专利名称：进行转基因的方法
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目前，在动物转基因方面有几种方法。前细胞核显微注射是最先得到广泛应用的方法。这个方法是在20世纪80年代早期通过老鼠实验发展起来的，它需要把转移基因DNA注射到单细胞胚胎的一个前体细胞核中。在这个方法的首次报道(Gordon,J.W.,Scangos,G.A.,Plotkin,D.J.,Barbosa,J.A.&Ruddle,F.H.,Proceedings ofthe National Academy of Science USA 77,7380)中，在出生的78只幼犬中只有两只带有转移DNA，转基因效率不到3％(2/78)。随着人们对这个方法的不断改进，目前利用前细胞核显微注射法在老鼠中进行转基因的效率已增加到15％左右的通常的数值。然而，对于其它物种，如牛、绵羊、猪及山羊(具有商业价值的物种的例子)，相对应的转基因的效率非常低(1％左右)。这可能反映了老鼠单细胞胚胎的获得和处理与其它物种单细胞胚胎的获得和处理的困难相比是相对容易的。同老鼠的单细胞的胚胎不同，当在标准光学显微镜下观察这些具有商业价值物种的单细胞的胚胎时，看到的结果非常模糊(由于这些物种含有高水平的脂类内含物)。这对于前细胞核显微注射来说是一重大的缺陷，因为该方法要求注射针被精确的注射到一个卵(前体细胞核)的一个特定的腔体中。前体细胞核必须被定位，因此它必须是可见的。在试图解决这个问题的尝试中引入了低速离心这个附加的步骤。
由于基因的整合位点及整合进宿主基因组基因拷贝数量的随机性，利用前体细胞核显微注射法进行转基因还不能对转移基因的插入结果进行控制和预测。通过利用胚胎干细胞(通常是老鼠的，ES)可以对整合的结果进行较好的控制。这样的胚胎干细胞是通过具有靶基因组同源重组的结构进行转染而得到的。被转染的胚胎干细胞可以在体外进行筛选、鉴定从而去确认那些结构上的整合位点。接下来，那些带有如胚胎干细胞靶基因的重组胚胎可以被用于产生嵌合后代(杂种后代)。这种基因改变的方法目前被限定到那些已建成的有利于生殖系胚胎干细胞存在的老鼠身上，而在其它物种上还没有可以被证实的应用。
由于修饰哺乳动物基因系方法的现有策略的限制，促使人们寻找可替代的方法。这些方法包括应用重组的逆转录酶病毒去感染卵母细胞预移植的胚胎、复制缺陷型的腺病毒所介导的转移体系或者以精子作为在体外受精期间DNA转移的载体。在最后的一种方法中，活的精子被用做在体外把重组DNA引入卵母细胞的一个载体。因为生物学上的现象很难被鉴定到，而且由于它的不可靠性而限定了它的应用。
以前曾经报道过下面的将细胞质内的精子注射(ICSI)进入处于细胞分裂中期Ⅱ老鼠卵母细胞的事件。精子的头部，由于它们在注射时是不可移动的，曾被认为是“死的”，尽管如此，它们仍旧能支持精子充分发育。更重要的是，细胞膜被破坏的精子也能支持精子的充分发育。(Perry,A.C.F.,Wakayama,T.& Yanagimachi,R.Biology of Reproduction 60,747)。在下面的精子的细胞膜的结构在整个生物学上是高度保留的。这种结构(主要是细胞核和细胞核周基质)的主要蛋白成分是带有正电荷的碱性蛋白质。这表示它们能支持如包括DNA和RNA这样的核酸在内的多聚阴离子相互间静电作用。这些特点已在一种新的转基因方法的研究发展中被利用，而这种方法就是在此要叙述的。这种方法与现存的方法比较有明显的优越性它可以高效率的产生转基因后代；它可以用于各种不同物种的转基因动物的生产；它的灵活性允许相对比较宽范围不同类型的转移基因和其它分子导入；它可以对非受精卵进行生物学上的操作；它支持转基因中的一个分枝-所谓的基因靶向。利用基因靶向方法在一个完整的基因组中能够进行特定位点的改变。该项发明的方法将在此后进行叙述。
该项发明的概况该发明提供了引入转移基因(tg)核酸(NA)进入如动植物这样生物体的细胞中，或通过注射转移基因核酸进入体外培养的细胞中，或利用事先和细胞核混合好的转移基因核酸共注射到一个未成熟的卵母细胞、一个未受精的卵母细胞或去核的卵母细胞(自此以后就称为卵母细胞)中的方法。
在本发明的一个实施例中，那些未受精的卵母细胞在细胞减数分裂的中期Ⅱ阶段被抑制了。中期Ⅱ的卵母细胞在该阶段正常参加哺乳动物受精。本发明进一步提供了将转移基因核酸(NA)引入一个含有残余细胞核成分细胞中的方法，随后进行发育激活。
在这里用的专业术语“转基因核酸”(或“tg NA”)意图包括任何可以被引入一个卵母细胞而诱导到此时为止仍为天然型的基因组的顺序变化的核酸及其衍生物，这种变化改变了基因组。在一个实施例中，转基因的核酸是脱氧核糖核酸即DNA。专业术语“细胞核”在此指的是整个核或对胚胎发育完全或进一步发育所必需的部分。在一个最佳实施例中，这个核是一个精子的细胞核。
该项发明进一步提供了通过转移基因和细胞核共插入而产生转基因动物的方法。例如，在这个方法中，通过混合在一起使这个细胞核接触转移基因核酸。在一个实施例中，细胞核是细胞膜已被去掉或破坏的精子的细胞核。该项发明允许使用各种各样的破坏膜的方法。
在本发明的一个最佳实施例中，细胞核是通过显微注射法或最好是采用压电激活显微注射法插入卵母细胞中。压电激活显微注射法(相对传统的方法而言)促进了显微注射的过程，使过程更加迅速。这样就减少了细胞损伤，增加了胚胎的存活率。以这种方式重组的细胞使发育成为可能。在一个实施例中，发育产生了相当大数量的同基因型的细胞(例如干细胞)。在进一步的实施例中，重组细胞可以在随后的体外培养发育成一个胚囊。而且得到的胚胎在这时或胚胎发育前一个阶段可以被转移到一个合适的代理母亲(受体母亲)中以便进行充分的发育。
在此我们验证了通过一个精子头部和一个转移基因DNA共插入的方法而产生活的转基因后代的研究结果。我们验证了不仅转移基因存在于后代中，而且这些转移基因在后代中进行了表达而改变了后代的特征。在本发明的不同的最佳实施例中，我们证实细胞膜已经被破坏的精子头部高效率地促进了转基因。细胞膜的破坏可以用不同的方法获得，这包括用清洁剂、冻融或冷冻干燥法处理精子。精子头部细胞膜的破坏足以表明了精子细胞适合应用在这种方法中。我们在这里用精子的头部，包括细胞膜受到损伤的精子的头部，去证明该项发明的原理。在本发明的一个实施例中，细胞膜的损伤允许转移基因DNA接近亚细胞核元素，这些亚细胞核元素包括但不限于核周基质(就精子而言)、核基质、染色质及基因组DNA。
在本发明的一个实施例中，转移基因核酸是一个经编码的易于检测的表现型标记的线形的DNA片段。通过细胞核和DNA共插入得到的转基因的胚胎和后代拥有了基因组的改变。这种基因组的改变可以以一种易于检测的方式(表现型)改变它们的特性。可以适用的易于检测的标记包括萤火虫荧光素酶(Luc)、大肠杆菌β-半乳糖甘酶(LacZ)和Aequoria victoria的绿色荧光蛋白(GFP)。
最好是，在用一个微量移液器共注射之前进行转移基因核酸和细胞核的混合。在另一个最佳实施例中，共注射进入一个在细胞减数分裂中期Ⅱ被抑制的胚胎。我们在这里用的是编码Aequoria victoria的绿色荧光蛋白(GFP)的DNA或大肠杆菌β-半乳糖甘酶的DNA(LacZ)，从而通过表明该发明的方法产生转基因胚胎中的转移基因序列以一个高的频率被表达以证明本发明的原理。本发明的另一个实施例中，转移基因核酸是和人工染色体，诸如哺乳动物、酵母及细菌的人工染色体是相对应的(分别是MAC、YAC、BAC:Schindelhauer,D.Bioessays21,76；Peterson,K.R.Method in Enzymology 306,186；Kim,U.J.,Birren,B.W.,Spleak,T.,Mancino,V.,Boysen,C.,Kang,H.L.,Simon,M.I.,& Shizuya,H.Genomics34,213)。在本发明的进一步实施例中，转移基因核酸对应于核糖核酸(RNA)，例如信使RNA(mRNA)，或对应于RNA-DNA异源双链(至少有一个错配的嵌合体)，或对应于肽核酸。
因此，该发明通过一个核和转移基因DNA共注射到一个未受精的卵母细胞中从而为产生转基因后代提供了一种高效率的方法。本发明可以应用于所有的生物体和变异细胞及干细胞的集合。而这些变异细胞及干细胞可以或可能随着一个细胞核插入到一个未受精的卵母细胞而产生。这些细胞核的来源没有限制，它包括来源于两栖动物、鱼、鸟(诸如家鸡、火鸡、鹅等等)及哺乳动物，诸如灵长类动物、绵羊、牛、猪、熊、山羊、猫、犬、马、鼠等等。在本发明的一个实施例中，细胞核来源于精子，同精子细胞核关系密切的一些属性被保留了。(见Kimura,Y.,Yanagimachi,R.,Kuretake,S.,Bortkiewicz,H.,Perry,A.C.F & Yanagimachi,HBiology ofReproducticn 58,1407)。
利用显微注射法进行转移基因DNA/细胞核物质的共同导入的方法和需要人工或通过在体外提高细胞融合方法有时空上的不同。(Lavitrano,M.,Camaioni,A.,Fazio,V.M.,Dolci,S.,Farace,M.G.& Spadafora,C.Cell 57,717)。在一个实施例中，显微注射法首先需进行细胞核(和核酸)的筛选，接下来它们的沉积物通过穿透卵母细胞的原生质膜而进入卵母细胞。
利用该项发明方法进行的转移基因和细胞核的共注射不需要从活细胞中获得细胞核。这进一步使该项发明的方法区别于那些认为活的精子和转移基因DNA(在体内成体外)被混合，然后通过授精引入DNA例证解释的方法。而且，根据该项发明的方法，转移基因DNA和一个来源于膜被破坏细胞的细胞核的共同注入，允许可能对程序的结果有效的、受到精确地控制的试剂的共导入。这样的试剂可以包括酶，抗体或药理上信号转导的抑制剂，它们可以通过调节重组或/和胚胎发育来促进转基因，这些试剂可以在转移基因DNA核酸和细胞核共导入胚胎之前、期间或之后导入胚胎。
图2表明了转基因的胚胎是通过single-shot double transgenesis(“单打二”转基因)而产生的。用将pCX-LacZ和pCX-EGFP转移基因混合进行预培养过的精子显微微注射卵母细胞。如例3所示。图中表明了用霍夫曼氏紫染色调整和未染色的显微镜观察3.5天后到的同样的胚胎(X400)情况的对比(A),(B)是在长波(480nm)紫外线下绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况，而(C)是表示用X-gal染色后的β-半乳糖苷酶的表达情况。
图3表示对来源于转基因的建立者与非转基因对照组的尾尖活体解剖分析。(A)为来自于非转基因(X40)(a:#16老鼠)和转基因绿色荧光种系(b；#3老鼠)的尾尖的绿色荧光显微镜检查。通过非-绿色毛，绿色荧光的皮可以被观察到。(B)为利用pCX-EGFP基因片段做探针，分别对对照B6D2F1(0),#3(5-9),#19(＞50),#28(5-9)和#41(2)做southem杂交分析总的DNA含量。(括号中数字为估计的转移基因在每个基因组中的拷贝数)。(C)为利用聚合酶链式反式(PCR)对#16、#17、#30、#36、#47、#49、和对照B6D2F1,#3、#19、#28、#41进行分析的结果，见例5。
本发明的详细说明进行转基因的方法本发明描述了产生含有一个被整合的转基因的细胞的一套独特的方法。该项发明的方法包括以下步骤(Ⅰ)使外源基因-转移基因核酸与细胞核成分接触(细胞核，或其一部分，包括染色体)；(Ⅱ)显微注射转移基因核酸-细胞核的混合物或转移基因核酸进入一个未受精的卵中；(Ⅲ)使得到的细胞发育。发育的结果可能产生变异细胞或干细胞，之后形成胚胎、胚胎移植到受体母亲身上产生一个个体。我们现在就更加详细的描述每个步骤，而且表明这些步骤是如何独到地被安排的。Ⅰ、外源转移基因核酸暴露于细胞核成分该方法允许在显微注射之前外源转移基因核酸暴露于细胞核成分，细胞核可以来源于体细胞或其它的细胞，外源转移基因核酸可以通过例证的方法，但不限于，如电穿孔、脂质转染法，转染法，混合或细胞核插入前的显微注射法引导进入细胞，这些方法对熟悉这一领域的人来说是熟知的。
在本发明的一个实施例中，pCX-EGTP DNA片段(见例1或例2)在冰上或在25℃条件下和非转基因的精子通过研磨混合30-180秒，而这些精子的细胞膜已通过清洁剂处理被破坏，这些清洁剂诸如Triton X-100、(3-[3-乙醇胺)二甲基氨)1-丙烷磺酸酯)(CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、十二烷基硫酸钠(SLS)、烷基三甲基胺溴化物(ATAB)，但也不仅限于此。本发明的进一步实施例中，精子的细胞膜是通过冻/融或冷冻干燥方法破坏的。这些方法引使精子受到了充分的损伤而损失了一部分精子。细胞膜被破坏的程度按下列顺序递增新分离的精子＜TritonX-100＜反复冻/融＜冷冻干燥。
扩大了转移基因核酸的选择范围是本发明的方法和以前方法相比的重大优越性的一个方面。转移基因核酸，可以包括单链或双链RNA或DNA，杂合异源双源(例如RNA-DNA杂合体，见下面)和相对大的分子的物种，如染色体。在该项发明的一个实施例中，核酸可和大的DNA分子相对应(例如5万个碱基对至＞1百万个碱基对)。大DNA分子的例子包括象哺乳动物、酵母和细菌的人工染色体(分别为MACs,YACs和BACs)，但也不仅限于此。这样大的分子对于损伤是敏感的(相对于小分子而言)，尤其是在显微操作期间。因此，在该发明的一个实施例中，通过温和地混合所给的细胞膜容易破坏的精子头的步骤使大的DNA分子稳定，这主要基于以下几点(ⅰ)允许这些大DNA分子和精子头部的相对大的保护结构结合(ⅱ)在注射期间不让它们受到化学或物理作用(如剪切力)的损伤，因此增加了成功的机率。
本发明的方法对于以往的方法的显著优点的一个进一步的方面在于本发明提供了使得未受精卵母细胞细胞质(细胞分裂中期Ⅱ)的新的特性被利用的方法。尤其是，细胞核注入细胞分裂中期Ⅱ的卵母细胞后的细胞核的解凝提供了使基因组DNA相对裸露的情况；因此更具有活性(在Perry,A.C.F,Wakayama,T.& Yanagimachi,RBiology of Repoduction 60,747(1999)中介绍)。而且，由于注射到细胞分裂中期Ⅱ卵母细胞中的精子被损坏或加热到48℃引起重组产生双中心的(即转位的)、偏中心的或环形的染色体或染色体片段，便得细胞分裂中期Ⅱ的胚胎含有一些重组基因的因子，(Ward,W.S.,Perry,A.C.F.,& Balhom,R.Biology of Reproducton,已准备发表)。本发明的方法为通过同源重组和/或通过收集对DNA修复起作用的因子，就像在嵌合体的例子(见下面)提供了基因靶。在一实施例中，该项发明也考虑到通过在细胞核-核酸混合物中包含进具有位点特异性或非位点特异性可以提高重组效率的试剂来提供重组。这些试剂包括大肠杆菌的ReCA蛋白、相应的人类的ReCA蛋白、HsDmc-1、结合有如噬菌体T4基因32产物、位点特异性的重组酶(象Cre和Flp重组酶)的单链DNA结合蛋白等等，但不仅限于这些试剂。在进一步的实施例中，被用于基因靶DNA结构的核酸含有一个广泛的序列，这个序列和基因组天然基因座一部分序列配对(常常是1)。基因靶载体设计的标准对于在熟悉此领域的人来说是能够很好的设计及熟知的。
本发明在这里介绍的方法还允许核酸(NA)和嵌合体是相匹配的。在一个实施例中，这些分子均是短的RNA-DNA异源双源(＜100个核苷酸)，(例如，Yoon,k.,cole-strauss,A.& Kmiec,E.B.Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 93,2071)，除了1-3碱基在中心附近错配以外，这个异源双链含有与基因组序列极其互补的序列。这样的分子可以指导细胞DNA修复机器去将错配(碱基)引入基因组序列。在本发明的此实施例中，DNA修复机器在卵母细胞中，这样在细胞核-嵌合体共注射进入细胞分裂中期Ⅱ的卵母细胞或在细胞核不存在的情况下，嵌合体被注射进卵母细胞的期间或随后，位点特异性的突变就可以被引入。
该发明允许在混合期间包含进一些附加的物质。这可能包括核酸酶活性的调节剂(例如，[EDTA]乙二胺四乙酸、金红三羧酸，限制性内切酶等等)，细胞程序死亡(例如金红三羧酸等等)、蛋白水解(例如亮抑蛋白酶肽，E,64等等)、还有DNA结合蛋白诸如鱼精蛋白和拓扑异构酶等，但不仅限于这些附加物质。在本发明的一个实施例中，辅加的试剂是在细胞核不存在情况下和转移基因核酸混合在一起的，在这种情况下，通过把转移基因核酸(tgNA)显微注射进卵母细胞，而卵母细胞中细胞核的残余物提供了基因组，这就如一个去核的细胞分裂中期Ⅱ卵母细胞通过细胞核移植接受了一个体细胞的细胞核或一个非去核的细胞分裂中期Ⅱ的卵母细胞中的情况。这些细胞通过用孤雌生殖的试剂，人工激活进行发育，这些激活方法对于这个领域熟悉的人是熟知的(促植物细胞分裂素、封闭试剂，如细胞松驰素B、D等等)。
细胞核-核酸的混合物应被保持一段时间以便让细胞核-核酸结合。在一个实施例中，这种结合至少30秒才会出现，然后混合物被转移到显微镜平台下进行显微注射。在进一步的实施例中，显微注射在细胞核暴露于核酸1个小时内被完成。Ⅱ．显微注射转移基因核酸(tg NA)-细胞核混和物或转移基因核酸进入一个未受精的卵中。
那些和转移基因核酸充分接触的细胞核通过显微注射法被插入一个未受精的卵母细胞中。细胞核-核酸混合物被转移到显微注射仪的显微镜平台上成为一个小滴，这样就可以被收集到用于显微注射的针中进行注射。在一个实施例中，细胞核-核酸混合物被聚乙烯吡咯烷酮溶液补充去帮助操作。被注射的转移基因-细胞核样品的收集是用吸器吸进一个注射的吸管中。在本发明的一个最佳实施例中，显微注射针头是压力激活式的。合适的压电驱动器元件在Prime技术有限公司(Tsukuba,Ibaraki-ke，日本)和Eppendorf Scientific(纽约，美国)有售，可以根据卖方的指令进行使用。该元件能够以一个高度可控和快速的方式传递压电脉冲以推动显微注射吸管管尖被吸附在一个很短的距离内(0.5μm)。强度和每两次压电及间隙(根据控制元件不同而变化，具有普遍性的强度数值为1-5，速度为1-16)被应用于推动管尖穿过卵母细胞的透明区(卵母细胞被来源于一个支持吸管的微抽吸装置所固定)。吸管的管尖和卵母细胞原生质体细胞膜是上下相对放置的而且向前推动(朝着卵母细胞相对的面)直到卵母细胞原生质体细胞膜被深深陷入。一旦应用小量的(常用的是1个)压电脉冲(通常强度1-4，速度1)，原生质体细胞膜就会被穿透，这样就允许转移基因核酸-细胞核或转移基困核酸进入卵母细胞的细胞质。在一个实施例中，这个注射是用一个平齐末端硼硅化的玻璃针(典型的内在直径为4.5-10um)，这个针在末端附近含有水银。水银增加了压电激活针尖的动量及控制。另外的可选的显微注射的修改方法可以被用于插入(tg NA)转移基因核酸和/或细胞核，这包括在Yanagida(K.,Yanagimachi,R.,Perreault,S.D.and Kleinfeld,R.G.Biology ofProduction 44,44(1991)的描述中做为例证说明的那些传统的吸管。
细胞核可以被注射进那些来源同一物种的卵母细胞中，或来源于不同物种的一个卵母细胞，而且，该说明的方法允许核酸注射或核酸-细胞核共注射进卵母细胞、去核卵母细胞或不成熟(如胚泡阶段)卵母细胞，也包括在体外成熟的排卵前的卵母细胞。在体外的卵母细胞成熟(ⅣM)是所需要的，但成熟的卵母细胞源是受限的或不存在的，而且必须在某些试剂存在的情况下它们才更适合显微注射。牛的卵母细胞ⅣM(卵母细胞的成熟)在WO98/07841中已被介绍过；老鼠卵母细胞的ⅣM(卵母细胞的成熟)在Eppig & Telfer(Methods in Erzymology 225,77,Academicpress)中被介绍过。成熟的卵母细胞可以通过连续配给促性腺或其它类激素诱导超数排卵而得到。(例如，连续配给人的绒毛膜促性腺激素和孕马血清促性腺激素)。接下来是象外科手术一样收集卵。(例如猫在发情期开始后80-84小时，牛是72-96小时，而老鼠是13-15小时)。
该发明另外的一个实施例中，暴露于细胞核的核酸来源于二倍体体细胞，而且它被插入卵细胞的细胞质中，而这个卵母细胞的染色体己被除去(去核卵母细胞)；去核的卵母细胞方法对于熟悉这个领域的人是熟知的而且被利用，例如在Wakayama,T.,perry,A.C.F.,Johnson,k.,Zuccotti,M.& Yanagimachi,R.Nature394,369(1998)中。细胞核是从通过如胰蛋白酶(0.025％)和乙二胺甲乙酸(EDTA；0.75mM)混合物处理过的被分散的细胞中得到收集的。细胞是在重组后0-6小时被人工刺激开始发育的，根据已知的方法，使用如Sr2+，乙醇或电子脉冲进行刺激，但又不仅限于此。本发明的方法适用于得自于两栖动物、鱼、鸟类(象家鸡、火鸡、鹅等等)和哺乳动物诸如灵长类动物、绵羊、牛、猪、熊、山羊、猎、犬、马、鼠等等提取的或在体内或在体外生长的细胞核。
在本发明的进一步的实施例中，细胞核被包含如在膜易受到破坏的这样的精子的头部中，精子头部的注射有效地激活了被注射的卵母细胞进行充分发育，直到发育完成。正在发育的胚胎通过对这个领域熟悉的人们熟知的程序，可以转移到一个代理母亲受体中进行发育。精子的头部可以用加热或能增强它激活卵母细胞的一种试剂进行处理，在这种情况下，显微注射后卵母细胞对激活剂是敏感的而且易于诱导发育。精子可以来源于两栖动物、鱼、鸟类(像家鸡、火鸡、鹅等等)或哺乳动物诸如灵长类动物、绵羊、牛、猪、熊、山羊、猪、犬、马、鼠等等。
本发明的方法也允许注射移管的管尖直径在一个大的范围内。以往的转基因方法不允许一个大片段的DNA导入(例如，当用病毒载体时)或也可以允许这样一个大片段的DNA导入，但都有着相当大的技术上的困难。例如前细胞核显微注射法对于高粘度的人工染色体制备是不适用的。用制作精良的吸管(管尖直径1-2μm)进行注射是困难的，而且DNA分子常常被剪切，导致失败。而且这么窄的管尖在用过几次后会变得更粘稠，处理就会变得困难。相比之下，该发明的方法描述的所用移管的管尖通常的直径＞5μm，相对大的管尖直径(ⅰ)使得粘性DNA溶液的处理容易得多，部分原因在于那些针的粘性小了，(ⅱ)同时产生了较小量级的剪切力，大DNA分子对剪切力引起的损伤是敏感的。
该发明方法的进一步优点在于，它不要求那些物质注射进卵细胞中一个精确的位置，这点不同于前核显微注射。这个优点尤其对于那些卵母细胞细胞质含有丰富的脂类而在光学显微镜下观察起来不清楚的物种来源特别适用，如许多有商业价值的物种或品种的卵母细胞就属于此种类型，因此该发明的方法不要求在显微注射的管尖和在显微注射期间所要精确地了解的卵母细胞的细胞质有空间上的关系。
该发明的方法也允许在没有共注射细胞核的情况下进行转基基因核酸的注射。在一个实施例中，转移基因核酸首先和那些可以稳定核酸的成分混合，这些成分包括像来源于精子的碱性蛋白这样的成分(例如鱼精蛋白，细胞核周围的成分等等)。在这种情况下，注射是进入一个有细胞核的细胞。这样的细胞已被细胞分裂中期Ⅱ卵母细胞(在这种情况下可用的胚胎是一个孤雌生殖的)或通过细胞核移植把体细胞的或其他的细胞的细胞核移进一个去核的细胞分裂中期Ⅱ的卵母细胞所例证解释了。细胞核移植在Wakayama,T.,Perry,A.C.F.,Johnson,K.,Zuccotti,M.&Yanagimachi,R.Nature 394,369(1998)中进行了介绍。在报告中，胚胎是通过无性繁殖而获得。卵母细胞是根据已知的方法，用一些如Sr2+、乙醇或电脉冲这样的刺激物进行人工刺激，而开始发育，但不仅限于这些方法。Ⅲ．允许得到的细胞进行发育经过显微注射的细胞在体外重组移到一个适合的培养条件下或移到一个合适的代理母亲体内，都能进行发育。在某些情况下，我们希望培养细胞去发育成一个胚胎。在该发明的进一步的实施例中，它可以检查那些被培养在体外的胚胎，这样这些胎胚的发育就可以被描述而且转移基因的表达就可以被确定。因此，如果转基因的胚胎中含有一个转移基因，而这个转移基因的表达在不杀死胚胎的情况下可以被检测到，那么，该发明的方法允许对转基因胚胎进行选择性转移。这里有一个GFP绿色荧光蛋白的例子，它的表达在早期的胚胎中被驱动的，也就是和CME-IE增强子/鸡的肌动蛋白启动子联在一起。它的表达主要通过在长波(480nm)紫外灯下观察胚胎就能很容易检测到。最大程度的减小暴露于长波紫外线对胚胎的潜在损伤，因为这些损害可以损伤随后的胚胎的发育。
胚胎培养及转移的方法对于熟悉这一领域的人是熟知的。在随后的选择或非选择的胚胎(也就是不一定是基于转移基因的表达)转移到代理母亲体内后，开始受孕、一直到最后活的转基因后代出生。转移基因整合在后代的鉴定，主要是对基因组DNA进行物理分析来完成的，所用的方法是包括Southem杂交和聚合酶链式反应这样的对于熟悉这一领域人来说的熟知方法。转基因在后代中的表达可以做为一个特征属性(表型地)被辨别出来，或通过组织免疫分析或用相Northem杂交这样的利用mRNA的分析方法。GFP绿色荧光蛋白在转基因幼犬中的表达通过在长波紫外线下检查新出生后代的皮毛很容易被看出来。例子下面的例子意在没有限制该项发明的范围的情况下例证说明该项发明的方法。试剂所用的化合物若无另外说明均购自Sigma化学有限公司(StLouis,MO)。动物卵母细胞捐赠者(B6D2F1)，精子捐赠者(B6D2F1)，代理母亲(养母)饲养(ICR)是在夏威夷大学试验动物服务部的指导下进行的。这些代理母亲(养母)是由实验资源国家研究委员会实验动物爱护和应用学院的委员们准备的(DHEWpublication no.[NIH]80-23,1985年修订，动物的处理程序得到了夏威夷大学动物爱护和应用委员会的审查和同意。卵母细胞的制备在腹膜内配给5IU人的绒毛膜促性腺激素(hCG)后14.5-16小时，就可以从孕马血清引导的(5IU)、超数排卵的、4-10周龄的雌性B6D2F1老鼠的输卵管中收集成熟的卵母细胞。累积的大量细胞可通过在CZB-H中(CZB缓冲液含有20mM HEPES,PH7.4；Chatot,C.L.,Lewis,J.L；Torres I.& Ziomek,C.A.Biology ofReprochuction 42,432)进行立即处理，在室温下放5-10分钟分散，在CZB-H中含有0.1％(w/v)牛睾丸透明质酸酶(300U/mg,ICN Biochemicals,Costa Mesa,CA)。不积累的卵母细胞在(CZB-H)中洗四次而且被转移到一滴在37℃,5％(v/v在空气中)CO2中平衡的矿物油下的CZB中，(Squibb & Sons,Princeton,NJ)。老鼠的卵和胚胎的操作精子头的压电激活显微注射进入老鼠的卵曾在(Kimura Y.& Yanagimachi,R.Biology of Reproduction 52,709(1995)中叙述过。注射通常在绒毛膜促性腺激素(hCG)配给后18-19小时被完成的。注射针针尖直径通常是5μm。实验用的溶液(通常含有单一精子头)在少量水银被排除进入实验溶液液滴后被吸进吸管。这样保证了在水银边界的前头实验溶液充满了吸管，而且因此不需要进一步稀释。每次显微注射大约有1pl的相对应物被移进受精的卵质。被注射的卵母细胞在移到37℃,5％(v/v空气中)CO2中平衡的矿物油下面的CZB之前，要在操作培养基(CZB-H)中保留大约2-10分钟。在操作培养中保留适宜时候时，卵母细胞在注射后立即通过温育进行人工激活，温育在37℃,5％(v/v在空气中)CO2平衡的矿物油下面的不含有Ca2+而含有6.7mM SrCl2的CZB中约45-60分钟。此后，卵粗略地在新鲜CZB中冲洗一下，然后被移到新鲜的CZB中继续温育。胚胎在体外的培养是在CZB中，需要4天。双细胞的胚胎(培养大约1天后)或桑椹胚/胚泡(培养2.5-3.5天后)被移植到假妊娠白化体的ICR/CD1老鼠输卵管中，这只老鼠在显微注射的当晚和一只输精管切除的同一品系的雄性老鼠交配。这样通过在体外操作而出生的老鼠就有黑色的眼睛和彩色的皮毛这样的特征了。
例1精子细胞核的制备和显微注射如前所述，用于进行显微注射的B6D2F1老鼠细胞分裂中期Ⅱ卵细胞的分离和培养是必要。精子是从成熟的B6D2F1雄性老鼠中被收集到400μl CZB培养基中。在0-1℃的细胞核分离培养中(成分为(NIM):125mM KCl,2.6mM NaCL,7.8mMNa2HPO4,1.4mM KH2PO4,3.0mM EDTA；PH7.45)利用triton X-100抽提进行精子的分离，要精确地切下两条尾部的附睾。过滤那些处理过的精子悬浮液，定容到终体积为900μl。卵母细胞的压电激活显微注射和在37℃、5％(v/v空气中)CO2中平衡的矿物油下面的CZB中胚胎的培养在别处已详述过。对于显微注射来说，精子头部被吸进一个吸管，而那吸管和一个压电驱动吸管的元件相连，而且每次注射一个精子进入卵母细胞。在注射后很快裂解的卵母细胞被丢掉。在适当的时候，通过一个单压电脉冲作用到精子中段，精子产生了由尾部至头部的移位。移位这个程序本身破坏了细胞膜，因此表示了在这里所用的“新鲜的”精子和以往报道中通过体外授精获得的能提高转基因效率的活的精子的不同之处。我们估计每次注射大约有1pl的精子从吸管里被转移。
例2通过混合使精子的细胞核暴露于绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶转移核酸中转基因胚胎的产生这里用的是pCX-EGFP质粒的大的SalGⅠ-BamHⅠ片断，它保留了GFP绿色荧光蛋白的基因，由一个强的CMV-IE/鸡的肌动蛋白增强子-启动子联合驱动表达的。(Niwa,H.,Yamamura,K.& Miyazaki,J.Gene 108,193)，但缺乏真核生物的复制区(Zhang,G.Vamessa,G.& Kain,S.R.Biochemical and Biophysical ResearchCommunication 227,707；Takada,T.Iida,K.Awaji,T.Itoh,K.Takahashi,R.Shibui,A.Sugano,S.& Tsujimoto,G.Nature Biotechnology 15,458)。精子的细胞核或者是没有进行进一步制备(“新鲜的”)而和pCX-EGFP片断混合，或者是它们进行了三个破坏细胞膜程序中的一个之后，才和pCX-EGFP混合的，这三个程序分别为反复冻融(Wakayama,T.,Whittingham,D.G.& Yanagimachi,R.Journal of Fertility andReproduction 112,11)、冷冻干燥(Wakayama,T.& Yanagimachi,R.NatureBiotechnology l6,639)或TritonX-100抽提。对于利用TritonX-100抽提来说，在冰上，100μl 0.5％(v/v在NIM,核酸分离培养基)Triton X-100被加到900μl在NIM(核酸分离培养基)中的精子悬浮液中(见例1)，通过研磨混合30秒。20,000g，离心1分钟，细胞被沉淀成了小颗粒，2℃，在2μl冰预冷的NIM(核酸分离培养基)中充分重悬浮沉淀颗粒，2℃,20,000g下再重新沉淀2分钟。这最终的沉淀颗粒在400μl,CZB或NIM中被重悬浮。在显微注射前，用吸管把1μl的DNA片断和9μl精子悬浮液(含有2-5×105个精子)在CZB或NIM中混合，使DNA片段的最终浓度为7ng/μl。 DNA/精子的混合物在室温(大约25℃)或在冰上培育1分钟。然后聚乙烯吡咯烷酮(PVP，平均分子量MR 360,000)溶液混合至PVP的最终浓度10％(v/v)左右，把它放在显微镜台上进行显微注射。所有的注射均是在精子-DNA混合1小时内或精子-Triton X-100的混合1小时内在室温在CZB-H中被完成的。
显微注射3-3.5天后，用带FITC滤镜(480nm)的紫外光源的落射荧光显微镜检查胚胎中GFP绿色荧光蛋的表达情况。这样就可以对非荧光的(非-GFP-表达的)，弱荧光的和强荧光胚胎及镶嵌胚胎(含有荧光及非荧光的细胞)进行清晰的鉴定，相应地做出判断记载。用于去例证解释该发明方法的相似的实验用了一个不同的转移基因核酸。纯化pxCANLacZ中含有LacZ的片段，通过SalGⅠ或XhoⅠ和SalGⅠ消化进行线性化，然后和精子分别以4.5和9ng/ul的浓度混合，像前文所述的那样进行显微注射。两个LacZ(β-半乳酶苷酶基因)片段都得到相似的结果。pxCANLacZ xhoⅠ-SalGⅠ片段缺少一个真核生物的复制区。被pxCANLacZ所编码的β-半乳糖苷酶含有一个细胞核定位信号。胚胎预处理3天后，在室温下，在PBS(磷酸盐缓冲液，PH7.6)中固定5分钟，就可以进行pxCANLacZβ-半乳糖苷酶表达的鉴定了，其中PBS配方为1％(v/v)甲醛，0.2％(v/v)戊二醛，5mg/ml牛血清蛋白(BSA)。固定的胚胎在含有BSA(5mg/ml)的PBS缓冲液中被彻底清洗，接着在37℃，在含有5mg/mlBSA、4mM铁氰化钾、4mM亚铁氰化钾、2mM MgCl2和1mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖(x-gal)的PBS中进行染色。胚胎可以通过光学显微镜进行检查和判断记载。
在下面表1中的结果表明了该发明的方法以高的效率产生了转基因的胚胎，当pXC-EGTP DNA片段浓度是500pg/μl，但不是50pg/μl时，这个方法就可以产生可以观察到的转移基因表达的胚胎。这表明该方法对于相当于大约每次注射15-150这样少的分子的平均DNA浓度是敏感的。
表一细胞分裂中期Ⅱ的卵母细胞和外源的编码报告基因DNA及精子头共显微注射产生胚胎的体外培养及转移基因的表达产生情况在三天时桑椹胚-胚泡和荧光(GFP)或染色的LacZ的总数片段+精子处理++卵母细胞数量 m-b(％)*-§ +/-§+*§pCX-EGFP 无(新鲜的) 162134(83)a10013 21apCX-EGFP Triton X-100270212(79)a7537 100bpCX-EGFP 冻融313155(50)b2831 96bpCX-EGFP 冷冻干燥278154(55)b2023 111bpx-CANLacZ 冻融151110(73)a745 58bpx-CANLacZ 冷冻干燥136106(78)a832 66bpCX-EGFP 冲洗过的153114(75)° 43 4 67°pCX-EGFP 未冲洗的11783(71)° 17 3 63°pCX-EGFP 冻融71 56(79) 56 00pCX-EGFP 冻融51 35(69) 35 00pCX-EGFP 单独- 49 48(98) 48 00*表示在同一列中标有a、b的数值被比较时，它们有明显差异(P＜0.05)，标有c的数值在同一列中无明显差别。
+表示外源DNA片段pCX-EGFP-BamHI-SalGI或pxCANLacZ-SalGI,SalGI-XhoI,或XhoⅠ片段在DNA浓度为5-10ng/l时和精子头部混合，除了最后的三行(见例X)，外源DNA都是在和精子样品混合后注射的，如例2所述。
++精子如例1所述进行处理。清洗与没清洗样品的制备如例4所述完成，作为阴性对照，所有的实验都包括一等分新鲜的适宜的精子的制备物和NIM或CZB单独混合的混合物进行同一天的注射，没有观察到“错误的阳性”表达。连续的注射每对的间隔为30-90分钟，精子头制备采用如例X所述的冻融法(冻融精子事先和DNA混合好，进行同一天阳性对照共注射，在75％的胚胎中产生荧光的(卵)裂球。)。单独转移基因DNA的注射是在孤雌生殖激活后进行的，如例X所述。§转移基因表达-阴性无表达；+阳性有表达；+/-,m-b含有+和-细胞(嵌合体)。
例3在一个操作中进行双元基因GFP绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶胚胎的制备(“single-shot double transgenesis”转基因方法)如例1所示，单打二转基因方法(single-shot double transgenesis)用于在单个显微注射后产生共表达两个转移基因的胚胎及其随后的改变。精子头部用含有2.5ng/μl pCX-EGFP SalGI-BamHI片段和2.5ng/μl pCX-LacZ SalGI-PstI片段的DNA溶液共注射。pCX-LacZ是pCX-EGFP中EGFP基因被编码β-半乳糖苷酶基因取代后的衍生物。在接下来的体外培养中，胚胎首先被记录观察GFP表达，然后是编码β-半乳糖苷酶基因的表达，如例1、例2分别所述。对于摄影来说，在固定和染色去观察LacZ表达之前，胚胎应该被固定在显微镜的承物玻璃片和盖玻片之间，这样所看到的图象就表明了发育和GFP荧光蛋白的表达情况。
例4冲洗转移基因核酸-细胞核混合物后，GFP绿色荧光蛋白转移基因胚胎的产生在每次冲洗实验中，精子悬浮液在和pCX-EGFP DNA混合和温育1分钟后立即被分成两个5μl的等份。其中的一等份(冲洗过的精子)被充分混合好的用50μl冰预冷的新鲜的CZB或NIM进行稀释和冲洗。然后，两等份在2℃,20,000g的条件下离心形成沉淀颗粒2分钟。被洗过的那份精子的等分试样的上清液被小心除去，用5μl新鲜的CZB或NTM代替；第二等份的上清液被用于重新悬浮它自己的沉淀颗粒(这样这个样品没有被冲洗)。表1中的结果明显地表明在显微注射之前细胞核和核酸在体外结合的能力。
例5GFP绿色荧光蛋白转移基因幼犬的产生与证实，及它们转基因特性的证实确定是否转移基因DNA结构的基因整合，可以在活的后代中被证实。遭受到三种破坏细胞膜程序中的一种破坏了的精子的头与pCX-EGFP DNA一起被共注射，得到的胚胎在体外被培养达到大约3.5天(达到桑椹胚-胚泡时期)，胚胎接着被移植到非选择性的代理母亲上(即不基于荧光表达)。对于转移基因整合的表型分析是通过在长波紫外线下对后代观察而进行的。有很大部分(17-21％)的后代是转基因的，因为在它们的皮肤上有可观察的GFP绿色荧光蛋白的表达(下面表2)；这个效率并不取决于用于制备精子时细胞膜破坏的方法。合子发育完成的百分率和其它三组细胞膜破坏的精子的头的每一个(12-14％)是可比较的。
表二表型上转基因的(绿色)幼犬及它们同胞的发育精子处理*卵母细胞数量 转化的幼犬的总数+(绿色)幼犬§冷冻干燥116 67(4) 14 3a冻融97 53(3) 12 2a冷冻干燥218 150(9) 31 6a*每排记录了从去膜的精子的头和一个pCX-EGFP质粒片段共注射的卵母细胞中产生的胚胎及幼犬的发育。
a表示数值无显著差异。
桑椹胚-胚泡。在括号里的数值表示在胚胎转移中作为一个受体的代理母亲的数量。
§Tg表达，+，在它们的皮上异位地表达GFP基因的阳性幼犬。
在进一步的实验中，一个去膜的精子头，根据例2的方法被暴露于pCX-LacZ(见例3)进行显微注射，之后出生了一个单β-半乳糖甘酶(LacZ)表达的幼犬。根据例2的方法，β-半乳糖甘酶(LacZ)的表达可以通过固定和X-gal染色一个尾尖的活组织进行证实(出生后3天获得)。这就证明了该发明的方法并不限定于一个转移基因的类型，而且表明了该方法对各种转移基因的应用能力。
从3-6周龄的随机挑选的绿色的幼犬和它们的非绿色的同一窝的幼犬的尾尖的活体组织中进行基因组总DNA的提取。尾部的照相是在一个配有480/40nm滤光镜的荧光立体显微镜下进行的。在Southem分析中，每一个样品中10μg基因组DNA用EcoRⅠ消化后和用EcoRⅠ消化的733bp的pCX-EGFP片段探针杂交。寡聚核甘酸引物用于在每个反应里和1μg基因组DNA进行PCR反应，以检测GFP基因，正反应的引物为TTGAATTCGCCACCATGGTGAGC，反向引物为TTGAATTCTACTTGTACAGCTCGTCC。反应参数为95℃、9分钟(一个循环)；94℃、45秒、60℃、30秒、72℃、45秒(40个循环)。电泳分离的产物通过EB(溴乙锭)染色可以观察到。
通过Southem杂交及PCR(聚合酶链式反应)对尾尖基因组的物理分析表明，所有的显示绿色荧光的建立者品系(也就是第一代转基因动物)，都拥有转移基因，包括一个最初表型鉴定为阴性的，但它的活组织尾尖检查表明有GFP表达。在三种情况下，转移基因应通过PCR进行鉴定，因为建立者中没有可检测到的绿色荧光，即由于在转移基因整合的基因座上存在着局部地顺式活性的元件，导致没有见到推测中的表达。Southem分析表明转移基因在建立者中的拷贝数范围从≤1-＞50；这个结果同前细胞核显微注射后转移基因整合的模式是相类似的。基因组的pCX-EGFP DNA物理特征的记述和GFP表达的效率均表明了转移基因DNA并没有在整合时进行大范围的重排。
随机挑选12只表达GFP的建立者(8只雌性，4只雄性；来源于表2且相似的系列)和非转基因的动物进行杂交。除了一只雌的外，其余的均产生了后代。在这11只产生后代的建立者中，有8只产生的幼犬在它们的皮肤上有GFP绿色荧光蛋白的异位表达，比率是27-50％(平均为40％)。。在大多数情况下，转移基因的遗传模式符合单位点GFP基因的孟德尔种系遗传传递。
例6用Cre-lox系统检测转基因由于没有必要对转基因个体一生中连续的转移基因进行表达，我们希望评价通过该发明的方法产生的用于转移基因整合的胚胎。这可以用一个含有内部核糖体进入位点的(IRES)转移基因的载体来实现。通过显微注射产生胚胎的方法，如例1所述。DNA的结构包含有GFP基因，它位于lox位点侧面，被一个强的CMV-IE/鸡的肌动蛋白增强子-启动子联合驱动表达，如例2所述。这个增强子-启动子和足以驱动任何一给定转移基因的程序化表达的第二个元件相邻。GFP开放读取框架和一个特定的转移基因的开放读取框架相邻，中间被一个IRES(内部核糖体进入位点)所分开。转移基因DNA构造和一个去膜的精子混合并共注射进入细胞分裂中期Ⅱ的卵母细胞中，这个卵母细胞来源于如goosrcoid基因启动子控制下的表达重组酶Cre的株系，这个启动子在发育的原肠(胚)形成阶段起作用，因此就会在此阶段期间切除CMV-IE/鸡的肌动蛋白增强子-启动子元件。胚胎在体外培养达到3.5天(到桑椹胚-胚泡期)被选择地移植到代理母亲体内(也就是有荧光的)充分发育。
例7在没有精子细胞核的情况下转移基因DNA的显微注射表明精子的细胞核成分以重组基因的形式维持转移基因DNA为了检测是否核酸整合会出现在卵母细胞内(也就是显微注射后)，我们连续注射了精子的头和pCX-EGFP DNA，但没有在注射前混合(表1)。我们始终不能观察到外源转移基因DNA(GFP)的表达，即使在75％阳性对照的胚胎是有荧光的(冻融精子的头和pCX-EGFP同表1一样共注射)。
质粒pCX-EGFP的SalGⅠ-BamHⅠ片段的新鲜稀释物和等量的20％PVP(w/v)混合，而且每个注射的卵母细胞大约为1pl。在室温下恢复5-10分钟后，卵母细胞被转到不含有Ca2+的CZB中，在CZB中含有10mM SrCl2和胞质分裂封闭剂，细胞松弛素B(5μg/ml),37℃温育6小时。(Bos-Mikich,A.,Whittingham,D.G&Jones,K.T.Developmental Biology 182,172)。它们接着被移到CZB中，在标准的胚胎的培养的条件下继续培育。如例2所述，3.5天以后，胚胎就可以判定有无GFP的表达。与用精子的头共注射的比较，单单是等量的GFP转移基因注射不妨碍孤雌生殖的良好发育(在注射后存活的卵母细胞有98％发育到桑椹胚一胚泡阶段)。而且，这些有结果的胚胎中没有一个显示出可观察到的转移基因的表达(表1)。因此，在没有精子的头的情况下，几乎没有转移基因的表达或转录活性转移基因DNA的表位染色体的持续存在。
在精子的头-pCX-EGFP共注射后，而不是pCX-EGFP DNA单独注射后，我们观察到了含有阳性GFP和阴性GFP的裂殖细胞(+/-桑椹胚一胚泡)的嵌合的胚胎。这样的+/-嵌合体的频率表明DNA的整合有时被延迟直到注射后第一次S-期转移基因才进行整合。这种现象的一个解释是，来源于精子的物质在早期的胚胎中稳定了外源DNA，因此有利于延迟整合。在缺乏这样物质的情况下(例如，在孤雌生殖中)，外源基因DNA在整合之前就被降解掉了。
权利要求
1．一种生产转基因细胞的方法，包含以下步骤(a)暴露细胞的细胞核于核酸(NA)；(b)收集被暴露过的细胞核；(c)暴露的细胞核至少有一部分被插入一个卵母细胞，这一部分包括被暴露的细胞核的染色体，还至少包括核酸的一部分；(d)允许卵母细胞的发育。
2．一种生产转基因细胞的方法，包含以下步骤(a)暴露一个细胞核于核酸(NA)；(b)收集步骤(a)中被暴露的细胞核；(c)被暴露的细胞核至少有一部分插入去核的卵母细胞，这一部分包括被暴露的细胞核的染色体，还包括至少核酸的一部分；(d)允许卵母细胞的发育。
3．在权利要求1或2的方法中，细胞核是从一个完整生物体细胞中提取出来的
4．在权利要求1或2的方法中，细胞核是从一个胚胎中提取出来的。
5．在权利要求1或2的方法中，细胞核是从一个胎儿细胞中提取出来的。
6．在前述的权利要求的任何一个的方法中，细胞核是从哺乳动物细胞中提取出来的。
7．在前述的权利要求的任何一个的方法中，细胞核是采用显微注射的吸管收集的。
8．在前述的权利要求的任何一个的方法中，细胞核通过和核酸及含有细胞核的全部或部分细胞混合而暴露于核酸。
9．在前述的权利要求的任何一个的方法中，细胞核通过引导核酸进入一个完整的细胞而暴露于核酸的。
10．在前述的权利要求的任何一个的方法中，细胞核是从一个体细胞中提取的。
11．在前述权利要求1至9的任何一个的方法中，细胞核是配子前体中的。
12．在前述权利要求1至9的任何一个的方法中，细胞核是配子中的。
13．在权利要求12的方法中，配子包含一个卵母细胞。
14．在权利要求12的方法中，配子包含一个精子。
15．一种生产转基因细胞的方法包含以下步骤(a)暴露一个精子于核酸(NA)；(b)收集被暴露的精子，(c)把至少精子的一部分，包括精子的染色体和进一步包括至少核酸的一部分插入到一个卵母细胞中；(d)允许卵母细胞发育。
16．在权利要求14或15的方法中，精子的细胞膜已被破坏。
17．在权利要求16的方法中，破坏的方法包括冷冻。
18．在权利要求16的方法中，破坏的方法包括机械破坏。
19．在权利要求16或17的方法中，破坏的方法包括暴露于清洁剂中。
20．在权利要求19的方法中，清洁剂是非离子型的。
21．在权利要求19的方法中，清洁剂是离子型的。
22．在权利要求19的方法中，清洁剂是TritonX-100。
23．在权利要求14至22的任何一个的方法中，精子通过引导核酸进入含有细胞核的精子的部分或全部而暴露于核酸(NA)。
24．在权利要求14至23的任何一个的方法中，精子通过核酸和含有细胞核的精子的部分或全部混合而暴露于核酸(NA)。
25．在权利要求14至24的任何一个方法中，精子是哺乳动物的精子。
26．在权利要求6或25的方法中，哺乳动物是由包括灵长类动物、绵羊、牛、猪、熊、山羊、猫、犬、马和鼠的集合中的一个。
27．在权利要求9或23的方法中，引导的步骤可以是通过诸如脂质转染、显微注射、电穿孔及转染这样的方法而实现。
28．在权利要求9或23的方法中，引导的步骤可以是通过混合而实现。
29．在权利要求28的方法中，混合用的是一个吸管的管尖。
30．一种生产转基因细胞的方法，包含以下步骤(a)插入核酸进入一个卵母细胞；(b)激活胚胎的发育；(c)允许重组的胚胎发育。
31．在前述的权利要求的任何一个的方法中，核酸(NA)是脱氧核糖核酸(DNA)。
32．在权利要求31的方法中，DNA含有双链成分。
33．在权利要求31至32的任何一个的方法中，DNA是环形的。
34．在权利要求31至33的任何一个的方法中，DNA是线形的。
35．在权利要求31至34的任何一个的方法中，DNA含有一个报告基因。
36．在权利要求35的方法中，报告基因编码一个绿色荧光蛋白(GFP)。
37．在权利要求35至36的任何一个的方法中，编码报告基因DNA的表达是被在胚胎早期起作用的一个启动子元件驱动的。
38．在权利要求35至37的任何一个的方法中，报告基因被定位在含有一个内部核糖体结合位点的载体上(IRES)。
39．在权利要求38方法中，内部核糖体进入位点(IRES)载体包含一个亚克隆编码序列。
40．在权利要求35至39的任何一个的方法中，报告基因包括已经提过的在lox位点侧翼的哪个启动子元件。
41．在权利要求40的任一个方法中，lox位点侧翼的那个启动子元件和一个组织特异性的启动子相连。
42．在权利要求32至41的任何一个的方法中，DNA是具有和天然互补基因组序列同源重组能力的靶结构。
43．在权利要求42的方法中，靶结构含有相对天然基因组序列的一个或更多的改变。
44．在权利要求32至43的任何一个的方法中，DNA是一个染色体。
45．在权利要求44的方法中，染色体是一个人工染色体。
46．在权利要求45的方法中，人工染色体是一个细菌的人工染色体(BAC)。
47．在权利要求45的方法中，人工染色体是一个酵母的人工染色体(YAC)。
48．在权利要求45的方法中，人工染色体是一个哺乳动物的人工染色体(MAC)。
49．在权利要求32至48的任何一个的方法中，DNA含有一个单链的成分。
50．在权利要求32至49的任何一个的方法中，DNA已被共价修饰过。
51．在权利要求50的方法中，DNA被共价修饰而包含一个肽部分。
52．在权利要求1至31的任何一个的方法中，核酸是核糖核酸(RNA)。
53．在权利要求52的方法中，核糖核酸RNA含有一个双链成分。
54．在权利要求52的方法中，核糖核酸RNA含有一个单链成分。
55．在权利要求52至54的任何一个的方法中，核糖核酸RNA是环形的。
56．在权利要求52至54的任何一个的方法中，核糖核酸RNA是线形的。
57．在权利要求52至56的任何一个的方法中，核糖核酸RNA是被共价修饰过的。
58．在权利要求57的方法中，核糖核酸RNA是被共价修饰过含有一个肽部分。
59．在权利要求1至31的任何一个的方法中，核酸(NA)是嵌合的。
60．在权利要求59的方法中，嵌合体含有DNA-RNA异源双链。
61．在权利要求60的方法中，嵌合的DNA-RNA异源双链是包含至少一个错配碱基的嵌合体。
62．在前述权利要求的任何一个的方法中，核酸(NA)包括事先没有共价连接过的多个分子的物种。
63．在前述权利要求的任何一个的方法中，对于核酸(NA)暴露至少30秒钟。
64．在前述权利要求的任何一个的方法中，核酸(NA)在0-100℃条件下暴露的。
65．在前述权利要求的任何一个的方法中，核酸(NA)在冰上暴露的。
66．在前述权利要求的任何一个的方法中，核酸(NA)在核酸结合蛋白存在的条件下暴露的。
67．在权利要求66的方法中，核酸(NA)结合蛋白提高重组。
68．在权利要求67的方法中，可以提高重组的蛋白质是从下列的组成位点特异性的重组酶、单链DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、反转录酶、拓扑异构酶、核酸内切酶及提高同源重组的重组酶的组成成分中提取出来的。
69．在前述权利要求的任何一个的方法中，插入步骤是进入卵母细胞的细胞质中。
70．在前述权利要求的任何一个的方法中，插入步骤是通过显微注射完成的。
71．在权利要求70的方法中，显微注射是压电激活显微注射。
72．在前述权利要求的任何一个的方法中，卵母细胞是在减数分裂中期Ⅱ(metⅡ)被抑制的。
73．在权利要求72的方法中，细胞分裂中期Ⅱ的卵母细胞在排卵后被收集的。
74．在权利要求73的方法中，排卵是通过人工进行诱导的。
75．在前述权利要求的任何一个的方法中，卵母细胞是成熟的。
76．在权利要求75的方法中，未成熟的卵母细胞是在体外培养的。
77．在权利要求75或76的方法中，在体外培养的未成熟的卵母细胞产生了细胞分裂中期Ⅱ的卵母细胞。
78．在前述权利要求的任何一个的方法中，还包括在插入步骤期间或之后引起卵母细胞活化的步骤。
79．在权利要求76的方法中，卵母细胞通过应用一个或多个电脉冲或暴露于一个激活剂中而活化的。
80．在前述权利要求的任何一个的方法中，进一步包括以下步骤(e)、允许卵母细胞发育形成干细胞。
81．在前述权利要求的任何一个的方法中，进一步包括以下步骤(f)、允许卵母细胞发育形成分化细胞。
82．在权利要求81的方法中，进一步包括以下步骤(g)、允许卵母细胞发育形成胚胎。
83．在权利要求82的方法中，进一步包括以下步骤(h)、允许胚胎发育直至最后发育完成。
84．在权利要求83的方法中，允许胚胎发育直至最后发育完成的步骤包括转移那个胚胎到一个雌性的代理受体上，在那里，胚胎发育成一个能存活的胎儿。
85．通过前述权利要求的方法生产的许多转基因细胞。
86．通过前述权利要求的方法生产一种转基因动物。
87．在权利要求86中，动物指的是一个哺乳动物。
88．在权利要求87中，动物是从由包括灵长类动物、绵羊、牛、猪、熊、山羊、猫、犬、马和老鼠等等组成的哺乳动物的集合中选择出来的。
89．在权利要求87中，哺乳动物是老鼠。
90．通过权利要求1至84的任何一个的方法生产转基因动物，在此，转基因动物含有一个位点特异性的基因组的改变。
全文摘要
本发明通过把核酸和一个细胞核共注射进一个未受精的卵母细胞而提供了一种产生转基因动物和细胞的方法。尤其是一种通过显微注射进行共注射的方法，最好是一种通过压电激活显微注射进行共整合的转基因方法。随着一个未受精的老鼠的卵母细胞与一个精子的头及一个编码外源DNA的绿色荧光蛋白(GFP)或β－半乳糖甘酶的报告基因的共注射，转移基因表达的胚胎就产生了。经过显微注射处理的卵母细胞可以发育成分化细胞或干细胞；或在移植到一个代理母亲的受体之前，在生物体外发育成一个胚胎；或它直接被移植到一个代理母亲受体中。胚胎的发育可以发生至完成，这样它们的后代就拥有可以改变它们特性(表型)的转基因改变，接下来，这样的基因改变就可以传递给它们的后代。
文档编号A01K67/027GK1316878SQ99810645
公开日2001年10月10日 申请日期1999年8月11日 优先权日1998年8月11日
发明者安东尼C·F·佩里, 若山辉彦 申请人:安东尼C·F·佩里, 若山辉彦