gln Leu Ser Lys Glu Ala Glu Trp Lys Phe Arg Asp His Leu245 250 255CAT GCT GTA AAG TAT TCG TCG CAA ATT ACA TCG TTT AGT AAT GGG CGG 1292His Ala Val Lys Tyr Ser Ser Gln Ile Thr Ser Phe Ser Asn Gly Arg260 265 270TAT GTA CGG AAT ATT GTT GAA AAA TCA ATT CGT ACA CAG GCG ATG CGG 1340Tyr Val Arg Asn Ile Val Glu Lys Ser Ile Arg Thr Gln Ala Met Arg275 280 285TTG TTG CAA GAA GAT GCC TAT GAT AAA AAT GAT TTA ATT GGA ATA TCG 1388Leu Leu Gln Glu Asp Ala Tyr Asp Lys Asn Asp Leu Ile Gly Ile Ser290 295 300 305AGT ATG GAT TTG ATG CTC GAA GAG GAG ACG CAC AGT ACA TAAACTGTGC 1437Ser Met Asp Leu Met Leu Glu Glu Glu Thr His Ser Thr310 315GTCGATTTTT GTGTATAAGT TCGTTTACTC TTTTTTTTCT TTTTCTTGGT GTACTTCATG 1497GAAGTGTTCC ATTTTAGCGC TCTTTTCGTG TGCTGAATTA GGATCGTGTC CAAATTGATT 1557TACTGAGCTT TTTTGAGCTC CTTTATTAAC GTGGTTTGTC ATTTGTATTC ACCTCACTTT 1617AAAAATTAGT ATAAACATTA TATAAAGAAA AAATCGTTAG AAAGA 1662(2)SEQ ID NO2资料(i)序列特征(A)长度318氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Glu Gln Ser Met Arg Lys Lys Asn Asn Asn Gln Ile Asn Ile Val1 5 10 15Leu Asn His Arg Lys Lys Ile Ser Leu Pro Ala Ala Glu Asn Lys Thr20 25 30Val Ile Ser Asn Glu Thr Ala Ile Lys His Glu Met Leu Gln Arg Ile35 40 45Glu Glu Glu Met Gly Lys Leu Val Gly Met Asp Asp Ile Lys Lys Ile50 55 60Ile Lys Glu Ile Tyr Ala Trp Ile Tyr Val Asn Lys Lys Arg Gln Glu65 70 75 80Lys Gly Leu Lys Ser Glu Lys Gln Val Leu His Met Leu Phe Lys Gly85 90 95Asn Pro Gly Thr Gly Lys Thr Thr Val Ala Arg Met Ile Gly Lys Leu100 105 110Leu Phe Glu Met Asn Ile Leu Ser Lys Gly His Leu Val Glu Ala Glu115 120 125Arg Ala Asp Leu Val Gly Glu Tyr Ile Gly His Thr Ala Gln Lys Thr130 135 140Arg Asp Leu Ile Lys Lys Ala Met Gly Gly Ile Leu Phe Ile Asp Glu145150 155 160Ala Tyr Ser Leu Ala Arg Gly Gly Glu Lys Asp Phe Gly Lys Glu Ala165 170 175Ile Asp Thr Leu Val Lys His Met Glu Asp Lys Gln His Gly Phe Val180 185 190Leu Ile Leu Ala Gly Tyr Ser Arg Glu Met Asn His Phe Leu Ser Leu195 200 205Asn Pro Gly Leu Gln Ser Arg Phe Pro Phe Ile Ile Glu Phe Ala Asp210 215 220Tyr Ser Val Asn Gln Leu Leu Glu Ile Gly Lys Arg Met Tyr Glu Asp225 230 235 240Arg Glu Tyr Gln Leu Ser Lys Glu Ala Glu Trp Lys Phe Arg Asp His245 250 255Leu His Ala Val Lys Tyr Ser Ser Gln Ile Thr Ser Phe Ser Asn Gly260 265 270
Arg Tyr Val Arg Asn Ile Val Glu Lys Ser Ile Arg Thr Gln Ala Met275 280 285Arg Leu Leu Gln Glu Asp Ala Tyr Asp Lys Asn Asp Leu Ile Gly Ile290 295 300Ser Ser Met Asp Leu Met Leu Glu Glu Glu Thr His Ser Thr305310 315(2)SEQ ID NO3资料(i)序列特征(A)长度30碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO3GGCTTTCGCT ACCTGGAGAG ACGCGCCCGC 30(2)SEQ ID NO4资料(i)序列特征(A)长度30碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO4CCAGACCAAC TGGTAATGGT AGCGACCGGC 30(2)SEQ ID NO5资料(i)序列特征(A)长度19碱基(B)类型核酸(C)股型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO5GAGAGATGTC ACCGTCAAG 19(2)SEQ ID NO6资料(i)序列特征(A)长度18碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO6CCCTGTACCT GGATTCCC 18(2)SEQ ID NO7资料(i)序列特征(A)长度18碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO7GGGAATCCAG GTACAGGG 18(2)SEQ ID NO8资料(i)序列特征(A)长度19碱基(B)类型核酸
(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO8CCATCCCAAC AAGCTTCCC 19(2)SEQ ID NO9资料(i)序列特征(A)长度19碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO9GGGAAGCTTG TTGGGATGG 19(2)SEQ ID NO10资料(i)序列特征(A)长度20碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO10CCTGTCCCCC TTGTAAATGC 20(2)SEQ ID NO11资料(i)序列特征(A)长度20碱基
(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO11GCATTTACAA GGGGGACAGG 20(2)SEQ ID NO12资料(i)序列特征(A)长度21碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO12CGCCGTCTAC TTACAAGCAG C21(2)SEQ ID NO 13资料(i)序列特征(A)长度18碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO13GGTGGTGGGA CTATGGAG18(2)SEQ ID NO14资料(i)序列特征
(A)长度18碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO14CTCCATAGTC CCACCACC 18(2)SEQ ID NO15资料(i)序列特征(A)长度18碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO15CGAGGAGGAG AGAAGGAC 18(2)SEQ ID NO16资料(i)序列特征(A)长度17碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO16GTCCTTCTCT CCTCCTC17(2)SEQ ID NO17资料(i)序列特征(A)长度12碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构；线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO17CACGATGCAT CG 12(2)SEQ ID NO18资料(i)序列特征(A)长度12碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO18CACGATGCAT CG 12(2)SEQ ID NO19资料(i)序列特征(A)长度17碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO19CGAAAGAGGC TGAATGG17(2)SEQ ID NO20资料(i)序列特征(A)长度15碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO20GGGCGGTATG TACGG 15(2)SEQ ID NO21资料(i)序列特征(A)长度15碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO21CCGTACATAC CGCCC 15(2)SEQ ID NO22资料(i)序列特征(A)长度25碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非
(xi)序列描述SEQ ID NO22GCATCAAATC CATACTCGAT ATTCC25(2)SEQ ID NO23资料(i)序列特征(A)长度21碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO23CGAGTATGGA TTTGATGCTC G21(2)SEQ ID NO24资料(i)序列特征(A)长度20碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO24GGACACGATC CTAATTCAGC 20(2)SEQ ID NO25资料(i)序列特征(A)长度20碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非
(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO25GCTGAATTAG GATCGTGTCC 20(2)SEQ ID NO26资料(i)序列特征(A)长度38碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO26GATGTGATTG TAAGGAACAA TCGAAGCGAT AGAAAAAC(2)SEQ ID NO27资料(i)序列特征(A)长度32碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO27GATCTTGTAT GAGAGTAAAT CGGCCATACA GC 32(2)SEQ ID NO28资料(i)序列特征(A)长度32碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA
(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO28GCTGTATGGCCGATTTACTC TCATACAAGC TC32(2)SEQ ID NO29资料(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO29CTATACAGCA TGTTAATGAT CCC 23(2)SEQ ID NO30资料(i)序列特征(A)长度38碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO30AGCTTGCGGC CGCGTCGACC CCGGGCCATG GGGGCCCG 38(2)SEQ ID NO31资料(i)序列特征(A)长度38碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO31AATTCGGGCC CCCATGGCCC GGGGTCGACG CGGCCGCA 38(2)SEQ ID NO32资料(i)序列特征(A)长度20碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO32GCGAAAGAAA AACAACAATC 20(2)SEQ ID NO33资料(i)序列特征(A)长度28碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO33GGAACGCTAC ATACTAGTGA TAGAGTAG 28(2)SEQ ID NO34资料(i)序列特征(A)长度28碱基(B)类型核酸(C)股型单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO34GCTTGTACAC CGCAACTGTT TTCGCATG 28(2)SEQ ID NO35资料(i)序列特征(A)长度20碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型 CDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO35GAAATCGGCT CAGGAAAAGG 20(2)SEQ ID NO36资料(i)序列特征(A)长度19碱基(B)类型核酸(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型 CDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO36AGCAAACCCG TATTCCACG 19(2)SEQ ID NO37资料(i)序列特征(A)长度18碱基(B)类型核酸
(C)股型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想序列非(iv)反义链非(xi)序列描述SEQ ID NO37GCACGATCAT GCGCACCC 18
权利要求
1.分离的spoV DNA序列，它选自i)具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的spoVBt基因；ii)编码SEQ ID NO.2所述苏云金杆菌芽孢形成蛋白的核苷酸序列；iii)编码与SEQ ID NO.2所述蛋白基本一致之苏云金杆菌芽孢形成蛋白之核苷酸序列；iv)在严格杂交条件下，与i)、ii)、iii)之序列的互补链杂交的核苷酸序列，和v)上述i)、ii)、iii)、或iv)之截短核苷酸序列，其中所述截短序列包括至少300个核苷酸。
2.DNA片段，它包含权利要求1的spoV DNA序列和编码至少一种杀虫晶体蛋白的DNA序列。
3.权利要求2的DNA片段，它进一步包含来自革兰氏阴性菌的复制起点和选择性标志。
4.权利要求2的DNA片段，其中DNA序列编码杂种毒素蛋白，其中所述杂种蛋白包含两或三个不同的晶体编码毒素的结构域。
5.一种制备转化苏云金杆菌宿主的方法，该宿主表达一至三个外源晶体蛋白编码基因，包括(a)根据权利要求2获得DNA片段，(b)将所述片段导入苏云金杆菌宿主，(c)使DNA片段和芽孢形成基因的基本同源核苷酸片段在宿主苏云金杆菌染色体上发生同源重组，其中DNA片段稳定地整合到苏云金杆菌宿主染色体上；和，(d)分离稳定转化的苏云金杆菌转化体其中所述稳定转化的苏云金杆菌能够产生外源晶体蛋白。
6.杀虫剂组合物，包含按权利要求5制备的杀虫有效量的苏云金杆菌。
7.分离的突变的spoV DNA序列，它选自i)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；ii)编码SEQ ID NO.2所述苏云金杆菌芽孢形成蛋白的核苷酸序列；iii)编码与SEQ ID NO.2所述蛋白基本一致之苏云金杆菌芽孢形成蛋白之核苷酸序列；iv)在严格杂交条件下，与i)、ii)、iii)之序列的互补链杂交的核苷酸序列，和v)上述i)、 ii)、iii)、或iv)之截短核苷酸序列，其中所述核苷酸序列之截短部分包含至少300个核苷酸。其中，上述i)、 ii)、iii)、iv)或v)之核苷酸序列具有一个或多个点突变、插入或缺失。
8.DNA片段它包含权利要求7的突变spoV DNA；以及一至三种杀虫晶体蛋白编码基因。
9.DNA片段，它包含权利要求7的突变spoV DNA；晶体蛋白编码基因；以及来源于革兰氏阴性菌的复制起点。
10.制备具有突变体芽孢的杀虫晶体蛋白产生苏云金杆菌菌株的方法，包含(a)根据权利要求9获得DNA片段，(b)将所述片段导入芽孢形成苏云金杆菌宿主，(c)使DNA片段和芽孢形成基因的基本同源核苷酸片段在宿主苏云金杆菌染色体上发生同源重组，其中DNA片段包含突变spoV DNA序列，稳定地整合到苏云金杆菌宿主染色体上；和，(d)分离稳定转化的苏云金杆菌转化体其中所述稳定转化的苏云金杆菌产生突变体芽孢而且能够产生外源晶体毒素蛋白。
11.杀虫剂组合物，包含按权利要求10制备的、杀虫有效量的苏云金杆菌。
12.权利要求5的方法，进一步包含转导已转化的苏云金杆菌宿主，包含a)将苏云金杆菌宿主用转导噬菌体处理；b)让噬菌体在宿主苏云金杆菌中复制，其中，已整合在宿主染色体上的一至三个外源晶体蛋白编码DNA序列参入噬菌体中；和c)将外源晶体蛋白编码DNA序列从噬菌体导入受体苏云金杆菌其中，所述导入的外源晶体蛋白编码DNA序列稳定地参入受体苏云金杆菌染色体，并且在所述受体中表达。
13.权利要求7的方法，进一步包含转导已转化的苏云金杆菌宿主，包含a)将苏云金杆菌宿主用转导噬菌体处理；b)让噬菌体在宿主苏云金杆菌中复制，其中，已整合在宿主染色体上的突变的spoV DNA序列以及一至三个外源晶体蛋白编码DNA序列参入噬菌体中；和c)将外源晶体毒素编码DNA序列从噬菌体导入受体苏云金杆菌其中，突变的spoV DNA序列以及所述外源晶体蛋白编码DNA序列稳定地参入受体苏云金杆菌染色体，并且在所述受体中表达外源晶体蛋白，其中，受体产生突变体芽孢。
14.一种方法，它应用苏云金杆菌染色体芽孢形成基因片段作为DNA片段的染色体整合的座位，所述片段包含一个至三个杀虫晶体蛋白编码基因，其中所述基因稳定地整合到苏云金杆菌染色体上。
全文摘要
本发明涉及从苏云金杆菌分离的新的芽孢形成基因，以及DNA片段，包含编码基因的核酸序列和编码晶体毒素蛋白的DNA序列，其中所述DNA片段通过同源性重组稳定地整合到苏云金杆菌宿主中。本发明进一步涉及DNA片段，其中芽孢形成基因是突变的因而作为DNA片段通过同源性重组稳定地整合到苏云金杆菌染色体的结果，造成了寡产芽孢的或不产芽孢的转化苏云金杆菌。
文档编号A01N63/00GK1160765SQ96111770
公开日1997年10月1日 申请日期1996年8月29日 优先权日1996年8月29日
发明者N·H·库帕, S·S·卡尔曼, M·S·雷诺索, T·山本 申请人:山道士有限公司