专利名称：合成编码雪花莲凝集素的抗同翅目害虫基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人工合成的编码雪花莲凝集素的基因，包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所说的表达载体转化的植物细胞，以及由所说的细胞产生的对害虫，尤其是对同翅目害虫表现有杀虫性的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。
近年来在抗虫植物基因工程研究领域，有关凝集素的研究逐渐引起了科学家们的重视。一般说来，凝集素是一类可逆的结合特异单糖或寡糖的蛋白质，部分具有杀虫作用。凝集素早期的定义“lectin”来源于拉丁文“legere”，意思是选择，以强调其能选择性地与糖复合物相结合的特性。后来由于lectin被广泛应用于表现出更广泛凝集行为的所有蛋白质，故“lectin”已失去早期选择的意思，而另一个名字“agglutinin”作为lectin的同义词，能更准确地反映这类蛋白质的特性，因为它是指能通过与细胞表面结合碳水化合物的特异性结合而使细胞凝集的所有蛋白质。由于植物凝集素家族成员的增加，对其结构、功能研究的深入以及分子生物学水平上新的发现，使得植物凝集素的定义几经修正。最近Peumans和Van Damme(Plant Physiology,109:347～352,1995)认为凝集素(lectin)的定义应为含有至少一个非催化结构域并能可逆结合到特异单糖或寡糖上的蛋白质总称。
关于凝集素的杀虫机理，目前一般认为外源凝集素进入昆虫消化道后，与肠道围食膜细胞表面的糖蛋白结合，降低膜的通透性，从而影响营养物质的正常吸收。此外，这种结合还可能在昆虫的消化道内诱发病灶，引起消化道内细菌和病毒的繁殖等，从而对昆虫本身造成危害(Eisemann C.H.,et al.Entomologia Experimental etApplicata.72:1～10,1994)。
雪花莲凝集素(Galanthus Nivalis Agglutinin,以下均简称GNA)是石蒜科(Amaryllidaceae)的一种名为雪花莲的植物体内存在的一种植物凝集素。Van Damme等人(Planta Vol 186:35～43,1991；European Journal of Biochemistry Vol 202:23～30,1991)发现GNA是由多基因家族编码的。它的杀虫效果较好，对具有刺吸式口器的害虫如蚜虫、稻飞虱、叶蝉等具有较好抗性，对咀嚼式害虫也具有中等抗性。另外由于GNA只专一识别并结合α-1,3和α-1,6甘露糖(Van Damme Els J.M.,etc.FEBS Letters.Vol215:140～144,1987)，而人及绝大多数动物细胞表面甘露糖残基很少，所以GNA对人畜几乎无害。是目前所知的最适于转基因植物研究的植物凝集素之一。
Annick Barre,Van damme等人(Plant Physiology,112:1511～1540,1996)通过SDS-PAGE以及蔗糖密度梯度离心证明GNA分子是每个亚基约为12.5KD的四聚体蛋白，且蛋白质分子没有被糖基化。GNA分子的三维结构相当于一个由四条β折叠片(亚结构域)通过Ω环连成的一个β折叠桶。每个凝集素单体有3个相同的由四个氨基酸残基组成的甘露糖结合位点。四个GNA单体构成一个具有充分暴露的结合甘露糖位点的四聚体。
1995年Powell等人(Entomologia Experimental et Applicata.75:51～59,1995)以GNA和麦胚凝集素(WGA)分别按0.1％(w/v)的浓度加入到人工饲料中饲喂稻褐飞虱，结果发现GNA的抗性效果较好，24小时内所测试稻褐飞虱蜜汁分泌降低达96％。1996年Nicolas Sauvion等人(Entomologia Experimental et Applicata.79:285～293,1996)以浓度为30uM的GNA人工饲喂桃蚜，幼虫死亡率为42％。
1995年Newell等人(Plant Science,107:215～227,1995)利用农杆菌介导将GNA和另外一种基因同时转入甘薯，但对其抗虫性未作报告。同年Hilder等人(TransgenicResearch,4:18～25,1995)在CaMV35S启动子下构建GNA表达载体，转基因烟草的叶片及整株虫试都表明转基因植物对桃蚜(Myzus persicae)具有抗性。叶片提取并纯化GNA，以0.1％w/v人工饲料饲喂桃蚜，其校正死亡率为33±1％，且蚜虫平均大小显著小于对照，桃蚜的发育、繁殖也大大降低。1996年Gatehouse等人(EntomologiaExperimental et Applicata.79:295～307,1996)将GNA基因转入马铃薯，结果表明，转基因马铃薯显著降低了桃蚜繁殖力，每个雌蚜虫每天产卵数为4.1-4.2个，而对照为5.4个。每一个转基因植株上的幼虫数比对照显著降低。
但到目前为止，转GNA植物的抗虫能力并不十分理想。本发明在前人的一些工作的基础上，通过现代基因工程技术，人工改造并合成一种GNA基因，该基因更适合在植物中表达。进一步构建了高效植物表达载体。该表达载体通过一定的方法转入植物后，可赋予植物对害虫，尤其是同翅目害虫的抗虫性。
本发明的目的是针对如下两个事实1．蚜虫、稻飞虱、叶蝉等同翅目害虫在世界范围内对植物危害严重。这些害虫具有刺吸式口器，危害农作物、园艺作物及装饰性植物。其取食不仅引起作物的直接损失，而且口器刺入时产生伤口，通过伤口100多种致病病原菌和植物病毒得以侵染植物，从而导致作物更加严重的损失。
2．广泛使用化学杀虫剂防治害虫，弊端很大。化学杀虫剂作用是非特异性的，在杀死害虫的同时也会杀死益虫，破坏生态平衡并污染环境，危害人身健康。利用转基因技术将杀虫基因导入作物体内，使其本身具有抗虫能力，不仅克服了化学杀虫剂的缺点，而且更有其独特的优越性。
雪花莲是一种不常见的植物，且在我国未有分布。对天然GNA基因的序列分析表明，GNA基因中密码子的使用与常见植物中的密码子使用情况差别很大。因而直接将天然GNA基因转入植物后，由于其密码子与植物体内蛋白翻译体系的不协调而使目的蛋白的表达量较低，影响转基因植物的杀虫效果。本发明提供的人工合成的sGNA基因是对天然GNA基因进行了改造，选择普通植物的优化密码子完全人工合成的。该基因适合在一般的植物中高效表达而使转基因植物对蚜虫等同翅目害虫表现有较高抗性。
因此，本发明提供了对天然GNA基因进行改造，使之适合于在普通植物中表达的一套基因修饰方案。根据这个方案，在本发明的一个实施方案的一个方面中，我们设计并合成了sGNA基因，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。该核苷酸序列所编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。此外，根据本发明的天然GNA基因修饰方案，也可以合成一系列SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的功能等同物，且具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的特征。但本领域技术人员可以理解到，为本发明的目的，也可以基于天然雪花莲凝集素基因的野生序列，以核苷酸定点诱变技术PCR酶促合成等技术制得本发明的具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的编码雪花莲凝集素的DNA序列或其功能等同物。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及为在受体植物中有效地表达上面所述GNA基因所需之调节及控制元件。
为了使外源基因在植物细胞中在转录和翻译水平上获得有效表达，在包含编码区的外源DNA序列侧翼必须连接有适当的表达调节和控制元件。这些控制元件包括启动子、增强子、终止子，转录产物的未翻译部分和多聚腺苷酸化序列、以及便于在适当的培养基中筛选被转化细胞的选择标记基因等。常用的植物细胞转录启动子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子和根瘤农杆菌T-DNA的胭脂氨酸合酶启动子等。这些启动子在大多数植物细胞中都是有效的，但其插入位点和插入的拷贝数目不同，将对其下游的蛋白质编码序列的转录和翻译活性产生很大影响。
因而，本发明涉及翻译增强序列；在任何读码情况下均能正确终止的多联终止子序列；对转录过程得到的mRNA进行正确切割的加工序列；以及促使加入多聚腺苷酸化序列的多聚腺苷酸化信号序列。
根据本发明的一个优选实施方案，在本发明所构建的表达载体中，所说的5′端非编码区由两个增强子序列，一个启动子序列，一个衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因的翻译增强序列，和一个外源基因在植物细胞内翻译过程中起促进作用的短核苷酸序列组成。
在本发明的融合基因表达载体中，除了上述本发明的GNA基因序列外，其他位于所说编码序列两侧翼(即5′和3′端边界区域)的用于调节和控制该编码序列在植物细胞中转录和翻译的序列都是本领域已知的和容易得到的。例如，本发明使用的所说的衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因编码区的翻译增强序列是Ω序列。根据已知的Ω序列核苷酸顺序，我们合成了两段核苷酸片段SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11，通过酶促反应合成了由68bp组成的Ω序列。该序列富集AAC序列，在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点(Richardset al.,Eur.J.Biochem.84:513-519,1987)。其中本发明使用的促进外源基因在植物细胞内翻译过程的短核苷酸序列是Kozak等人描述的Kozak序列(Kozak etal.,Nucleic Acids Research 12:857-872,1984；Cell,44:283-292,1986)。我们所合成的Ω序列和Kozak序列如SEQ ID NO:12所示。
适于与本发明GNA基因连接，并在植物细胞中启动该编码DNA序列转录开始的启动子包括组成型、诱导型、组织或器官特异性或发育阶段特异性启动子。例如，它们包括但不只限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S或19S启动子，mannopine合成酶(MAS)启动子，胭脂氨酸合成酶和章鱼碱合成酶启动子，玉米乙醇脱氢酶启动子，以及二磷酸核酮糖羧化酶，氧化酶小亚基启动子等。其中，本发明优选的是带有加倍增强子元件的CaMV 35S启动子。该启动子全序列如SEQ ID NO:13所示。此外，由于具有刺吸式口器的同翅目害虫主要在植物的韧皮部吸取汁液，故尤其适合启动本发明GNA基因的启动子是韧皮部特异性启动子，如蔗糖合成酶启动子(SSR Promoter)，一种叫做杜松烯合成酶的启动子(CAD1-B)等。
根据本发明的一个优选实施方案，在本发明所构建的高效植物表达载体中，所说的3′端非编码区包括一个多联终止密码子序列，一个mRNA切割序列和一个mRNA切割后加工序列及多聚腺苷酸化序列。这些调节和控制序列可以是载体质粒载体中天然固有的，或在dNTP及适当的DNA合成酶和DNA连接酶的存在与作用下，利用各种已知的技术合成并通过分子克隆技术加入的。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的编码序列及其5′和3′端侧翼序列是以化学方法合成的。
然而，在本发明的一个优选的实施方案中，上述这些3′端调控序列，基本上都是根据我们的预先设计而人为合成的。本领域技术人员可以理解到，建立在大量理论研究工作基础上的本发明的这一实施方案，必将更有利于提高我们所制备的GNA基因在植物细胞中的表达效率及其稳定性和准确性。例如，在本发明的一个特别优选的实施方案中，我们设计并合成了直接连接于GNA结构基因3’端的多联终止子序列(SEQ ID NO:14)，在该核苷酸的短序列中，包括有三个分别位于不同读码框中的终止密码子。从而即使在对其左翼的结构基因序列的翻译过程出现错读，也将得以正确终止。再如，本方面所设计的3’端正确切割和加工序列进一步保证了蛋白质翻译的正确终止(SEQ ID NO:15)。
另外，适用于本发明的GNA高效植物表达载体还可以包括衍生于花椰菜花叶病毒，Nopaline(Nos)基因及其类似物的终止子。在本发明的一个实施方案中，我们使用了Nos基因的终止子。
为了提高本发明的GNA基因在单子叶禾木科植物中的表达效率，可在结构基因与启动子序列之间加入适当大小的内含子序列，例如，玉米醇脱氢酶基因的第一内含子(Gene and Development 1:1183-1200,1987)、衍生于蓖麻油植物的过氧化氢酶基因的第一内含子(Tanaka et al.,NucleicAcids Research 18:6767-6770,1990)等。
可使用本领域中已知的方法将本发明的适于在植物细胞中表达GNA的融合基因构建体连接到任何一种可在细菌细胞或植物细胞中自我复制的载体上。这样的载体例如包括衍生于大肠杆菌的质粒载体pUC18、pUC19(Gene 103:1985)，以及经过不同的修饰而造成不同的多克隆酶切位点的一系列统称为pGEM的质粒载体(由Promega公司生产)。尤其是植物表达载体pBI101,pBI121以及pBI131系统(Iefferson,et al.,EMBO J.16:3901,1987)，等等。在本发明的一系列优选实施方案中，携带上述本发明sGNA基因构建体的载体是pUC19、pBI121等，后者特别适于作为制备植物表达载体的工具质粒载体。
当然，如前所述，为了正确地选择和鉴定被转化的植物细胞，本发明的上述重组的融合表达载体还进一步含有可选择标记和报告基因。所使用的选择标记和报告基因的两侧可带有各自的调节序列，以促使它们在植物中的表达。适用的选择标记和报告基因是本领域内已知的。编码选择标记的外源基因及其他基因可以包含于同一个表达载体中，或者包含于转化时同时应用的不同的载体中。本发明优选的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)基因和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因，并一同包含于同一个重组表达载体内，从而保证了对被转化细胞或植株选择的可靠性。
因此，根据本发明的一个方面，本发明进一步提供适于在植物细胞中表达GNA的融合植物表达载体，其中包含1)．sGNA基因表达盒；a)．5’端非编码区；b)．编码GNA的如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；c)．3’端非编码区。
2)．来源于pBI121的载体部分a)．新霉素磷酸转移酶基因(NptⅡ)表达盒；b)．β-葡萄糖苷酸酶基因(Gus)表达盒；以及c)．起始复制子及与植物转化相关的左右边界序列等功能结构。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的5’端非编码区和3’端非编码区分别具有如前所述的构成元件及其功能。例如，5’端的带有加倍的增强子元件的启动子，Ω序列和Kozak序列；3’端的多联终止序列，正确切割和加工序列，多聚腺苷酸信号序列。
根据本发明，所说的编码区域具有如SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列或包含于SEQ ID NO:3的其功能等同序列。
根据本发明的一个优选实施方案，所况的编码基因序列及其5′和3′端侧翼序列是以化学方法合成的。
根据布达佩斯条约的规定，申请人已于1998年10月5日将转化到大肠杆菌DH5α宿主细胞中的本发明构建的带有sGNA基因表达盒的融合表达载体pG4AS8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO.0363。
通过本发明所提示的天然GNA修饰方案，所得到的符合SEQ ID NO:3的核苷酸序列且具有植物基因特征的改造后GNA基因都可以通过DNA重组技术，连接到上面所描述的表达载体中，并使之转入并整合到植物基因组中。而且GNA基因在目标植物中的表达可赋予该植物对害虫，尤其是针对同翅目害虫的杀虫性。
应该指出，上面所描述的表达载体是本发明的一个优选实施例，并未限制本发明。凡是应用本发明所描述的GNA基因所构建的任何表达载体均包括在本发明之内。尤其是该修饰后的GNA基因还可以通过与其它任何杀虫基因重组或协同，以获得杀虫能力更强、杀虫范围更宽或这两方面都得到加强的转基因植物。包括如下的实现方式1．与其它一种或几种杀虫基因重组，构建多种杀虫基因的表达载体并转入植物；2．与其它一种或几种杀虫基因融合，构建表达载体并转入植物；3．与其它一种或几种杀虫基因相协同，分别构建植物表达载体，同时或分步导入同一种植物受体。
用相类似的方法，本发明修饰后的GNA基因还可以与其它目的基因进行重组或协同，以达到具有除杀虫性以外的其它优良性状的转基因植物。也包括利用选择标记基因而获得利于筛选转基因植株的转基因植物等，例如抗除草剂基因。
为了在植物细胞中，特别是整株植物中表达外源杀虫基因，以赋予整株植物及其种子和后代以杀虫能力，必须使用适当的方法将按上述方法制备的携带本发明的GNA基因的重组表达载体转化或转导到适当的宿主细胞或植物体内。
将携带外源基因的重组载体导入宿主植物或其细胞内的许多方法都是本领域技术人员熟知的。这些方法包括但并不仅限于1)使用农杆菌(Agrobacterium)作为植物病原体所介导的农杆菌转化法(AgrobacteriumMediated transformation)、2)物理法，如基因枪法(Particle Bombardment & particle gun& Gene gun)、电击融合法(Electroporation)、显微注射法(Microinjection)、超声波法(Ultrasonic waves)、激光微束法(Laser microwave)、碳化硅纤维介导法(Silicon carbidefiber)、电泳法(Electrophoretic transfection)等。3)化学法，如PEG介导的转化法、脂质体介导转化法等。4)种质系统转化法，如花粉介导法、花粉管通道法、子房注射法、浸泡法等。5)．以花椰菜花叶病毒(CaMV)、双生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒载体所介导的转化法。
一种特别令人感兴趣的在整体植株中导入外源基因的方法是本发明人使用的所谓种质系统转化法中改进的子房注射植物受精胚囊法(参见CN95119563.8,1995:Zhou et al.,Enzymol.Method.101:433-481,1983)。
根据本发明一个优选实施方案，我们优选棉花作为GNA基因转化受体植物。棉花作为一种经济作物，我们考虑其主要作为纺织工业原料，安全性好；其次，在世界范围内被广泛种植的棉花每年因虫害造成的经济损失是十分巨大的。
因而，本发明涉及人工改造的编码GNA的DNA序列，包含所说的DNA序列的高效植物表达载体，用所说的表达载体转化植物细胞，组织和整株植物的方法，以及由此产生的对植物害虫具有控制和杀虫能力的转基因植物，特别是对同翅目昆虫例如蚜虫等具有显著抗虫作用的转基因棉花。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了获得对害虫有抗虫性，尤其是对同翅目害虫有抗虫性的植物的方法，该方法包括1)．构建包含所说GNA基因的植物表达载体；2)．用任何一种可行方法将步骤1)中得到的植物表达载体导入到植物细胞内，并由此获得对害虫有抗性或杀伤能力的转基因植物及其后代，包括任何部分的植物组织和种子。
这里应特别指出的是，虽然在本发明下述实施例中以转基因棉花的产生举例进一步详细描述了本发明，但这绝不意味本发明的GNA基因及携带该DNA序列的重组融合表达载体只用于转化和生产具有抗虫能力的转基因棉花。
因此，使用具有本发明所描述的特征的GNA基因表达载体，以本领域技术人员已知的任何一种方法导入任何植物或其组织或细胞中，以及由此而获得的具有杀伤或控制植物敏感害虫之能力的植物，其后代及其种子和植物部分，均包括在本发明之内。
附图1以人工合成的寡核苷酸片段F1～4(SEQ ID NO:4,5,6,7)及引物P1,P2(SEQ IDNO:8,9)合成sGNA基因过程示意图；附图2本发明所构建的携带有人工合成的sGNA基因的植物表达载体pGBIGNA质粒图谱附图3:sGNA转基因烟草叶片对蚜虫抑制效应曲线图CK为未转基因烟草，K11,K13,K14均为转基因烟草。试验时，在琼脂平板上分别放入待试材料，接入8头3龄蚜虫并连续观察其生长、繁殖情况一周。从表中曲线可知，转基因烟草明显的降低了蚜虫的繁殖率。附图4:sGNA转基因棉花的PCR和PCR-Southern分子检测结果上图是对转基因棉进行PCR分子检测的结果下图是应用sGNA基因特异性探针对上图所示PCR产物进行分子杂交的结果第一泳道DNA标准梯度第二泳道以未转基因棉花DNA为模板的阴性对照第三泳道以质粒pG4AS8为模板的阳性对照第四～九泳道以不同转基因棉花植株DNA为模板的PCR结果附图5:sGNA转基因棉花对蚜虫的抗虫性上图为转基因棉接种10头蚜虫后在封闭罩内10天后状况下图为未转基因棉花接种10头蚜虫后在封闭罩内10天后状况通过对比可知，转基因抗虫棉对蚜虫抗性显著给出以下实施例的目的是举例详细描述本发明，而不构成对本发明待批权利范围的限制。在本发明技术特征和待批权利要求范围内，本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。
实施例一编码GNA蛋白质的结构基因的制备1.1对天然GNA的修饰方案及sGNA基因的设计天然GNA基因编码一个由157个氨基酸组成的前体蛋白，翻译后在N端和C端各有23和29个氨基酸被去除，只剩下105个氨基酸的成熟蛋白质(Hester Gerko,KakuHanae,et al.The Journal of Biological Chemistry,Vol 258:15:9544～9549,1983)。根据此成熟蛋自氨基酸序列，完全采用普通植物优化密码子，我们人工合成了其编码核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，连同5’及3’端克隆所设计的限制性内切酶位点以及起始密码子ATG和终止密码子TAA共333个碱基对。所设计基因命名为sGNA，它所编码的GNA蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。
1.2小片段的合成及完整sGNA的组装为获得我们所需要的核苷酸序列，我们设计了四个核苷酸片段F1(SEQ IDNO:4),F2(SEQ ID NO:5),F3(SEQ ID NO:6),F4(SEQ ID NO:7)，以及一对引物P1(SEQ ID NO:8),P2(SEQ ID NO:9)。四条寡核苷酸片段分成两组分别退火并用DNA聚合酶延伸补齐，再以所获得的两种DNA片段为模板，用引物P1、P2进行PCR扩增，得到完整的333bp的sGNA基因片段。附图1是用这几个核苷酸片段，经分子酶促反应而得到sGNA片段的过程示意图。按照设计，该片段的5’及3’端分别带有一个PstⅠ和SacⅠ位点。本实施例及以下各实施例所涉及的克隆步骤均按本技术领域常规方法进行(Sambrook,J.Et al.,Molecular Cloning-ALaboratory Manual,2nd,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork)。载体pUC19和PCR产物经PstⅠ、SacⅠ双酶切后，将333bp片段和载体退火连接，转化DH5α感受态细胞，通过a-互补现象的观察，得到重组子定名为pGS8。经PstⅠ、SacⅠ双酶切鉴定，证实该重组质粒中有300bp左右DNA片段的插入。
1.3对pGS8中所克隆GNA基因的序列分析(1)变性模板的制备用小量提取质粒DNA方法，制备待测pGS8质粒DNA。取1.5～2μg DNA(约2～5μl)加水至总体积32μl，然后加入8μl 2M NaOH，轻轻混匀，室温变性10分钟，然后加入4μl H2O,7μl 3M NaAc(pH4.8),120μl无水乙醇，12000rpm离心8分钟，用70％乙醇洗2次所得的沉淀，真空抽干，溶于10μl水中，放冰上待用。
(2)退火向变性后的模板DNA中加入2μl退火buffer,2μl测序引物，轻轻混匀，瞬时离心后于65℃温育退火5分钟，迅速移至37℃继续温育10分钟，然后于室温放置5分钟以上。
(3)标记反应先吸2μl酶稀释buffer，然后向其中加入0.5μl T7测序酶，置于冰上，然后向退火后的模板，引物退火混合物中加入labal Mix 3μl，α～32P dATP 1μl；稀释后的T7测序酶2μl，在管中轻轻吸打混匀，瞬时离心甩一下，室温反应5分钟。
(4)链延伸终止反应在4个离心管上分别标上A、C、G、T，并分别加入2.5μl相应的链终止液(Mix short)在37℃至少保温1分钟，从(3)中标记反应液中分别移取4.5μl反应物加入到A、C、G、T，四个管中，混匀后置37℃反应5分钟，各加入5μl终止液，于37℃保温2分钟。
(5)测序胶的制备应用Bio-rad公司的测序仪器。
量取50ml 6％测序丙烯酰胺凝胶贮备液(6％ Seqencing gel:1.5g甲叉双丙烯酰胺，28.5g丙烯酰胺，240g尿素，50ml 10×TBE，加水定容至500ml)，加入500μl 10％过硫酸胺，50μl TEMED，混匀，缓慢注入到洗净的测序板装置中，插入点样梳，室温聚合45分钟以上。
(6)装置好电泳装置，加入1×TBE为电泳缓冲液(10×TBE:108g Tris,9.3gNa2EDTA.2H2O,55g硼酸，用H2O定溶于1000ml(pH8.3))。将样品80℃变性2分钟，置于冰上，上样电泳。如有必要，当溴酚兰到达板底部时，进行二次上样，继续电泳到二次上样溴酚兰至板底部。
(7)停止电泳，下胶，压片，-70℃放射自显影过夜，冲片阅读。
结果证明该质粒中带有与设计相符的sGNA基因插入片段。
实施例2带有GNA基因植物表达载体的构建2.1sGNA基因表达盒的构建如前所述，本实施例所构建的sGNA基因表达盒中包括以下基因表达调控元件5’端的35S启动子、加倍的增强子、Ω序列及Kozak序列，3’端的多联终止序列、切割序列、正确加工序列以及NOS终止子。这些表达调控元件除35S启动子和增强子之外都是通过化学方法人工合成的(详见中国专利CN95119563.8,1995)。在本实验室所保存的质粒pG4AB中包括有这些元件。此外，该质粒还带有人工合成的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因表达盒(GFM CryⅠA基因)。
利用质粒pG4AB，经PstⅠ和SacⅠ双酶切后，回收3.5kb片段作为载体，将pGS8中的sGNA基因用PstⅠ和SacⅠ切下后连接到所回收的载体上去，得到重组质粒pG4AS8。在该质粒中则带有一整套复杂的sGNA基因表达盒。
2.2sGNA基因植物表达载体的构建用HindⅢ切下pG4AS8中的1.5kb杀虫基因，克隆到植物表达载体pBI121.1中的HindⅢ位点上，获得重组质粒pGBIGNA。这就是所构建的sGNA植物表达载体。其质粒图谱如附图2所示。
实施例3.sGNA植物表达载体向模式植物烟草中的导入及鉴定3.1 LBA4404感受态细胞的制备挑取LBA4404单菌落接种于5ml YEB(含链霉素100μg/ml)中，28℃,250rpm培养过夜。吸取2ml菌落加入50ml YEB培养基中，继续培养至OD值约为0.6。将菌液转至无菌离心管中，冰浴30分钟，5000rpm离心5分钟，用2ml 20mM的CaCl2重悬菌体，按每管200μl分装于无菌小离心管中。
3.2重组质粒转入LBA4404细胞在200μl LBA4404感受态细胞中分别加入2μg重组质粒pGBIGNA DNA，置冰浴5分钟，然后转至液氮中冷冻8分钟，迅速于37℃水浴中温育5分钟后，加入800μl YEB培养基，28℃ 250rpm预表达培养4～5小时，然后涂铺含有卡那霉素的YEB固体平板，28℃培养24～48小时。则长出的农杆菌菌落带有相应的转化质粒。
3.3烟草的转化(1)农杆菌的准备28℃过夜分别培养带有植物表达载体的农杆菌50ml，5000rpm离心5分钟，收集菌体沉淀，用液体MS培养液洗涤一次，再用MS重悬至OD600=0.2～0.4。
(2)浸染取烟草无菌苗叶片，用刀切成边长约0.5厘米小方块，在农杆菌悬液中浸泡5～10分钟，然后用灭菌滤纸吸干。
(3)共培养将叶块摆放在不加抗生素的共培养培养基中(上面垫二层滤纸)于25％避光共培养3天。
(4)选择培养将叶片继代到选择培养基中在光照培养箱中(光照12小时，黑暗12小时)培养至抗性芽的出现。
(5)抗性小苗的获得将愈伤移至生根培养基因，每隔二周继代培养一次，最后种植到小塑料钵中。
3.4转基因烟草的分子生物学鉴定3.4.1 PCR鉴定取1～3克烟草鲜叶片，加等量Al2O3用液氮研磨，将粉末置于50ml离心管中，加入20ml DNA提取缓冲液(100mM Tris.HCl pH8.0,500mM NaCl,10mM β-巯基乙醇，50mM EDTA pH8.0)，剧烈振荡1分钟，加入4ml 10％SDS，轻轻混匀，于65℃加热10～20分钟，至颜色翠绿，加入冰冷5M KAC 4ml，冰上放置30分钟，然后在4℃,12000rpm离心15分钟，吸上清，用0.6倍异丙醇沉淀后，用RNAase处理，纯化备用。
以转基因烟草的基因组DNA为模板，用所合成sGNA基因的特异性引物进行如下PCR反应在0.5ml Eppendorf管中加入H2o30.5μl10×PCR buffer 5μlMgCl2(25mM)3μl4×dNTP(各2.5mM) 5μlPrimerl(20pmol/μl) 2.5μlPrimer2(20pmol/μl) 2.5μl模板质粒pGUSO DNA(100ng/μl) 1μlTaq酶(3U/μl)0.5μl50μl石蜡油50μl反应程序为94℃ 3分钟93℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 60秒，35个循环72℃ 5分钟所用引物(20pmol/ul)为Primer(上链)5’-CCCATGGACTGCAGGCTTTACTCTGG-3’26b(SEQ ID NO:8)Primer(下链)5’-GAGCTCTCATTATCCAGTAGCCC-3’ 23b(SEQ ID NO:9)结果发现分别有与预期大小相符的DNA扩增片段。
3.4.2 PCR产物的Southern分析进一步进行PCR的Southern分析，(1)将植物DNA的PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶进行电泳并照相。
(2)将胶置于小盘中加入200ml变性液(0.5M NaOH,1.5M NaCl)振荡45分钟。
(3)弃去变性液，用蒸馏水漂洗数次，加入中和液(1M Tris,pH7.4,1.5MNaCl)200ml，振荡30分钟，然后更换新的中和液，继续中和15分钟。
(4)剪相应大小的硝酸纤维素膜(NC膜)，于蒸馏水中均匀湿透后，将NC膜浸于10×SSC(20×SSC每1000ml含NaCl 175.3g，柠檬酸钠88.2g pH7.0)中，放置20分钟。
(5)使用Bio-rad公司的转膜仪转膜1小时。
(6)去掉胶块，标记好加样孔位置，用6×SSC洗膜5分钟，然后紫外照射5分钟，以固定DNA。2×SSC洗膜，室温风干。
(7)将NC膜卷入杂交瓶中，加入20ml预杂交液(6×SSC,5×Denhardt,0.5％SDS,200ug/ml鱼精DNA)，使膜均匀浸润无气泡，然后置于DNA分子杂交仪中68℃预杂交过夜。
(8)探针的标记采用Promega公司随机引物试剂盒标记。取适量待标记DNA片段，95-100℃变性2分钟迅速置于冰上，在一新的Eppendrof管中，依次加入5×labling buffer 10μldCTP,dGTP,dTTP，混合物 2μl变性模板 25ngBSA2μlα-32P-dATP 5μl酶 1μl加H2O至总体积50μl轻轻混匀，室温反应60分钟。95％变性2分钟置于冰上。加入2μl 0.5MEDTA。
(9)向预杂交完毕的袋中加入变性探针30～50μl，重新封好继续于68℃杂交8～10小时。
(10)取出杂交膜用2×SSC,0.5％SDS洗膜30分钟，用2×SSC,0.1％SDS洗15分钟，再用0.1×SSC,0.5％SDS于42℃洗膜30分钟～数小时，中间更换新的洗膜液。
(11)0.1×SSC洗膜2分钟，用吸水纸吸去水珠，用保鲜膜包好膜，暗室中压片。
(12)-70℃放射自显影3～6小时后洗片。
结果表明，扩增产物的PCR-Southern的结果为阳性。
3.5转基因烟草的GUS分析取转基因烟草的叶片，切几个小块(0.5mm2)，放到1.5ml Eppendorf管中并加入15ul GUS底物，于37℃处理过夜。然后用95％乙醇脱色2小时，70％乙醇继续脱色数次，每次1小时以上。观察是否出现蓝色反应。结果证明，大部分转基因植株呈现明显的GUS阳性反应。
3.6转基因烟草的抗蚜虫能力测试采用如下方法1)．配制1％的琼脂糖，融化，倒入平皿中，以稍大于直径25MM的打孔器打孔。以直径25MM的打孔器取转基因烟草叶片及非转基因烟草叶片，注意避免大的叶脉处，放入琼脂内孔洞处，叶片下注入少量蒸馏水，保持叶片新鲜。
2)．将待接蚜虫机饿4小时，然后每片叶片接四头3-4龄蚜虫，每天观察、点数虫数。
3)．连续观察2-3周，记录蚜虫群体生长状况。
结果表明，获得的转基因植株具有程度不同的抑制蚜虫效果，抑制蚜口密度从30-85％不等。附图3为表达雪花莲凝集素GNA的转基因烟草桃蚜抑制试验结果。出图3可知，转基因植株对蚜虫抗性明显。
实施例4制备花粉管通道法转化植物用植物表达载体pGBIGNA超纯度质粒DNA4.1大量提取质粒pGBIGNA(1)接单菌落于20ml带有相应抗生素的液体LB培养基中，37℃,250rpm条件下振荡培养过夜。
(2)将菌液转入4000ml液体LB培养基中，继续培养8-12小时；(3)用5000rpm离心5分钟，收集菌体；(4)用STE 100ml悬浮洗涤菌体，合并各管于2个500ml离心管中，重新离心去上清；(5)分别向每管加入80ml SolutionⅠ(50mM蔗糖，10mM EDTA,25mM Tris-HCl pH8.0)，将菌体悬浮后加入160ml新配制的SolutionⅡ(0.2M NaOH,1％SDS)，轻轻混匀数次，冰上放置10分钟，再加入120ml预冷的SolutionⅢ(每100ml含5M KAC 60ml，冰乙酸11.5ml，蒸馏水28.5ml)，轻轻混匀，冰上放置30分钟；(6)8000rpm离心15分钟，收集上清，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置10分钟；(7)8000rpm离心15分钟，70％乙醇洗涤一次，溶于4ml TE(10mM Tris,1mM EDTA pH8.0)中，加RNAase 8μl(10mg/ml)37℃处理1小时；(8)用酚、氯仿抽提纯化一下，乙醇沉淀后溶于3mlTE中。
4.2超速离心进一步纯化所提取质粒DNA(用Beckman公司超速离心机)(1)在一个50ml离心管中加入2.9mlDNA溶液，6.6ml饱和氯化铯溶液，1ml溴化乙锭溶液(EB,10mg/ml)，混匀待用。
(2)上步中如有许多沉淀，则8000rpm离心5分钟。
(3)将上述混合液转入两个5.2ml超速离心管中，用Beckman超速离心机专用设备热封管口。
(4)用vTi80转头室温真空离心20小时，6,5000rpm。
(5)在暗室中紫外光下，先在离心管上部用针头穿孔，然后用5ml一次性注射器吸出质粒亮带。
(6)用水饱和正丁醇抽提数次去EB。
(7)用TE稀释三倍后用二倍无水乙醇4℃沉淀，离心，溶解后稀释待用。
实施例5植物受精胚囊注射法转化棉花编码GNA杀虫蛋白质的基因在植物中的高效表达，对于产生具有高抗虫性的转基因植物是最为关键的，但是外源基因转化植物是否能获得成功，也是致关重要的环节。在本发明之前，本领域科技人员熟知的利用农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电激法等方法转化植物虽然有许多成功的例子，但都存有不利的因素。如上述方法不仅受到实验室条件和昂贵的仪器及费用极高等的限制，更重要的是上述方法都有一个不利的共性，那就是受到植物基因型的限制。目前在生产上发挥着重要作用的优良植物品种，由于基因型的不同，不能通过愈伤途径再生成植株；或再生植株极为困难。在这样的情况下，本申请的发明人通过植物受精胚囊注射转化的技术或称植物受精胚囊注射转化法(CN95119563.8)，成功地获得了具有高抗虫能力的抗虫转基因棉花。虽然本发明优选棉花作为子房注射外源基因转化植物受精胚囊方法的起始植物，但并不限于棉花。子房注射外源基因转化植物受精胚囊技术的优点在于1)．适合于所有植物的基因型；2)．方法简单，有效；3)．不受实验室条件、仪器的限制，且费用低；4)．速度快，一年内即可获得转基因植物种子及后代。
在本实例中，子房注射外源基因转化植物受精胚囊的方法，是在棉花开花授粉后的大约10-24小时之间。如在珠心孔道封闭之前，用微量注射系统将外源基因溶液注射到子房内，外要材料即可通过珠孔和珠心孔道，逐渐扩散到或在珠心孔道封闭的过程中被挤压到刚受精后的胚囊内。在受精卵分裂的过程中，外源基因被吸收整合到受精卵细胞的基因组中，从而完成外源基因导入和整合过程。
棉花是常异花授粉作物，为保持品种(系)的相对纯度，在开花的前一天下午，将要在第二天开花的蕾用线扣紧，使花辨不易张开，以使其自花授粉。开花后约10小时左右，即当天开花的晚6点钟左右花粉管进入胚囊后，即可进行外源基因的注射。注射前将花辨连同雄蕊剥去露出幼铃，抹去幼铃顶端的花柱，我们设计的微量注射系统吸取预冷的外源基因溶液，从抹掉幼铃的顶端，沿中轴垂直插入幼铃大小的2/3处，再将微量注射器向上提到1/3的地方，留下约幼铃1/3的插入空间，缓慢将注射装置内的外源溶液注射到插入空间内。此后，外源DNA溶液将沿着珠孔和珠心孔道向受精胚囊内扩散，或由于珠心孔道在逐渐封闭而被挤压进受精胚囊中而实现其整合。一般注射的外源基因溶液为10μl，总量约为0.25-0.5μg。当然，对于不同的作物可根据其子房内胚珠数目的多少，适当地增加或减少外源基因的注射量。外源基因注射后，为了防止和减少幼铃的脱落，提高成铃率，在幼铃柄基部用毛笔涂沫40ppm的赤霉素或用浸有40ppm赤霉素的棉球夹在幼铃柄基部和茎(枝)之间，同时将所说注射外源基因的幼铃所在的枝条项端摘掉，以保持幼铃的充分营养，从而将有利于成铃和铃内种子的发育。
对注射后棉株所收获种子的后代进行抗虫及分子检测，获得抗虫棉植株。
实施例6所获得转基因抗虫棉的分子生物学检测及抗虫性测试采用实施例3.4和3.6的方法，对所获得的转基因棉花植株分别进行了PCR、PCR-Southern分析，以及抗蚜虫试验。证实了sGNA基因已导入到棉花中并高效表达。
附图4提供了对所获得抗虫棉植株进行PCR和PCR-Southern分子检测的试验结果照片。该试验结果证明了sGNA基因已成功转入到棉花基因组中。此外，还进行了抗虫棉的整株虫试试验每株棉花(包括抗虫棉和对照棉)各在顶尖幼芽处接10头三龄蚜虫，置于相同条件下用隔离罩扣上，10天后观察试验结果。结果发现，抗虫棉对蚜虫抗性十分明显，蚜虫数目很少，且生长状态不佳，每株约为30～80个不等，棉株叶片舒展，生长情况完全正常；对照棉上蚜虫数目较多，均在150个以上，且生长健康，棉株叶片萎缩。附图5提供了所获得抗虫棉植株对蚜虫抗性的一组试验照片。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)名称中国农业科学院生物技术研究中心(B)地址北京海淀区白石桥路30号(C)国家中国(D)邮编100081(F)电话(010)62184096(G)传真(010)62184096(ⅱ)发明名称合成编码雪花莲凝集素抗同翅目害虫基因及其应用(ⅲ)序列数15(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度333碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息人工合成的GNA基因序列(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:15′-CCCATGGACT GCAGGCTTTA CTCTGGAGAG ACTCTTTCTA CTGGAGAGTT CCTTAACTAC 60bpGGATCTTTCG TTTTCATCAT GCAAGAGGAT TGCAACCTTG TTCTTTACGA TGTTGATAAG 120bpCCAATTTGGG CTACTAACAC TGGAGGACTT TCTAGATCTT GCTTCCTTTC TATGCAAACT 180bpGATGGAAACC TTGTTGTTTA CAACCCATCT AACAAGCCAA TTTGGGCTTC TAACACTGGA 240bpGGACAAAACG GGAACTACGT TTGCATTCTT CAAAAGGATA GAAACGTTGT TATCTACGGA 300bpACTGATAGAT GGGCTACTGG ATAATGAGAG CTC-3’ 333bp(3)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度106个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅲ)其它信息雪花莲凝集素杀虫蛋白(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:21 5 10 15Met Asp Cys Arg Leu Tyr Ser Gly Glu Thr Leu Ser Thr Gly Glu16 20 25 30Phe Leu Asn Tyr Gly Ser Phe Val Phe Ile Met Gln Glu Asp Cys31 35 40 45Asn Leu Val Leu Tyr Asp Val Asp Lys Pro Ile Trp Ala Thr Asn46 50 55 60Thr Gly Gly Leu Ser Arg Ser Cys Phe Leu Ser Met Gln Thr Asp61 65 70 75Gly Asn Leu Val Val Tyr Asn Pro Ser Asn Lys Pro lle Trp Ala76 80 85 90Ser Asn Thr Gly Gly Gln Asn Gly Asn Tyr Val Cys Ile Leu Gln91 95 100 105Lys Asp Arg Asn Val Val Ile Tyr Gly Thr Asp Arg Trp Ala Thr106Gly(4)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(E)长度324碱基对(F)类型核苷酸(G)链型双链(H)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)假设序列是(ⅳ)其它信息人工合成GNA基因序列的设计方案(ⅴ)序列描述SEQ ID NO:3NNN ATG GAY TGY CGN/AGR CTN/TTR TAY TCN/AGY GGN GAR ACN CTN/TTRTCN/AGY ACN GGN GAR TTY CTN/TTR AAY TAY GGN TCN/AGY TTY GTN TTYATY/ATA ATG CAR GAR GAY TGY AAY CTN/TTR GTN CTN/TTR TAY GAY GTNGAY AAR CCN ATY/ATA TGG GCN ACN AAY ACN GGN GGN CTN/TTR TCN/AGYCGN/AGR TCN/AGY TGY TTY CTN/TTR TCN/AGY ATG CAR ACN GAY GGN AAYCTN/TTR GTN GTN TAY AAY CCN TCN/AGY AAY AAR CCN ATY/ATA TGG GCNTCN/AGY AAY ACN GGN GGN CAR AAY GGN AAY TAY GTN TGY ATY/ATACTN/TTR CAR AAR GAY CGN/AGR AAY GTN GTN ATY/ATA TAY GGN ACN GAYCGN/AGR TGG GCN ACN GGN TAR/TGA注N=A、C、G、或T(四种核苷酸中任何一种)Y=T或C(两种嘧啶碱基中任一种)R-A或G(两种嘌呤碱基中任一种)(5)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度109碱基(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息用于sGNA基因合成的寡核苷酸片段片段F-1(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:45′- CCCATGGACT GCAGGCTTTA CTCTGGAGAG ACTCTTTCTA CTGGAGAGTT CCTTAACTACGGATCTTTCG TTTTCATCAT GCAAGAGGAT TGCAACCTTG TTCTTTACG -3’ 109bp(6)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度108碱基(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息用于sGNA基因合成的寡核苷酸片段片段F-2(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:55′- CCATCAGTTT GCATAGAAAG GAAGCAAGAT CTAGAAAGTC CTCCAGTGTT AGTAGCCCAAATTGGCTTAT CAACATCGTA AAGAACAAGG TTGCAATCCT CTTGCATG-3’108bp(7)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度106碱基(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息用于sGNA基因合成的寡核苷酸片段片段F-3(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:65′-AGATCTTGCT TCCTTTCTAT GCAAACTGAT GGAAACCTTG TTGTTTACAA CCCATCTAACAAGCCAATTT GGGCTTCTAA CACTGGAGGA CAAAACGGGA ACTACG -3’106bp(8)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度110碱基(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息用于sGNA基因合成的寡核苷酸片段片段F-4(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:75′-GAGCTCTCAT TATCCAGTAG CCCATCTATC AGTTCCGTAG ATAACAACGT TTCTATCCTTTTGAAGAATG CAAACGTAGT TCCCATTTTG GCCTCCAGTG TTGCTTGCCC-3’ 110bp(9)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度24碱基(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息sGNA基因的PCR引物-1(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:85’-CCCATGGACTGCAGGCTTTACTCTGG-3’26b(10)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21碱基(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息sGNA基因的PCR引物-2(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:95’-GAGCTCTCATTATCCAGTAGCCC-3’23b(11)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度57碱基(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息Ω序列片段引物-1(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:105’-CCTAGGATCC TATTTTTACA ACAATTACCA ACAACAACAA ACAACAAACA ACATTAC-3’57(12)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度50碱基(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息Ω序列片段引物-2(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:115’-GTTGTTTGTT GTAATGTTAA TGATAAATGT TATTGTTACC TGACGTCGGG-3’50b(13)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度91碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息合成的Ω序列和Kozack片段(ⅳ)序列拙述SEQ ID NO:125’-CCTAGGATCC TATTTTTACA ACAATTACCA ACAACAACAA ACAACAAACA ACATTACAATTACTATTTAC AATAACAATG GACTGCAGCC C-3’91bp(14)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)长度802碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息外源基因表达盒5’端带有加倍增强子的35S启动子序列(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:13CAAGCTTCAT ACAGAGCTCA ATGACAAGAA GAAAATCTTC GTCAACATGG TGGAGCTCTC 60bTTACGAACGA CACGATTGTC TACTCCAAAA ATATCAAAGA TACAGTCTCA GAAGACCAAA120bGGGCAATTGA GACTTTTCAA CAAAGGGTAA TATCCGGAAA CCTCCTCGGA TTCCATTGCC180bCAGCTATCTG TCACTTTATT GTGAAGATAG TGGAAAAGGA AGGTGGCTCC TTACAATGCC240bATCATTGCGA TAAAGGAAAG GCCATCGTTG AAGATGCCTC TGCCGACAGT GGTCCCAAAG300bATGGACCCCC ACCCACGAGG AGCATCGTGG AAAAAGAAGA CGTTCCAACC ACGTCTTCAA360bAGCAAGTGGA TTGATGTGAT ACTCCAAAAA TATCAAAGAT ACAGTCTCAG AAGACCAAAG420bGGCAATTGAG ACTTTTCAAC AAAGGGTAAT ATCCGGAAAC CTCCTCGGAT TCCATTGCCC480bAGCTATCTGT CACTTTATTG TGAAGATAGT GGAAAAGGAA GGTGGCTCCT TACAATGCCA540bTCATTGCGAT AAAGGAAAGG CCATCGTTGA AGATGCCTCT GCCGACAGTG GTCCCAAAGA600bTGGACCCCCA CCCACGAGGA GCATCGTGGA AAAAGAAGAC GTTCCAACCA CGTCTTCAAA660bGCAAGTGGAT TGATGTGATA TCTCCACTGA CGTAAGGGAT GACGCACAAT CCCACTATCC720bTTCGCAAGAC CCTTCCTCTA TATAAGGAAG TTCATTTCAT TTGGAGAGGA CACGCTGAAA780bTCACCTCTAG AGGATCCCCG GG 802b(15)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度35碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息读码框不同的终止子编码序列(UT)(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:145’-CACTCGAGGC TGAATGAGTA AGTGAGTAGG TTAAC-3’35bp(16)SEQ ID N0:15的信息(ⅰ)序列特征(A)长度95碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅲ)其它信息正确切割和修饰以及植物多腺苷信号肽序列(ⅳ)序列描述SEQ ID NO:155’-GGTTAACTTT GAGTATTATG GCATTGGAAA AGCCATTGTT CTGCTTGTAA TTTACTGTGTTTCTTTCAGT TTTTGTTTTC GGAAATAAAG TTAAC-3’ 95bp
权利要求
1．合成的编码雪花莲凝集素杀虫蛋白质或其部分的如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列及其功能等同序列。
2．根据权利要求1的核苷酸序列，特征在于其编码具有如SEQ ID NO:2所示的雪花莲凝集素的氨基酸序列或其部分及其功能等同蛋白质。
3．根据权利要求1的核苷酸序列，其功能等同序列符合SEQ ID NO:3所示核苷酸序列或其部分。
4．根据权利要求1至3中任一项的核苷酸序列，特征在于其基本上是由适合于在普通植物细胞中表达的优化密码子组成的。
5．适于在植物细胞中表达权利要求1的核苷酸序列的融合植物表达载体。
6．根据权利要求5的融合植物表达载体，其中包含的雪花莲凝集素基因表达盒包含a)．5′端非编码区b)．根据权利要求1～4的核苷酸序列c)．3′端非编码区
7．根据权利要求6的融合植物表达载体，其中a)所说的5′端非编码区由两个增强子序列，一个启动子序列，一个衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因的翻译增强序列，和一个编码核糖体结合蛋白的序列组成。
8．根据权利要求7的5′端非编码区，其中所说的带有加倍的增强子元件的CaMV 35S启动子序列具有如SEQ ID NO:13的核苷酸序列或其功能等同序列。
9．根据权利要求7的5′端非编码区，其中所说的翻译增强序列是Ω序列和Kozak序列，具有如SEQ·ID NO:12的核苷酸序列或其功能等同序列。
10．根据权利要求6的雪花莲凝集素基因表达盒，其中c)中所说的3′端非编码区包含一个多联终止子序列，具有如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列或其功能等同序列。一个融合基因转录产物的切割序列和一个融合基因转录产物的加工序列，具有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序或其功能等同序列。
11．可构建在植物表达载体中并在植物细胞或整株植物中表达雪花莲凝集素的基因表达盒，其具有保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO.0363的携带于大肠杆菌DH5α中的重组载体pG4AS8的特征。
12．产生对同翅目害虫有杀虫性的植物的方法，该方法包括1)．构建所说的如权利要求5至10所描述的融合植物表达载体；2)．用任何一种可行方法将步骤1)中得到的融合植物表达载体导入到植物细胞内，并由此获得对害虫有抗性或杀伤能力的转基因植物及其后代，包括种子和任何部分的植物组织。
13．根据权利要求12的方法，其中所说的植物是可表达权利要求5的融合植物表达载体的任何一种植物。
14．根据权利要求12的方法，其中所说的植物是棉花。
全文摘要
本发明提供了人工合成的编码雪花莲凝集素的基因。涉及包含所说基因的融合基因构建体,携带该构建体的新的重组表达载体。该表达载体具有在普通植物中高效表达的特性。还涉及被所说的表达载体转化的植物细胞,以及由所说的转化细胞产生的对害虫,尤其是对同翅目害虫表现有杀虫性的转基因植物及其后代,包括植物种子及植物组织。本发明尤其涉及了抗蚜虫转基因棉花。
文档编号A01H1/00GK1222578SQ9812023
公开日1999年7月14日 申请日期1998年10月6日 优先权日1998年10月6日
发明者郭三堆 申请人:中国农业科学院生物技术研究中心