专利名称：：一种获得治疗性克隆植入前胚胎的制备方法
技术领域：
：本发明涉及治疗性克隆植入前胚胎的制备方法，更具体地，涉及用体细胞(尤其是人的体细胞)来治疗性克隆植入前胚胎的制备方法。所谓治疗性克隆，是指应用病人的体细胞移植到去核的卵母细胞内，经过一定的处理使其发育到囊胚，再利用囊胚建立ES细胞(是从早期内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养筛选分离出来的具有全能性和多能性的细胞)，在体外进行诱导分化成特定的组织或器官(如皮肤、软骨、乳房、肾脏、心、牙齿、心脏、肝脏、尿道、膀胱等等)，再将组织或器官移植到病人身上。利用这种方法解决组织或器官移植过程中最重要的排斥反应，而且解决了组织或器官的来源问题。然而，治疗性克隆的获得涉及到多种较为复杂的技术。哺乳动物细胞核移植，不仅在胚胎生物学研究中是一种很重要的工具，而且对“优良”胚胎(家畜)的扩繁也是一种较好的方法。在哺乳动物中，已应用早期的胚胎分裂球或胚胎来源的培养细胞(胚胎干细胞，简称为“ES细胞”)来提供细胞核，获得了相应的克隆动物绵羊(使用8-16细胞)[WilladsenS.M.,etal,Nature,1986]；兔(使用8-细胞)[SticeS.L.,etal,Bio.Reprod.,1989]；猪(使用2-8细胞)[PratherR.S.,etal.Biol.Reprod.,1989]；牛(使用2-32细胞)[PratherR.S.,etal.J.Anim.Sci.,1987,]；山羊(使用8-细胞)[张涌，“国外畜牧-草食家畜分册”，1993]；小鼠(使用ES-细胞)[TsundaY.,etal.JournalofReproductionandFertility.,1993]。1997年，Willmult等人应用乳腺上皮细胞进行核移植产生了绵羊多利[WillmutI.,etal.,Nature.1997]。随后，又获得了不同类型的体细胞克隆动物(1)胎儿成纤维细胞核移植绵羊[SchniekeA.E.,etal.,Science,1997]，(2)胎儿成纤维细胞核移植牛[GibelliJ.B.,etal.IBID,1998]，(3)输卵管上皮细胞核移植牛等。在异种动物核移植方面，也取得了可喜的进展，Dominko等人应用体外成熟的牛卵母细胞作通用的受体细胞，分别用牛、绵羊、猪、猴、兔的皮肤成纤维细胞(G0期，饥饿2-9天)作供核细胞，获得的重构胚在体内培养7天后约有14-38％的重构胚发育到椹桑或囊胚。据美国AdvanceCellTechnology公司98年11月23日宣布，将体细胞移植到去核的牛卵母细胞中，获得了发育至囊胚的胚胎并培育出具有全能性的人胚性干细胞。以上核移植动物或发育的重构胚均是应用细胞融合的方法制备的。此外，1988年WakayamaT等人利用小鼠的另一种体细胞-即卵丘细胞，先将该体细胞的细胞质去除，然后将细胞核直接注射到去核的鼠卵细胞细胞胞质内，产生了核移植小鼠[WakayamaT.,etal.,Nature,1988]。然而，上述的产生治疗性克隆植入前胚胎(尤其是用于人的)的方法所涉及到的步骤仍很繁多，因此本领域迫切需要步骤更少、效率更高获得治疗性克隆植入前胚胎的方法。本发明的目的就是提供一种步骤更少，效率更高的用人的体细胞来制备治疗性克隆植入前胚胎的方法。在该方法中，不对人的体细胞进行去除细胞质的处理，而是将体细胞直接注射到去核的卵母细胞中，并省去了细胞融合步骤；或者用于供核的人体细胞直接注射入非人哺乳动物的卵周隙中，再用电刺激法使人体细胞融合进卵母细胞内。在本发明的第一方面，提供了一种治疗性克隆植入前胚胎的制备方法，该方法包括以下步骤提供去核的非人哺乳动物供质卵母细胞和用于供核的人体细胞；用显微注射法，将用于供核的人体细胞直接注射人所述的去核供质卵母细胞，形成重构卵；或者将用于供核的人体细胞直接注射入非人哺乳动物的卵周隙中，再用电刺激法使人体细胞融合进卵母细胞内，形成重构卵；对所述的重构卵进行激活处理，形成激活的重构卵；将所述的激活的重构卵移植到非人寄母动物的输卵管中，作短暂培养，再回收发育的早期胚胎。本发明的方法与现有技术相比，其发明点在于省去了对体细胞去除细胞质的处理步骤，而是将体细胞直接注射到去核的卵母细胞或卵周隙中。在另一实例中还省去了细胞融合步骤。由于省去了这些步骤，因此导致获得治疗性克隆植入前胚胎的方法更加简易，效率更高。在说明书附图中，图1显示了本发明一实例中产生治疗性克隆植入前胚胎的流程图。图2显示了对本发明获得的治疗性克隆植入前胚胎进行PCR检验的电泳图。图中的检测样品如下goat1和2分别为莎能奶山羊细胞、和本地山羊细胞，human1和human2为来自2个治疗性克隆植入前胚胎的细胞。现描述一下现有技术中的获得和应用治疗性克隆的过程(DavorSolter和JohnGearhart,Science,1999年5月1468-1470)。该过程主要包括以下阶段(1)治疗性克隆植入前胚胎的获得在病人身上取下活体组织进行体外细胞培养，将体细胞移入去核的卵母细胞的卵周隙中，通过激活使体细胞与卵母细胞融合，融合卵进行体内或体外培养使之发育成囊胚；(2)ES细胞建立与诱导分化将发育成的囊胚经免疫外科手术方法处理，将囊胚的内细胞团细胞在体外培养成ES细胞，将ES细胞在诱导物的作用下，使之分化成各种器官或组织(如肌肉、神经、造血细胞等)。(3)组织或器官移植将诱导分化成的组织或器官通过外科手术方法移植到病人身上。本发明主要涉及上述过程中的第一阶段，即治疗性克隆植入前胚胎的获得。本发明人在国际上首次应用人的脐带内皮细胞和成纤维细胞移植到莎能奶山羊卵母细胞内，获得了发育到囊胚的胚胎。本发明人在成功地对体细胞克隆哺乳动物的制备方法的进行改进的基础上，通过进一步研究完成了本发明。对于将体细胞直接注射入卵母细胞，从而制备重构卵的详细内容，还可参见同一申请人1999年11月提交的发明名称为“一种体细胞克隆哺乳动物的制备方法”的专利申请，该专利申请在此引用作为参考。本发明方法，主要包括以下步骤(1)获得提供细胞质的卵母细胞(简称为“供质卵母细胞”)。一般地，获得供质卵母细胞可由以下两种方法获得。一是从卵巢卵泡上取出未成熟卵母细胞，并在体外成熟；一是供细胞质的哺乳动物经超数排卵诱导后，从其输卵管内冲出中Ⅱ期卵母细胞。这些获得供质卵母细胞的方法都是本领域的常规技术。较佳地，供质卵母细胞是通过母畜的超数排卵而获得的。(2)获得供核的人体细胞(即提供细胞核的人的体细胞)一般地，获得供核细胞可采用成年动物的体组织(如皮肤)、未期体细胞(如颗粒细胞)等，将有关组织剪碎和消化后，分散成单个体细胞，然后在体外培养，形成细胞系。也可直接消化成单个体细胞。较佳地，应用病人的体组织(如皮肤等)或将刚出生的婴儿脐带内皮或成纤维细胞，在体外培养成系用于供核，或将细胞冷冻保存，待发生意外事故或发生疾病后进行体细胞克隆。本领域常规的制备供核体细胞的方法都可适用于本发明。(3)卵母细胞的去核一般，将卵母细胞的核遗传物质在显微镜下应用去核针机械去除，从而获得去核的卵母细胞。本领域常规的去核方法都可适用于本发明。(4)移核现有技术中的移核过程通常有两种方式。第一种是将含细胞质的体细胞移入卵周隙中，然后将注入卵周隙的体细胞和卵母细胞在融合液内通过电刺激而发生融合，形成融合式的移核卵(重构卵)。然而，在制备治疗性克隆植入前胚胎中从未将该方法应用于人体细胞。第二种是先将体细胞的细胞质去除，再把体细胞核(不含或含少量胞质)直接注入去核卵母细胞的胞质内，形成注射式的移核卵(重构卵)。在本发明中，一种方法是将用于供核的人体细胞直接注射人非人哺乳动物的卵周隙中，再用电刺激法使人体细胞融合进卵母细胞内，形成重构卵。另一种更佳的方法是将供核的人体细胞直接用显微注射法而注入去核的非人哺乳动物的卵母细胞中，形成重构卵。在后一种方式，既不必对人体细胞去除胞质，也不必先将体细胞移入卵周隙中再进行融合处理。(5)激活对步骤(4)中形成的重构卵，通过激活处理，形成被激活的重构卵。本领域中的常规的激活处理方法都可用于本发明。通常，对重构卵的激活处理可用电刺激和/或化学刺激法进行。较佳地，在本发明中对重构卵的激活处理选自下组(ⅰ)重构卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mMMgSO4的激活液中，进行1-3次电刺激，电压为600-800V/cm，每次电刺激持续20-100μs；(ⅱ)重构卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mMMgSO4的激活液中，进行1-3次电刺激，电压为600-800V/cm，每次电刺激持续20-100μs(更佳地25-80μs)，然后再如下进行化学法激活即在5-20μM离子霉素中激活5分钟，并在1-5μM6-DMAP(6-dimethylaminopurine，即6-二甲基氨基嘌呤)激活1-6小时。(6)体内培养本领域常规的对重构卵进行体内或体外培养，都可适用于本发明。简而言之，对于步骤(5)中形成的被激活的重构卵，可以将其移入寄母动物的输卵管而在体内进行短暂培养(较佳地，所述的重构卵被移植到同步发情的非人寄母动物的输卵管中)，或者利用饲养细胞(feedercell)(例如输卵管上皮细胞)进行体外培养，然后回收重构胚并观察重构胚的发育情况。合格的发育胚胎可建立用于ES细胞系或可被冷冻保存备用。此外对于获得的发育的胚胎，可通过各种检验方法来加以检验，例如用随机引物PCR法、DNA指纹法等。一种优选的方法是用随机引物PCR法。通过上述的比较可以看出，本发明的方法与现有技术相比，其特点在于首次应用人的脐带内皮细胞和成纤维细胞移植到莎能奶山羊卵母细胞内，获得了发育到囊胚的胚胎。此外，本发明的特点还在于，可省去了对体细胞去除细胞质的处理步骤，而是将体细胞直接注射到卵周隙中并融合，或者将体细胞直接注射到去核的卵母细胞(这还进一步省去了细胞融合步骤)。由于省去了一个或多个步骤，因此导致获得治疗性克隆植入前胚胎的方法更加简易，效率更高。在本发明中，可用于提供供核卵母细胞的动物包括各种哺乳动物，较佳地是非人的哺乳动物。可用于本发明方法的哺乳动物的例子包括(但并不限于)羊、牛、猪、马、狗、猫、兔、小鼠和大鼠。适用于本发明方法的体细胞包括各种已分化的体细胞，例如来自各种组织(如皮肤、乳腺、输卵管、肌肉等)和器官(如耳、卵巢等)的细胞，尤其是分化程度较低的体细胞，例如新生儿脐带的各类体细胞。可用于本发明方法的体细胞的例子包括(但并不限于)新生儿脐带的各类体细胞、皮肤细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、耳细胞、卵巢细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、卵丘细胞、肌肉细胞、神经细胞、成骨细胞。本领域中各种获得卵母细胞的方法以及对卵母细胞进行去核处理的方法都可用于本发明。在本发明的一个实例中，去核的哺乳动物供质卵母细胞是这样获得的通过超数排卵法获得处于中Ⅱ期卵母细胞，然后进行去核处理获得去核的哺乳动物供质卵母细胞。在本发明方法中，在体细胞被直接注射之前，可对其进行预处理，以使其充分分散成单个细胞。例如，在如下条件下进行处理将培养的体细胞用0.1-0.5％的胰蛋白酶消化以后，再应用1-10mg/L蛋白酶E，36-39℃,3-8％CO2中消化1-20min，然后用于直接注射。在本发明方法中，还包括验证步骤即对重构胚随机引物PCR方法或DNA指纹分析法加以分析，以验证是否胚胎的基因组是否来自人的基因组。一种可行的方法是从获得的早期胚胎中吸取部分细胞，然后用随机引物PCR方法或DNA指纹分析法对发育的早期胚胎进行检验。一种优选的检验方法是随机引物PCR法中使用如下引物5′-ACCCCCGAAG-3′；并且PCR反应程序是90-95℃3-10min；然后是90-95℃6-15秒→34-40℃12-20秒→70-74℃20-40秒，共35-40个循环；最后在72℃下延伸2-10分钟。下面结合实施例进一步详细地描述本发明，应理解，这些实施例仅用于阐述目的而不用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例A、方法供质母畜超数排卵技术(提供卵母细胞)超数排卵是指采用激素诱导动物一次排出比正常排卵数多若干倍的方法。通过激素[孕马血清促性激素(PMSG)；促卵泡激素(FSH)、促卵泡激素释放因子(LRH)]处理，使母畜呈非季节性排卵，并且在一次排卵中，能排出较多的卵子。对激素处理过的、使用过的动物，仍可以再重复超排使用3-4次，只是在时间间隔、激素用量等方面有所不同，这样充分地利用了试验动物。有多种超数排卵技术可供使用。在本发明中采用的具体方法是每只动物肌注氯前列烯醇(PG，上海计划生育研究所)0.06-0.1mg/次，间隔10-14天后注射第二次，在第二次注射PG10-14天后开始超排，即首先肌肉注射FSH(宁波激素制品厂)，用量按7-12IU/kg计(不同种动物用量不尽相同)，分6次，2次/日，每次间隔8-12小时。间隔24小时发情时注射LRH(上海东风制药厂)，25ug/次，注射LRH后28-30小时回收卵母细胞。受体母畜的激素处理为与提供卵母细胞胞质的供质母羊同步，受体母羊间隔10-14天分两次肌肉注射PG，在供质母羊超排注射PG前24小时，受体也同时注射PG，受体注射LRH的时间及剂量与供体相同。人体细胞系的建立在获得治疗性克隆早期胚胎过程中，人体细胞的外培养及细胞系的建立亦很重要。其方法为将刚出生的脐带组织贮藏在10-37℃保温瓶内，迅速拿到实验室，0.25％胰酶消化，根据消化的时间，首先获得内皮细胞，随着消化时间的延长，获得成纤维细胞。用M199或RMl640等培养液(加10％胎牛血清)培养，传代，遗传分析，冷冻保存或作供核用。卵母细胞的收集供卵母细胞胞质的供体莎能奶山羊在注射LRH后26-30小时，进行卵母细胞的收集。收集是通过手术的方法，在母畜的腹部作一切口，将母畜的输卵管与卵巢暴露在体外，用冲卵液(含5％BSA的F10培养液)从输卵管中冲出卵母细胞，将收集的卵母细胞培养在CZB培养液中。卵母细胞去核将卵母细胞移人手术液中，在显微镜下，用持卵针固定卵母细胞，卵母细胞排出的极体处于钟表3点位置，去核针正对着或稍偏离极体去除极体与一部分胞质。人内皮细胞或成纤维细胞直接注射人体细胞的处理，即将培养的体细胞用0.25％的胰蛋白酶消化以后，再应用蛋白酶E(1-10mg/L),37℃,5％CO2中消化1-10分钟。洗涤以后，移人手术液中，再将体细胞注射进去核的卵母细胞中，形成重构卵。或者，将体细胞直接注射到卵周隙中，然后如下进行融合处理将注射到卵周隙的人体细胞和卵母细胞在融合液(0.3M甘露醇，4mg/ml的胎牛血清，0.1mMMgSO4)中电刺激(600-800V/cm，每次60-80μs)三次，使之融合，从而形成重构卵。重构卵的融合与激活重构卵激活，将重构卵在激活液(0.3M甘露醇，4mg/ml的胎牛血清，0.1mMMgSO4)中电刺激(600-800V/cm，每次持续40μs)后，再用化学方法激活10μM离子霉素5分钟，2μM6-DMAP(含7.5μg/ml细胞松驰素B)处理3-4小时，激活后的重构卵移入正常的培养液(CZB培养液)中培养。重构胚体内培养应用手术的方法，将激活的重构卵吸入移卵管内，将移卵管从莎能奶山羊或本地山羊的输卵管喇叭口处插入，将卵移进输卵管内，随后在输卵管与子宫连拉部用缝线结扎。在体内培养6天后，剪下输卵管，用培养液冲出胚胎，观察胚胎发育情况。早期发育胚验证采用PCR方法对发育的胚胎进行验证，即该胚胎是否是来自人体细胞。方法如下从发育至桑椹或囊胚的胚胎取其部分细胞进行PCR检测，所用的随机单引物(10bp)的序列为5′-ACCCCCGAAG-3′，PCR反应程序是先94℃4分钟，然后94℃10秒→36℃15秒→72℃30秒(共40个循环)，最后是72℃4分钟。将筛选出的胚胎用于建立ES细胞系或冷冻保存。B、材料在本发明中所用的M199培养基、RM1640培养基、F10培养基和CZB培养基等都是本领域中常规的培养基(培养液)。其中，CZB培养液的配方如下表1、CZB培养液实施例1将人的体细胞移入莎能奶山羊卵母细胞中制备囊胚细胞在该实施例中，所用的具体技术路线如图1所示。具体而言，包括以下步骤1、人脐带内皮细胞或成纤维细胞获得与培养从医院无菌地取约10-40cm长的刚出生婴儿的脐带，贮藏在10-37℃保温瓶内，迅速拿到实验室，用0.25％胰酶消化液注射到脐带内。根据消化的时间，首先(约1小时)获得内皮细胞。随着消化时间(约2-4小时)的延长，获得成纤维细胞。用M199或RM1640等培养液(加10％胎牛血清)培养，传代，遗传分析，冷冻保存或作供核。2、奶山羊超排与寄母羊同步奶山羊超排每只动物肌注PG，0.06-0.1mg/次，间隔10-14天后注射第二次，在第二次注射PG10-14天后开始超排，即首先肌肉注射FSH，用量按7-12IU/Kg计(不同种动物用量不尽相同)，分6次，2次/日，每次间隔8-12小时。间隔24小时发情时注射LRH，25ug/次，根据羊的体重作适当调整。寄母羊的同步为与提供卵母细胞胞质的供质母羊同步，受体母羊间隔10-14天分两次肌肉注射PG，在供质母羊超排注射PG前24小时，受体也同时注射PG，受体注射LRH的时间及剂量同供体。3、卵母细胞的回收奶山羊注射LRH后28-30小时后手术回收卵母细胞。按手术常规剪毛、消毒、打开腹腔、拉出子宫与输卵管，用10ml针筒7号针头，冲卵液为含5％BSA的F10培养液，冲出输卵管内的卵子接于园杯内。在体视解剖镜下，将卵母细胞检出置于CZB培养液中，37℃,5％二氧化碳培养箱中培养。4、卵母细胞去核与注射人的体细胞将卵母细胞移于含7.5ug/ml细胞松弛素B的CZB培养液中20min，再移至CZB(含20mMHEPES)培养液中，同时将已消化成球形的脐带内皮细胞或成纤维细胞亦移至该液中。按常规将卵母细胞去核，去核后再将人的脐带内皮细胞或成纤维细胞直接注入卵母细胞的胞质内，形成的细胞被称之为重构卵。重构卵置于CZB液中培养30分钟，然后激活。5、激活与包埋重构卵于CZB+细胞松弛素B(7.5μg/ml)+离子霉素(10μm)中，37℃培养5分钟。移至CZB+细胞松弛素B(7.5μg/ml)+6-DMAP(2μm)370C，液滴法培养2-6小时。激活后的重构卵移至CZB中，待包埋。包埋采用双层包埋。所用的包埋液是0.8％与1.0％琼脂糖(低熔点胶，约40℃)溶液。该包埋液是这样制备的在10ml锥形玻璃离心管内将适量的琼脂糖与生理盐水混合煮沸，至完全溶解后置于42℃，水浴待用。包埋时，在一塑料平皿中加入含Ca2+、Mg2+的PBS液，在PBS液底部用吸管加入胎牛血清，将待包埋的卵母细胞移入血清层，使其自然下沉，待位于底壁，吸出。然后移入另一含刚倒出的0.8％琼脂糖的小平皿中，将卵母细胞的位置移动2-4次(起到洗涤作用)，再均匀吸卵(卵与卵之间有一定的距离，但相靠不是太远)，移至PBS中。让其自然凝固，再分割，换一口径稍大的吸管，按相同方法进行第二层包埋，不同点在于包埋液的琼脂糖浓度为1.0％。6、移植与回收应用手术的方法，将包埋后的重构卵吸入移卵管，从输卵管喇叭口处插入移卵管，将卵移进输卵管内。随后在输卵管与子宫连接部用缝线结扎。在体内培养6天后，剪下输卵管，用培养液冲出胚胎，观察胚胎发育情况。7、发育胚胎检验与保存采用PCR方法对发育的胚胎进行验证，即该胚胎是否是来自人体细胞。方法如下从发育至桑椹或囊胚的胚胎取其部分细胞进行PCR检测，所用的随机单引物(10bp)的序列为5′-ACCCCCGAAG-3′，PCR反应程序是先94℃4分钟，然后94℃10秒→36℃15秒→72℃30秒(共40个循环)，最后是72℃4分钟。发育至囊胚的胚胎的保存可利用其内细胞团细胞进行体外培养，建立ES细胞；或者将发育的胚胎液氮冷冻保持备用。结果如下(一)超数排卵1、超排奶山羊总数20只2、奶山羊超排效果卵巢发育率(以卵巢直径＞1cm计)85％(17/20)平均每只奶山羊排卵数11.2枚(225/20)平均每只奶山羊回收卵数11.7枚(235/20)回收卵效率104％(235/225)(在计排卵点数时有误，有的几个排卵点紧靠在一起)(二)受体同步发情通过PG处理后，羊的同步率为78％(20/26)。(三)体细胞培养建立婴儿脐带内皮细胞或成纤维细胞库。在传代供过程中进行了染色体数分析。观察了100分裂相，2倍体(46条染色体)占75％。本试验所用的人体细胞是脐带内皮细胞或脐带成纤维细胞，未进行冷冻与饥饿处理。(四)卵母细胞去核与注射人的体细胞去核总卵数153枚，其中成活148枚，成活率96.7％体细胞注射后成活卵数133枚重构卵存活率89.8％(五)重构胚发育情况重构胚早期发育情况表<tablesid="table3"num="003"><table>移植卵数回收卵数重构卵发育率(％)2-4细胞32-64细胞桑椹早期+晚期囊胚1339817231224</table></tables>(六)发育胚胎的验证用发育胚胎的细胞与山羊胚胎(囊胚)的DNA，分别进行随机引物PCR分析，其检测结果见图2，其中goat1和2分别为莎能奶山羊细胞、和本地山羊细胞，human1和human2为来自2个治疗性克隆植入前胚胎的细胞。结果表明，发育胚胎的细胞的两个样品间是一致的，两种山羊囊胚间亦是一致的；而山羊囊胚与发育胚胎(其基因组来自人体细胞)之间的差别是很明显的。因此，这证实发育胚胎来自人，即胚胎细胞中含有的是人的染色体和基因组。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求1．一种治疗性克隆植入前胚胎的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤提供去核的非人哺乳动物供质卵母细胞和用于供核的人体细胞；用显微注射法，将用于供核的人体细胞直接注射入所述的去核供质卵母细胞，形成重构卵；或者将用于供核的人体细胞直接注射入非人哺乳动物的卵周隙中，再用电刺激法使人体细胞融合进卵母细胞内，形成重构卵；对所述的重构卵进行激活处理，形成激活的重构卵；将所述的激活的重构卵移植到非人寄母动物的输卵管中，作短暂培养，再回收发育的早期胚胎。2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括步骤从获得的早期胚胎中吸取部分细胞，用随机引物PCR方法对发育的早期胚胎进行检验。3．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人的体细胞选自下组的细胞新生儿脐带的各类体细胞、皮肤细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、耳细胞、卵巢细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、卵丘细胞、肌肉细胞、神经细胞、成骨细胞。4．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体细胞在直接注射之前，在如下条件下进行处理将培养的体细胞用0.1-0.5％的胰蛋白酶消化以后，再应用1-10mg/L蛋白酶E,36-39℃,3-8％CO2中消化1-20min，然后用于直接注射。5．如权利要求1所述的方法，其特征在于，对重构卵的激活处理选自下组(ⅰ)重构卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mMMgSO4的激活液中，进行1-3次电刺激，电压为600-800V/cm，每次电刺激持续20-100μs；(ⅱ)重构卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mMMgSO4的激活液中，进行1-3次电刺激，电压为600-800V/cm，每次电刺激持续20-100μs，然后再如下进行化学法激活即在5-20μM离子霉素中激活5分钟，并在1-5μM6-DMAP激活1-6小时。6．如权利要求1所述的方法，其特征在于，该非人哺乳动物选自羊、牛、猪、马、狗、猫、兔、小鼠和大鼠。7．如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括验证步骤对重构胚进行DNA指纹分析，以验证是否是克隆动物。8．如权利要求1所述的方法，其特征在于，提供去核的非人哺乳动物供质卵母细胞是这样获得的通过超数排卵法获得处于中Ⅱ期卵母细胞，然后进行去核处理，获得去核的非人哺乳动物供质卵母细胞。9．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重构卵被移植到同步发情的非人寄母动物的输卵管中作短暂培养，以获得发育的胚胎。10．如权利要求2所述的方法，其特征在于，在随机引物PCR法中所用的引物是5′-ACCCCCGAAG-3′；且PCR反应程序是90-95℃3-10min；然后是90-95℃6-15秒→34-40℃12-20秒→70-74℃20-40秒，共35-40个循环；最后在72℃下延伸2-10分钟。全文摘要本发明提供了治疗性克隆植入前胚胎的制法,包括:提供去核的非人哺乳动物供质卵母细胞和供核人体细胞;用显微注射法,将供核体细胞直接注入去核供质卵母细胞,或者将供核体细胞直接注入卵周隙,再用电刺激法使人体细胞融合进卵母细胞,从而形成重构卵;激活重构卵;将激活的重构卵移入非人寄母动物输卵管,短暂培养后再回收发育的早期胚胎。该方法可提供用于建立ES细胞的胚胎,进而获得用于移植的组织和器官。文档编号A61D19/04GK1302591SQ9911995公开日2001年7月11日申请日期1999年11月2日优先权日1999年11月2日发明者成国祥,陈建泉申请人:上海中路生物工程有限公司