专利名称：“试管牛”技术产业化工艺流程的制作方法
技术领域：
本发明属生物工程技术，特别涉及动物的繁殖方法。
“试管家畜”技术，也叫家畜体外受精技术(In Vitro Fertilization,IVF)，是指通过人工操作使家畜的卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并能够发育为早期胚胎的技术。这项技术在家畜最早取得成功的是在1982年，美国的Brackett等(Bio.Reprod.,27:147-158)用高渗溶液处理牛精子，得到了世界首例体外受精的小牛。但他们所采用的精子获能方法重复性很差，包括他们自己也未能得到重复的结果。1984年本专利申请者(旭日干)和日本学者花田章，首次利用钙离子载体Ionophore A23187和咖啡因等化学药物诱导山羊、绵羊及牛精子获能均获得成功，并利用此方法培育出世界首胎体外受精山羊(Bull Nippon Vet.and Zootech.Coll.,33:219-221)。后来这一方法在日本、英国、美国、中国和俄罗斯等多国的实验室，在绵羊、牛和猪等多种家畜的实验中取得成功，并在此基础上逐步发展成为比较成熟的，可开发利用的生物高技术。
申请者自1987年起主持国家“863”高技术计划项目“牛体外受精技术的研究与开发”，经过“七五”基础研究、“八五”应用研究和“九五”中试开发研究取得了重大进展。于1989年培育出了国内首胎、首批“试管绵羊”(1989，内蒙古大学学报，20:564-569)和“试管牛”(1990，中国科学通报，21:1666-1667)。同时创造性地提出了利用屠宰家畜卵巢卵母细胞工厂化生产“试管胚胎”的技术路线，提出了牛体外受精技术产业化工艺流程，提出了利用羔羊卵子进行“试管内杂交育种”的新概念，新技术。
本发明的目的是利用“试管牛”技术产业化工艺流程，可以批量引进国外良种家畜的遗传资源，在国内进行规模化纯种繁殖，从而迅速扩大良种畜群的规模，以推动我国养牛业，特别是肉牛养殖业的良种化、产业化进程。这一技术过程的主要特点是成本低、速度快、数量大和效果好，因此该项技术具有任何一项常规技术都不可替代的优势。
本发明的内容在国外利用不同优良品种牛的资源，大批量生产纯种肉牛和奶牛试管胚胎，运回国内进行大规模胚胎移植，从而达到国内牛品质的迅速改良，满足国内对高档肉牛和奶牛的需求，这就是本项技术的主要目的。这一技术路线及其生产规模目前在国际上尚无前例。
(1)从国外屠宰场中采集优良品种纯种牛卵巢，带回实验室后从卵巢表面回收卵母细胞。将卵母细胞在体外成熟培养液中培养成熟后进行体外受精处理，受精用精子采用与卵巢相同品系的种公牛精子。体外受精卵在体外培养系统内继续被体外发育培养至囊胚期，然后将发育良好的优质胚胎经冷冻保存处理后储存于液氮罐中。在整个体外受精培养过程中，培养液中添加的任何成分均确定不含有任何病原体，从而保证批量生产出的良种牛试管胚胎为不带有病原体的胚胎。
(2)将保存于液氮罐中的胚胎运回国内。胚胎解冻后移植到国内遗传品质较差的受体牛子宫内。
(3)受体牛受孕后产下优良品种的纯种牛犊。
(4)良种犊牛经18个月的饲养发育至育成期小牛。
(5)优良品种的育成期小牛经3-5个月的育肥饲养后成为育肥牛。
(6)将育肥牛送至屠宰场屠宰可以得到高品质的牛肉。
(7)屠宰得到的高品质的牛肉可直接供应市场。
(8)屠宰过程中得到的卵巢又可用于生产良种牛试管胚胎。
(9)选择发育状况优秀的育成期小牛，经饲养后可成为种牛。良种母牛经超数胚卵处理后可以获得优质良种胚胎，用于胚胎移植。
(10)没有受孕的受体母牛可以利用优良品种牛的精液进行人工授精，生产出具有较高经济价值的杂交一代小牛，经育肥后屠宰。这样既可以得到较高质量的牛肉，又可避免了受体牛空怀造成的经济损失。
本发明的优点和积极效果1．采用此项工艺可以工厂化、大规模生产牛试管胚胎。利用本技术从屠宰场采集的卵巢卵母细胞的30％以上可以发育至可供胚胎移植的囊胚期胚胎，然后将这些胚胎进行冷冻保存。在此条件下两名研究人员在国外一年可以生产近万枚胚胎，这一生产量是其他任何技术不能达到的。试管胚胎的大规模生产可以充分保证国内大规模胚胎移植所用胚胎的供应，从而为这一技术的产业化提供保障。
2．采用此项工艺可以短时间内大批量繁殖良种肉牛。利用运回国内的牛试管胚胎可以在国内大规模开展胚胎移植工作，目前牛试管胚胎的移植妊娠率为40％左右，一名胚胎移植工作人员一天可移植几十头牛，因此只要受体牛充足，每年可以获得大批试管牛犊。因为生产的试管牛胚胎均为纯种胚胎，因此胚胎移植得到的牛犊均为纯种牛犊，实现了牛遗传品种的一步改良。如果采用传统的牛遗传品种改良方法(如人工授精)，一个品种的改良往往需要20年以上的时间，而且得到的改良品种仍不是纯种，如果管理不善很容易造成品种的退化。由此可以看出采用本工艺可以在短时间内得到大量的纯种牛，具有周期短，效果好的特点。
3．采用此项工艺可以极大地降低良种牛引进的成本。在此之前良种牛的引入主要采取活牛引入和从国外购买超排处理胚胎(体内受精胚胎)的方法。从国外购买一头纯种牛往往需要几万元人民币，而且很容易造成疾病的传播，运输也十分不方便。从国外购买超排处理胚胎防止了疾病的传播，胚胎的运输也十分便利，但每枚胚胎的价格都在200-300美元以上，价格十分昂贵，增加了引进牛的成本，不容易大规模推广。本项工艺避免了上述两种方法的缺陷，在国外生产的无病原体胚胎可以大批量运回国内，而且胚胎的成本十分低。两名研究人员一年在国外的实验费用及生活费用只需人民币十多万元，却可以生产出近万枚胚胎，这样每枚胚胎的成本只需人民币几十元。这样低成本的胚胎十分适合我国的国情，完全可以在国内大规模推广应用。
从以上几点可以看出，目前在国外良种牛的引进方法中，采用“试管牛”技术在国外生产试管胚胎，然后运回国内进行大规模胚胎移植是最有效的技术途径。
附图
为“试管牛”技术产业化工艺流程实施例在国外从屠宰场采集纯种牛卵巢。将采自屠宰场的卵巢带回实验室，从卵巢表面的卵泡内回收卵母细胞，采卵液为BSA+3mg/mlBSA。将卵母细胞置于Hepes缓冲的TCMl99+10％FCS+HCG+E2内成熟培养20-24小时，培养箱内条件为39℃,5％CO2。将与卵巢相同品种的种公牛冷冻精液置于37℃BO+10mM咖啡因内，以3000转/分离心洗涤2次，然后将精子移入BO+5mM咖啡因+10mg/mlBSA+5μg/ml肝素的受精培养液中，使精子浓度达到2×106ml。将成熟培养后的卵母细胞移入该精子悬液中，共同培养7小时进行受精处理。
将受精后的受精卵移入发育培养液中进行体外发育培养。受精卵在Hepes缓冲的TCM199+10％FCS+0.12mg/ml丙酮酸钠的培养液内培养48小时，将发育至8细胞期的胚胎移入含有卯丘细胞或输卵管上皮细胞的共同培养系统内培养至桑椹胚或囊胚阶段，然后进行冷冻保存。体外受精胚胎的冷冻保存方法为将囊胚期胚胎移入PBS+20％FCS+10％乙二醇+0.25M蔗糖的冷冻液中平衡15分钟，装入冷冻管中进行冷冻。冷冻程序为-7℃下停留10分钟，5分钟时进行植冰，然后以0.3℃/分的速度降温至-30℃，投入液氮中保存。
将保存于液氮罐中的胚胎运回国内，在旭日生物高科技有限公司牧场(位于呼和浩特市托克托县)和其他胚胎移植基地(大连，呼伦贝尔盟)进行胚胎移植。胚胎移植时先将保存于液氮罐中的胚胎进行解冻处理，解冻时将含有胚胎的冷冻管置于30℃水浴中解冻，然后将胚胎移入PBS+20％FCS+0.7M蔗糖的解冻液中停留10分钟，最后移入PBS+20％FCS中待移植。选择营养状况良好、发情后6-7天的受体母牛，利用非手术方法将解冻后的胚胎移入受体牛子宫内，观察受体牛妊娠情况。对妊娠母牛需加强管理，防止流产发生。母牛妊娠十个月后即可产下纯种牛犊。
采用上述工艺流程，在澳大利亚用三年的时间生产出了一万七千余枚胚胎。在胚胎的生产过程中，卵母细胞受精后的卵裂率为80％以上，囊胚的发育率为40％左右，冷冻胚胎解冻后的形态正常率为80％以上。通过国内的胚胎移植工作，现已获得纯种试管牛70多头，最好的移植受胎率可达40％以上。目前国内的胚胎移植工作正在大规模地开展中。与此同时在加拿大建成了第二个良种牛“试管胚胎”生产实验室，用以进一步扩大胚胎来源和良种牛的品种资源。
权利要求
1.试管牛技术产业化工艺流程，其特征是下列步骤组成(1)从屠宰场中采集优良品种纯种牛卵巢，从卵巢表面回收卵母细胞，采卵液为PBS+3mg/mlBSA，将卵母细胞在体外成熟培养液中培养成熟后进行体外受精处理，受精用精子采用与卵巢相同品系的种公牛精子，体外受精卵在体外培养系统内继续体外发育培养至囊胚期，然后将发育良好的优质胚胎经冷冻保存处理后储存于液氮罐中，在体外受精培养过程中，培养液添加的任何成分均确定不含有任何病原体；(2)将保存于液氮罐中的胚胎解冻后移殖到遗传品质较差的受体牛子宫内；(3)受体牛受孕后产下优良品种的纯种牛犊；(4)良种犊牛经18个月的饲养发育至育成期小牛；(5)优良品种的育成期小牛经3-5个月的育肥饲养后成为育肥牛；(6)将育肥牛送至屠宰场屠宰可以得到高品质的牛肉；(7)屠宰得到的高品质的牛肉可直接供应市场；(8)屠宰过程得到的卵巢又可用于生产良种牛试管胚胎；(9)选择发育状况优秀的育成期小牛，经饲养后可成为种牛，良种母牛经超数排卵处理后可以获得优质良种胚胎，用于胚胎移植；(10)没有受孕的受体母牛可以利用优良品种牛的精液进行人工受精，生产出具有较高经济价值的杂交一代小牛，经育肥后屠宰，可以得到较高质量的牛肉。
2.如权利要求1所述的试管牛技术产业化工艺流程，其特征是步骤(1)中的培养液为Hepes缓冲的TCM199+10％FCS+HCG+E2，培养时间为20-24小时，培养箱条件为39℃、5％CO2，与卵巢相同品种的种公牛冷冻精液置于37℃BO+10mM咖啡因内，以3000转/分离心洗涤2次，然后将精子移入BO+5mM咖啡因+10mg/mlBSA+5μg/ml肝素的受精培养液中，使精子浓度达到2×106ml，培养7小时，受精后的受精卵在Hepes缓冲的tcm199+10％fcs+0.12mg/ml丙酮酸钠的培养液内培养48小时，将发育至8细胞期的胚胎移入含有卵母细胞或输卵管上皮细胞的共同培养系统内培养至桑椹胚或囊胚阶段，然后冷冻保存。冷冻程序为-7℃下停留10分钟，5分钟进行植冰，然后以0.3℃/分的速度降温至-30℃，投入液氮中保存。
3.如权利要求1所述的试管牛技术产业化工艺流程；其特征是步骤(2)胚胎解冻时将含有胚胎的冷冻管呈于30℃水浴中解冻，然后将胚胎移入PBS+20％FCS+0.7M蔗糖的解冻液中停留10分钟，最后移入PBS+20％FCS待移植，选择营养状况良好，发情后6-7天的受体母牛利用非手术方法将解冻后的胚胎移入受体牛子宫内。
全文摘要
本发明属生物工程技术,利用优良品种纯种牛卵巢回收卵母细胞,经体外成熟、体外受精、体外发育及胚胎冷冻和解冻后的移植,利用我国现有母牛做为受体牛,借腹怀胎,从而得到大批的优良品种纯种牛犊,本发明的优点是可以短时间内大批量繁殖良种肉牛,同时可以极大地降低良种牛引进的成本。
文档编号A01K67/02GK1226377SQ9910329
公开日1999年8月25日 申请日期1999年4月1日 优先权日1999年4月1日
发明者旭日干 申请人:旭日干