专利名称：源于革兰氏阳性细菌的过敏反应诱导物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及将源于诸如密执安棍状杆菌坏腐亚种(Clavibactermichiganensis subsp．sepedonicus)的革兰氏阳性细菌的过敏反应诱导物用于抗病、改善生长和昆虫防治的用途。
本申请要求申请日为1997年8月6日的美国临时专利申请流水号60／057，464的优先权。
背景技术：
细菌病原体及其植物宿主之间的相互作用一般分成两种类型(1)相容型(病原体-宿主)，在宿主植物上导致细胞间细菌生长，症状出现，和疾病发展；和(2)不相容型(病原体-非宿主)，导致过敏反应，发生一种特殊类型的不相容的相互作用，而没有逐渐发病症状。在宿主植物上的相容性相互作用期间，细菌群体急剧增加，并逐渐出现症状。在不相容性相互作用期间，细菌群体不增加，并且不出现逐渐发展的症状。
所述过敏反应(HR)是一种快速的、局部的坏死，这种坏死与植物针对很多病原体的主动防御有关(Kiraly，Z．，“由入侵者引起的防御过敏反应”，201-224页，参见植物病害最新论文，第5卷，J．G．Horsfall和E．B．Cowling编著，学术出版社，纽约(1980)；Klement，Z．，“过敏反应”，149-177页，参见植物致病性原核生物，第2卷，M．S．Mount和G．H．Lacy编著，学术出版社，纽约(1982))。如果高浓度(≥107细胞／ml)的诸如丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)或解淀粉欧文氏菌的有限宿主范围的病原体渗入非宿主植物的叶片的话，很容易通过组织的崩解观察到由细菌引起的过敏反应(坏死仅发生在接种物下部叶片分离的植物细胞上)(Kiraly，Z．，“快速检测植物致病性假单胞菌的致病性”，自然199299-300；Kiraly等，“由植物致病性细菌在烟草叶片中诱导的过敏反应”，植物病理学54474-477，(1963)；Turner等，“与过敏反应有关的植物和细菌细胞之间的定量关系”，植物病理学64885-890(1974)；Kiraly，Z．，“过敏反应”，149-177页，参见植物致病性原核生物，第2卷，M．S．Mount和G．H．Lacy著，学术出版社，纽约(1982))。在非宿主中引起过敏反应的能力似乎与在宿主中的致病性有关。正如Kiraly，Z．(“过敏反应”，149-177页，参见植物致病性原核生物，第2卷，M．S．Mount和G．H．Lacy著，学术出版社，纽约)披露的，所述病原体还能在其与相容性宿主的相互作用中导致生理学上相似的(虽然是推迟的)坏死。另外，产生过敏反应或致病性的能力取决于同一类基因，被称为hrp(Lindgren，P．B．等，“控制豆类植物的致病性和在非宿主植物上的过敏反应的丁香假单胞菌菜豆致病变种的基因簇”，细菌学杂志168512-22(1986)；Willis，D．K．等，“植物病原性细菌的hrp基因”，分子植物-微生物相互作用4132-138(1991))。因此，过敏反应可以提供植物防御的性质和细菌致病性基础的线索。
所述hrp基因广泛分布于格兰氏阳性植物病原体中，在此，这些基因是成簇的，保守的，并且在某些情况下是可以相互交换的(Willis，D．K．等，“植物病原性细菌的hrp基因”，分子植物-微生物相互作用4132-138(1991)；Bonas，U．“植物病原性细菌的hrp基因”，79-98页，参见微生物学和免疫学的现代主题植物和动物的细菌致病性-分子和细胞机制，J．L．Dangl著，Springer-Verlag，柏林(1994))。几种hrp基因编码某种蛋白分泌途径的一些成分，这种途径类似于耶尔森氏菌、志贺氏菌和沙门氏菌用于分泌动物发病所必需的蛋白的途径(Van Gijsegem等，“在植物和动物病原菌之间致病性决定因子的进化保守性”，微生物学动态1175-180(1993))。在解淀粉欧文氏菌，丁香假单胞菌和青枯假单胞菌(Pseudomonas solancearum)中，业已证实了hrp基因控制富含甘氨酸的过敏反应蛋白诱导物的产生和分泌(He，S．Y．等，丁香假单胞菌丁香致病变种HarpinPss通过Hrp途径分泌的蛋白及其在植物中引起的过敏反应，细胞731255-1266(1993)，Wei，Z．-H．等，“解淀粉欧文氏菌的HrpI在Harpin的分泌中起作用，并且是新蛋白家族的一员”，细菌学杂志1757958-7967(1963)；Arlat，M．等，“PopAl，一种能在特殊的矮牵牛基因型上诱导过敏样反应的蛋白，是通过青枯假单胞菌的Hrp途径分泌的”，EMBO杂志13543-553(1994))。
所述蛋白的第一种发现于解淀粉欧文氏菌Ea321中，这种细菌能导致蔷薇科植物的火疫病，该蛋白被命名为harpin(Wei，Z．-M．等，“Harpin，由植物病原体解淀粉欧文氏菌产生的过敏反应诱导物”，科学25785-88(1992))。在编码hrpN基因过程中的突变揭示harpin是解淀粉欧文氏菌在非宿主烟草叶片中诱导过敏反应所必需的，并且能在高度易感的梨果上引起发病症状。青枯假单胞菌GMI1000PopA1蛋白具有类似的物理特性，而且也能在烟草的叶片中引起过敏反应，而烟草不是这种菌株的宿主(Arlat，M．等，“PopAl，一种能在特殊的矮牵牛基因型上诱导过敏样反应的蛋白，是通过青枯假单胞菌的Hrp途径分泌的”，EMBO杂志13543-553(1994))。不过，青枯假单胞菌popA突变型仍然能在烟草中引起过敏反应，并在番茄中导致发病。因此，所述富甘氨酸过敏反应诱导物的作用在格兰氏阳性植物病原体之间可以有很大的变化。
业已分离、克隆了其它一些植物致病性过敏反应诱导物，并测定了其序列。其中包括菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)(Bauer等，“菊欧文氏菌HarpinEch软腐致病性”，MPMI8(4)484-91(1995))；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)(Cui等，“胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovora subsp．carotovora)菌株Ecc71的RsmA-突变体能超量表达hrpNEcc，并且能在烟草叶片中引起过敏反应样反应”，MPMI9(7)565-73(1966))；施氏欧文氏菌(Erwinia stewartii)(Ahmad等，“Harpin不是施氏欧文氏菌在玉米上的致病性所必需的”，第8届国际分子植物-微生物相互作用大会，1996年7月14-19日，以及Ahmad等，Harpin不是施氏欧文氏菌在玉米上的致病性所必需的”，美国植物病理学协会年会，1996年7月27-31日)；丁香假单胞菌丁香致病变种(WO94／26782，该专利属于Cornell Research Foundation公司)。
本发明涉及源于革兰氏阳性细菌的过敏反应诱导蛋白或多肽的用途。
发明概述所述源于诸如棍状杆菌属，特别是密执安棍状杆菌坏腐亚种的革兰氏阳性细菌的过敏反应诱导蛋白或多肽可用于赋予植物抗病性，改善植物生长，和／或防治昆虫。其中包括以非感染形式将所述过敏反应诱导蛋白或多肽施加到植物或植物种子上，处理条件为赋予植物或由所述植物种子长成的植物抗病性，改善植物生长，和／或防治昆虫。
作为将所述革兰氏阳性菌过敏反应诱导蛋白或多肽施加到植物或植物种子上以便赋予抗病性，改善植物生长，和／或防治植物上的昆虫的另一种方案，可以使用转基因植物或植物种子。当使用转基因植物时，该方法包括提供用编码过敏反应革兰氏阳性菌诱导蛋白或多肽的DNA分子转化过的转基因植物，并在能在所述植物或由所述植物种子长成的植物上有效产生抗病性，改善植物生长，和／或防治昆虫的条件下生长所述植物。另外，可以提供用编码革兰氏阳性过敏性反应诱导蛋白或多肽的DNA分子转化过的转基因植物种子，并将其播种到土壤中。然后，在能在所述植物或由所述植物种子长成的植物上有效产生抗病性，改善植物生长，和／或防治昆虫的条件下繁殖成植株。
发明详述本发明涉及将源于诸如棍状杆菌属，特别是密执安棍状杆菌坏腐亚种的格兰氏阳性细菌的过敏反应诱导蛋白或多肽用于在植物上抗病、改善生长、和防治昆虫的用途。该过敏反应诱导蛋白或多肽披露于Nissinen等的文章中，并可按该方法提取(“密执安棍状杆菌坏腐亚种能在烟草中诱导过敏反应并分泌过敏反应诱导蛋白”，植物病理学，678-84页(1997)，该文献被收作本文参考文献)。
编码所述过敏反应诱导蛋白或多肽的基因可以通过本领域众所周知的方法获得。所述蛋白可以通过诸如层析或电泳的常规技术纯化。测定其氨基末端序列，并用于设计简并寡核苷酸，对该核苷酸进行标记，并用作筛选克隆文库的探针。Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1989)，该文献被收作本文参考文献。从能与该氨基末端探针杂交的克隆中提取质粒DNA，并测序。该DNA分子的序列可以使用化学方法(Maxam等，Proc，Natl．Acad．Sci．USA，74560(1977)，该文献被收作本文参考文献)或酶学方法(Sanger等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，745463(1977)，该文献被收作本文参考文献)测定。
本发明包括上述过敏反应诱导多肽或蛋白的片段。
可以通过若干方法产生合适的片段。首先，通过常规分子遗传学操作，亚克隆基因片段产生编码本发明诱导蛋白的基因的亚克隆。然后在细菌细胞中，在体外或体内表达所述亚克隆，以便产生较小的蛋白或肽，按照下面所披露的方法可以测出所述蛋白或肽的诱导活性。
另外，可以通过用诸如胰凝乳蛋白酶或葡萄球菌蛋白酶A或胰蛋白酶的蛋白酶消化完整长度的诱导蛋白，产生诱导蛋白的片段。很可能不同的蛋白酶根据诱导蛋白的氨基酸序列裂解诱导蛋白的不同位点。由蛋白水解所产生的某些片段可能是具有活性的抗性诱导物。
在另一种方法中，根据对所述蛋白一级结构的了解，可以用PCR技术和被选择用于体现所述蛋白特定部分的特异性引物组合成所述诱导蛋白基因的片段。然后将这些片段克隆到合适的载体上，以便加强截短的肽或蛋白的表达。
还可用化学合成法制备合适的片段。所述合成是以待生产的诱导物的已知氨基酸序列进行的。另外，用高温和高压处理完整长度的诱导物也可以产生片段。然后可以通过常规方法(例如，层析，SDS-PAGE)分离这些片段。
还可以修饰变体(或者以此作为替代方案)，例如，缺失或添加对所述多肽的特性、二级结构和亲水性质具有最小影响的氨基酸。例如，可将一种多肽缀合到位于所述蛋白N-末端的信号(或前导)序列上，它能在翻译同时或在翻译之后指导该蛋白的转移。还可将所述多肽缀合到接头或其它序列上，以便于合成、纯化、或鉴定所述多肽。
本发明的蛋白或多肽优选通过常规技术以纯化形式生产(纯度优选为至少大约80％，更优选90％)。通常，本发明的蛋白或多肽被分泌到重组宿主细胞的生长培养基中，或者产生了本发明的蛋白或多肽，但不分泌到生长培养基中。在以上情况下，为了分离所述蛋白，可繁殖此携带重组质粒的宿主细胞(例如，大肠杆菌)，通过超声波、加热、压力差、或化学处理裂解，并对匀浆物进行离心，以便除去细菌碎片。然后对上清液进行顺序硫酸铵沉淀。在合适大小的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱上对含有本发明多肽或蛋白的级份进行凝胶过滤，以便分离所述蛋白。如果必要，可以通过HPLC对所述蛋白级份进行进一步纯化。
可以用常规重组DNA技术将编码过敏反应诱导多肽或蛋白的DNA分子整合到细胞中。通常，该方法包括将所述DNA分子插入与该DNA分子异源的表达系统中(即，该系统正常情况下不存在该分子)。以合适的有义取向和正确的读框将所述异源DNA分子插入所述表达系统或载体。该载体含有所插入的蛋白编码序列转录和翻译所必需的因子。
被收作本文参考文献的授予Cohen和Boyer的US4，237，224披露了用限制酶裂解和DNA连接酶连接以重组质粒的形式产生表达系统的方法。然后通过转化方法将所述重组质粒导入，并且在包括生长在组织培养物中的原核生物和真核细胞在内的单细胞培养物中复制。
还可将重组基因导入病毒，例如痘苗病毒。可以通过将质粒转染到感染了病毒的细胞中来产生重组病毒。
合适的载体包括，但不限于以下病毒载体，如λ载体系统gtll，gtWES．tB，Charon4，和质粒载体，如pBR322，pBR325，pACYC177，pACYC1084，pUC8，pUC9，pUC18，pUC19，pLG339，pR290，pKC37，pKC1501，SV40，pBluescriptII SK+／-或KS+／-(参见来自Stratagene的“Stratagene克隆系统”目录(1993)，La Jolla，加利弗尼亚，该资料被收作本文的参考文献)，pQE，pIH821，pGEX，pET系列(参见S．W．Studier等，“用T7RNA聚合酶指导克隆基因的表达”，基因表达技术，185卷，(1990)，该文献被收作本文参考文献)，及其任何衍生物。可以通过转化，特别是通过转导、接合、转移或电穿孔将重组分子导入细胞。用本领域标准的克隆方法将DNA序列克隆到载体中，所述方法如Sambrook等所述，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)，该文献被收作本文参考文献。
多种宿主载体系统可用于表达所述蛋白编码序列。首先，所述载体系统必须与所使用的宿主细胞相容。宿主-载体系统包括，但不限于以下系统用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化过的细菌；诸如含有酵母载体的酵母类微生物；用病毒(例如，痘苗病毒，腺病毒等)感染过的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如，杆状病毒)感染过的昆虫细胞系统；和用细菌感染过的植物细胞。所述载体的表达元件在其强度和专一性方面有所不同。根据所使用的宿主-载体系统，可以使用多种合适转录和翻译元件中的任一种。
由不同的遗传信号和加工过程控制多个基因表达的水平(例如，DNA转录和信使RNA(mRNA)翻译)。
DNA的转录取决于启动子的存在，启动子是指导RNA聚合酶结合并因此启动mRNA合成的DNA序列。真核启动子的DNA序列不同于原核启动子的DNA序列。另外，真核启动子以及相伴的遗传信号在原核系统中不能被识别或者不能起作用，而且，原核启动子在真核细胞中也不能被识别并且不能起作用。
类似地，在原核生物中mRNA的翻译取决于不同于真核生物的正确原核信号的存在。在原核生物中mRNA的有效翻译需要一个核糖体结合位点，该位点在mRNA上被称为Shine-Dalgarno(“SD”)序列。该序列是位于起始密码子(通常为AUG)之前的短mRNA核苷酸序列，所述起始密码子编码该蛋白的氨基末端甲硫氨酸。SD序列互补于16SrRNA(核糖体RNA)的3’末端，并有可能通过与rRNA形成双链体对核糖体进行正确定位而促进mRNA与核糖体的结合。关于增强基因表达的评述，参见Roberts和Lauer，酶学方法，68473(1979)，该文献被收作本文参考文献。
启动子的“强度”(即促进转录的能力)有所不同。为了表达克隆的基因，需要使用强启动子，以便获得高水平的转录，并因此获得该基因的高水平表达。根据所使用的宿主细胞系统，可以使用多种合适启动子中的任一种。例如，当在大肠杆菌、其噬菌体或质粒中克隆时，可将以下启动子用于指导相邻DNA区段的高水平转录如T7噬菌体启动子、lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、大肠杆菌λ噬菌体的PR和PL启动子以及其它启动子，包括，但不限于lacUV5，ompF，bla，lpp等。另外，通过重组DNA或其它合成DNA的技术产生的杂交trp-lacUV(tac)启动子或其它大肠杆菌启动子可用于进行插入基因的转录。
可以选择细菌宿主细胞菌株和表达载体，使其能在未受特别诱导时抑制所述启动子的作用。在某些操作中，为了有效转录插入的DNA，必须添加特殊的诱导物。例如，lac操纵子是通过添加乳糖或IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导的。诸如trp、pro等的多种其它操纵子受到不同的控制。
为了在原核细胞中进行有效的基因转录和翻译也需要特定的起始信号。如通过分别定量基因特异信使RNA和所合成的蛋白所测定的，这些转录和翻译起始信号的“强度”也可以变化。所述含有启动子的DNA表达载体，还可以含有各种“强”转录和／或翻译起始信号的组合。例如，在大肠杆菌中，有效翻译需要与起始密码子(“ATG”)的5’末端间隔大约7-9个碱基的SD序列，以便提供核糖体结合位点。因此，可以使用能被宿主细胞核糖体采用的任何SD-ATG组合。所述组合包括，但不限于源于Cro基因或大肠杆菌λ噬茵体的N基因，或源于大肠杆菌色氨酸E、D、C、B或A基因的SD-ATG组合。另外，可以使用重组DNA或包括掺入合成核苷酸的其它技术产生的任何SD-ATG组合。
一旦将编码所述过敏反应诱导多肽或蛋白的分离的DNA分子克隆到表达系统中，即可将其整合到宿主细胞中。所述整合可以通过上文提到的各种转化形式完成，这要取决于载体／宿主细胞系统。合适的宿主细胞包括，但不限于细菌、病毒、酵母、哺乳动物细胞、昆虫、和植物等。
本发明还涉及赋予植物抗病性、改善植物生长、和／或实现植物的昆虫防治的方法。所述方法包括以非感染形式将过敏反应诱导多肽或蛋白施加到植物或植物种子的全部或部分上，处理条件为所述多肽或蛋白接触所述植物或植物种子细胞的全部或部分。另外，还可将所述过敏反应诱导蛋白或多肽施加到植物上，以便由该植物本身所收获的种子能够在植物上产生抗病性，改善植物生长，和／或实现昆虫防治。
作为另一种方案，为了将过敏反应诱导多肽或蛋白施加到植物或植物种子上以便在所述植物或由所述种子长成的植物上产生抗病性，促进植物生长和／或防治昆虫，可以使用转基因植物或植物种子。在使用转基因植物时，该方法包括提供用编码过敏反应诱导多肽或蛋白转化过的转基因植物，并在能够有效实现由所述DNA分子赋予植物抗病性，改善植物生长、和／或防治昆虫的条件下栽培所述植物。另外，可以提供用编码过敏反应诱导多肽或蛋白的DNA分子转化过的转基因植物种子，并种植在土壤中。然后在由所述DNA分子能够有效赋予植物抗病性，改善植物生长、和／或防治昆虫的条件下，由播种的种子繁殖成植株。
本发明的将过敏反应诱导多肽或蛋白施加到植物或植物种子上的实施方案可以用多种方法完成，包括1)施加分离的诱导多肽或蛋白；2)施加不会导致发病并且用编码过敏反应诱导多肽或蛋白的基因转化过的细菌；和3)施加能导致某些植物种(但不会导致其所施加的植物种)发病，并且天然含有编码所述过敏反应诱导多肽或蛋白的基因的细菌。
在本发明的一种实施方案中，可以从其细菌源中分离本发明的过敏反应诱导多肽或蛋白。
在本发明的其它实施方案中，可以通过施加含有编码所述过敏反应诱导多肽或蛋白基因的细菌，将本发明的过敏反应诱导多肽或蛋白施加到植物或植物种子上。所述细菌必须能够分泌或输出所述多肽或蛋白，以便所述诱导物能够接触植物或植物种子的细胞。在以上实施方案中，所述过敏反应诱导多肽或蛋白是在植物体内或在种子上由细菌生产的，或者是正好在将所述细菌导入植物或植物种子之前产生的。
在本发明的细菌施加方式的一种实施方案中，所述细菌不会导致发病，并且已用编码过敏反应诱导多肽或蛋白的基因转化过(例如通过重组方式转化)。例如，可以用编码过敏反应诱导多肽或蛋白的基因转化不能在植物上诱导过敏反应的大肠杆菌，然后将其施加到植物上。在本发明的该实施方案中还可以使用除大肠杆菌之外的细菌种。
在本发明细菌施加模式的另一种实施方案中，所述细菌能够致病，并天然含有编码过敏反应诱导多肽或蛋白的基因。所述细菌的例子在上文中提及。不过，在该实施方案中，是将所述细菌施加到对由该细菌传播的病害不易感的植物或其种子上。
可将本发明的方法用于处理广泛多种植物或其种子，以赋予抗病性，改善植物生长，和／或防治昆虫。合适的植物包括双子叶和单子叶植物。更具体地讲，有用的作物类植物可以包括苜蓿、稻、小麦、大麦、黑麦、棉花、向日葵、花生、玉米、马铃薯、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、苦苣、甘蓝、抱子甘蓝、甜菜、欧洲防风、芜菁、花椰菜、花茎甘蓝、芜菁、萝卜、菠菜、洋葱、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡萝卜、南瓜、西葫芦、小西葫芦、黄瓜、苹果、梨、甜瓜、柑桔、草莓、葡萄、树莓、菠萝、大豆、烟草、番茄、高粱和甘蔗。合适的观赏植物的例子有拟南芥 (Arabidopsis thaliana)、 非洲紫苣苔属、矮牵牛、天竺葵属、一品红、菊、香石竹和百日菊属。
就将本发明的诱导蛋白或多肽用于产生抗病性的用途而言，可能不会产生对感染的绝对免疫性，但病害的严重程度得到减轻，症状发生被推迟。损伤数量、损伤大小、和真菌病原体的产孢量都得以减弱。这种赋予抗病性的方法具有处理以前不能处理的病害的潜力，对于系统性处理由于成本原因而不可能单独处理的病害并避免使用感染制剂或对环境有害的物质都具有潜力。
本发明赋予病原体抗性的方法可用于赋予对包括病毒、细菌、和真菌在内的多种病原体的抗性。通过本发明方法可以获得抗性，特别是对以下病毒的抗性烟草花叶病毒和番茄花叶病毒。根据本发明，可赋予植物抗性，特别是对以下细菌的抗性青枯假单胞菌、丁香假单胞菌烟草致病变种(Pseudomonas syringae pv．tabaci)，和野油菜黄单胞菌天竺葵致病变种(Xanthomonas campestris pv．pelargonii)。使用本发明的方法可赋予植物抗性，特别是对以下真菌的抗性尖镰孢(Fusarium oxysporum)知Phytophthora inf estans。
就将本发明的诱导蛋白或多肽用于改善植物生长的用途而言，可以获得各种形式的植物生长改善或促进作用。这种作用可以发生在从种子开始的植物生长早期或在植物生命的更晚时期。例如，根据本发明的植物生长包括更高的产量、增加的种子产量、更大的生物量、更多和更大的果实、更早的果实着色、和更早的果实和植物成熟。结果，本发明可以为种植者提供明显的经济效益。例如，萌发早和成熟早使得作物能够在生长期短的地区种植，否则它们不能在这些地区种植。种子萌发百分比的提高，可导致改善的作物植被状态和更有效地利用种子。较高的产量、较大的体积、和提高了的生物量使得能够从特定的土地面积上获取更大的收益。
本发明的另一方面涉及对植物进行任何形式的昆虫防治。例如，本发明的昆虫防治包括防止昆虫接触业已施加了所述过敏反应诱导物的植物，防止由于采食损害对植物造成的直接昆虫损害，导致昆虫离开所述植物，杀伤接近所述植物的昆虫，干扰昆虫幼虫在所述植物上采食，防止昆虫寄居在宿主植物上，防止寄居的昆虫释放植物毒素等。本发明还避免了由于昆虫感染而对植物造成的继发性病害。
本发明能有效地对抗多种昆虫。欧洲玉米钻心虫是玉米(马齿玉米和甜玉米)的主要害虫，这种害虫还能采食200种以上的植物，包括绿荚菜豆、黄荚菜豆、和利马菜豆和食用大豆、胡椒、马铃薯、和番茄，以及许多杂草物种。其它昆虫幼虫采食害虫能损害多种蔬菜类作物，这些害虫包括甜菜粘虫、甘蓝尺蠖、玉米穗虫、草地夜蛾、菜蛾、甘蓝根蛆、葱蛆、玉米种子蛆、泡菜野螟(甜瓜野螟)、胡椒蛆和番茄蛲虫。总体上讲，这一类昆虫害虫代表了世界范围内蔬菜生产在经济上最重要的一类害虫。
当对包括叶、茎、根、繁殖体(例如，插穗)等在内的植物的全部或部分进行处理时，施加本发明过敏反应诱导多肽或蛋白的方法可以通过多种方法完成。该方法可以(但不一定)包括将过敏反应诱导多肽或蛋白渗入植物。合适的施加方法包括表面喷施，如高压或低压喷雾、以及注射、和在进行诱导物施加时对邻近的叶片进行摩擦。在根据本发明的施用实施方案处理植物种子时，可以通过表面方法，如低压或高压喷雾、包衣、或浸泡以及通过注射施加过敏反应诱导蛋白或多肽。本领域技术人员可以设计出其它合适的施加方法，只要这些方法能够实现过敏反应诱导多肽或蛋白与植物或植物种子的细胞接触。一旦用本发明的过敏反应诱导物进行处理后，即可将所述种子播种到天然或人工土壤中，并用常规方法栽培，以便形成植株。在由按照本发明处理的种子繁殖出植株之后，可以通过一次或几次施加过敏反应诱导蛋白或多肽处理所述植株，以便赋予植物抗病性，改善植物生长，和／或防治植物上的昆虫。
根据本发明，可将所述过敏反应诱导多肽或蛋白单独或与其它物质混合施加到植物或植物种子上。另外，可以在不同时间分别将所述过敏反应诱导多肽或蛋白与其它材料施加到植物上。
根据本发明施加实施方案的适于处理植物或植物种子的组合物含有包含在一种载体里的过敏反应诱导多肽或蛋白。合适的载体包括水、水溶液、糊剂、或干粉。在该实施方案中，所述组合物含有高于500nM过敏反应诱导多肽或蛋白。
尽管不是必须，该组合物可以含有其它添加成分，包括肥料、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、及其混合物。合适的肥料包括硝酸铵。合适的杀昆虫剂的例子是马拉硫磷。适用的杀真菌剂包括克菌丹。
其它合适的添加剂包括缓冲剂、湿润剂、包衣剂和摩擦剂，这些材料可用于促进本发明方法的完成。另外，可将所述过敏反应诱导多肽或蛋白与包括粘土和多糖在内的其它常规种子配制和处理材料一起施加到植物种子上。
在本发明涉及使用转基因植物和转基因种子的另一种实施方案中，没有必要将过敏反应诱导多肽或蛋白局部施加到植物或种子上。而是按照本领域众所周知的方法，生产用编码过敏反应诱导多肽或蛋白的DNA分子转化过的转基因植物。
通过使用微量移液管可将上述载体直接显微注射到植物细胞中，从而通过机械方法转移重组DNA。Croosway，分子基因遗传学202179-85(1985)，该文献被收作本文参考文献。还可以用聚乙二醇将所述遗传物质转移到植物细胞中。Krens等，自然，29672-74(1982)，该文献被收作本文参考文献。
用能赋予对病原体的抗性的基因转化植物的另一种方法是对宿主细胞进行粒子轰击(又被称为轰击转化)。该方法可以用多种方法中的一种实现。首先包括将惰性或生物活性颗粒推进到细胞中。该技术披露于授予Sanford等的US4，945，050，US5，036，006和US5，100，792中，以上专利被收作本文参考文献。一般，该方法包括将惰性或生物活性颗粒推进到细胞中，以上过程是在能有效穿透所述细胞的外表面，并掺入到其内部的条件下进行的。当使用惰性颗粒时，可以通过用含有异源DNA的载体涂敷所述颗粒，将所述载体导入所述细胞中。或者，可以用所述载体包围靶细胞，以便所述载体能够被所述颗粒带入所述细胞。还可将生物活性颗粒(例如含有所述载体和异源DNA的干燥细菌细胞)推进到植物细胞中。
导入的另一种方法将原生质体与其它实体、小细胞、细胞、溶酶体或其它可融合脂类表面体融合。Fraley等，Proc，Natl．Acad．Sci．USA，791859-63(1982)，该文献被收作本文参考文献。
还可以通过电穿孔将所述DNA分子导入植物细胞。Fromm等，Proc，Natl．Acad．Sci．USA，855824(1985)，该文献被收作本文参考文献。在该技术中，在存在含有所述表达框的质粒的条件下对植物原生质体进行电穿孔。高电场强度的电脉冲可逆地穿透生物膜，以便导入所述质粒。电穿孔的植物原生质体重新形成细胞壁、分裂、并再生。
将所述DNA分子导入植物细胞的另一种方法是用所述基因转化的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物细胞。在本领域已知的合适条件下，让转化的植物细胞生长形成芽或根，并进一步发育成植株。一般，该方法包括用细菌悬浮液接种植物组织，并在25-28℃下在含抗生素的再生培养基上培养所述组织48-72小时。
农杆菌属是格兰氏阴性根瘤菌科的一个代表性的属。这种细菌决定冠瘿病(根癌农杆菌)和毛根病(发根农杆菌)的发生。冠瘿瘤和毛根中的植物细胞被诱导产生被称为冠瘿碱的氨基酸衍生物，该衍生物仅能由这种细菌分解代谢。决定冠瘿碱表达的细菌基因，是用于嵌合表达框控制因子的常见来源。另外，测定冠瘿碱的存在可被用于鉴定转化的组织。
借助于根癌农杆菌的Ti质粒或发根农杆菌的Ri质粒，可以将异源遗传序列导入合适的植物细胞。通过农杆菌属将Ti或Ri质粒转入感染的植物细胞中，并稳定整合到植物基因组中。J．Schell，科学，2371176-83(1987)，该文献被收作本文参考文献。
在转化之后，必须对转化过的植物细胞进行再生。
由培养的原生质体进行植物再生的方法披露于以下文献中Evans等，植物细胞培养手册，第1卷(麦克米兰出版公司，纽约，1983)；和Vasil I．R(著)，植物细胞培养和体细胞遗传学，学术出版社，0rlando，第1卷，1984，或第3卷(1986)，以上文献被收作本文参考文献。
众所周知，实际上所有植物都可以从培养的细胞或组织再生，包括，但不限于甘蔗、甜菜、棉花、果树和豆科植物的所有主要种。
再生方法因植物种而有所不同，但通常首先提供转化过的原生质体的悬浮液或含有转化的外殖体的培养平板。形成愈伤组织，并由愈伤组织诱导发芽，然后长根。另外，可以在愈伤组织中诱导胚胎形成。这种胚胎像天然胚胎一样萌发形成植株。所述培养基通常含有各种氨基酸和激素，如生长素和细胞分裂素。将谷氨酸和脯氨酸加入所述培养基也是有利的，特别是对于诸如玉米和苜蓿的种来说尤其如此。有效的再生取决于培养基、基因型、和培养物的历史。如果对以上三个可变参数加以控制，再生通常是可以再现的和可以重复的。
在所述表达框稳定整合到转基因植物中之后，可以通过有性杂交将其转移到其它植物中。可以使用多种杂交技术中的任一种，这要取决于被杂交的物种。
一旦产生这种类型的转基因植物，可以按照常规方法在有编码所述过敏反应诱导物的基因的条件下培养所述植物，导致抗病性，改善植物生长，和／或防治所述植物上的昆虫。另外，可从所述转基因植物上回收转基因种子，然后可将这些种子种植到土壤中，并用常规方法栽培，产生转基因植物。在能有效赋予植物抗病性、改善植物生长、和／或防治昆虫的条件下，由播种的转基因种子繁殖转基因植物。尽管不希望受理论的限制，但所述抗病性、生长改善作用、和／或昆虫防治可能是RNA介导的或是由于诱导多肽或蛋白表达所致。
根据本发明当使用转基因植物和植物种子时，还可以用处理施加了过敏反应诱导多肽或蛋白处理过的植物和种子相同的材料对它们进行额外的处理。所述其它材料包括过敏反应诱导物，可通过上述方法将其施加到转基因植物和植物种子上，这些方法包括高压或低压喷雾、注射、包衣、和浸泡。类似地，在从所述转基因植物种子繁殖出植株之后，可以通过一次或几次施加过敏反应诱导物处理所述植株，以赋予其抗病性、改善生长、和／或防治昆虫。所述植物还可以用常规植物处理剂(例如，杀昆虫剂、肥料等)处理。
尽管业已出于说明目的而对本发明进行了详细说明，但应当理解的是，以上细节仅仅是用于说明目的的，本领域技术人员可以在不脱离由以下权利要求书限定的本发明构思和范围的前提下作出各种变化。
权利要求
1．一种赋予植物抗病性的方法，包括在蛋白或多肽接触植物或植物种子细胞并赋予抗病性的条件下，以非感染形式将源于革兰氏阳性细菌的过敏反应诱导蛋白或多肽施加到植物或植物种子上。
2．如权利要求1的方法，其中，在所述施加期间处理植物。
3．如权利要求1的方法，其中，在所述施加期间处理植物种子，所述方法还包括将用所述过敏反应诱导物处理过的种子播种到天然或人工土壤中，和由所述播种到土壤中的种子繁殖植株。
4．如权利要求1的方法，其中，所述革兰氏阳性细菌是棍状杆菌属。
5．如权利要求4的方法，其中，所述棍状杆菌属是密执安棍状杆菌坏腐亚种。
6．一种改善植物生长的方法，包括在蛋白或多肽接触植物或植物种子细胞并改善植物生长的条件下，以非感染形式将源于革兰氏阳性细菌的过敏反应诱导蛋白或多肽施加到植物或植物种子上。
7．如权利要求6的方法，其中，在所述施加期间处理植物。
8．如权利要求6的方法，其中，在所述施加期间处理植物种子，所述方法还包括将用所述过敏反应诱导物处理过的种子播种到天然或人工土壤中，和由所述播种到土壤中的种子繁殖植株。
9．如权利要求6的方法，其中，所述革兰氏阳性细菌是棍状杆菌属。
10．如权利要求9的方法，其中，所述棍状杆菌属是密执安棍状杆菌坏腐亚种。
11．一种用于植物昆虫防治的方法，包括在蛋白或多肽接触植物或植物种子细胞并防治昆虫的条件下，以非感染形式将源于革兰氏阳性细菌的过敏反应诱导蛋白或多肽施加到植物或植物种子上。
12．如权利要求11的方法，其中，在所述施加过程中处理植物。
13．如权利要求11的方法，其中，在所述施加期间处理植物种子，所述方法还包括将用所述过敏反应诱导物处理过的种子播种到天然或人工土壤中，和由所述播种到土壤中的种子繁殖植株。
14．如权利要求11的方法，其中，所述革兰氏阳性细菌是棍状杆菌属。
15．如权利要求14的方法，其中，所述棍状杆菌属是密执安棍状杆菌坏腐亚种。
全文摘要
本发明涉及源于密执安棍状杆菌坏腐亚种(Clavibavtermichiganens is subsp.sepedonibus)等格兰氏阳性细菌的蛋白或多肽的用途,该蛋白或多肽能在植物上引起过敏反应。该蛋白或多肽可用于赋予植物抗病性,改善植物生长,和/或防治植物上的昆虫。这一目的可以通过以非感染形式将所述过敏反应诱导蛋白或多肽施加到植物或植物种子上而实现,处理条件为能够有效赋予植物或由所述植物种子长成的植物抗病性,改善植物生长。和/或防治昆虫。
文档编号A01N63/00GK1280459SQ98810797
公开日2001年1月17日 申请日期1998年8月20日 优先权日1997年9月3日
发明者S·V·贝尔, J·L·布特勒 申请人:康乃尔研究基金会有限公司, 伊登生物科学有限公司