编码β－淀粉酶的核酸分子,合成一种改性淀粉的植物,制备方法及应用的制作方法

专利名称：：编码β－淀粉酶的核酸分子,合成一种改性淀粉的植物,制备方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及编码具有马铃薯β-淀粉酶活性的蛋白质的核酸分子，以及制备转基因植物细胞及制备合成改性淀粉的植物的方法。此外，本发明涉及含有根据本发明的核酸分子的载体和宿主细胞，用根据本发明的方法产生的植物细胞和植物，根据本发明的植物细胞和植物合成的淀粉，涉及产生所述淀粉的方法。考虑到植物组分作为可再生资源的逐渐提高的重要性，生物技术研究努力使基于植物的粗原料符合加工工业的要求。因此，为了能在尽可能多的应用领域中利用可再生资源，必须能获得多种材料。油、脂肪和蛋白质以及多糖组成了植物的重要可再生资源。多糖中的主要位置不仅被纤维素而且被淀粉所占据，淀粉是高等植物中最重要的贮藏物质之一。玉米、稻和小麦以及马铃薯尤其在淀粉生产中起重要作用。多糖淀粉是化学均一单元一葡萄糖分子的多聚体。然而，它是在聚合程度和葡萄糖链中分支存在等方面不同的不同形式分子的高度复杂混合物。因此淀粉不是均一的原料。具体地，我们区分为直链淀粉-α-1,4-糖苷键连接的葡萄糖分子的基本无分支的多聚体，和支链淀粉一其依次组成了不同分支的葡萄糖链的复杂混合物。由于额外α-1,6-糖苷键的存在产生分支。在用于淀粉生产的典型植物如玉米或马铃薯中，合成淀粉由大约25％的直链淀粉和大约75％的支链淀粉组成。主要取决于分支程度、直链淀粉/支链淀粉比率、侧链的平均长度和分布、和磷酸基团的存在的淀粉分子结构，对于淀粉及其水溶液的重要功能性质是最重要的。必须提到的重要功能性质是，例如，可溶性、退减行为、成膜特性、粘度、颜色稳定性、胶凝特性和结合及粘附特性。淀粉颗粒大小对于不同用途也可能是重要的。富含直链淀粉的淀粉的产生对于某些用途也是特别有意义的。此外，植物细胞中所含的改性淀粉可有利地改变植物细胞在某些条件下的行为。例如，在进一步加工如淀粉提取之前，在含淀粉器官如种子或块茎的贮藏期间降低淀粉降解是可行的。生产改性淀粉使含该淀粉的植物细胞或植物器官更适于加工也是有意义的，例如在食品制造中，如由玉米制造爆米花或玉米片，或由马铃薯制造炸薯片、炸薯条或马铃薯粉。特别有意义的是淀粉在降低冷甜化方面的改进，即在低温下长时间贮藏后还原糖(特别是葡萄糖)的释放减少。马铃薯通常贮存于4-8℃的温度下，以使贮存期间的淀粉降解减至最小。该过程中释放的还原糖(特别是葡萄糖)在炸薯片或炸薯条的生产中导致不希望的产褐色素反应(所谓的美拉(Maillard)反应)。能从植物中分离的淀粉常通过化学修饰以符合特定工业目的，这种修饰通常需要时间和金钱。因此希望发现这种可能性，即产生可合成其性质已满足加工工业特殊需要的淀粉的植物，从而将经济与生态优势结合起来。除了植物繁殖法外，产生这类植物的一种可能性是利用重组方法直接遗传修饰产淀粉植物的淀粉代谢。但是，其前提条件是参与淀粉合成修饰和淀粉降解(淀粉代谢)的酶的鉴定与表征，和编码这些酶的相应DNA序列的分离。引起淀粉合成的生物化学途径基本已知。在植物细胞中，淀粉合成在质体中发生。在光合活性组织中，这些质体是叶绿体，在无光合活性组织中，淀粉贮藏组织是造粉体。参与淀粉合成的重要酶是，例如分支酶、ADP葡萄糖焦磷酸化酶、颗粒结合淀粉合酶、可溶性淀粉合酶、脱支酶、歧化酶、质体淀粉磷酸化酶和R1酶(R1蛋白)、淀粉酶或葡糖苷糖。本发明的一个目的在于提供其它或备择的重组方法，用于改变合成淀粉植物(例如黑麦、大麦、燕麦、玉米、小麦、高梁和谷子、西米、稻、豌豆、大豌豆(marrowfatpea)、木薯、马铃薯、番茄、油籽油菜、大豆、大麻、亚麻、向日葵、豇豆、绿豆、菜豆、香蕉或竹芋)中的淀粉代谢方法是用适当的能转化植物细胞的核酸分子，使得能合成有利改变的淀粉变种。这些改变的淀粉变种例如在其分支程度、直链淀粉/支链淀粉比率、磷酸含量、淀粉颗粒大小和/或侧链的平均长度和分布(即侧链结构)等方面显示改变。本发明的另一目的在于提供能产生可合成一种经修饰的淀粉种类的转基因植物的方法。令人惊讶地，用根据本发明的核酸分子转化的转基因植物合成一种淀粉，其在物理化学性质和/或侧链结构方面以特定方式被修饰，使得通过提供权利要求书中详述的应用形式，达到上述的这些目的。因此本发明涉及一种编码具有马铃薯β-淀粉酶功能的蛋白质之核酸分子，其选自a)编码涵盖SEQIDNO.2所述氨基酸序列或其衍生物或部分的蛋白质之核酸分子，b)涵盖SEQIDNO.1所示核苷酸序列或其衍生物或部分，或相应核苷酸序列的核酸分子；c)可与a)或b)中所述核酸分子杂交，或与它们互补，优选地与它们特异性杂交的核酸分子，及d)核酸分子，由于遗传密码的简并性其核苷酸序列背离a)、b)或c)中所述核酸分子的序列。因此，本发明涉及一种编码β-淀粉酶的核酸分子，其包括SEQIDNO.2或其衍生物或部分的氨基酸序列，如质粒St-b-Amy(DSMNo.12348)的cDNA插入片段。上述本发明的β-淀粉酶参与马铃薯的淀粉代谢，其直接或间接参与淀粉生物合成。就本发明的β-淀粉酶蛋白质(或其多肽、氨基酸序列)而言，术语“衍生物”针对本发明的目的涵盖来源于SEQIDNO.2的多肽，其包括至少86个氨基酸残基，优选至少120个，特别是至少155个，非常优选大约163-170个氨基酸残基，其选自由SEQIDNO.2的如下氨基酸残基112V,113P,114V,116V,117M,119P,120L,139L,142L,145A,146G,147V,149G,151M,153D,155W,156W,157G,160E,164P,167Y,169W,172Y,175L,183G,184L,185K,187Q,190M,191S,192F,193H,195C,196G,197G,198N,199V,200G,201D,205I,206P,208P,210W,211V,219P,220D,223Y,224T,228G,230R,231N,233E,234Y,238G,240D,243P,247G,248R,249T,254Y,256D,258M,261F,262R,273I,276I,278V,279G,281G,282P,284G,285E,286L,287R,288Y,289P,290S,291Y,292P,298W,300F,301P,302G,303I,304G,306F,307Q,308C,309Y,310D,311K,312Y,321A,325G,329W,336D,337A,338G,340Y,344P,347T,349F,350F,362G,364F,365F,368W,369Y,370S,373L,376H,380I,381L,384A,388F,393V,394K,398K,401G,402I,403H,404W,406Y,411H,412A,414E,415L,416T,417A,418G,419Y,420Y,421N,426D,427G,428Y,430P,431I,432A,438H,443N,444F,445T,446C,448E,449M,453E,454Q,458A,462P,465L,466V,468Q,469V,481A,483E,484N,485A,486L,488R,489Y,490D,493A,496Q,518T,519Y,520L,521R,526L,538F,539V和542M并且包含至少大约1-61，优选至少122，特别是至少170，更优选地至少220，非常特别优选地大约232-241个氨基酸残基，其选自SEQIDNO.2的(此处显示氨基酸的单字母编码)1M,2A,3M,45,5L,6P,7H,8Q,9I,10G,11A,12L,13S,14G,15T,16S,17L,18T,19A,20E,21T,22G,23G,24V,25S,26C,27E,28V,29P,30A,31K,32G,33S,34S,35A,36T,38A,39M,40W,41R,42T,44M,45T,46N,47L,48K,49V,50S,51V,52Q,53K,54T,55G,56T,57E,58I,59D,60R,61V,62S,63P,64S,65P,66S,67P,68P,69M,70S,71P,73M,74G,75G,76G,78R,79P,80D,81L,82L,84C,85Q,86A,87L,88M,89E,90A,91Q,92V,93D,94E,95V,96V,97E,98R,99E,100Y,101K,103R,105S,107E,108K,109E,110K,111G,118M,122S,124K,126D,127H,128T,131R,132K,133K,140Q,144S,152M,161R,163A,170G,176M,177E,180K,186V,204T,209R,212V,215M,222A,226Q,227W,232F,235V,241T,242L,246K,251V,253C,260G,263D,267N,271D,272T,294K,295D,297V,299K,305A,314I,319G,323A,324F,331H,332T,335T,339Q,343W,348N,352K,353E,355G,356G,358D,360Q,363E,371E,372M,378E,382Q,383S,385K,386A,387I,389E,390D,391K,392G,395I,397V,399I,407G,413P,433Q,442F,447V,452H,456Q,459L,467R,470A,471L,474Q,475E,477Q,478V,479P,491D,492Y,494H,495E,499Q,500A,501S,502S,503L,505I,506N,508Q,509S,511D,513E,515C,524P,528H,529P,530D,534R,537A,546K,548A,549N,550K,551C,552R,555V,556E,558E,559A,560E,561H,562F,564H,565I,566T,567Q,568P,569L,570V,571Q,573A,574A,575A,576A,577L,578M和579H就本发明的β-淀粉酶蛋白质(多肽、氨基酸序列)而言，术语“部分”针对本发明的目的包括一种多肽或寡肽，其由本发明的核酸分子或其衍生物编码的β-淀粉酶的至少约10-19，优选至少80，更优选至少160，特别是至少320，最优选大约400-550个氨基酸残基组成。本发明还涉及一种含有符合质粒DSMNo.12348的cDNA插入片段的SEQIDNO.1的核酸分子之核酸分子，所述质粒DSMNo.12348已于1998年7月24日保藏于DSZM，或该核酸分子的衍生物或部分，特别是编码区或其衍生物或部分。就本发明的核酸分子(核苷酸序列或多核苷酸)而言，术语“衍生物”针对本发明的目的涵盖一种包括至少246个核苷酸，优选至少344个，特别是至少443个，非常优选大约467-487个核苷酸的多核苷酸，其选自SEQIDNO.1的如下核苷酸241T,245T,257C,268G,272A,279T,285A,290A,291G,307A,309G,311A,314C,320A,322A,323A,325G,334G,335T,337C,338C,340G,341T,343T,346G,347T,349A,350T,351G,353T,355C,356C,359T,361G,368T,370A,386T,400G,404T,406A,409G,416T,420G,425T,433G,434C,436G,437G,439G,440T,442G,443A,445G,446G,449T,451A,452T,453G,457G,458A,460G,463T,464G,465G,466T,467G,468G,469G,470G,473T,476T,478G,479A,487G,490C,491C,499T,500A,503A,505T,506G,507G,511G,514T,515A,524T,527T,533T,535G,539A,542A,547G,548G,551T,553A,554A,557T,559C,560A,562G,566T,568A,569T,570G,571T,572C,574T,575T,576C,577C,578A,583T,584G,586G,587G,589G,590G,592A,593A,595G,596T,598G,599G,601G,602A,610A,613A,614T,615C,616C,617C,620T,622C,623C,628T,629G,630G,631G,632T,637G,638A,653A,655C,656C,658G,659A,662T,667T,668A,669C,670A,671C,682G,683G,689G,690G,691A,692A,697G,698A,700T,701A,704T,710T,712G,713G,718G,719A,727C,728C,731T,734T,739G,740G,742A,743G,745A,746C,749C,752T,755A,760T,761A,7666,767A,768T,769T,771C,772A,773T,774G,779G,781T,782T,785G,787G,788A,794T,806T,811G,817A,818T,823G,824A,826A,827T,830A,832G,833T,835G,836G,839T,841G,842G,844C,845C,850G,851G,853G,854A,857T,860G,862T,863A,865C,866C,868T,869C,871T,872A,874C,875C,878A,880A,884A,886G,887G,892T,893G,894G,898T,899T,901C,902C,904G,905G,907A,908T,910G,911G,916T,917T,919C,920A,922T,923G,925T,926A,928G,929A,930C,931A,932A,934T,935A,938T,949T,950T,961G,962C,973G,974G,977A,980C,983A,985T,985G,987G,988G,1000C,1001C,1006G,1007A,1009G,1010C,1012G,1013G,1018T,1019A,1020C,1021A,1022A,1025A,1030C,1031C,1033G,1034A,1039A,1040C,1045T,1046T,1048T,1049T,1050C,1051A,1060G,1069T,1075A,1079A,1082A,1084G,1085G,1090T,1091T,1093T,1094T,1095C,1097T,1102T,1103G,1104G,1105T,1106A,1108T,1109C,1118T,1121T,1124A,1126C,1127A,1130G,1139T,1187C,1192A,1193A,1196T,1199C,1201G,1202G,1204A,1205T,1207C,1208A,1209C,1210T,1211G,1212G,1216T,1217A,1227G,1231C,1232A,1234G,1235C,1238C,1240G,1241A,1243C,1244T,1246A,1247C,1249G,1250C,1252G,1253G,1255T,1256A,1258T,1259A,1260C,1261A,1262A,1263C,1276G,1277A,1279G,1280G,1282T,1283A,1285C,1288C,1289C,1291A,1292T,1294G,1295C,1300A,1301T,1304T,1312C,1313A,1318G,1322T,1325T,1327A,1328A,1330T,1331T,1333A,1334C,1336T,1337G,1342G,1343A,1344G,1345A,1346T,1347G,1352A,1353C,1357G,1358A,1360C,1361A,1370A,1372G,1373C,1379G,1382C,1384C,1385C,1388A,1394T,1396G,1397T,1401G,1402C,1403A,1405G,1406T,1414G,1422G,1426G,1439T,1441G,1442C,1445G,1447G,1448A,1450A,1451A,1453G,1454C,1457T,1463G,1465T,1466A,1468G,1469A,1477G,1478C,1481A,1490T,1511A,1520A,1541T,1546G,1550T,1552A,1553C,1555T,1556A,1559T,1562G,1565T,1577T,1580T,1591A,1592A,1594T,1603T,1604T,1612T,1613T,1615G,1616T,1621A,1622A,1624A,1625T,1526G,1628A,1630G,1633G,1640A,1661A,1683T,1692T,1713A,1719T,1728C和1731C其还包括至少大约1-127个核苷酸，优选至少253个，特别是至少354个，更优选至少455个，以及非常优选大约481-501个核苷酸，其选自SEQIDNO.1的如下核苷酸1A,2T,3G,4G,5C,6A,7A,8T,9G,10A,11G,12T,13C,14T,15G,16C,17C,18A,19C,20A,21C,22C,23A,24G,25A,26T,27C,28G,29G,30T,31G,32C,33C,34T,35T,36A,37T,38C,39A,40G,41G,42A,43A,44C,45A,46T,47C,48G,49C,50T,51C,52A,53C,54G,55G,56C,57G,58G,59A,60A,61A,62C,63C,64G,65G,66T,67G,68G,69A,70G,71T,72T,73T,74C,75A,76T,77G,78C,79G,80A,81A,82G,83T,84T,85C,86C,87G,88G,89C,90G,92A,93G,94G,95G,96G,97A,99T,102A,103G,104C,105T,106A,109T,110C,111A,112G,113C,115A,116T,117G,118T,120G,121A,122G,123A,124A,125C,126A,127C,129G,131T,132G,133A,134C,135G,137A,138T,139T,140T,141A,142A,143A,144A,146T,148T,149C,150G,152T,153A,154C,155A,157A,160A,161C,162A,163G,165A,166A,167C,169G,171A,172A,174T,175G,176A,178A,179G,180G,181G,183G,184T,185C,188C,189G,190T,191C,195G,196T,199C,200C,201G,202C,203C,204G,205A,206T,207G,208A,209G,210T,211C,216G,217A,218T,226G,228A,229A,231G,233G,234G,237G,238G,239A,244T,246A,247G,250T,252T,254A,256G,260T,262A,263T,274G,275T,276A,277G,278A,284T,286G,287T,288T,293G,295G,297A,298T,301A,302A,304G,306T,308G,310A,313T,315G,324A,327G,328A,331G,333A,348T,352A,354G,358T,360G,363T,365G,369G,379C,383C,392G,393G,394A,395A,396G,397A,402G,408T,417A,419A,424T,430A,432C,447G,488C,495A,5t9T,528G,529G,538A,549A,556G,558T,567G,573T,588T,600T,611C,612G,618T,619C,621T,626G,633T,634G,639G,645G,657A,665C,666A,678G,681G,684A,687G,693T,694T,695T,703G,705A,708G,709C,717C,723A,726T,729A,732T,744G,747T,751G,756A,757T,758G,762T,777A,778G,780G,783T,789T,799A,805C,814A,815C,816C,859C,861T,864T,879A,882A,883G,885T,889G,890T,891A,912T,914C,915T,941T,942C,943A,951A,952C,956G,966A,970T,978G,992A,995C,996C,999T,1003A,1004C,1014T,1015C,1026T,1027T,1028G,1029G,1042A,1055A,1062T,1065T,1066G,1067G,1072G,1078C,1080A,1087G,1098C,1115T,1119T,1120T,1134G,1144C,1146A,1147T,1148C,1155G,1156G,1157C,1159A,1161A,1165G,1166A,1169A,1171A,1172A,1173G,1174G,1175G,1179T,1183A,1186T,1191T,1195A,1197T,1200A,1203T,1219G,1224A,1233T,1237C,1245G,1267C,1281T,1296C,1305T,1311C,1320A,1350T,1354C,1355A,1356C,1365A,1366C,1368A,1377A,1386T,t393T,1400G,1408G,1409C,1410T,1411T,1412T,1413A,1420C,1421A,1423G,1428T,1429C,1432G,1435C,1436C,1456T,1472A,1474T,1476T,1479A,1483G,1485A,1494T,1499C,1500A,1501T,1503C,1504T,1507T,1508T,1509G,1514T,1516A,1517A,1525T,1526C,1527A,1528G,1529G,1533T,1536A,1538A,1544G,1557T,1558T,1560G,1569T,1570C,1571C,1575C,1581C,1582C,1584T,1585C,1588G,1590T,1593C,1597A,1601G,1608T,1629A,1635A,1636A,1638A,1641C,1643C,1644A,1646A,1642C,1649A,1651T,1652G,1655G,1664T,1666G,1668G,1674G,1676C,1678G,1680G,1682A,1686C,1687G,1690C,1693A,1656A,1698T,1708G,1712A,1724C,1725T,1727C,1729C,1730T,1732A,1734G,1735C,1736A和1738T,在如上所示的SEQIDNO.1或SEQIDNO.2的本发明之核苷酸或氨基酸序列独立元件中的位置之编码中，根据本发明的所述序列之衍生物也应理解为是指这样的序列，其中，单个序列元件的编码可背离根据本发明的SEQIDNO.1或2的那些序列。此处决定性的是至少一种序列区段(“部分”)与本发明序列的明显一致。这种一致可利用普通技术人员的知识以简单的方法，例如使用适当的计算机程序加以确定，例如通过将本发明的序列与待比较的序列进行序列比较(所谓序列排列对比)。这类计算机程序例如为市售的(例如，Omiga,1.1.3版,OxfordMolecularLtd.,Oxford，英国)，有时它也是序列数据库(例如，EMBL,GenBank)中的组成部分，例如，鉴定最可能的相同性程度，或如果适当的话，化学等效物，序列元件，特别是考虑特定的插入和/或缺失，其可引起单独序列元件或序列区段的移码，由此可影响序列元件或序列区段的编号。就本发明的编码β-淀粉酶的核酸分子而言，术语“衍生物”进一步涵盖通过添加、删除、插入或重组一种或多种核苷酸而背离SEQIDNO.1的，且符合上述条件的核酸分子。就本发明的编码β-淀粉酶的核酸分子而言，术语“衍生物”进一步包括一种本发明的核酸分子的互补性或反向互补性序列(多核苷酸)，或其衍生物或其部分。就根据编码β-淀粉酶的本发明之核酸分子而言，术语“部分”涵盖一种多核苷酸或寡核苷酸，其由编码β-淀粉酶的本发明核酸分子的至少大约15-35，优选至少大约36-100，更优选至少200，特别是至少400，尤其特别是至少800，及最优选大约1400-1700个核苷酸，或其衍生物组成。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的术语“衍生物”和/或“部分”涵盖如上所述的多核苷酸，或者多肽或寡肽，其显示获自马铃薯的β-淀粉酶基因(即编码β-淀粉酶的核酸分子)或β-淀粉酶多肽的功能和/或结构等效物。术语“功能和/或结构等效物”一般为同义，是指目标创造性分子的等效物或相似的功能，如适当，尤其是指生物学功能。本发明还涉及重组核酸分子，包括a)一种核苷酸分子，其编码一种具有β-淀粉酶功能的蛋白质，优选地来自马铃薯，或所述核苷酸序列的部分，以及b)一种或多种核苷酸序列，其编码一种选自A组的蛋白质，其中包括如下功能的蛋白质分支酶、ADP葡萄糖焦磷酸化酶、颗粒结合淀粉合酶、可溶性淀粉合酶、脱支酶、歧化酶、质体淀粉磷酸化酶、R1酶、淀粉酶、葡糖苷酶，编码选自A组的蛋白质的核苷酸序列的片段，和可与这些核苷酸序列或其片段之一杂交的核酸分子，优选地脱氧核糖核酸分子或核糖核酸分子，特别优选地cDNA分子。特别优选的是可与这些核苷酸序列或其片段之一特异性杂交的核酸分子。根据本发明的核苷酸分子编码一种具有如SEQIDNO.1所示的马铃薯β-淀粉酶之功能的蛋白质，该蛋白质由SEQIDNO.2的核苷酸序列编码。Seq.IDNo.1:attaatattattattatggcaatgagtctgccacaccagatcggtgccttatcaggaacatcgctcacggcggaaaccggtggagtttcatgcgaagttccggcgaaggggagttcagctacatcagctatgtggagaacaccgatgacgaatttaaaagtatcggtacaaaaaacaggaactgaaattgacagggtgtcgccgtcgccgtcgccgccgatgagtccgatgatgggaggaggaatgcggccggatttattagcgtgtcaagcgttgatggaagctcaggtagatgaggtagttgagagagaatataaggttaggaattcgtcggagaaagagaaaggagttccggtgtttgttatgatgccgttggatagtgtgaaaatggatcatactgtgaataggaagaaggcgatgaatgcgagtttacaggcgttgaagagcgccggtgtggaagggattatgatggatgtgtggtggggattggtggagagagatgcgccgggagagtataattggggcggttatgctgagcttatggaaatggcgaaaaaacatggactcaaagttcaagctgtgatgtctttccatcaatgtggtggaaacgtcggtgattcctgcacgatccctcttccaaggtgggttgttgaggagatggagaaggatccagatcttgcatacacagatcagtggggaaggaggaattttgaatatgtatcgcttggttgcgatacacttccagttcttaaaggaaggactcctgtccaatgctattctgatttcatgagagggtttagagatagatttgagaatctcctaggtgacaccattgtggaaattcaagtcgggatgggtccagctggagagctccgttatccatcctatccggaaaaagatggagtatggaaattccctggaattggtgcttttcagtgttatgacaagtacatgatcagtagcttacagggtgcagcagaagcttttggtaagcctgaatggggacacaccggtccaaccgatgctggtcagtacaacaattggccagaagataccaactttttcaagaaggaaggtggtggatgggatagtcaatatggggagttcttcctcacttggtattctgagatgcttttgaaccatggtgagaggatactgcaatcagccaaggcgatattcgaggacaagggtgttaagatttcagttaagattgcaggtattcactggcactatggaacaaggtcccatgcccctgagctgaccgctggatactacaacacccgtaaccgagatggttaccttcccatcgcccaaatgcttgcccgccacggtgcagttttcaacttcacatgtgttgagatgcgtgaccacgagcagccacaagatgcactatgtgcacctgagaagttggttaggcaagtggctttagcaactcaggaagctcaagttccacttgctggggagaatgcattgccacgatacgatgattatgcacatgaacagatccttcaagcatcctcattgaatatcaacgatcaatcaggtgatagagagatgtgcgcgtttacatatttgaggatgaatcctgacctattccatcctgataactggaggcgattcgttgccttcgtgaagaaaatgaaagaaggaaaagacgcaaacaaatgccgggaacaagtagagagggaggcagagcatttcgtgcatataactcagccgttagtgcaagaagctgcagctgccctcatgcactaagcaaatggttgtcaaatagtactgtaattttgatccttttagctaacatggagtttttcaacatgttacgaggatcttatagctcgttatcgttcttcttatatgtttgtaaaactgtccatcgtgtattttttcgaagttagacattatgtcttaatgaaatgatacataattcagtagtaaaaaaaaaaaaaaSeq.IDNo.2:MAMSLPHQIGALSGTSLTAETGGVSCEVPAKGSSATSAMWRTPMTNLKVSVQKTGTEIDRVSPSPSPPMSPMMGGGMRPDLLACQALMEAQVDEVVEPEYKVRNSSEKEKGVPVFVMMPLDSVKMDHTVNRKKAMNASLQALKSAGVEGIMMDVWWGLVERDAPGEYNWGGYAELMEMAKKHGLKVQAVMSFHQCGGNVGDSCTIPLPRWVVEEMEKDPDLAYTDQWGRRNFEYVSLGCDTLPVLKGRTPVQCYSDFMRGFRDRFENLLGDTIVEIQVGMGPAGELRYPSYPEKDGVWKFPGIGAFQCYDKYMISSLQGAAEAFGKPEWGHTGPTDAGQYNNWPEDTNFFKKGECGGWDSQYGEFFLTWYSEMLLNHGERILQSAKAIFEDKGVKISVKIAGIHWHYGTRSHAPELTAGYYNTRNRDGYLPIAQMLARHGAVFNFTCVEMRDHEQPQDALCAPEKLVRQVALATQEAQVPLAGENALPRYDDYAHEQILQASSLNINDQSGDREMCAFTYLRMNPDLFHPDNWRRFVAFVKKMKEGKDANKCREQVEREAEHFVHITQPLVQEAAAALMH根据本发明的β-淀粉酶核苷酸序列显示与已知β-淀粉酶编码分子相对较少的序列同源性(Wang等，1997，植物生理(PlantPhysiol.),113(2):403-409；Yoshigi等，1994，生物技术及生物化学(Biotechn.&Biochem.)58(6):1080-1086；Monroe等，1991，植物生理97:1599-1601)。此外，该氨基酸序列通过额外的N-末端序列(氨基酸位置1-25)与现有技术中所述的β-淀粉酶不同，其如核苷酸序列表所示。适用于本发明并且编码一种选自A组的蛋白质的核苷酸序列是，例如，可溶性淀粉合酶(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ)或颗粒结合淀粉合酶同工型(例如，Hergersberg,1988，博士论文，Cologne大学；Abel,1995，博士论文，FUBerlin；Abel等人，1996，植物杂志(PlantJorunal)10(6):981-991；Visser等人，1989，植物科学(PlantSci.)64:185-192；vanderLeij等人，1991，分子与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)228:240-248；EP-A-0779363；WO92/11376；WO96/15248；WO97/26362；WO97/44472；WO97/45545；Delrue等人，1992，细菌学杂志(J.Bacteriol.)174:3612-3620；Baba等人，1993，植物生理学(PlantPhysiol.)103:565-573；Dry等人，1992，植物杂志2,2:193-202，或EMBL数据库条目X74160；X58453；X88789)、分支酶同工型(分支酶Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb)、脱支酶同工型(脱支酶、异淀粉酶、支链淀粉酶、R酶)或歧化酶同工型，如WO92/14827、WO95/07335、WO95/09922、WO96/19581、WO97/22703、WO97/32985、WO97/42328、Takaha等人，1993，生物学与化学杂志(J.Biol.Chem.)268:1391-1396或EMBL数据库条目X83969所述，和ADP葡萄糖焦磷酸化酶、质体淀粉磷酸化酶同工型和，如EP-A-0368506；EP-A-0455316；WO94/28146；DE19653176.4；WO97/11188；Brisson等人，1989，植物细胞(ThePlantCell)1:559-566；Buchner等人，1996，植物(Planta)199:64-73；Camirand等人，1989，植物生理学89(增4):61；Bhatt和Knowler，实验植物学杂志(J.Exp.Botany)41(增):5-7；Lin等人，1991，植物生理学95:1250-1253；Sonnewald等人，1995，植物分子生物学(PlantMol.Biol.)27:567-576；DDBJ号D23280；Loberth等人，1998，自然生物技术(NatureBiotechnology)16:473-477所述。可按照本发明适当使用的核苷酸序列是原核或真核来源的，优选地是细菌、真菌或植物来源的。对于本发明，术语“核苷酸序列的部分”是指将按照本发明使用的核苷酸序列的部分，其长度至少15bp，优选地至少150bp，特别优选地至少500bp，但通常不超过5000bp，优选地2500bp。对于本发明，术语“杂交”是指在常规杂交条件下优选地在严格条件下的杂交，如Sambrook等人(《分子克隆，实验室指南》，第二版(1989)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY)所述。特别优选地，“特异性杂交”在下列高度严格条件下发生杂交缓冲液2×SSC；10×Denhardt溶液(Ficoll400+PEG+BSA；比例1∶1∶1)；0.1％SDS；5mMEDTA；50mMNa2HPO4；250μg/ml鲱精DNA；50μg/mltRNA；或0.25M磷酸钠缓冲液pH7.2；1mMEDTA；7％SDS，杂交温度T=55-68℃洗涤缓冲液0.2×SSC；0.1％SDS和洗涤温度T=40-68℃可与根据本发明的核酸分子杂交的分子也包括根据本发明的核酸分子的片段、衍生物和等位变体。“片段”可理解为指长度足以编码所述蛋白质功能活性部分的核酸分子的部分。术语“衍生物”在本发明说明书中是指，这些分子的序列在一个或多个位置上不同于根据本发明的核酸分子的序列，并显示与这些序列有高度同源性。同源性是指至少60％，优选地超过70％，特别优选地超过85％的序列相同性。相对于根据本发明的核酸分子的差异可通过一种或多种缺失、置换、插入或重组产生。同源性还指，目标核酸分子或其所编码的蛋白质之间存在的功能和/或结构等同性。与根据本发明的分子同源，并组成这些分子的衍生物的核酸分子，通常是这些分子的变异，它们构成行使相同的生物功能的修饰。它们可以是天然发生的变异，例如其它植物种的序列，或突变，这些突变可能是天然发生的或经定向诱变引入的。变异另外还可以是合成序列。等位变体可以是天然发生的变体或合成变体或通过重组DNA技术产生的变体。根据本发明的核酸分子可以是DNA分子，特别是cDNA分子，或者基因组分子。根据本发明的核酸分子还可以是RNA分子。根据本发明的核酸分子或其片段可以例如从天然来源获得、利用重组技术产生或合成产生。为了在植物细胞中以有义或反义方向表达根据本发明的核酸分子，将其与确保可在植物细胞中转录的调节DNA元件连接。这些元件特别包括启动子。在植物细胞中有活性的任何启动子通常都适于表达。可选择启动子，使得表达为组成型的，或仅发生于特定组织中、植物发育的特定时间或可能是例如化学或生物诱导性的外界因素所确定的时间。相对于被转化的植物，启动子以及核苷酸序列可能是同源或异源的。合适的启动子的实例是用于组成型表达的花椰菜花叶病毒35SRNA启动子，用于在马铃薯中块茎特异性表达的patatin启动子B33(Rocha-Sosa等人，1989,EMBOJ.8:23-29)，或确保只在光合活性组织中表达的启动子，例如ST-LS1启动子(Stockhaus等人，1987，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84:7943-7947；Stockhaus等人，1989,EMBOJ.8:2445-2451)、或用于胚乳特异性表达，小麦HMG启动子或玉米醇溶蛋白基因的启动子。终止根据本发明的核酸分子的终止序列可用来正确地终止转录并向转录物添加poly-A尾，这被认为具有稳定转录物的作用。这些元件已在文献(参见Gielen等人，1989,EMBOJ.8:23-29)中描述，通常在希望时是可交换的。根据本发明的核酸分子能用于产生显示β-淀粉酶活性增加或降低，或者β-淀粉酶和至少另一种淀粉代谢酶活性提高和/或降低的转基因植物细胞和植物。为此，将根据本发明的核酸分子引入含有在植物细胞中有效转录所必需的调节核酸序列的适当载体中，并引入植物细胞中。另一方面，能用根据本发明的核酸分子抑制细胞中内源性β-淀粉酶的合成，或内源性β-淀粉酶和至少另一种选自A组的蛋白质的合成。这可借助于反义构建体、体内诱变、发生的共抑制作用或利用适当构建的核酶来实现。另一方面，根据本发明的核酸分子能用于在转基因植物细胞中表达β-淀粉酶，或表达β-淀粉酶和至少另一种选自A组的蛋白质，从而导致在每种情况中表达的酶在细胞中的活性都提高。另外，存在利用根据本发明的核酸分子抑制细胞中内源性β-淀粉酶合成和至少另一种选自A组的蛋白质过量表达的可能性。最后，根据本发明的核酸分子也可用于在转基因植物细胞中表达β-淀粉酶和抑制至少另一种选自A组的蛋白质。于是最后提到的两个本发明的实施方案在细胞中导致分别被抑制或表达的酶的活性同时抑制和提高。本发明还涉及一种包含根据本发明的核酸分子的载体。术语“载体”包括质粒、粘粒、病毒、噬菌体和在遗传工程中常规使用的其它载体，它们包含根据本发明的核酸分子且适于转化细胞。这些载体优选地适用于转化植物细胞。特别优选地，它们允许将根据本发明的核酸分子，适当时与侧翼调节区一起，整合到植物细胞基因组中。实例是二元载体如pBinAR或pBinB33，它们能用于土壤杆菌介导的基因转移。在一个优选实施方案中，根据编码一种具有β-淀粉酶功能的蛋白质的核苷酸序列或其片段以有义或反义方向存在这一事实区别根据本发明的载体。在另一个优选实施方案中，根据编码一种或多种选自A组的蛋白质的核苷酸序列或其片段以有义或反义方向存在这一事实区别根据本发明的载体。在再另一个优选实施方案中，根据编码多种选自A组的蛋白质的核苷酸序列或其片段部分以有义方向、部分以反义方向存在这一事实区别根据本发明的载体。极特别优选地，根据本发明的载体与在原核或真核细胞中确保RNA的表达，即转录和合成的调节元件相连，如果核苷酸序列以有义方向存在，则RNA是可翻译的。另外，能利用分子生物学常规技术(见，例如，Sambrook等人，1989，《分子克隆，实验室指南》，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY)向根据本发明的DNA序列中引入多个突变，这导致生物学性质已被修饰的蛋白质的合成。一方面，能产生缺失突变体，其中的序列通过可引起类似截短的蛋白质合成的编码DNA序列5’或3’端的渐进缺失产生。例如，DNA序列5，端的这些缺失允许定向产生由于有关转运序列或信号序列的去除而不再定位于其原始(同源)区室中而定位于细胞溶胶中，或者由于其它信号序列的添加而定位于一种或多种其它(异源)区室(例如质体、液泡、线粒体、质外体)中的酶。另一方面，在改变的氨基酸序列可影响如酶活性或酶调节的位置处引入点突变也是可行的。因此，能产生如KM或kcat值改变或不再经受细胞中正常存在的调节机制如经过别构调节或共价修饰的突变。对于原核细胞中的遗传工程操作，能向质粒中引入根据本发明的DNA序列或这些序列的片段，这允许诱变或通过DNA序列重组改变序列。利用标准分子生物学方法(参见Sambrook等人，1989，同前)可进行碱基互换或添加天然或合成序列。为了使DNA部分彼此连接，可将连接体或接头与这些部分连接。此外，还可进行提供适当限制酶切位点或除去过量DNA或不再需要的限制酶切位点的操作。在适用插入、缺失或置换时，也可使用体外诱变、引物修复、限制酶切或连接。通常使用的分析方法是序列分析、限制酶切分析及适当时其它生物化学和分子生物学方法。本发明还涉及一种宿主细胞，特别是原核或真核细胞，优选地细菌或植物(单子叶植物或双子叶植物)细胞(例如大肠杆菌、土壤杆菌、茄科(Solananceae)、Poideae、黑麦、大麦、燕麦、玉米、小麦、高梁和谷子、西米、稻、豌豆、大豌豆(marrowfat)、木薯、马铃薯、番茄、油籽油菜、大豆、大麻、亚麻、向日葵、豇豆、绿豆、菜豆、香蕉或竹芋的细胞)，它们含有一种或多种根据本发明的核酸分子，或一种或多种根据本发明的载体。本发明还涉及一种宿主细胞，特别是原核或真核细胞，优选地细菌或植物细胞(例如大肠杆菌、土壤杆菌、茄科、Poideae、黑麦、大麦、燕麦、玉米、小麦、高梁和谷子、西米、稻、豌豆、大豌豆、木薯、马铃薯、番茄、油籽油菜、大豆、大麻、亚麻、向日葵、豇豆、绿豆、菜豆、香蕉或竹芋的细胞)，除了一种编码具有β-淀粉酶功能的蛋白质的重组核酸分子之外，它们含有一种或多种编码选自A组的蛋白质的重组核酸分子或其部分，或可与这些核酸分子杂交的核苷酸序列。根据本发明的宿主细胞不仅可用根据本发明的核酸分子产生，而且也可利用连续转化(例如所谓的“超级转化”)产生，其中在多个连续细胞转化步骤中使用单独的核苷酸序列或包含编码具有如下蛋白质功能的核苷酸序列的载体，包括分支酶、ADP葡萄糖焦磷酸化酶、颗粒结合淀粉合酶、可溶性淀粉合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ、脱支酶、歧化酶、质体淀粉磷酸化酶、淀粉酶、葡糖苷酶、R1酶、其部分，和可与所述核苷酸序列或其部分之一杂交的核酸分子。本发明的另一个实施方案涉及一种产生可合成改性淀粉的转基因植物细胞的方法，其包括向植物细胞基因组中整合根据本发明的核酸分子或根据本发明的载体。通过遗传工程方法能使根据本发明的核酸分子使得参与植物的淀粉代谢，并将其改变，这样引起改性淀粉的合成，相对于野生型植物中合成的淀粉该改性淀粉在以下方面得到改变，例如，结构、含水量、蛋白含量、脂含量、纤维含量、灰分/磷酸含量、直链淀粉/支链淀粉比率、分子量分布、分支程度、颗粒大小、颗粒形状及结晶，或其物理化学性质，如流动及吸收状态、胶凝温度、粘度、增稠能力、溶解度、凝胶结构、透明度、热稳定性、剪切稳定性、酸稳定性、退减的趋势、胶凝作用、冻融稳定性、复合体形成、碘结合、薄膜形成、粘合力、酶稳定性、可消化性或反应性。通过提高参与淀粉代谢的蛋白质的活性，例如过量表达适当的核酸分子，或提供不再经历细胞调节机制和/或显示与其活性有关的不同温度依赖性的突变，也能够提高适当的遗传修饰植物中的产量。特别明显的产量提高可能是由于提高了一种或多种参与淀粉代谢的蛋白质在被转化植物淀粉贮藏组织的特殊细胞中，如在马铃薯的块茎或玉米或小麦的胚乳中的活性。这些参与淀粉代谢的可能性的经济重要性和优点是明显的。当在植物中表达根据本发明的核酸分子时，所合成的蛋白质原则上能定位于植物细胞的任何希望的区室中。为了实现在特定区室(细胞溶胶、液泡、质外体、质体、线粒体)中的定位，必要时必须缺失(除去)确保定位的转运或信号序列，并且在必要时必须将剩余的编码区与确保在特定细胞区室中定位的DNA序列连接。这些序列已知(见，例如，Braun等人，EMBOJ.11(1992),3219-3227；Wolter等人，美国国家科学院院刊85(1988),846-850；Sonnewald等人，植物杂志1(1991),95-106)。例如，通过使用根据本发明的核酸分子，表达适当的反义RNA、有义RNA以实现共抑制作用、体内诱变，或表达适当构建的可特异酶切编码参与淀粉代谢的蛋白质之一的转录物的核酶，优选地通过表达一种反义转录物，能实现参与淀粉代谢的蛋白质活性降低的植物细胞的产生。为此，一方面，能使用一种DNA分子，其包含编码一种参与淀粉代谢的蛋白质的所有序列，包括可能存在的任何侧翼序列能使用只包含编码序列的部分的DNA分子，这些部分的最小长度为15bp，优选地至少100-500bp，特别是超过500bp。通常使用短于5000bp，优选地短于2500bp的DNA分子。也能使用显示与根据本发明的DNA分子的序列有高度同源性，但与之不完全相同的DNA序列。最小同源性应当超过约65％。优选使用具有75％，特别是80％同源性的序列。用于降低细胞中特定蛋白质活性的核酶表达为本领域技术人员所周知，并在如EP-B1-0321-201中有述。例如，Feyter等人(分子与普通遗传学250(1996),329-338)描述了植物细胞中核酶的表达。也可通过所谓的“体内诱变”在根据本发明的植物细胞中减少参与淀粉代谢的蛋白质，其中通过细胞转化向细胞中引入杂合RNA-DNA-寡核苷酸(“chimeroplast”)(KippP.B.等人，“第五届国际植物分子生物学大会”的招贴会议，21-27,1997年9月，新加坡；R.A.Dixon和C.J.Arntzen，“转基因植物的代谢工程”上的会议报告，重要座谈会，CopperMoutain,CO,USA,TIBTECH15(1997),441-447；国际专利申请WO95/15972；Kren等人，肝脏病学(Hepatology)25(1997),1462-1468；Cole-Strauss等人，科学273(1996),1386-1389)。用于该目的的RNA-DNA-寡核苷酸的一部分DNA组分与内源蛋白质的核酸序列同源，但与内源蛋白质的核酸序列相比显示一种突变，或者含有被同源区包围的异源区。RNA-DNA-寡核苷酸的同源区与内源核酸分子的碱基配对及随后的同源重组使得RNA-DNA-寡核苷酸的DNA组分中包含的突变或异源区能被转移到植物细胞基因组中。这导致参与淀粉代谢的蛋白质活性的降低。此外，也可利用共抑制作用降低在植物细胞中参与淀粉代谢的酶活性。这些方法为本领域技术人员周知，例如，Jorgensen(生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)8(1990),340-344)、Neibel等人(现代微生物学与免疫学观点(Curr.Top.Microbiol.Immunol.)197(1995),91-103)、Flavell等人(现代微生物学与免疫学观点197(1995),43-46)、Palaqui和Vaucheret(植物分子生物学29(1995),149-159)、Vaucheret等人(分子与普通遗传学248(1995),311-317)、deBorne等人(分子与普通遗传学243(1994),613-621)描述了该方法。为了抑制被转化植物中参与淀粉生物合成的多种酶的合成，能使用同时含有反义方向并处于适当启动子控制下的编码相关酶的多种区域的DNA分子进行转化。每种序列可受其启动子的控制，或者这些序列另外可由一种连接启动子作为融合体转录，使得所述蛋白质的合成被抑制到大致相同或不同的程度。至于在这种构建体中使用的个别编码区的长度，以上关于产生反义构建体的叙述也适用于此。原则上，从这种DNA分子中启动子开始转录的反义片段的数量没有上限。但是，产生的转录物长度通常不应超过25kb，优选地15kb。因此，根据本发明的核酸分子使得转化植物细胞并同时抑制多种酶的合成成为可能。另外，能向一种或多种淀粉生物合成基因缺乏或缺陷的传统突变体中引入根据本发明的核酸分子(Shannon和Garwood,1984，于Whistler,BeMiller和Paschall，《淀粉化学与技术》，学院出版社，伦敦，第二版25-86)。例如，这些缺陷可能涉及下列蛋白质小球结合淀粉合酶(GBSSⅠ)和可溶性淀粉合酶(SSSⅠ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ)、分支酶(BEⅠ、Ⅱa和Ⅱb)、脱支酶(R酶、异淀粉酶、支链淀粉酶)、歧化酶和质体淀粉磷酸化酶。因此本发明也涉及可通过根据本发明的方法获得的转基因植物细胞，其已用根据本发明的载体或核酸分子转化，并涉及由这些转化细胞衍生的转基因植物细胞或植物。根据本发明的细胞含有根据本发明的核酸分子，它们优选地与确保在植物细胞中转录的调节DNA元件(如启动子、增强子、终止子)特别是启动子连接。根据本发明的细胞能与天然存在的植物细胞相区别，这尤其是根据它们含有这些细胞中不天然存在的根据本发明的核酸分子这一事实，或者是根据这种分子整合于细胞基因组中的某一位置，而在不同基因组环境中原本不存在这种分子这一事实。另外，根据本发明的转基因植物细胞能与天然存在的植物细胞相区别，这是根据它们含有至少一个拷贝的稳定整合于其基因组中的根据本发明的核酸分子，适当时还含有细胞中天然存在的这种分子的拷贝这一事实。如果引入细胞中的核酸分子是细胞中已天然存在的分子的额外拷贝，那么根据本发明的植物细胞能与天然存在的植物细胞相区别，特别是根据这种或这些额外拷贝位于基因组中其不天然存在的位点处这一事实。例如，这能通过Southern印迹分析检查。优选的根据本发明的植物细胞是这样的细胞，其中参与淀粉代谢的各个酶的酶活性在每种情况中提高和/或降低至少10％，特别优选地至少30％，极特别优选地至少50％。另外，优选地至少根据下列特征之一能将根据本发明的植物细胞与天然存在的植物细胞相区别如果已被引入的核酸分子相对于植物细胞是异源的，则转基因植物细胞显示已被引入的根据本发明的核酸分子转录。例如，这能通过Northern印迹分析检测。例如，根据本发明的植物细胞含有一种或多种由已引入的根据本发明的核酸分子编码的蛋白质。例如，这能通过免疫学方法特别是Western印迹分析检测。如果已被引入的根据本发明的核酸分子相对于植物细胞同源，则根据根据本发明的核酸分子的额外表达，能将根据本发明的细胞与天然存在的细胞相区别。例如，转基因植物细胞含有更多或更少的根据本发明的核酸分子的转录物。例如，这能通过Northern印迹分析检测。“更多”或“更少”在本说明书中意思是比相应的未转化细胞优选地多或少至少10％，优选地多或少至少20％，特别优选地多或少至少50％的转录物。此外，这些细胞优选地显示由引入的核酸分子编码的蛋白质含量相应提高或降低(至少10％、20％或50％)。利用本领域技术人员周知的技术能使转基因植物细胞再生为完整的植物。可通过再生根据本发明的转基因植物细胞获得的植物，和通过由根据本发明的植物细胞再生为完整的植物产生转基因植物的方法，也是本发明的主题。本发明的另一主题是含有根据本发明的转基因植物细胞的植物。原则上，转基因植物可以是任何种的植物，即，不仅可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。植物优选地是有益植物和淀粉贮藏植物，如谷物类种(黑麦、大麦、燕麦、玉米、小麦、高梁和谷子等)、西米、稻、豌豆、大豌豆、木薯、马铃薯、番茄、油菜、大豆、大麻、亚麻、向日葵、豇豆、绿豆或竹芋。本发明也涉及根据本发明的植物的繁殖材料，例如果实、种子、块茎、根状茎、幼苗、插条、愈伤组织、原生质体、细胞培养物等。改变参与淀粉代谢的酶的活性导致在通过根据本发明的方法产生的植物中合成结构改变的淀粉。大量克隆载体可用于准备向高等植物中引入外源基因，载体含有大肠杆菌复制信号，和用于筛选被转化细菌细胞的标记基因。这些载体的实例是pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。能将希望的序列引入载体的适当限制酶切位点处。用所获得的质粒转化大肠杆菌细胞。被转化的大肠杆菌细胞在适当培养基中生长，然后收获并裂解。回收该质粒。表征所获质粒DNA的分析方法通常是限制酶切分析、凝胶电泳和其它生物化学及分子生物学方法(Sambrook等人，同前)。每种操作后，能酶切质粒DNA，并将获得的DNA片段与其它DNA序列连接。每种质粒DNA序列都能被克隆到同一或其它质粒中。有许多技术可用于向植物宿主细胞中引入DNA这些技术包括用根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)作为转化体用T-DNA转化植物细胞，利用聚乙二醇(PEG)的原生质体融合，注射，DNA电穿孔，利用biolistic法引入DNA，及其它可能性。向植物细胞中注射和DNA电穿孔不需所用质粒或DNA的特殊方面。能使用简单的质粒如pUC衍生物。但是，如果欲由这些转化细胞再生为完整植物，则需要选择性标记基因的存在。根据向植物细胞中引入希望的基因的方法，可需要其它的DNA序列。例如，如果用Ti或Ri质粒转化植物细胞，则Ti和Ri质粒T-DNA的至少右边界，但通常是左右边界必须与欲作为侧翼区引入的基因相连接。如果用土壤杆菌转化，则必须将欲引入的DNA克隆到特定质粒，中间载体或二元载体中。通过与T-DNA序列同源的序列的同源重组，能将中间载体整合到土壤杆菌Ti或Ri质粒中。前者也含有T-DNA转移所需的vir区。中间载体不能在土壤杆菌中复制。也能利用辅助质粒(接合)将中间载体转移到根癌土壤杆菌中。二元载体能在大肠杆菌和土壤杆菌中复制。它们含有处于左右T-DNA边界区之中的一种选择性标记基因和一种接头或多接头。它们可被直接转化到土壤杆菌中(Holsters等人(1978)分子与普通遗传学163:181-187)。用作宿主细胞的土壤杆菌应含有一种携带vir区的质粒。vir区是向植物细胞中转移T-DNA所必需的。也可存在其它T-DNA。用这样转化的土壤杆菌转化植物细胞。T-DNA在转化植物细胞中的应用已进行了大量研究，描述于EP120516；Hoekema，《二元植物载体系统》OffsetdrukkerijKantersB.V,Alblasserdam(1985)，第5章；Fraley等人，植物科学评述(Crit.Rev.PlantSci.)4:1-46和An等人(1985)EMBOJ.4:277-287。为了向植物细胞中转移DNA，能方便地将植物外植体与根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌共培养。然后能在含有如用于筛选转化细胞的抗生素或杀生物剂的适当培养基中，由被感染的植物材料(例如叶切片、茎切片、根，以及原生质体，或在悬浮培养液中生长的植物细胞)再生为完整植物。然后可检查得到的植物是否存在引入的DNA。用biolistic法或原生质体转化引入外源DNA的其它可能性也已知(参见，例如，Willmitzer,L,1993，转基因植物。于《生物技术》，一部多卷综合论文(H.J.Rehm,G.Reed,A.Puhler,P.Stadler编)第二卷，627-659,VCHWeinheim-NewYork-Basel-Cambridge)。利用根癌土壤杆菌经Ti质粒载体系统转化双子叶植物已较明确，而最近的研究表明，利用基于土壤杆菌的载体甚至也使单子叶植物实际上可被转化(Chan等人，植物分子生物学22(1993),491-506；Hiei等人，植物杂志6(1994),271-282)。用于单子叶植物转化的备择系统是利用biolistic法的转化、原生质体转化、部分通透细胞的电穿孔和利用玻璃纤维引入DNA。文献中已描述了用于玉米转化的特别不同的方法(参见，例如，WO95/06128,EP0513849,EP0465875)。EP292435描述了一种方法，利用它能从无粘液、脆性、颗粒状玉米愈伤组织获得能育植物。在该说明书中，Shillito等人(生物技术7(1989),581)发现，再生为能育植物的能力需要从愈伤组织悬浮培养液开始，由其能制备具有再生植物能力的分裂的原生质体培养物。Prioli和Sondahl(生物技术7(1989)，589)也描述了从玉米原生质体再生并获得能育玉米植物。被引入的DNA整合到植物细胞基因组中后，通常稳定于此，并且也保持于最初转化的细胞的子代中。其通常含有一种选择性标记，该选择性标记赋予被转化的植物细胞对杀生物剂或抗生素如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素或膦丝菌素等的抗性。因此所选的各个标记应使得能在缺乏引入DNA的细胞中筛选被转化的细胞。在植物中，被转化的细胞以常规方式生长(参见，McCormick等人(1986)植物细胞报道(PlantCellReports)5:81-84)。产生的植物能正常生长，并与具有相同转化种质或其它种质的植物杂交。得到的杂种具有相应的表型特征。应生长两代或多代以确保表型特征能稳定保持并遗传。另外应收获种子等以确保能保持所述表型或其它特征。本发明的另一主题是一种以本质上已知的方式生产淀粉的方法，其中在该方法中处理或结合根据本发明的宿主细胞、植物细胞、植物、植物部分或繁殖材料。从植物或淀粉贮藏植物器官中提取淀粉的方法为本领域技术人员所周知。例如，Eckhoff等人(谷物化学(CerealChem.)73(1996)54-57)描述了从玉米粒中提取淀粉的方法。工业规模的玉米淀粉提取通常以湿磨法进行。另外，从多种淀粉贮藏植物中提取淀粉的方法描述于例如《淀粉化学与技术》(编者Whistler,BeMiller和Paschall(1994)，第二版，AcademicPressInc.LondonLtd.；ISBN0-12-746270-8；见，例如，第12章，412-468页；“玉米与高梁淀粉生产”，Watson，第13章，469-479页；“木薯、竹芋及西米淀粉生产”，Corbishley和Miller，第14章，479-490页；“马铃薯淀粉生产与应用”，Mitch，第15章，491-506页；“小麦淀粉生产、改性与应用”，Knight和Oson，第16章，507-528页；Rohmer和Klem的“稻淀粉生产与应用”)。在从植物材料中提取淀粉的方法中常用的装置是分离器、倾析器、旋液分离器、喷雾干燥器和流化床干燥器。由于根据本发明的核酸分子的表达，根据本发明的转基因植物细胞和植物合成一种淀粉，例如，与野生型植物中合成的淀粉相比，其物理化学性质已改变。本发明的另一主题是可从根据本发明的植物细胞和植物、其繁殖材料中或通过根据本发明的方法获得的淀粉。本发明的另一实施方案也包括根据本发明的淀粉在工业上，优选地在生产食品、包装材料或一次性产品生产中的应用。根据本发明的淀粉能用本领域技术人员周知的方法化学和/或物理修饰，其未修饰和或修饰的形式适用于食品或非食品方面的多种用途。根据本发明的淀粉的可能应用大体上可分为两个重要方面。一方面包括通过酶法或化学法获得的淀粉水解产物，主要是葡萄糖和葡萄糖单元。它们作为原材料用于其它化学修饰和如发酵的方法。此处重要的是水解法的简单性与便宜的设计，因为目前基本上用淀粉葡萄糖苷酶酶促进行。利用较少的酶节约经费是可行的。这可能是由于改变了淀粉的结构，例如提高了颗粒的表面积，由于分支程度的降低造成更好的可降解性，或限制与所用酶接近的空间结构的减少。根据本发明的淀粉能用作所谓的天然淀粉的另一方面，由于其聚合结构，可分为另外两个应用领域1．食品工业淀粉是许多食品的一种传统添加剂，其功能基本上是结合含水添加剂或提高粘度或提高胶凝能力。重要特性是流动特性、吸附特性、溶胀温度、胶凝温度、粘度、增稠能力、淀粉可溶性、透明度、凝胶结构、热稳定性、剪切稳定性、酸稳定性、退减的趋势、成膜能力、冻融稳定性、可消化性和与如无机或有机离子形成复合体的能力。2．非食品工业在此重要方面，淀粉用作多种制造方法的助剂，或用作产品添加剂。当用淀粉作为助剂时，特别是必须提到纸与纸板制造工业。淀粉主要用于缓聚目的(保持固态)、结合填充颗粒和细粉、作为硬化剂及用于脱水。而且，淀粉的有利特性涉及劲度、硬度、声音、触感、光泽、平滑度、粘合强度和表面。2.1.纸与纸板制造工业在造纸方法中，必须区分四个应用领域，即，表面、包涂、块状和喷涂。表面淀粉通常占最大的淀粉量，消费的80％，8％用作包涂淀粉，7％为块状淀粉，5％为喷涂淀粉。对淀粉在表面处理方面的要求一般是高白度、适当的粘度、高度稳定的粘度、良好的成膜性和较低的粉尘形成。当用于包涂时，固体含量、适当的粘度、高结合力和高色素亲合力起重要作用。当用作团块添加剂时，重要的是在纸织物中的快速、均匀、无损耗的分布、高机械强度和完整保持。如果淀粉用于喷涂方面，则适度的固体含量、高粘度和高结合力是重要的。2.2.粘合剂工业淀粉的一个重要应用领域是粘合剂工业，其潜在用途可分为四个部分作为纯浆糊的应用、在用专业化学药品处理过的浆糊中的应用、淀粉作为合成树脂和乳聚橡胶的添加剂的应用，和淀粉作为合成粘合剂的补充剂的应用。90％基于淀粉的粘合剂用于波面纸板生产、纸袋生产、纸铝复合材料的生产、用于信封、邮票的盒纸板和粘合剂的生产等。2.3.纺织工业和纺织品护理产品工业淀粉作为助剂和添加剂的一个重要应用领域是纺织品和纺织品护理产品的生产。在纺织工业中必须区分下面四个应用领域淀粉作为胶粘剂的应用，即作为助剂用于减轻和加强燃烧性能，以保护其免于纺织中施加的张力，并用于在纺织中增强耐磨性，淀粉作为织物整理剂的应用，特别是在降低质量的预处理如漂白、染色等之后，淀粉作为增稠剂在用于预防出血的染料浆制造中的应用，及淀粉作为用于缝纫线的弯曲剂的添加剂的应用。2.4.建筑材料工业第四个应用领域是淀粉在建筑材料中作为添加剂的应用。一个实例是石膏板的生产，其中与石膏浆混合的淀粉与水胶化，扩散到石膏核心表面，并且石膏板与核心结合。其它应用领域是与炼油和矿物纤维的混合。在预拌混凝土中，淀粉产品用于延缓结合。2.5.土壤稳定淀粉产品的一个有限市场是土壤稳定剂的生产，其用于当土壤被人工破坏时对土壤颗粒的暂时防水保护。根据本说明书，淀粉与合成胶乳的产品组合在其防止腐蚀和结硬皮作用方面等同于以前使用的产品，但明显更便宜。2.6.在作物保护产品和肥料中的应用使用淀粉的一个应用领域是用于改变产品特殊性质的作物保护产品。因此，淀粉用于提高作物保护产品和肥料的湿润性，用于测量有效成分的释放，用于将液体有效成分、挥发性有效成分和/或具有异味的有效成分转化为微晶、稳定、成形的物质，用于混合不相容的化合物，用于通过减少分解延长作用时间。2.7.医药及化妆品工业另一应用领域是医药及化妆品工业。在制药工业中，淀粉用作片剂的粘合剂或用于稀释胶囊中的粘合剂。另外，淀粉也用作片剂分解剂，因为它们在吞咽后吸收液体并在短时间内膨胀，使有效成分释放。医用润滑粉和创伤粉由于质量原因是基于淀粉的。在化妆品方面，例如，淀粉用作粉状添加剂如香料和水杨酸的载体。淀粉的一个相对较大的应用领域是牙膏。2.8.淀粉向煤和煤砖中的添加淀粉的一个应用领域是向煤和煤砖中的添加。加入淀粉后，由于较大的数量，煤能聚集或成块，从而防止煤砖的早期分解。在烧烤煤中，淀粉添加可达4-6％，在铝化煤中为0.1-0.5％。另外，淀粉作为粘合剂也是重要的，因为当向煤和煤砖中添加淀粉时，能明显减少有害物质的释放。2.9.矿石和煤泥滓的制造另外，淀粉能用作矿石和煤泥滓的制造中的絮凝剂。2.10.铸造助剂另一个应用领域是作为铸造助剂的添加剂。多种铸造方法需要由粘合剂处理的沙子制成的核心。现在主要使用的粘合剂是用改性淀粉，在大多数情况下用可溶胀淀粉处理的膨润土。加入淀粉的目的在于提高流动性并提高结合力。另外，可溶胀淀粉能满足生产工程的其它要求，如可用冷水分散，可再水合，易于与沙子混合，并具有较高水结合力。2.11.在橡胶工业中的应用在橡胶工业中，淀粉用于提高技术与视觉质量。原因是表面光泽的改善，触感与外观的改善，为此在冷熟化之前将淀粉分散于橡胶材料的粘胶表面，以及橡胶可印性的改善。2.12.皮革替代品的生产改性淀粉另外还可用于皮革替代品的生产。2.13.合成聚合物中的淀粉在聚合物方面，可设想以下应用领域淀粉降解产物在加工方法中的应用(淀粉只是填充物，在合成聚合物与淀粉之间没有直接的键)，或淀粉降解产物在聚合物生产中的应用(淀粉与聚合物形成稳定的键)。与其它物质如滑石相比，淀粉作为纯填充物的应用是没有竞争力的。当淀粉的特性影响从而显著改变终产物的特性谱时，这有所不同。一个实例是淀粉产物在热塑塑料如聚乙烯加工中的应用。在此通过按1∶1比例共表达结合淀粉与合成聚合物，得到母炼胶，用常规技术由之生产多种产品和粒状聚乙烯。通过在聚乙烯薄膜中应用淀粉，能实现中空体中物质通透性的提高，水蒸汽通透性提高，抗静电力的提高，防粘连性能的提高和墨水可印性的提高。当前的缺点涉及透明度不足，拉伸强度降低和弹性降低。另一种可能性是淀粉在聚氨酯泡沫塑料中的应用。通过改变淀粉衍生物和工艺流程优化，能以直接方式控制合成聚合物与淀粉羟基的反应。由于淀粉的使用，这产生具有下列特性谱的聚氨酯薄膜热伸展系数减小，收缩行为减小，压力-张力增高，不改变水吸收的情况下对水蒸汽的通透性提高，可燃性降低，极限拉伸强度降低，易燃部分无水滴形成，不含卤素，老化减缓。仍存在的缺点是可印性降低和冲击强度降低。当前产品的发展已不再限于薄膜。也可制造含有50％以上淀粉含量的固体聚合物产品如罐、板和盘。另外，淀粉/聚合物混合物因其生物降解性相当高故被认为是有利的。淀粉接枝聚合物因其极高的水结合能力而变得非常重要。它们是具有按照自由基链机制原则接枝的一条淀粉骨架和一条合成单体侧链的产物。根据可达每克淀粉1000克水的较好的结合与保持能力，结合高粘度，能区分当前可利用的淀粉接枝聚合物。这些超级吸收剂的应用领域在最近已大大扩大，在卫生领域，是产品尿布和垫布，在农业领域，例如是种子涂层。对于新型遗传工程淀粉的应用要确定的是，一方面，结构、含水量、蛋白含量、脂含量、纤维含量、灰分/磷酸含量、直链淀粉/支链淀粉比率、分子量分布、分支程度、颗粒大小、颗粒形状及结晶，另一方面，还有影响下列特征的性质流动及吸收状态、胶凝温度、粘度、增稠能力、可溶性、凝胶结构、透明度、热稳定性、剪切稳定性、酸稳定性、退减的趋势、凝胶形成、冻融稳定性、复合体形成、碘结合、薄膜形成、粘合力、酶稳定性、可消化性和反应性。利用重组方法生产改性淀粉一方面能改变例如植物产生的淀粉的性质，这样不再需要利用化学或物理改变的其它修饰。另一方面，已用遗传工程方法改变的淀粉可进行进一步的化学修饰，这可导致质量的进一步提高，以用于上述某些应用领域。这些化学修饰大都已知。特别是，通过加热及压力处理、有机酸或无机酸处理、酶处理、氧化或酯化的修饰，这导致例如磷酸淀粉、硝酸淀粉、硫酸淀粉、黄酸淀粉、乙酸淀粉和柠檬酸淀粉的形成。另外，在强酸存在下一元醇或多元醇可用于制备淀粉醚，产生淀粉烷基醚、邻烯丙醚、羟烷基醚、O-羧甲基醚、含氮淀粉醚、含磷淀粉醚、含硫淀粉醚、交联淀粉或淀粉接枝聚合物。根据本发明的淀粉的应用是在工业用途中，优选地用于食品或包装材料和一次性物品的生产。下面的实施例用来说明本发明，而决不是限制。缩写BE分支酶bp碱基对GBSS颗粒结合淀粉合酶IPTG异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷SS可溶性淀粉合酶PMSF苯甲基磺酰氟实施例中使用的培养基与溶液20×SSC175.3gNaCl88.2g柠檬酸钠加重蒸馏水至1000ml用10NNaOH调至pH7.0缓冲液A50mMTris-HClpH8.02.5mMDTT2mMEDTA0.4mMPMSF10％甘油0.1％连二亚硫酸钠缓冲液B50mMTris-HClpH7.62.5mMDTT2mMEDTA缓冲液C0.5M柠酸钠pH7.650mMTris-HClpH7.62.5mMDTT2mMEDTA10×TBS0.2MTris-HClpH7.55.0MNaCl10×TBST10×TBS0.1％(v/v)吐温20洗脱缓冲液25mMTrispH8.3250mM甘氨酸透析缓冲液50mMTris-HClpH7.050mMNaCl2mMEDTA14.7mMβ-巯基乙醇0.5mMPMSF蛋白质缓冲液50mM磷酸钠缓冲液pH7.210mMEDTA0.5mMPMSF14.7mMβ-巯基乙醇在实施例中使用下列方法1．克隆方法载体pBluescriptⅡSK(Stratagene)用于克隆到大肠杆菌中。对于植物的转化，将基因构建体克隆到二元载体pBinARHyg(Hofgen和Willmitzer,1990，植物科学6:221-230)和pBinB33-Hyg中。2．细菌菌株与质粒对于pBluescript载体pBluescriptⅡKS(Stratagene)和pBinARHyg和pBinB33Kyg构建体使用大肠杆菌DH5α株(BethesdaResearchLaboratories,Gaithersburgh，美国)。体内切除使用大肠杆菌XL1-Blue株。pBinAR质粒pBinAR是二元载体质粒pBin19(Bevan,1984)的衍生物，其如下构建从质粒pDH51中分离包含花椰菜花叶病毒35S启动子的核苷酸6909-7437的529bp片段作为EcoRⅠ/KpnⅠ片段(Pietrzak等人，1986)，连接于pUC18多接头的EcoRⅠ与KpnⅠ酶切位点之间，命名为质粒pUC18-35S。利用限制性内切核酸酶HindⅢ和PvuⅡ，从质粒pAGV40(Herrera-Estrella等人，1983)中分离192bp片段，其包含Ti质粒pTiACH5(Gielen等人，1984)的DNA(核苷酸11749-11939)。待PvuⅡ酶切位点具有SphⅠ接头后，将该片段连接于pUC18-35S的SphⅠ与HindⅢ酶切位点之间，将其命名为质粒pA7。另外，用EcoRⅠ和HindⅢ切下包含35S启动子和ocs终止子的完整多接头，连接于适当酶切的pBin19中。这产生植物表达载体pBinAR(Hofgen和Willmitzer,1990)。pBinB33将马铃薯(Solanumtuberosum)patatin基因B33(Rocha-Sosa等人，1989)的启动子作为DraⅠ片段(核苷酸-1512-+14)连接于SstⅠ酶切的载体pUC19中，该载体已用T4DNA聚合酶处理成平端。这产生质粒pUC19-B33。用EcoRⅠ和SmaⅠ从该质粒上切下B33启动子，将其连接于适当酶切的载体pBinAR中。这产生植物表达载体pBinB33。pBinAR-Hyg从质粒pA7(参见载体pBinAR的描述)开始，将包含35S启动子、ocs终止子和位于35S启动子与ocs终止子之间的多接头部分的EcoRⅠ-HindⅢ片段引入适当酶切的质粒pBin-Hyg中。pBinB33-Hyg从质粒pBinB33开始，切下包含B33启动子、多接头部分和ocs终止子的EcoRⅠ-HindⅢ片段，连接于适当酶切的载体pBin-Hyg中。这产生植物表达载体pBinB33-Hyg。3．根癌土壤杆菌的转化按照Hofgen和Willmitzer(1988，核酸研究16:9877)的方法通过直接转化转移DNA。按照Birnboim和Doly(1979，核酸研究7:1513-1523)的方法分离被转化的土壤杆菌的质粒DNA，进行适当的限制酶切，然后经凝胶电泳分析。4．马铃薯的转化借助于根癌土壤杆菌C58C1株，将质粒转化到马铃薯植物中(SolanumtuberosumL.cv.Desiree,VereinigteSaatzuchteneG,Ebstorf)(Dietze等人(1995)，《植物的基因转移》24-29页，编者Potrykus,I.和Spangenberg,G.,SpringerVerlag,Deblaere等人，1985,核酸研究13:4777-4788)。将用解剖刀创伤的不育马铃薯培养物的10片小叶子置于补加有2％蔗糖并含有50ml在选择条件下生长的根癌土壤杆菌过夜培养物的10mlMS培养基(Murashige和Skoog(1962)植物生理学15:473)中。轻摇培养物3-5分钟后，在暗处温育2天多。对于愈伤组织诱导，将叶子置于补加有1.6％葡萄糖、5mg/l萘乙酸、0.2mg/l苄氨基嘌呤、250mg/lclaforan、50mg/l卡那霉素和0.80％Bacto琼脂的MS培养基中。将叶子在25℃和3000Lux下温育1周后，将其置于补加有1.6％葡萄糖、1.4mg/l玉米素核糖、20mg/l萘乙酸、20mg/l赤霉酸、250mg/lclaforan、50mg/l卡那霉素和0.80％Bacto琼脂的MS培养基上，诱导发芽。5．植物培养方案按下列方案将马铃薯植物保持于温室中光照期25,000Lux和22℃16小时黑暗期15℃8小时大气湿度60％6．DNA片段的放射性标记按照使用说明书，用BoehringerMannheim(德国)的DNA随机引物标记试剂盒放射性标记DNA片段。7．淀粉合酶活性的测定如Denyer和Smith,1992，植物186:609-617所述，通过测定ADP[14C葡萄糖]的14C葡萄糖向甲醇/KCl-不溶性产物中的掺入，进行淀粉合酶活性的测定。8．非变性凝胶中可溶性淀粉合酶的检测为了用非变性凝胶电泳检测可溶性淀粉合酶的活性，在50mMTris-HClpH7.6、2mMDTT、2.5mMEDTA、10％甘油和0.4mMPMSF中水解马铃薯块茎的组织样品。电泳在MiniProteanⅡ容器(BioRAD)中进行。1.5mm厚凝胶的单体浓度是7.5％(w/v)，用25mMTris-甘氨酸pH8.4作为凝胶缓冲液和电泳缓冲液。每块凝胶加样相同量的蛋白提取物，并在10mA下分离2小时。随后将活性凝胶在50mMTricine-NaOHpH8.5、25mM乙酸钾、2mMEDTA、2mMDTT、1mMADP-葡萄糖、0.1％(w/v)支链淀粉和0.5M柠檬酸钠中温育。用鲁戈士溶液染色形成的葡聚糖。9．淀粉分析用下列方法表征转基因马铃薯植物形成的淀粉a)马铃薯植物的淀粉中直链淀粉/支链淀粉比率的测定用标准方法从马铃薯植物中分离淀粉，并用Hovenkamp-Hermelink等人(马铃薯研究(PotatoResearch)31(1988)241-246)所述的方法测定直链淀粉支链淀粉比率。b)磷酸含量的测定在马铃薯淀粉中，某些葡萄糖单元可能在C2、C3和C6位碳原子上磷酸化。为了测定葡萄糖C6位磷酸化的程度，将100mg淀粉在1ml0.7MHCl中95℃水解4小时(Nielsen等人(1994)植物生理学105:111-117)。用0.7MKOH中和后，对50ml水解产物进行目视酶检测，以测定葡萄糖-6-磷酸。监测所测批次(100mM咪唑/HCl；10mMMgCl2；0.4mMNAD；2单位肠系膜明串球菌(Leuconostocmesenteroides)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；30℃)在334nm处的吸光度改变。如Ames,1996，酶学方法(MethodsinEnzymology)Ⅷ,115-118所述测定总磷酸。c)支链淀粉侧链的分析为了分析淀粉样品中侧链的分布和长度，在100mM柠檬酸钠缓冲液pH3.5中用0.4单位异淀粉酶(MegazymeInternationalIrelandLtd.,Bray，爱尔兰)37℃消化1ml0.1％淀粉溶液过夜。除非另外指明，否则其余分析如Tomlinson等人(1997)植物杂志11:31-47所述进行。d)颗粒大小的测定用德国RetschGmbH的“lumosed”光沉降仪测定颗粒大小。为此，将0.2g淀粉悬浮于约150ml水中并立即测定。厂商提供的程序计算淀粉颗粒的平均直径，假定平均淀粉密度为1.5g/l。e)胶凝性质用德国BrabenderOHG的ViskographE或使用快速粘度分析仪，NewportScientificPtyLtd,InvestmentSupportGroup,WarriewoodNSW2102，澳大利亚，记录淀粉的胶凝性质或粘性。当使用ViskographE时，对溶于450ml水的20g淀粉悬液进行下列加热程序以3℃/分钟从50℃加热到96℃，保持恒定30分钟，以3℃/分钟冷却到30℃，再次保持恒定30分钟。温度分布型显示特征性胶凝性质。当用快速粘度分析仪(RVA)测定时，对溶于25ml水的2g淀粉悬液进行下列加热程序于50℃悬浮60秒，以12℃/分钟从50℃加热到95℃，保持恒定2.5分钟，以12℃/分钟冷却到50℃，再次保持恒定2分钟。RVA温度分布型显示所测淀粉的粘度测定参数，最大粘度(Max)、终末粘度(Fin)、胶凝温度(T)、最大粘度后发生的最小粘度(Min)，和最小粘度与终末粘度的差(回退值，Set)(参见表1和图1)。f)凝胶强度的测定为了用结构分析仪测定凝胶强度，使2克淀粉在25ml水中凝化(参见RVA测定)，然后排除空气在密封容器中25℃贮存24小时。将样品置于结构分析仪TA-XT2(StableMicroSystems)的探头(圆形印章)之下，按下列参数设置测定凝胶强度检测速度0.5mm刺入深度7mm(印章)接触面积113mm2压力胺触面积2g10．葡萄糖、果糖和蔗糖的检测为了测定葡萄糖、果糖和蔗糖含量，将马铃薯块茎的小块茎部分(直径约10mm)在液氮中冷冻，然后用0.5ml10mMHEPES,pH7.5、80％(v/v)乙醇80℃抽提30分钟。移出含有可溶物的上清液并测定其体积。该上清液用于测定可溶性糖的量。在具有下列组成的批次中进行可溶性葡萄糖、果糖和蔗糖的定量测定100.0mM咪唑/HCl,pH6.91.5mMMgCl20.5mMNADP+1.3mMATP10-50μl样品1.0单位酵母葡萄糖-6磷酸脱氢酶该批次在室温下温育5分钟。随后在连续加入下列酶后通过测定340nm的吸光度光测糖1.0单位酵母己糖激酶(测定葡萄糖)1.0单位酵母葡糖磷酸异构酶(测定果糖)和1.0单位酵母蔗糖酶(测定蔗糖)应用实施例实施例1编码马铃薯β-淀粉酶的cDNA片段的分离根据制造商(Stratagene)指示，将肿瘤特异性cDNA马铃薯文库(λZAPⅡ,Stratagene)的大约6×106个噬斑形成单位(pfU)体内切割，将一部分噬菌粒原种用于大肠杆菌XL1-MRF细胞的转染(根据制造商指示)。从大约5×105这样的大肠杆菌转化子中制备质粒DNA(Sambrook等，1989，出处同上)，用于根据电穿孔方法(BioRAD，依制造商指示)对大肠杆菌菌株KV832/pACAG(Abel,G.,1995，柏林技术大学生物系博士论文)的细胞的转化。将KV832/pACAG转化子于37℃用1％葡萄糖和1mMIPTG在YT培养基(5g/lNaCl,8g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物)上培养。为筛选质粒pACAG的存在，培养基含有10mg/l氯霉素。为筛选阳性转化子，培养基含有100mg/l氨苄青霉素。大约生长14小时后，转化的细胞菌落用碘蒸汽染色。根据Birnboim&Doly(1979)的方法制备明显颜色较弱的菌落之质粒，并用于转化大肠杆菌DH5α(Sambrook等，1989，出处同上)。这些转化子的质粒用来进行DNA测序，鉴定为SEQIDNO.1。用这种方法筛选的质粒于1998年7月24日保藏于德意志微生物保藏中心，FRG，保藏号DSM12348，且含有编码马铃薯(Solanumtuberosum)的β-淀粉酶之CAMV35S启动子与ocs终止子之间的如SEQIDNO.1所示的大约1300bp长的核苷酸序列之Asp718/BamH1片段。实施例2质粒p35SαSSⅠ-Hyg的制备将含有编码马铃薯SSⅠ(Abel,G.(1995)，博士论文，FreieUniversitatBerlin)的部分cDNA的1831bpAsp718/XbaⅠ片段以相对于35S启动子的反义方向引入载体pBinAR-Hyg的Asp718与XbaⅠ酶切位点之间。实施例3质粒p35S-SSⅠ-Kan的制备使含有编码马铃薯SSⅠ(Abel,1995,同前)的cDNA的2384bpEcoRⅠ片段成为平端，并以相对于35S启动子的有义方向引入预先用SmaⅠ酶切的载体pBinAR中。实施例4质粒p35SαSSⅡ-Kan的制备使含有编码马铃薯SSⅡ(Abel,1995，此处称为GBSSⅡ)的部分cDNA的1959bpSmaⅠ/Asp718片段成为平端，并以相对于35S启动子的反义方向引入载体pBinAR的SmaⅠ酶切位点中。实施例5质粒pB33-SSⅡ-Hyg的制备将含有编码马铃薯SSⅡ(Abel,1995，同前)的cDNA的2619bpSmaⅠ/SalⅠ片段以相对于B33启动子的有义方向引入预先用SmaⅠ和SalⅠ酶切的载体pBinB33-Hyg中。实施例6质粒p35SαSSⅢ-Hyg的制备将含有编码马铃薯SSⅢ(Abel等人，1996，植物杂志10(6):981-991)的cDNA的4212bpAsp718/XbaⅠ片段以相对于35S启动子的反义方向插入载体pBinAR-Hyg的Asp718与XbaⅠ酶切位点之间。实施例7质粒p35S-SSⅢ-Kan的制备使含有编码马铃薯SSⅢ(Abel等人，1996，同前)的cDNA的4191bpEcoRⅠ片段成为平端，并以相对于35S启动子的有义方向引入载体pBinAR的SmaⅠ酶切位点中。实施例8质粒pB33αBEαSSⅢ-Kan的制备使含有编码马铃薯BE酶(Kossmann等人，1991，分子与普通遗传学230(1-2):39-44)的部分cDNA的1650bpHindⅢ片段成为平端，并以相对于B33启动子的反义方向引入预先用SmaⅠ酶切的载体pBinB33中。用BamHⅠ切开产生的质粒。再将含有编码马铃薯SSⅢ酶(Abel等人，1996，同前)的部分cDNA的1362bpBamHⅠ片段以相对于B33启动子的反义方向引入该酶切位点中。实施例9质粒p35SαSSⅡ-αSSⅢ-Kan的制备将含有编码马铃薯SSⅡ(Abel,1995,同前)的部分cDNA的1546bpEcoRV/HincⅡ片段克隆到已用EcoRV/HincⅡ酶切的载体pBluescriptⅡKS中，然后经Asp718/BamHⅠ消化切下，以相对于35S启动子的反义方向引入以相同方式消化的载体pBinAR中。然后，再将含有编码马铃薯SSⅢ(Abel等人，1996，同前)的部分cDNA的1356bpBamHⅠ片段以相对于35S启动子的反义方向引入载体pBinAR-SSⅡ的BamHⅠ酶切位点中。实施例10质粒pB33αSSⅠαSSⅢ-Kan的制备使含有编码马铃薯SSⅠ(Abel,1995,同前)的cDNA的2384bpEcoRⅠ片段成为平端，并以相对于B33启动子的反义方向克隆到pBinB33载体的SmaⅠ酶切位点中。再将含有编码马铃薯SSⅢ(Abel等人，1996，同前)的部分cDNA的1362bpBamHⅠ片段以相对于B33启动子的反义方向引入产生的载体的BamHⅠ酶切位点中。实施例11质粒p35SoSSⅡ-Hyg的制备使含有编码SSⅡ(Abel,1995,同前)的部分cDNA的1959bpSmaⅠ/Asp718片段成为平端，并以相对于35S启动子的反义方向引入pBinAR-Hyg载体的SmaⅠ酶切位点中。实施例12质粒向马铃薯细胞基因组中的引入将实施例1-11所述的质粒单个和/或连续地转移到土壤杆菌中，由此如上所述转化马铃薯细胞。随后由被转化的植物细胞再生为完整植物。实施例13改性淀粉的物理化学表征转化产生的转基因马铃薯植物显示其合成的改性淀粉的物理化学的改变。由这些植物形成的淀粉例如与野生型植物就其磷酸或直链淀粉含量、RVA测定的粘度或胶凝化性质及其层析行为而言不同。序列表<110>HoechstScheringAgrEvoGmbH<120>编码β-淀粉酶的核酸分子，合成改性淀粉的植物，植物的制备，其用途，及改性淀粉<130>AGR1998/M224<150>DE19836099.1<151>1998-07-31<160>2<170>PatentlnVer.2.1<210>1<211>1950<212>DNA<213>马铃薯<400>1attaatattattattatggcaatgagtctgccacaccagatcggtgccttatcaggaaca60tcgctcacggcggaaaccggtggagtttcatgcgaagttccggcgaaggggagttcagct120acatcagctatgtggagaacaccgatgacgaatttaaaagtatcggtacaaaaaacagga180actgaaattgacagggtgtcgccgtcgccgtcgccgccgatgagtccgatgatgggagga240ggaatgcggccggatttattagcgtgtcaagcgttgatggaagctcaggtagatgaggta300gttgagagagaatataaggttaggaattcgtcggagaaagagaaaggagttccggtgttt360gttatgatgccgttggatagtgtgaaaatggatcatactgtgaataggaagaaggcgatg420aatgcgagtttacaggcgttgaagagcgccggtgtggaagggattatgatggatgtgtgg480tggggattggtggagagagatgcgccgggagagtataattggggcggttatgctgagctt540atggaaatggcgaaaaaacatggactcaaagttcaagctgtgatgtctttccatcaatgt600ggtggaaacgtcggtgattcctgcacgatccctcttccaaggtgggttgttgaggagatg660gagaaggatccagatcttgcatacacagatcagtggggaaggaggaattttgaatatgta720tcgcttggttgcgatacacttccagttcttaaaggaaggactcctgtccaatgctattct780gatttcatgagagggtttagagatagatttgagsatctcctaggtgacaccattgtggaa840attcaagtcgggatgggtccagctggagagctccgttatccatcctatccggaaaaagat900ggagtatggaaattccctggaattggtgcttttcagtgttatgacaagtacatgatcagt960agcttacagggtgcagcagaagcttttggtaagcctgaatggggacacaccggtccaacc1020gatgctggtcagtacaacaattggccagaagataccaacttttccaagaaggaaggtggt1080ggatgggatagtcaatatggggagttcttcctcacttggtattctgagatgcttttgsac1140catggtgagaggatactgcaatcagccaaggcgatattcgaggacaagggtgttaagatt1200tcagttaagattgcaggtattcactggcactatggaacaaggtcccatgcccctgagctg1260accgctggatactacaacacccgtaaccgagatggttaccttcccatcgcccaaatgctt1320gcccgccacggtgcagttttcaacttcacatgtgttgagatgcgtgaccacgagcagcca1380caagatgcactatgtgcacctgagaagttggttaggcaagtggctttagcaactcaggaa1440gctcaagttccacttgctggggagaatgcattgccacgatacgatgattatgcacatgaa1500cagatccttcaagcatcctcattgaatatcaacgatcaatcaggtgatagagagatgtgc1560gcgtttacatatttgaggatgaatcctgacctattccatcctgataactggaggcgactc1620gttgccttcgtgaagaaaatgaaagaaggaaaagacgcaaacaaatgccgggaacaagta1680gagagggaggcagagcatttcgtgcatataactcagccgttagtgcaagaagctgcagct1740gccctcatgcactaagcaaatggttgtcaaatagtactgtaattttgatccttttagcta1800acatggagtttttcaacatgttacgaggatcttatagctcgttatcgttcttcttatatg1860tttgtaaaactgtccatcgtgtattttttcgaagttagacattatgtcttaatgaaatga1920tacataattcagtagtaaaaaaaaaaaaaa1950<210>2<211>579<212)PRT<213>马铃薯<400>2MetAlaMetSerLeuProHisGlnIleGlyAlaLeuSerGlyThrSer151015LeuThrAlaGluThrGlyGlyValSerCysGluValProAlaLysGly202530SerSerAlaThrSerAlaMetTrpArgThrProMetThrAsnLsuLys354045ValSerValGlnLygThrGlyThrGluIleAspArgValSerProSer505560ProSerProProMetSerProMetMetGlyGlyGlyMetArgProAsp65707580LeuLeuAlaCysGlnAlaLeuMetGluAlaGlnValAspGluValVal859095GluArgGluTyrLysValArgAsnSerSerGluLysGluLysGlyVal100105110ProValPheValMetMetProLeuAspSerValLysMetAspHisThr115120125ValAsnArgLysLysAlaMetAsnAlaSerLeuGlnAlaLeuLysSer130135140AlaGlyValGluGlyIleMetMetAspValTrpTrpGlyLeuValGlu145150155160ArgAspAlaProGlyGluTyrAsnTrpGlyGlyTyrAlaGluLeuMet165170175GluMetAlaLysLysHisGlyLeuLysValGlnAlaValMetSerPhe180185190HisGlnCysGlyGlyAsnValGlyAspSerCysThrIleProLeuPro195200205ArgTrpValValGluGluMetGluLysAspProAspLeuAlaTyrThr210215220AspGlnTrpGlyArgArgASnPheGluTyrValSerLeuGlyCysAsp225230235240ThrLeuPrpValLsuLysGlyArgTArProValGlnCysTyrSerAsp245250255PheMetArgGlyPheArgAspArgPheGluAshLeuLeuGlyAspThr260265270IleValGluIleGlnValGlyMetGlyProAlaGlyGluLeuArgTyr275280285ProSerTyrProGluLysAspGlyValTrpLysPheProGlyIleGly290295300AlaPheGlnCysTyrAspLysTyrMetIleSerSerLeuGlnGlyAla305310315320AlaGluAlaPheGlyLysProGluTrpGlyHisThrGlyProThrAsp325330335AlaGlyGlnTyrAsnAsnTrpProGluAspThrAsnPhePheLysLys340345350GluGlyGlyGlyTrpAspSerGlnTyrGlyGluPhePheLeuThrTrp355360365TyrSerGluMetLeuLeuAsnHisGlyGluArgIleLeuGlnSerAla370375380LysAlaIlePheGluAspLysGlyValLysIleSerValLysIleAla385390395400GlyIleHisTrpHisTyrGlyThrArgSerHisAlaProGluLeuThr405410415AlaGlyTyrTyrAsnThrArgAsnArgAspGlyTyrLeuProIleAla420425430GlnMetLeuAlaArgHisGlyAlaValPheAsnPheThrCysValGlu435440445MetArgAspHisGluGlnProGlnAspAlaLeuCysAlaProGluLys450455460LeuValArgGlnValAlaLeuAlaThrGlnGluAlaGlnValProLau465470475480AlaGlyGluAsnAlaLeuProArgTyrAspAspTyrAlaHisGluGln485490495IleLeuGlnAlaSerSerLeuAsnIleAsnAspGlnSerGlyAspArg5005055l0GluMetCysAlaPheThrTyrLeuArgMetAsnProAspLeuPheHis515520525ProAspASnTrpArgArgPheValAlaPheValLysLysMetLysGlu530535540GlyLysAspAlaAsnLysCysArgGluGlnValGluArgGluAlaGlu545550555560HisPheValHisIleThrGlnProLeuValGlnGluAlaAlaAlaAla565570575LeuMetHis权利要求1．一种编码具有马铃薯β-淀粉酶功能的蛋白质之核酸分子，其选自a)编码涵盖示于SEQIDNO.2的氨基酸序列，或其衍生物或部分的蛋白质的核酸分子，b)涵盖SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或其衍生物或部分，或一种相应的核苷酸序列的核酸分子；c)可与a)或b)所述核酸分子杂交，或与它们互补，优选地与它们特异性地杂交的核酸分子；和d)核酸分子，由于遗传密码的简并性其核苷酸序列背离a)、b)或c)所述核酸分子的序列。2．一种重组核酸分子，其包含a)一种编码权利要求1的具有马铃薯β-淀粉酶功能的蛋白质之核酸分子；和b)一种或多种核苷酸序列，其编码一种选自A组的蛋白质，包括具有下列功能的蛋白质分支酶、ADP葡萄糖焦磷酸化酶、颗粒结合淀粉合酶、可溶性淀粉合酶、脱支酶、歧化酶、质体淀粉磷酸化酶、R1酶、淀粉酶、葡糖苷酶，所述核苷酸序列的片段，或可与所述核苷酸序列杂交的核酸分子。3．权利要求1或2的核酸分子，其为脱氧核糖核酸分子。4．权利要求2的核酸分子，其为cDNA分子。5．权利要求1的核酸分子，其为核糖核酸分子。6．一种核酸分子，其可与一种或多种权利要求1-5的核酸分子杂交，优选地特异性杂交。7．一种含有权利要求1-6中一项或多项的核酸分子的载体。8．一种含有权利要求1-6中一项或多项的核酸分子的载体，其中编码具有可溶性淀粉合酶Ⅲ的功能的蛋白质或其部分的核苷酸序列为有义或反义反向。9．一种含有权利要求1-6中一项或多项的核酸分子的载体，其中编码选自A组的一种或多种蛋白质或其部分之核苷酸序列为有义或反义反向。10．一种含有权利要求1-6中一项或多项的核酸分子的载体，其中编码选自A组的一种或多种蛋白质之核苷酸序列部分为有义方向，部分为反义反向。11．一种含有权利要求1-6中一项或多项的核酸分子的载体，其与在原核或真核细胞中确保RNA转录和合成的调节元件连接，所述RNA任选地可翻译。12．一种用权利要求1-6中一项或多项核酸分子或用权利要求7-11中的一项或多项载体转化的宿主细胞或来自这类细胞的宿主细胞。13．一种产生合成改性淀粉的转基因植物细胞的方法，其中如权利要求1-6中的一项或多项核酸分子或权利要求7-11中的载体整合入植物细胞的基因组。14．一种通过权利要求13的方法可获得的植物细胞。15．一种用于产生合成改性淀粉的转基因植物的方法，其中从权利要求14的细胞中再生完整植物。16．一种植物，其含有权利要求14的植物细胞。17．权利要求16的植物，其是有用的植物。18．权利要求16-17中一项或多项的植物，它是一种淀粉贮藏植物。19．权利要求16-18中一项或多项的植物，它是小麦、玉米、马铃薯或稻植物。20．权利要求16-19中一项或多项的植物的繁殖材料。21．一种通过本质上已知的方法制备淀粉的方法，其中权利要求14的植物细胞，权利要求16-19中一项或多项的植物，或权利要求20的繁殖材料结合于该方法中。22．一种淀粉，其可获自权利要求12或14中的细胞，权利要求16-19中一项或多项的植物，获自权利要求20的繁殖材料或权利要求21的方法。23．权利要求22中的淀粉在工业中，优选地在食品、包装材料或一次性物品生产中的应用。24．权利要求1-6中一项或多项的核酸分子或权利要求7-11中一项或多项的载体在产生转基因细胞，优选地细菌或植物细胞中的应用。25．权利要求14中的植物细胞，权利要求16-19中一项或多项的植物，或权利要求20的繁殖材料在淀粉生产中的应用。全文摘要本发明涉及编码具有β－淀粉酶活性的来自马铃薯的蛋白质之核酸分子,以及制备转基因植物细胞及合成改性淀粉的植物的方法。本发明还涉及含有根据本发明的核酸分子的载体和宿主细胞,用根据本发明的方法产生的植物细胞和植物,根据本发明的植物细胞和植物合成的淀粉。本发明还涉及产生所述淀粉的方法。文档编号A01H5/00GK1316005SQ99810307公开日2001年10月3日申请日期1999年7月30日优先权日1998年7月31日发明者C·弗罗伯格申请人:阿温提斯作物科学有限公司