专利名称：无融合生殖玉米的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及通过将无融合生殖机制由野生植物种转移到栽培植物中形成不分离杂种而得到的纯育植物。更具体而言，本发明涉及无融合生殖的玉米和无融合生殖的玉米/磨擦禾杂种。本发明也涉及控制无融合生殖的遗传因子、含有控制无融合生殖的遗传因子的载体、用这些遗传因子产生不分离的植物子代的方法和可用于鉴定与无融合生殖关联的遗传因子的核酸序列。
植物的生殖通常划分为有性和无性。无融合生殖通常被认为是通过各种无性生殖形式代替有性生殖(Rieger等，1976)。无融合生殖是植物生殖的遗传控制方法，其中胚胎形成无需卵子和精子核的结合。有三种基本的无融合生殖类型1)无孢子生成的胚胎由珠心来源的胚囊中染色体未减数的卵子发育而来，2)二倍孢子形成的胚胎由未减数的大孢子母细胞来源的胚囊中的卵子发育而来，和3)不定胚生殖的胚胎直接由体细胞发育而来。在多数无融合生殖形式中，极核的假配合或受精产生胚乳对种子活力是必需的。专性无融合生殖体据信具有完全封闭的重组系统；即，重组仅发生于小孢子发生过程中，大孢子发生过程中不发生重组。在兼性无融合生殖体中，无性和有性生殖方式共存。
前述无融合生殖类型具有经济潜力，因为它们能使无论怎样杂合的任何基因型的生物繁殖时不分离。它是一种规避了雌性减数分裂和配子配合而产生遗传上完全等同于母本的胚胎的生殖过程。通过无融合生殖，特殊适应的或杂种基因型生物的子代在重复的生命周期中都会保持其遗传忠实性。除了保持杂种活力，无融合生殖还使生产杂种所需的有效雄性不育或育性恢复系统尚为未知或尚未建立的作物的商用杂种生产成为可能。此外，无融合生殖还可增加具有畸形或不利的染色体结构的植物的生殖能力。
无融合生殖无需多步杂交而使得杂种育成更为有效。它也简化了杂种的生产，增加了具有良好的雄性不育系的植物的遗传多样性。它用来寻找控制栽培种中专性或高水平无融合生殖的基因是理想的，并能方便地进行杂交亲和的有性×无融合基因型的杂交产生不分离的F1杂种。实际上，多数理想的控制无融合生殖的基因发现于野生种，它们与栽培种关系较远。尽管栽培和野生种之间的种间杂交也是可能的，但基因组间染色体配对通常较少或不存在。
无融合生殖的典型情况存在于多倍体草中(Harlan等，1964；Connor，1979；Bashaw等，1990a；Asker等，1992；Koltunow，1993；)，鸭茅状磨擦禾(Tripsacum dactyloides(L.)L.)也不例外。鸭茅状磨擦禾是玉米(Zea mays L.)的远亲，为兼具有性和无性生殖形式的多年生疏丛性禾本科牧草。在二倍体水平上(2n＝2x＝36)，主要见到的是有性生殖，而在三倍体(2n＝3x＝54)和四倍体(2n＝4x＝72)水平上，二倍孢子形成的无融合生殖占优势(Brown等，1958；Burson等，1990；Sherman等，1991)。无融合生殖的鸭茅状磨擦禾中胚囊发育机制的特征在于蝶须属型的二倍孢子假配合(Brown等，1958；Burson等，1990；Leblanc等，1995)。在该系统中，极核和卵子的双受精不会发生。极核的受精刺激未减数卵细胞的无性发育。
小麦、水稻、高粱和玉米是提供世界上大多数食物来源的主要作物种。已有人提出发展这些禾本科作物的无融合生殖形式对发展中国家的食物安全会提供主要的贡献(Wilson等，1992)。农业社会中特别感兴趣的是实现杂种玉米的有效水平的无融合生殖。达到该目标可使世代连续无限，维持F1杂种具有的杂种活力、抗病性和其它遗传特性的原始水平，从而使世界上的玉米种植区中该谷类作物的使用和生产大大改变。现有技术的说明磨擦禾首先由Mangelsdorf等(1931)实现与玉米杂交。其它研究也证实了产生这两个种间的可育杂种的可能性(Mangelsdorf等，1939；Galinat，1973)。其他研究人员进行的研究进一步提示将磨擦禾种质渐渗至玉米中的可能性(Maguire，1961，1962；Reeves等，1964；deWet等，1972；Simone等，1976；Bergquist，1981；Cohen等，1984)。Petrov及其同事提出了将控制无融合生殖的基因由磨擦禾转移至玉米中以形成不分离杂种的可能性(Petrov，1957；Petrov等，1984a)，并报道了成功的结果(Petrov等，1984b)；遗憾的是，对这些材料的遗传学研究(Yudin等，1989)否定了这些发现。
在经典的玉米/磨擦禾//玉米回交方案中，一旦得到56条染色体(20玉米+36磨擦禾)或38条染色体(20玉米+18磨擦禾)水平，通常会在无融合生殖中发生部分或全部丢失(deWet等，1974)。在该水平或该水平之上甚至只是部分表达无融合生殖的材料也可用于进一步研究，并可能作为尝试使无融合生殖渐渗至玉米中的候选者。
让有性生殖的个体与无性生殖的个体互交已成功地用于阐明禾本科中几个种的无融合生殖机制。Harlan等(1964)运用孔颖草属和双花草属的有性×有性、有性×无融合生殖和无融合生殖×有性来源的胚胎学和杂交研究，提出了一种双基因座系统来解释这些种中无融合生殖的遗传性。无融合生殖体中无融合生殖基因被认为是杂合的，无融合生殖对有性生殖来说是显性的。有性二倍体的基因型怀疑为a1 a1 a2 a2，而四倍体基因型为A1 A1 a1 a1 A2 A2 a2 a2。此外，已发现两个基因座之间平衡的基因型关系。在雀稗属中，Burton等(1960)通过产生有性四倍体探讨了无融合生殖的遗传控制。在该方案中，有性四倍体与专性的无性四倍体杂交，随后产生有性的同源四倍体。对该数据的分析表明，无融合生殖由一些隐性基因控制。
Hanna等(1973)通过将大黍(Panicum maximum)天然存在的有性四倍体与天然存在的四倍体无融合生殖体互交并评价其子代，提出在该物种当中，无融合生殖相对有性生殖是隐性的，生殖方式可能由至少两个基因座控制。
利用有性和无性的玉米/磨擦禾杂种进行的研究已预言了杂合的双基因系统(Petrov等，1978，1979)。一套基因控制卵子的非减数作用(N)，而另一套控制卵子的无性(单性)发育(A)。提出的无融合生殖的四倍体磨擦禾的基因组成为N N n n A A a a。基于在无融合生殖的56染色体(20玉米+36磨擦禾)和无融合生殖的38染色体(20玉米+18磨擦禾)玉米-磨擦禾回交杂种中观察到的分离，推测两套基因是连锁的(Petrov等，1978，1979)。未提出有性二倍体的基因组成。近来Kindiger和Dewald(未发表)对一套鸭茅状磨擦禾三倍体的有性和无性生殖系统的分离进行的研究，也提示无融合生殖由两个显性基因控制。
尽管有将无融合生殖性状引入正常有性作物的需求，并且已有一些使栽培种与关系较远的野生种杂交的成功的例子，迄今为止，还未实现使无融合生殖渐渗入有性作物。在很多情况下，这种努力由于不能得到相关的无融合生殖的野生型或无法实现栽培品种和野生型的杂交而遇到障碍。Asker(1992)报道将无融合生殖性状引入小麦、大麦、高粱、甜菜、玉米和许多其它作物的努力大多以失败告终。
到现在为止，有关无融合生殖的最成功的方案是将控制无融合生殖的基因由狼尾草属野生种转移到栽培种之中(Dujardin，1983，Dujardin等，1989)。与珍珠稗的种间杂 种通常是高度雄性不育的。然而，无融合生殖的杂种中，产生可育花粉的正常雄性减数分裂通常是继续杂交的前提，因为无融合生殖的固有特性是缺乏减数分裂过的减数(即重组)的雌性配子。通过提高诱导的四倍体珍珠稗(2n＝4x＝28)，野生的无融合生殖的种P.squamulatum Fresen(2n＝6x＝54)和象草(P.purpureum Schum)(2n＝4x＝28)之间产生的复合杂种的雄性不育性，渐渗珍珠稗中的无融合生殖基因已获得了进展(Dujardin等，1989，本文引作参考)。Maxon等(1989)也报道，以无性可传递的雄性不育因子(AMS载体)处理植物使无融合生殖现象转移至有性种(大豆)中也取得了一些进展。
发明概述我们已成功地证实无融合生殖机制可由野生种转移到主要的栽培种背景中，以提供以无性发育为特征的纯育植物。具体来说，我们已产生了其玉米染色体所占比例较现有技术迄今报道比例更高的无融合生殖的玉米/磨擦禾杂种。本发明范围内的杂种的玉米染色体∶磨擦禾染色体的比例为至少30∶9。示出了包括30-70个玉米染色体和9个磨擦禾染色体的核型，其中包括带有无融合生殖基因的磨擦禾16号染色体长臂易位至玉米6号染色体长臂的核型。具30个玉米(Zea mays)染色体和9个磨擦禾染色体的代表性杂种已于1995年7月27日保藏于ATCC，美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland 20852 USA，ATCC登记号为97233。
根据本发明的目的，即使无融合生殖渐渗至通常通过有性生殖繁殖自身的植物中，我们已成功地产生了玉米/磨擦禾杂种，它们在基因型上较现有技术中已知的杂种更像玉米。这些杂种所含的显性遗传物质使杂种规避有性生殖过程，而代之以无融合生殖形式，即通常所称的蝶须属型二倍孢子形成的无融合生殖。
本发明的另一目的是提供具有来自磨擦禾的9个染色体和30-70个玉米染色体的一套染色体的玉米，其具有二倍孢子形成的无融合生殖能力。这些植物可用作育种库，以产生具有更高比例的玉米染色体并减少磨擦禾染色体数量的无融合生殖的杂种。
本发明的再一个目的是提供建立专性无融合生殖的玉米的永生化商业品系的基础，该玉米具有稳定的遗传特征，而无需通过与选定亲本品系的多步或重复杂交连续生产杂种种子。
本发明的又一个目的是提供一系列用于分析玉米/磨擦禾杂种的无融合生殖行为的DNA标记。
本发明的再一个目的是提供决定和控制二倍孢子形成的无融合生殖的基因，以及根据基因与分子标记的关联提供基因与特定的分子连锁群的相应关系，并根据细胞遗传和分子研究提供基因在特定染色体上的定位。
最后，本发明的目的是提供可以通过经典的植物育种方法、细胞和组织培养方法和/或植物转化和遗传工程技术将所需基因引入玉米以及其它植物种的遗传物质，随后这些植物可以通过克隆选择、再生和繁育，形成能够进行二倍孢子形成的无融合生殖的个体。
本发明其它目的和优点由以下叙述显而易见。
种子的保藏包括含有30个玉米染色体和9个鸭茅状磨擦禾染色体的杂种的至少2500粒种子的样品代表本文所称的V162家族，于1995年7月27日根据布达佩斯条约的规则保藏于美国典型培养物保藏中心，12301Parklawn Drive，Rockville，MD 20852，并已给予登记号ATCC97233。
附图简述
图1表示用来发展与无融合生殖关联的RAPD标志的五个家族间的一般谱系/关系。
图2表示玉米第6号染色体的相对分子图，包括玉米和部分同源的磨擦禾连锁群。
图3比较了磨擦禾16号染色体，玉米6号染色体和Mz6L-Tr16L易位，并给出了关联的RAPD引物和RFLP标记。
术语无融合生殖以各种无性生殖形式代替有性生殖。专性无融合生殖体据信具有完全封闭的重组系统，而在兼性无融合生殖体中，无融合生殖和有性生殖方式共存。
BIII杂种由未减数的卵子(2n)与减数的精核(n)融合产生的个体。
二倍孢子的假配合极核由精子受精从而刺激未减数的卵细胞的无融合生殖发育。
连锁群位于任一染色体上的基因或分子标记的顺序排列。
减数分裂与有性生殖关联的一种核分裂类型，由一个二倍体细胞产生四个单倍体细胞，其过程包括两轮分裂。减数分裂用来使染色体数目减半，从而防止每一代中发生染色体加倍，并通过独立的分配和重组在子细胞中产生遗传物质的混合。
Mz6L-Tr16L-随体(或Mz6L-Tr16L)染色体磨擦禾16号染色体(Tr16)长臂易位至玉米第6号染色体长臂末端形成的染色体。
多胚性在单个胚珠内有几个胚胎发育；一个合子形成一个以上胚胎，如同卵双生。
RAPD随机扩增多态DNA。
RFLP随机片段长度多态性。
发明详述遗传模型作为理解无融合生殖由鸭茅状磨擦禾渐渗至玉米中的机制的基础，我们已建立了一个磨擦禾中无融合生殖因子的遗传和分离的遗传模型。若不囿于任何特定理论，此处提出该模型作为理解本发明以下叙述的上下文。提出的遗传模型及鸭茅状磨擦禾中无融合生殖遗传的基因型组合于以下表I中提供。
表I由有性二倍体×无融合生殖四倍体杂交产生的三倍体鸭茅状磨擦禾杂种中无融合生殖因子的遗传和分离模型基因组成a预计频率 母本育性 生殖方式N N n A A a1 3高育性三倍体 无融合生殖N n n A A a2中等育性三倍体 无融合生殖n n n A A a1不育 有性生殖N N n A a a2几乎完全不育，＞99％ 有性生殖N n n A a a4几乎完全不育，＞99％ 有性生殖n n n A a a2 13 不育 有性生殖N N n a a a1不育 有性生殖N n n a a a2不育 有性生殖n n n a a a1不育 有性生殖a 三倍体由有性二倍体(n n a a)与无融合生殖四倍体(N N n n A A aa)杂交产生。
该模型包括假设具有以下特性的两个独立分离的基因座(I)N为非减数作用的显性等位基因；(II)A为控制未减数的卵子无融合生殖发育(孤雌发育)的显性等位基因；(III)非减数(N)和无融合生殖(N)基因是上位的和不完全显性的，因此需要两倍剂量才能必然发生卵子的非减数作用和无融合生殖发育。一倍剂量N和两倍剂量A可能会产生“渗漏”表型，其中非减数作用和可能的无融合生殖发育是偶然的，而不是经常的(极少超过40％育性)；(IV)两个基因系列(N，n和A，a)的适当剂量或平衡对高频率的无融合生殖发育是必需的要素；(V)存在两类“可育的”三倍体，并且每一类保持略微不同的基因组成(N N n A A a＝高度可育的三倍体，N n n A A a＝中度可育的三倍体)；及(VI)所有其它基因型分离产物是有性(非无融合生殖)发育(经历减数分裂)，并且由于其为三倍体而被认为是高度可育的。然而，这并非意味着表现为雌性可育的极低水平的无性发育在这一类(即N N n A a a和N n n A a a)的某些个体中极少发生。
根据表I的预测和上列参数，可以预计到13不育2中等可育1高度可育的比例。高度可育的个体应当具有N N n A A a基因型。中等可育的个体基因型为N n n A A a。不育或几乎完全不育的个体具有所有其它基因型组合。
在一项由有性二倍体(2n＝36)个体与无性四倍体(2n＝4x＝72)花粉亲本杂交产生的387个三倍体(2n＝3x＝54)杂种的研究中，该模型得以证实。同样，由有性二倍体与“合成”或BIII-来源的无性四倍体杂交产生的90个三倍体子代也以预期的13∶2∶1的比例分离。
另外，偶尔也会产生由不育的三倍体(2n+n交配)产生的BIII-来源的四倍体杂种。该模型预测这种4×BIII杂种是不育和非无融合生殖的。四个高度可育的3×杂种杂交产生4个BIII来源的四倍体，证实了上述预测。每一BIII-来源的四倍体都是高度不育的(超过99％)。
最后，有性和无性的玉米-磨擦禾杂种的细胞遗传和分子评价以及无融合生殖的玉米6L-Tr16L易位原种表明只有一个染色体臂带有赋予无融合生殖的基因。这表明等位基因N和A位于Tr16L上。
39染色体无融合生殖的玉米/磨擦禾杂种的产生在本发明工作之前，Petrov等(1984b)在俄罗斯育成了一种玉米/鸭茅状磨擦禾杂种，此后称之为H278。该杂种核型为20玉米和36磨擦禾染色体，并被用来通过与玉米回交而产生一些与H278遗传上等同的56染色体(20玉米+36磨擦禾染色体)无融合生殖的杂种。随后，利用本地的开放传粉二倍体玉米栽培种与H278回交(Petrov等，1984b)产生了具有38个染色体(20玉米+18磨擦禾)的5个个体。其中，3个个体可见产生减数分裂或有性生殖方式来源的子代。第4个个体完全不育，而第5个个体产生染色体计数为38的子代(H781)。与二倍体(2n＝2x＝20)和四倍体(2n＝4x＝40)测交玉米连续回交15代之后，由该单一个体(H781)最终产生了大量具有10-30个玉米染色体和18-36个磨擦禾染色体的个体和家族。最近对来源于H781的材料的研究已证实它们能够通过无融合生殖进行繁殖(Kindiger等，1995a)。
本发明的无融合生殖材料来源于前述的38染色体无融合生殖(20mz+18Tr)杂种，通过与二倍体和四倍体测交玉米进一步回交，并筛选58染色体的回交杂种(40Mz+18Tr)获得。该58染色体的个体是基因组聚集过程的结果，基因组聚集过程中未减数的卵子不进行无融合生殖发育，而可由精核受精，形成BIII杂种(即2n+n交配)。鉴定的58染色体杂种与二倍体测交玉米回交。由杂交产生的种子形成具有30玉米+9磨擦禾染色体的个体，如
图1谱系树最左支所示。39染色体的子代为完全有性过程的结果，而具有20Mz+9Tr染色体的未减数卵细胞由单倍体(n＝10)精核受精。这样产生了30Mz+9Tr染色体的个体。
在本文所述杂种中，有部分雄性育性的证据，这是使极核能够受精和随后产生有活力的种子的有用性状。然而，在商业育种程序中，胚乳和种子发育必需的花粉可由任何玉米花粉来源或培育的栽培种提供，花粉源种植于无融合生殖的杂种附近使得传粉能够进行。由于栽培种的未减数卵子通过孤雌生殖发育，花粉源当然不会影响无融合生殖的栽培种的遗传学。
通过前述方法已产生了几个无融合生殖的玉米/磨擦禾杂种家族。在各例中，均存在同样的9个磨擦禾染色体，即，磨擦禾染色体7、10、11、12、13、14、16、17和18。这套染色体被命名为9B系列。细胞学观察表明这9个染色体通常是正常存在于磨擦禾的18个染色体中较小的染色体。它们可通过细胞学观察或使用特定引物(如十聚体引物)进行RAPD分析获得阳性鉴定，下文实施例2中将详述所述鉴定。
根据对具有18个或9个磨擦禾染色体的植物衍生的有性和无融合生殖的个体进行RAPD研究的结果，我们已确定有性回交杂种代表了9个连锁群中的8个。这使得只有一个连锁群可能携带无融合生殖的基因。因此，结论是基因A和N位于同一个染色体上，并且在空间上距离足够远，使得它们在花粉/小孢子发育中重组后能够独立分离。因此，这些基因的特征在于非连锁。
通过研究特定的玉米/磨擦禾杂种使得无融合生殖的基因与Tr16的长臂(Tr16L)相对应。在对具有来自9B系列的40个玉米和8个磨擦禾染色体的非无融合生殖的(有性)玉米/磨擦禾杂种(V142-3)进行核型分析中，可见磨擦禾染色体组中缺Tr16，表明其必定与无融合生殖关联。其次，在具有Mz6L-Tr16L-随体染色体(易位的Tr16L，见下文讨论)的无融合生殖个体(V9)的根尖压片中，可见该植物缺少Tr16短臂，但具有易位至Mz6L远末端的Tr16L片段(见实施例4)。因此，可以得出结论无融合生殖基因必定位于Tr16的长臂(随体末端)。
一个称为V9的39-染色体无融合生殖的玉米/磨擦禾杂种来源于最初的F1杂种H278，如
图1所示。它类似于V162的衍生，但其为减数分裂的结果，产生具有10Mz+18Tr染色体的个体。V9个体的独特在于它们以Mz6L-Tr16L易位为特征，该易位由允许Mz6和Tr16的部分同源区域之间配对的部分减数分裂过程产生。该易位区别于，但也类似于Maguire(1961，1962)和Kindiger等(1990)所述玉米9号染色体的易位。带有核仁组织区(NOR)和随体的每一染色体有助于参与Mz6L-Tr16L易位的玉米和磨擦禾染色体的鉴定。经典的玉米核型表明玉米随体位于6S，而磨擦禾核型显示随体位于16L。Mz6L-Tr16L易位在有小的Tr16L区段加入的6号染色体的两个末端具有随体。参见图3和下文实施例2和3的进一步讨论。
无融合生殖体的特征本发明的杂种在无融合生殖方面具有以下特征无融合生殖的子代无融合生殖的子代可通过多种技术鉴定。大多数子代染色体数与其无融合生殖的亲本相同，只有BIII杂种例外。因此，例如39染色体个体的子代也具有39个染色体，或在BIII-杂种时为49或59个染色体。本领域中已知的标准细胞学方法可用于确定个体中的染色体数。在子代之间以及子代和亲本之间，遗传均一性是可以预见的。这种均一性可以通过例如子代检测、同工酶和分子方法确证。但是，由于BIII杂种的出现，相关的无融合生殖体的分子带型偶尔可见到差异，下文详细讨论。BIII杂种BIII杂种被定义为由未减数的卵子(2n)与减数的精核(n)融合产生的个体。在蒺藜草属(Bashaw等，1990b)、雀稗属(Burson，1992)、狼尾草属(Bashaw等，1992)及最近在磨擦禾属(Kindiger等，1994a)中，这种2n+n交配已在文献中有充分的叙述。作为鸭茅状磨擦禾中无性发育的独特生殖特征，预计如果无融合生殖的磨擦禾基因在玉米背景中具有全部功能，这种方式会在玉米-磨擦禾杂种中表现出来。BIII杂种的产生通常为相对低频出现的事件。如下文实施例2中所示，39染色体的无融合生殖体出现2n+n交配的百分比通常低于10％。在二倍体形式的磨擦禾中未见产生BIII杂种，并且预期也不会产生，因为这些植物的生殖形式为有性。多胚性鸭茅状磨擦禾中出现多胚性已由Farquharson(1955)观察到和报道。多胚性未见于有性二倍体形式，而只是磨擦禾无融合生殖形式的独特特征。尽管未进行充分的研究，推测磨擦禾中出现多个胚胎是在极核受精和未减数卵细胞的无融合生殖刺激之后(Farquharson，1955)。未减数的卵子的无融合生殖发育之后，刺激了邻近的助细胞自动发育成有活力的胚。
在磨擦禾和玉米-磨擦禾杂种中，双生体具有相同的染色体数(均为无融合生殖体)或不同的染色体数(一个为无融合生殖体，另一个为BIII来源的杂种或两者均为BIII杂种，由2n+n杂交产生)。双生和三生多胚已在磨擦禾和30Mz+9Tr无融合生殖的杂种材料中观察到。
但是，在玉米中出现多胚性不是没有先例。Kermicle(1969)在具有ig(不确定的配子体)等位基因的玉米原种中观察到多胚性，该等位基因允许玉米中形成雄核发育的单倍体。Lin(个人通讯)和Kindiger等(1993)进一步证实在额外的ig原种发育期间多胚性可以选择性降低或提高。在两种情况下，均未观察或预计到这些材料的无融合生殖。在ig的情况下，多胚性与玉米的非无融合生殖品系关联。但是，预计在无融合生殖的玉米-磨擦禾回交杂种中观察到的多胚性，真实地反映了无融合生殖基因成功地由磨擦禾转移至这些杂种中的结果，因为ig未引入玉米-磨擦禾杂种材料中。不完全减数分裂多倍体磨擦禾被认为是兼性或近于专性的无融合生殖体。因此，它具有一定水平的有性发育(即减数分裂后有精子和卵子的受精)。已有人提出，在某些表现出有丝分裂的二倍孢子形成的植物中，偶尔会发生进入减数分裂的情况，但在很早的阶段就终止了。可能是这种不完全减数分裂过程允许不改变染色体数而发生遗传改变。这种行为通常称为第一次分裂恢复，并已在无融合生殖的磨擦禾中见到(Kindiger等，1995b)。它允许产生新的重组类型，而不减少染色体数或由外部花粉源引入新的等位基因。不完全减数分裂过程的偶尔发生也见于无融合生殖的玉米-磨擦禾杂种。这种行为为无融合生殖因子由磨擦禾中成功地转移到玉米中并在玉米背景中表达该性状提供了进一步的证据。倍性相关的无融合生殖表达在磨擦禾中，已观察到由2n+n交配产生的BIII来源的五倍体(2n＝5x＝90)和六倍体(2n＝6x＝108)杂种表现出完全或近乎完全的雌性育性。因为2n+n交配中不会丢失母本基因组和无融合生殖基因，花粉亲本额外基因组的作用肯定是打破了控制无融合生殖的基因的平衡。这种行为在无融合生殖种中明显是不寻常的(Asker和Jerling，1992)。
对产生无融合生殖的38、48、58和68染色体的BIII-来源杂种的2n+n交配产生的玉米-磨擦禾BIII来源杂种的结实能力进行观察，也表明了失去结实能力的趋势。结实率从具有38染色体(20Mz+18Tr)的个体的约30％到具有58染色体(40Mz+18Tr)的个体的约5％。58染色体以上，育性基本上为零。核苷酸标记也许正如预计的那样，存在着与无融合生殖关联的独特的核苷酸序列或标记。其中，包括可通过多种试验中的任一种鉴定的控制无融合生殖的等位基因A和N的独特的标记。下文实施例2叙述了使用RAPD分析区分无融合生殖和非无融合生殖的个体。
无融合生殖进一步渐渗至玉米背景中设计了多种技术使用本文所述的30Mz+9Tr杂种作为起始材料使无融合生殖进一步渐渗至玉米背景中。当然，据信减少磨擦禾染色体套数的原材料优选具有Mz6L-Tr16L易位的材料(如来自V9家族的个体)。经典育种该方法取决于前述由原始F1杂种H278获得含有39染色体(30Mz+9Tr)的材料的策略。30Mz+9Tr材料同样可以成功地与玉米回交。2n+n交配之后，选择无融合生殖并且玉米染色体套数增加(即基因组聚集)的BIII-来源的杂种。采用该策略，可以衍生出具有49(40Mz+9Tr)、59(50Mz+9Tr)、69(60Mz+9Tr)和79(70Mz+9Tr)染色体的个体。由于玉米基因组的增加，进一步减少磨擦禾遗传物质比例是可能的。一般情况下，40-70个玉米染色体的存在或积累导致出现不频繁的有性过程，这引起磨擦禾9B系列染色体的进一步随机丢失。以这种方式可以产生具有整套玉米染色体和减少了的一套磨擦禾染色体的植物。
由于N和A基因不连锁，设想获得无融合生殖的玉米F1杂种是可能的。每一基因独立转移至玉米的两个互补近交系中会使杂种无融合生殖。该系统类似于玉米和高粱杂种种子的商业生产中所用的胞质雄性不育系/恢复系系统。小孢子培养在无融合生殖的磨擦禾和无融合生殖的玉米 磨擦禾杂种中，蝶须属型二倍孢子形成的无融合生殖体表现出的经典行为表明大孢子发生(卵子的发育)过程中忽略了减数分裂。但是，在小孢子发生(花粉发育)过程中减数分裂正常进行。孤雄发育是胚胎的基因组成仅来源于雄性配子体的胚胎形成。通过孤雄发育产生单倍体植物已在一种称为花药培养的方法中进行了探讨(Collins，1977；Morrison等，1988)。成熟的玉米小孢子法已由二倍体(2n＝2x＝20)玉米个体产生的减数小孢子获得了单倍体(1n＝1x＝10)个体(Ting等，1985；Pescitelli等，1988)。对玉米-磨擦禾杂种(Kindiger等，1993)进行的观察已证实减数分裂是正常的，并且在减数分裂形成之后破坏了花粉发育。
通常，经典的小孢子技术使用两种培养基系统。第一种是用于愈伤组织发育的Murashige和Skoog MS起始培养基(Green等，1975；和Conger等，1987，二者均被本文引作参考)。愈伤组织形成之后，将培养物转移至再生培养基中刺激根和茎的发生。发育的小植株转移至无菌土壤混合物中维持和继续发育。小孢子培养法一般在减数分裂之后(有丝分裂之前)的单核阶段或在此之前分离有活力的小孢子。培养由30Mz+9Tr和40Mz+9Tr个体获得的小孢子极有可能成功地产生具有Tr染色体数减少的有活力的“单倍体”小孢子。在39染色体植物的情况下，具有少于5个的不同数目Tr染色体的二倍体玉米(2n＝2x＝20)是结果之一。另外，还会产生具有不同玉米染色体和磨擦禾染色体数的几种非整倍体个体。一个实例是具有18Mz和0-5Tr染色体的个体。也许更具价值的是由具有40Mz+9Tr染色体的个体培养的小孢子。小孢子发生过程中正常的减数分离将会提供具有20个玉米染色体和随机数目的0-5Tr染色体的“二倍体”小孢子。由两种核型中的任一种起始，目标都是通过小孢子法使玉米和磨擦禾染色体数减少，并筛选具有无融合生殖方式的减数产物。很有可能在每种情况下都会产生核型为20Mz染色体和Tr16染色体的无融合生殖个体。小孢子培养法的产物必需具有Tr16染色体或在如前述的Mz6L-Tr16L染色体的易位形式中的染色体的一部分。本文所述的标准方法可用来鉴定这些材料中是否存在完整的Tr16或Mz6L-Tr16L染色体。
鉴定无融合生殖基因通过染色体步查分离和克隆基因现在，已有几种方法可由植物基因组中鉴别、鉴定和分离基因。每一种方法都依赖于分子标记及其与目的基因的关联和连锁的利用。接近所述基因的标记被认为与该基因紧密连锁并且是最有价值的。与该基因关联但不一定与其紧密连锁的其它标记也有价值但直接的价值较小。实施例2(第V部分)所述的7个RAPD标记大小为200-1200bp，并与无融合生殖发育(无融合生殖基因)关联。这些标记证实了Tr16具有无融合生殖基因的细胞学测定，并提供了该基因位于Tr16长臂的必要证据。这些标记也提供了追查无融合生殖性状和基因在Tr16臂或Mz6L-Tr16L易位上的位置。
RAPD分析产生的带可由琼脂糖凝胶上分离并克隆至大肠杆菌型质粒(载体)中。这些克隆可用作鉴定任何磨擦禾种或玉米-磨擦禾杂种中是否存在无融合生殖的RFLP标记。
另外，这7个RAPD标记与Tr16染色体上的特定DNA区域关联。这些标记在Tr16染色体上的空间分布可用来对控制无融合生殖的A和N基因进行定位。标记与基因之间的顺序、位置和空间关系因而可通过本领域的常规方法作图。一旦确定了基因的位置，就可使用标准的基因分离技术。例如，染色体可通过脉冲凝胶电泳或标准的琼脂糖电泳，使用这些标记作为提取基础或基点进行分离。一旦分离到所需片段，就可通过本领域已知的标准方法进行测序。通过转座子标记分离和克隆基因另一个对A和N基因进行定位和分离的方法是使用转座因子系统。通常称为“跳跃基因”的这些自主因子由一个染色体跳跃至另一个染色体，改变基因组的遗传结构并且产生突变。一个称为增变因子“Mu”的转座因子特别活跃，并被成功地用来确定基因的位置，以及提供分离基因的标记(Chomet，1994；Walbot等，1986)。Mu进入染色体的特定位点或基因修饰了该基因的序列，因此改变了其表达。作为玉米中的一个实例，Mu因子插入Wx(非蜡质)基因座改变了该基因，从而产生Wx(蜡质)表型，该表型通过修饰种子中淀粉颗粒的结构而表现出来。发生这种情况时，Mu在该基因座留下了特定的遗传指纹；因而可以通过成熟的方法分离相应片段和基因(Chandler等，1994；Martienssen等，1989；和O′Reilly等，1985)。
我们已通过简单回交成功地将Mu因子转移到了30Mz+9Tr染色体品系中并且通过2n+n交配产生了40Mz+9Tr BIII杂种个体。增加这些材料会产生大量带有Mu因子的49染色体植株，预期Mu因子最终会插入一个控制无融合生殖的基因，从而赋予相应个体一些嵌合特征。迄今，已在玉米-磨擦禾杂种中观察到高度雄性不育伴随着无融合生殖发育。在植物个体中寻找高度雄性不育部分将会发现一个Mu因子插入A或N基因座。另外，该嵌合部分产生的种子都会是有性来源的。由未受Mu插入影响的部分产生的种子会是无融合来源的。若发生这样的情况，可以通过遗传学家用来鉴定Mu插入的220bp末端倒转重复“标记”分离和克隆该基因。发现目的无融合生殖基因突变后，对该基因进行定位的第一步是用可以公开获得的Mul探针检测含突变原种DNA的Southern印迹。突变基因座的远交和分离及其与Mul探针的关联肯定地证实了探针，Mu插入，与目的基因的连锁。
其它可用来定位和分离A和N基因的转座因子系统包括Ac/Ds系统(Shure等，1983；Federoff等，1983；和Dellaporta等，1994)和Spm系统(Cone，1994)。
用无融合生殖基因转化植物一旦分离到与无融合生殖关联的基因，即可通过已知方法将它们插入质粒中进行增强、维持和扩增。目前已知有几种将基因插入植物和动物材料的方法。包括花粉转化法(Ohta，Y.1986；Smith等，1994；deWet等，1985，三者均为本文引入作为参考)、电穿孔法(Rhodes等，1988；Krzyzk等，1995；二者均为本文引入作为参考)和微粒基因转移法。一些方法利用聚乙二醇介导系统吸收所提供的基因进入细胞系中。基本上，每一种方法均设计为将选定基因植入植物细胞(或原生质体)中并将这些基因整合进选定种的基因组中(Kamo等，1987)。因为无融合生殖可能处于尚待鉴定的表达或抑制蛋白的控制之下，可能需要引入合适的调控序列以适当控制宿主植物中的表达。
微粒介导的基因转移法可能被认为是今日产业上应用的最可靠和有效的方法。基本上，待插入的多个拷贝基因置于多种微粒介质(碳化硅纤维、钨粒子、金粒子等)的任一种之中，并插入所谓的基因枪中。一般通过注入空气或压力系统，可将这些颗粒射入植物愈伤组织中。鉴定基因整合进入愈伤组织的特定系统(也称为报告基因)为大肠杆菌vidA“GUS”基因和花色素苷调节基因C1和B。一旦鉴定到转化细胞，将它们由愈伤组织移出并转移到适当的生长培养基中。最后通过愈伤组织由生长培养基转移到再生培养基的标准组织培养方法再生出完整植株。大田研究和子代检测证实了无融合生殖的稳定表达，因而也证明合适的等位基因已整合至基因组中。Lowe等(1995)报道用这种方法成功地转化了玉米，该文献本文引作参考。
当然，其它转化方法也可使用，如以玉米条斑病毒(MSV)或载有包括无融合生殖基因的重组装核蛋白复合体的油壶属(Olpidium)游动孢子转染(Langenberg等，1995)。
可用来接受无融合生殖基因的非限制性的植物类别为农学和园艺学上重要的植物，如谷类作物、饲料作物、种子繁殖的水果、种子繁殖的观赏植物和经济作物。这些植物的非限制性实例为玉米、小麦、大麦、高粱、黑麦、燕麦、水稻、菜豆、豌豆、花生、小扁豆、西红柿、胡椒、西瓜、苹果、橙子、葡萄柚、柠檬、莱母酸橙、珍珠稗、苜蓿、洋葱、胡椒、甜菜、糖甜菜、芜菁、花茎甘蓝、圆白菜、土豆、大豆、向日葵、亚麻、芥菜、红花、油菜、棉花、烟草等。
无融合生殖基因产物的表达如上所述，无融合生殖可处于表达或抑制蛋白的控制之下。为检测和鉴定这些蛋白，可将未转化细胞系的蛋白图谱与类似的转化细胞系的蛋白图谱进行比较。例如，如果无融合生殖基因被引入玉米近交系Mo17中，可将其蛋白图谱通过本领域熟知的方法与标准Mo17玉米近交系的蛋白图谱进行比较，从而揭示蛋白在无融合生殖中起作用。分离、洗脱和生化分析可按常规方法进行。
无融合生殖体的用途本发明用于产生不分离的杂种特别有用，从而简化商用F1杂种的生产。商用的栽培作物中出现无融合生殖将会减少常规杂种生产的很多缺点，包括1)抑制自花传粉；2)增加和维持大量的雄性不育、保持系和恢复系；和3)当杂种种子仅由雌性亲本收获时种植大面积的杂种的雄性和雌性亲本以产生商用杂种。
无融合生殖增加产生最优基因组合的机会。无论遗传杂合程度，专性无融合生殖基因型植物的染色体数或染色体组成(即种间杂交)在繁育时均不分离。无融合生殖拓宽了基因库并降低了商用杂种的遗传可变性，因为它无须使用具有雄性不育诱导系统的母本来生产商用杂种。
本文考虑的无融合生殖作物可用作饲料或谷物栽培种，或作为有性种质的雄性传粉者以产生新的无融合生殖的饲料和谷物杂种。无融合生殖植物也可如上所述作为控制无融合生殖的基因来源。这些植物的种子当然可作为食物、饲料和繁殖材料。种子也可作为淀粉、蛋白、油脂和其它可通过本领域熟知的方法分离或加工的成分的来源。
应当理解，本文所指的无融合生殖植物，无论是广义的还是狭义的，都意在包括这些植物的所有营养和繁殖形式，包括生长中的或已收获的植物、种子、花粉、根、茎、叶和其它各种植物部分和种子成分，特别是可用来产生植物子代的那些，而不论是通过常规技术还是组织培养技术获得。
实施例1本发明的无融合生殖材料来自F1杂种个体，以下称为H278(20Mz+36Tr)。H278是被称为V182(2n＝2x＝40)的四倍体玉米测交种和四倍体鸭茅状磨擦禾(2n＝4x＝72)杂交的结果，后者最初获自墨西哥中部并在Tashkent Botanical Gardens，Tashkent，Uzbikitan(Petrov等，1984b)保持。V182四倍体玉米测交种的特征在于种子白色、果皮无色、果穗白色。雄花穗花药黄色。这些性状的遗传标记为y(白色)，而Y为黄色种子；P-WW为果皮无色、果穗白色。无色或黄色花药称为pl。具有花色素苷色素的二倍体玉米测交种(2n＝2x＝20)V174被用于下述的后续杂交中。V174植株为紫色(花色素苷色素)，种子有色，果穗有色，雄花穗具紫色花药。这些性状的遗传标记为A、C、Bz1、Bz2、R(有色种子)、B(植株紫色)、P1(紫色花药，与无色或黄色相对)和P-WR(果穗红色，但果皮无色)。鸭茅状磨擦禾亲本(Tp209)、玉米测交种和来自H278的无融合生殖种子和种质于Southern Plains Range Research Station，Woodward，Oklahoma维持。
由最初的F1杂种(H278)通过无融合生殖育成了几种遗传上等同的56染色体(20玉米染色体+36磨擦禾染色体)F1杂种。随后这些杂种之一的进一步回交使用本地的开放传粉二倍体玉米品种(Petrov等，1984b)，获得了5株38个染色体(20玉米+18磨擦禾)的个体。其中，3个个体可见产生通过减数分裂或有性生殖方式获得的子代。第4个个体完全不育，而第5个个体(H781)产生染色体数为38的子代。随后与二倍体(2n＝2x＝20)和四倍体(2n＝4x＝40)玉米测交种连续回交15代以上，最后由该单一个体(H781)产生了带有18个磨擦禾染色体和10-40个玉米染色体的大量个体和家族。对由H278和H781获得的这些材料所做的其它研究已证实了它们通过无融合生殖繁殖的能力(Kindiger等，1995a；Kindiger，1995b)。
38染色体材料与二倍体和四倍体玉米测交种的进一步回交之后，产生了另一系列具有30个玉米染色体和9个磨擦禾染色体的潜在无融合生殖材料。这些材料通过无融合生殖的38染色体个体与四倍体玉米测交种回交并筛选58染色体的BIII来源的杂种而得到。该个体是基因组聚集过程的结果，基因组聚集过程中未受精的卵子不会无融合生殖发育，而可接受精子核的受精，形成BIII杂种(2n+n交配)。鉴定的58染色体杂种与二倍体玉米测交种再次回交。这样产生了具有30个玉米染色体+9个磨擦禾染色体的个体(见
图1谱系树的最左支)。七个这样的个体于下述表II中报道。磨擦禾染色体由18个减少至9个是有性过程的结果(减数分裂I和II)，而聚集的玉米染色体导致无融合生殖表达的失败。因此58染色体的杂种(40Mz+18Tr)形成具有20Mz+9Tr的减数的卵子。该单倍体卵子随后由来自二倍体花粉亲本的单倍体精核(n＝10)受精，产生具有30Mz+9Tr染色体的个体。
V162家族代表通过前述方法得到的30Mz+9Tr杂种。V162家族的50个个体植株的测量平均值获得了下列的形态特征穗节叶(ear node leaf)长度76.22cm植株高度(至雄花穗尖端)173.96cm穗高(至顶穗基部)94.68cm分蘖数目8.5穗节叶宽度5.81cm顶穗节间长度14.12cm顶穗以上叶数2.12雄花穗分支数9.36雄花穗长度29.58cm穗长10.65cm每穗种子行数4两组成对行“雄性不育”包括来自V162家族个体的至少2500粒种子的样品保藏于美国典型培养物保藏中心，并给予登记号ATCC 97233，已如上述。
表II来自几个无融合生殖的39染色体(30Mz+9Tr)玉米-磨擦禾杂种的子代的染色体数1ID 39染色体无2n+n总数BIII来源的杂(家族个体) 融合生殖体 交配产物 种的百分率V141-1 12 0 12 0V144-6 15 0 15 0V162-2 18 2 20 10V162-6 11 0 11 0V162-7 10 0 10 0V162-8 35 2 37 5.4V164-3 17 1 18 5.51Mz和Tr分别指玉米和磨擦禾染色体。
实施例2如实施例1所述产生具有30、40或50个玉米染色体和9个磨擦禾染色体的40个以上杂种家族，并采用多种技术对前述的一些无融合生殖方式和特征进行评价。用于评价冬季苗圃的材料从二月到四月生长于温室中。温度保持25C(+/-5C)，并由1000W金属卤化物灯提供9小时白昼长度。I.无融合生殖子代的出现染色体计数按Kindiger的方法(1993，本文引作参考)进行。每一家族的染色体计数证实所有个体的染色体计数均为39个染色体。根据已知的玉米和磨擦禾核型对这些个体进行了细致的核型分析，结果表明这些个体均具有30个玉米染色体和9个最小的磨擦禾染色体(即9B系列)。与玉米核型相比，最大的磨擦禾染色体(属9B系列)较玉米染色体6、7和8为小。另外，由于大小、臂比和结构造的差别，9个磨擦禾染色体无一类似于玉米一套染色体中的任一染色体，可能只有玉米染色体10例外。9个磨擦禾染色体均具有非常小的短臂，磨擦禾第16号染色体被示出，该染色体带有磨擦禾一套基因组中的核仁组织区(随体区)。
利用已建立的Adh、Acp、Mdh、Phi、Pgd和Pgm的同工酶系统分析每一家族的个体的潜在“非正常型”。如Stuber等(1988)所述，针对每一同工酶系统的电泳技术用于该分析。该分析表明在研究的材料之内和之中没有同工酶变异性。II.BIII来源的杂种的出现如前面讨论的那样，如果无融合生殖的磨擦禾基因在玉米背景中完全正常地发挥功能，预期玉米-磨擦禾杂种中会表现出BIII杂种的出现。
根据染色体计数，来自几个玉米-磨擦禾回交杂种的观察到的BIII来源杂种的频率可由以上表II中得到。V162家族中2n+n交配频率为4/78或5.1％。V164家族中该频率为1/18或5.6％。由以下表III可清楚地看出，由2n+n交配产生的类似个体可见于鸭茅状磨擦禾的无融合生殖家族中，但出现频率更高。由2n+n交配产生的BIII杂种的比较还表明磨擦禾的无融合生殖基因在39染色体杂种中存在并发挥功能。BIII杂种的产生在磨擦禾的有性、二倍体形式中未观察到，并且其产生也未有预期。
表III在选择的无融合生殖体鸭茅状磨擦禾Accessionsa中BIII产生的杂种的频率ID 最初亲本评价的BIII来源的倍性 子代数目 杂种数目b百分率WW10082n＝4x＝72 107 7 6.5％WW21902n＝4x＝72 49 22 44.9％WW17662n＝3x＝54 113 28 24.8％WW22962n＝3x＝54 111 31 27.9％a根据来自4x x 4x，4x x 2x，3x x 2x和3x x 4x交配的染色体计数的数据。b包括所有2n+n交配，该交配产生新的四倍体(2n＝4x＝72)、五倍体(2n＝5x＝90)或六倍体(2n＝6x＝108)子代。III.多胚性的出现对30Mz+9Tr无融合生殖的玉米-磨擦禾杂种的评价包括由3个无融合生殖家族(106个个体)获得的数据。其中25个(24％)是多胚的。评价的结果于以下表IV中报道。
表IV比较无融合生殖磨擦禾Accessions与无融合生殖30Mz+9Tr杂种的多胚性频率家族/倍性子代数目多胚现象数目 多胚现象百分率(无融合生殖的磨擦禾)WW1008(4x) 209 39 18.7WW2167(4x) 315 47 14.9WW2031(4x) 474 8.5WW2296(3x) 237 49 20.7WWFT1-12(3x) 2355 611 25.9(无融合生殖的39染色体玉米-磨擦禾杂种)V162-8 3710 27.0V162-2 20 5 25.0V141-1 12 2 16.6V137 37 8 21.6IV.倍性对无融合生殖表达的影响分别对具有48、58、68、78和88个染色体(40、50、60、70米染色体+18磨擦禾染色体)的玉米/磨擦禾杂种个体的结实率进行了分析，结果表明58染色体以上结实能力显著降低(表V)。对由无融合生殖的四倍体产生的五倍体(5x＝5n＝90)和六倍体(6x＝6n＝108)的结实率进行观察，也表明通过相同的基因组聚集机制(即2n+n交配)增加倍性之后引起结实率(0-1％育性)的大幅降低。
表V各种无融合生殖的玉米-磨擦未杂种中的母本育性染色体组成1评价的家族数育性百分比220Mz+18Tr 630.030Mz+18Tr 615.040Mz+18Tr 4 5.050Mz+18Tr 2 060Mz+18Tr 1 070Mz+18Tr 2 01Mz和Tr分别指玉米和磨擦禾染色体的数目。2为根据具有相同染色体组成的家族的总值。该值为花序上潜在种子数的平均估计值。V.RAPD分析对新鲜的冻干叶材料中提取的DNA进行RAPD分析，以确定19个评价个体中遗传同一性或鉴定其变异。按照Saghai Maroof等(1984)的方法提取DNA。按照Williams等(1990)建立的方法采用RAPD技术对个体进行分析。反应是用大约5ng植物DNA进行的。Taq聚合酶和10×反应缓冲液购自Perkin Elmer(Branchburg，NJ)。RAPD研究中所用的40个引物为十聚体寡核苷酸，以试剂盒A到K形式提供，购自Operon Technologies(Alameda，CA)。PCR扩增在带有“热盖”附件的M.J.Research，PTC-100热循环仪上进行。PCR扩增反应程序为94EC 1.5分钟1个循环，随后是94EC 1分钟；45EC 2分钟及72EC 5分钟34个循环，最后是45EC 2分钟及72EC 5分钟1个循环。扩增后，RAPD产物保持于4EC，然后于1.5％琼脂糖凝胶上1×TBE中100V下分离4小时。EB染色1小时后于紫外光下显色。由于偶尔形成或存在假象RAPD带，不考虑微弱的或不合理的带。评价时只考虑清楚的带。另外，对表现出可疑或变化的带型的个体或家族重复电泳以证实其真实性/可重复性。
一组8个玉米对照最初用于俄国玉米-磨擦禾程序，也用于本试验中以帮助鉴别玉米背景中引物给出的有关信息。之前对这些十聚体引物给出的有关信息的评价表明它们能够在无融合生殖和非无融合生殖的后代中间检测遗传可变性。RAPD评价均未鉴别出评价的家族或个体间的差异，这与偶尔出现的BIII来源的杂种中情况不同。
经鉴定与无融合生殖有关的RAPD标记(即Tr16的长臂)于以下表VI中报道。将带有无融合生殖基因的磨擦禾染色体与这七个标记进行比较，对所有品系的世代100％有效。即无论被分析的个体是否来源于具有18或9个磨擦禾染色体的亲本，或来源于不同的后代品系，所述标记与无融合生殖的关联是100％准确的。
Blakey(1993)(本文引作参考)披露了两个RFLP标记UMC62和UMC134与磨擦禾连锁群L关联。由于Mz6L-Tr16L易位的产生，我们现在知道连锁群L表示磨擦禾染色体16的长臂。因此，通过参照，引物UMC62和UMC134肯定与无融合生殖关联。另外，Leblanc等(1995)已报道了三个也定位于Mz6L远末端的玉米RFLP标记(UMC62、UMC28和CSU68)。这些标记在繁殖程序中也可用来观察无融合生殖。
表VI引物和与无融合生殖关联的相应RAPD标记引物 标记的大致分子量 序列号引物序列OPA-01 3911 CAGGCCCTTCOPA-06 2512 GGTCCCTGACOPA-12 1523 TCGGCGATAGOPG-06 5524 GTGCCTAACCOPI-11 4195 ACATGCCGTCOPJ-14 12006 CACCCGGATCOPK-06 4897 CACCTTTCCC用来建立与无融合生殖关联的RAPD标记的5个家族的一般关系于
图1中示出。有五个独特的后代品系。五个家族中的四个来源于由染色体数目标记的完全不同的途径。V58A与所有其它家族的区别在于其表型上较其它家族更接近玉米，每穗行数更多，分蘖少或无。图的最末行表示有性生殖来源的个体，它们已失去了无融合生殖的潜力，只有带有Mz6L-Tr16L易位的V9例外(
图1右下)。与无融合生殖关联的RAPD标记在这些个体中不存在，而存在于它们所有的无融合生殖亲本中。
实施例3一个鉴定为V9的30Mz+9Tr染色体的玉米/磨擦禾杂种按实施例1所述相同的方法产生，所不同的是在无融合生殖发育阶段，在Mz6和Tr16的同源区之间发生了减数分裂过程(联会和重组)，从而产生了Mz6L-Tr16L易位。图2为Mz6的相对分子图。相对图单位示于垂直线的左边，具体基因示于右边。磨擦禾连锁群G和M同源，并分别与图中位置84的上下区域共线。图的右下，Tr16长臂易位表示为连锁群L(B1akey，1993)。Mz6L-Tr16L易位原种(V9)似乎保留了大多数(如果不是全部的话)Mz6L，而失去了Tr16S臂。根据对磨擦禾材料、带有36、18和9个磨擦禾染色体的无融合生殖的玉米-磨擦禾杂种、有性来源的玉米/磨擦禾杂种(即V142-3，其遗传组中缺失Tr16)和四倍体玉米测交种的筛选，最初与无融合生殖关联的18个RAPD标记中，只有上述表VI中所述七个标记存在于Mz16L-Tr16L原种中，这由相应的RAPD带指示。因此，所有18个RAPD标记均存在于Tr16上。其中，7个位于Tr16L上。因而，Mz6L-Tr16L的连锁群L清楚地显示出带有无融合生殖的基因。
图3示出染色体图(左边，由上到下)，表示染色体Tr16、Mz6和Mz6L-Tr16L易位。所有与一个染色体臂相应并与无融合生殖关联的RAPD标记采用操纵子技术(Operon Technologies)，Alameda，CA，USA表示为OP(操纵子)名称后加具体的盒(A-K)和与每一十聚体引物相应的具体引物编号(1-20)(即OPA-01)。所有与Tr16L和Mz6L相应的RFLP标记通过显色剂表示为UMC或CSU名称后加与探针相应的特定数字(即UMC134)。提供了染色体Tr16、Mz6和Mz6L-Tr16L易位的线图(具备随体)，以使观察者能看出每一染色体上RAPD和RFLP标记的相对位置。随体表示为大的实心圆。着丝粒表示为小的空心圆。规定了线图中每一染色体的长(L)或短(S)臂，词头Tr和Mz表示磨擦禾和玉米染色体(即Tr16L或Tr16S)。Mz6L-Tr16L易位表示为“V9Mz6L-Tr16L”，并在最下面的线图中示出。
实施例4Mu基因已通过2n+n繁殖过程插入无融合生殖材料。具有30Mz+9Tr染色体的植株(V162)与带有几个拷贝活性Mu因子的2n＝2x＝20玉米植株杂交(获自D.Robertson，Iowa State Univ)。二倍体玉米种子无性种带有基因ACRP1，该基因使玉米种子产生便于鉴定的颜色。来自杂交的具有40Mz+9Tr染色体的个体为2n+n交配的产物，将带有Mu因子。
应当理解，前面的详细描述仅为进行说明，在不背离本发明精神与范围的前提下可对其进行改良和加以变化。本发明的范围不限于所保藏的种子，至于该保藏的意图，仅将其作为本发明的一个实施方案和本领域技术人员进行进一步改进的起点。
参考文献Asker，S.E.and L. 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序列表(1)一般信息(i)申请人Kindinger，Bryan K.
Sokolov，Victor(ii)发明名称无融合生殖的玉米(iii)序列数目7(iv)通讯地址(A)联系人Curtis P.Ribando(B)街道1815 North University Street(C)城市Peoria(D)州IL(E)国家USA(F)邮政编码61604(v)计算机可读形式(A)载体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)当前申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)律师/代理人信息(A)姓名Ribando，Curtis P(B)登记号27976(ix)电讯信息(A)电话309-681-6513(B)传真309-681-6688(2)序列1信息(i)序列特征(A)长度10碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列表述序列1CAGGCCCTTC 10(2)序列2信息(i)序列特征(A)长度10碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列表述序列2GGTCCCTGAC10(2)序列3信息(i)序列特征(A)长度10碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列表述序列3TCGGCGATAG10(2)序列4信息(i)序列特征(A)长度10碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列表述序列4GTGCCTAACC 10(2)序列5信息(i)序列特征(A)长度10碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列表述序列5ACATGCCGTC 10(2)序列6信息(i)序列特征(A)长度10碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列表述序列6CACCCGGATC 10(2)序列7信息(i)序列特征(A)长度10碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(iii)假设无(iv)反义无(xi)序列表述序列7CACCTTTCCC 10
权利要求
1.无融合生殖玉米。
2.权利要求1的无融合生殖玉米，具有至少一个显性基因N控制卵子的非减数作用，至少一个显性基因A控制卵子的无融合生殖发育。
3.权利要求2的无融合生殖玉米，其中其基因组具有正好一个显性基因A和正好一个显性基因N。
4.权利要求1的无融合生殖玉米，其核型包括带有无融合生殖等位基因的鸭茅状磨擦禾16号染色体的长臂。
5.权利要求1的无融合生殖玉米，特征在于Mz6-Tr16易位。
6.一种无融合生殖玉米/磨擦禾杂种，其核型为玉米染色体∶磨擦禾染色体的比例为至少30∶9。
7.权利要求6的杂种，其中其核型包括30-70个玉米染色体和9个磨擦禾染色体。
8.权利要求1的玉米，在通过一种引物由聚合酶链式反应扩增的其基因组DNA中具有至少一个标记，其中所说的引物选自序列1，序列2，序列3，序列4，序列5，序列6和序列7。
9.权利要求1的玉米的种子。
10.权利要求2的玉米的种子。
11.权利要求3的玉米的种子。
12.权利要求4的玉米的种子。
13.权利要求5的玉米的种子。
14.权利要求6的杂种的种子。
15.权利要求7的杂种的种子。
16.一种增加玉米/磨擦禾杂种中玉米染色体数的方法，包括将杂种与有性生殖的玉米品系回交并筛选BIII-来源的杂种。
17.权利要求16的方法，其中所说的玉米/磨擦禾杂种包括30个玉米染色体和9个鸭茅状磨擦禾染色体。
18.权利要求17的方法，其中所说的玉米/磨擦禾杂种ATCC登记号为97233。
19.权利要求17的方法，其中所说的玉米/磨擦禾杂种包括Mz6-Tr16易位。
20.一种增加玉米/磨擦禾杂种中玉米染色体数的方法，包括将杂种与有性生殖的玉米品系回交，选择具有Mz6-Tr16易位的个体，将该个体与有性生殖的玉米品系回交，筛选BIII-来源的杂种。
21.权利要求20的方法，其中所说的玉米/磨擦禾杂种包括30个玉米染色体和9个鸭茅状磨擦禾染色体。
22.权利要求21的方法，其中所说的玉米/磨擦禾杂种ATCC登记号为97233。
23.一种将无融合生殖渐渗至有性生殖的玉米的方法，包括以包含显性等位基因N和显性等位基因A的表达系统转化玉米，等位基因N控制非减数作用，等位基因A控制非减数卵子的无融合生殖发育。
24.鸭茅状磨擦禾16号染色体长壁的一个分离的片段，包括控制非减数作用的显性等位基因N和控制非减数卵子的无融合生殖发育的显性等位基因A。
25.分离的控制鸭茅状磨擦禾的非减数作用的显性等位基因N。
26.分离的控制鸭茅状磨擦禾中非减数卵子的无融合生殖/单性发育的显性等位基因A。
全文摘要
已育成了玉米染色体:摩擦禾染色体比例为至少30∶9的无融合生殖的玉米/摩擦禾杂种。这些杂种通过与选定亲本品系反复杂交可用于使二倍孢子形成的无融合生殖渐渗至玉米背景中,最终建立具有稳定遗传特征的无融合生殖玉米的永生化商用品系,而无需连续产生杂种种子。提供了用于分析玉米/摩擦禾杂种的无融合生殖行为的DNA引物。
文档编号A01H5/10GK1202199SQ96198378
公开日1998年12月16日 申请日期1996年9月23日 优先权日1995年9月22日
发明者B·K·金迪格尔, V·索科罗夫 申请人:美国政府农业部