一种紫花苜蓿ems突变体库构建的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物突变体库构建的方法，尤其涉及一种紫花苜蓿甲基磺酸乙酯 (EMS)突变体库构建的方法。
【背景技术】
[0002] 紫花苜蓿（MedicagosativaL.)具有适应性广、高产优质、改良土壤、经济效益 高、生态功能齐全的特性，素有"牧草之王"的美称。紫花苜蓿富含蛋白质、多种维生素和矿 物质，是多种家禽喜食的优质蛋白质饲草和能量饲料，它既可用于青饲，同时也被用来开发 研制成产品，包括草捆、草粉、草块、草颗粒和浓缩叶蛋白等。紫花苜蓿在畜牧业中发挥了决 定性的作用，已成为我国畜牧业种植结构调整的首选饲料作物。另外，紫花苜蓿适应性极 强、分枝多，不仅能固氮改土、保持水土，还对土壤的改良和生态环境的改善有重要的作用。
[0003] 构建饱和突变体库是进行植物功能基因组学与遗传育种研宄的直接而有效的方 法之一。目前已在模式植物拟南芥、水稻等作物中构建了饱和突变体库并进行了相关的功 能基因组学研宄，获得了一批有价值的创新种质资源。若构建紫花苜蓿EMS突变体库之后， 可通过生物学性状和农艺性状的鉴定、筛选，得到用于该品种遗传改良的育种材料，同时， 为紫花苜蓿的正向遗传学和功能基因组学分析提供丰富的研宄材料。
[0004] 化学诱变育种是人为的利用化学诱变剂，诱发作物发生突变，通过不断的筛选和 鉴定，直接或间接地培育出能在直接利用于生产中的作物新品种，因而化学诱变是目前为 止迅速发展农作物育种的手段。在众多的化学诱变剂中，甲基磺酸乙醋（Ethylmethane sulphonate，EMS)是应用最广泛、操作简便、高效、稳定的化学诱变剂。但在公知的甲基磺 酸乙酯（EMS)诱变方法中针对紫花苜蓿EMS处理并构建EMS突变体库的优化方法还未见报 道。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明主要解决的问题是提供一种紫花苜蓿EMS突变体库 构建的方法。
[0006] 本发明所述紫花苜蓿EMS突变体库构建的方法，步骤是：
[0007] 1)种子准备：选择饱满度高的紫花苜蓿种子，并按设定量称取该种子作为诱导剂 处理材料；
[0008] 2)甲基磺酸乙酯（EMS)溶液准备：配制0.lmol/L、pH5. 8的磷酸缓冲液并将诱导 剂甲基磺酸乙酯（EMS)溶于该磷酸缓冲液中，制得甲基磺酸乙酯（EMS)溶液；
[0009] 其中，所述pH5. 8的0?lmol/L磷酸缓冲液的配制方法是：将lmol/L的似2即04溶 液定为A液；将lmol/L的NaH2PO^液定为B液。分别取A液92.ImL和B液7. 9mL，加入 到量筒中，定容至1L。
[0010] 3)处理种子：用甲基磺酸乙酯（EMS)溶液处理紫花苜蓿种子；
[0011] 4)播种：对处理之后的紫花苜蓿种子分别编号，并播种于含育苗营养土的营养钵 中育苗；
[0012] 5)移栽：待紫花苜蓿苗长出四片真叶后，将其移入起垄好的大田；苗生长期间加 强肥水管理；
[0013] 6)收种：在苗生长发育的各阶段进行突变体鉴定、筛选、编号，单株收种并记载相 关性状；
[0014] 7)将获得各突变体分别编号并记载性状，建立紫花苜蓿甲基磺酸乙酯（EMS)突变 体库，用于后续的紫花苜蓿选择育种和基因功能组学研宄；
[0015] 其特征在于：
[0016] 步骤2)所述甲基磺酸乙酯（EMS)溶液浓度以重量百分比计为1. 6% ;
[0017] 步骤3)所述处理种子的方法是：现将紫花苜蓿种子用蒸馏水浸泡24±4小时，然 后去除蒸馏水并用步骤2)所述EMS溶液浸泡处理8±2小时，处理期间将含种子的容器置 于摇床上以60 ± 5rpm的转速轻摇；EMS溶液处理结束后，倒掉EMS溶液，将蒸馏水加入含种 子的容器中并浸没种子，将该容器置于摇床上以60±5rpm的转速轻摇，每次30分钟，之后 倒掉蒸馏水，再向该容器中加入蒸馏水并浸没种子，置于摇床上以60±5rpm的转速轻摇， 每次30分钟，之后如此重复用蒸馏水冲洗EMS处理后的种子3-4次直至去除种子中残留的 EMS；
[0018] 步骤4)所述播种方法是：将处理后的种子播于直径6厘米，高10厘米的无纺布育 苗营养钵中，人工穴播，播深1-2厘米；一天喷水3-4次；其中所述育苗营养土的组分配比 以重量份计为：蛭石：泥炭：珍珠岩：腐熟有机堆肥=1:2:2:3。
[0019] 上述紫花苜蓿EMS突变体库构建的方法中：步骤3)所述处理种子的方法优选是： 现将紫花苜蓿种子用蒸馏水浸泡24小时，然后去除蒸馏水并用步骤2)所述EMS溶液浸泡 处理8小时，其中EMS溶液浓度以重量百分比计为1. 6%。
[0020] 本发明公开了一种紫花苜蓿EMS突变体库构建的方法，以现有的紫花苜蓿栽培品 种为材料，是经一定浓度的EMS溶液处理一定时间而获得该品种紫花苜蓿EMS突变体库的 方法。本发明的方法具有操作简便、高效稳定、成本低等特点。利用该方法，可通过生物学 性状和农艺性状的鉴定、筛选，得到用于该品种遗传改良的育种材料，同时，为紫花苜蓿的 正向遗传学和功能基因组学分析提供丰富的研宄材料。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。
[0022] 实施例1 :以紫花苜蓿栽培品种中苜一号为实验材料进行说明。
[0023] 紫花苜蓿（苜一号）EMS突变体库构建的方法，步骤是：
[0024] 1)种子准备：人工挑选饱满度高的苜一号紫花苜蓿种子作为诱导剂处理材料。为 保证得到紫花苜蓿EMS饱和突变体库，严格称量320克的紫花苜蓿种子。
[0025] 2)EMS溶液准备：将lmol/L的似2即04溶液定为A液；将lmol/L的NaH2P04溶液定 为B液。分别取A液92.ImL和B液7. 9mL，加入到量筒中，定容至1L，得pH5. 8的0.Imol/ L磷酸缓冲液。将诱导剂甲基磺酸乙酯（EMS)溶于该磷酸缓冲液中，制得不同浓度的甲基磺 酸乙酯（EMS)溶液。
[0026] 其中，EMS浓度以重量百分比计分别为0、0. 4 %、0. 8 %、1. 2 %、1. 6 %、2. 0 %、 2. 4%、2. 8%、3. 2%〇
[0027]3)处理种子：将紫花苜蓿（苜一号）种子分组，分别先置于IL三角瓶中，用蒸馏 水浸泡24小时。去除蒸馏水后，分别加入上述各浓度的EMS溶液对种子浸泡处理8小时、 12小时、18小时，处理期间将含种子的容器置于摇床上以60rpm的转速轻摇；EMS溶液处理 结束后，倒掉EMS溶液，将蒸馏水加入含种子的容器中并浸没种子，将该容器置于摇床上以 60rpm的转速轻摇，每次30分钟，之后倒掉蒸馏水，再向该容器中加入蒸馏水并浸没种子， 置于摇床上以60rpm的转速轻摇，每次30分钟，之后如此重复用蒸馏水冲洗EMS处理后的 种子3-4次直至去除种子中残留的EMS。
[0028] 4)播种：对处理之后的各组紫花苜蓿种子分别编号，并播种于含育苗营养土的营 养钵中育苗；其中，所述播种方法是：将处理后的种子播于直径6厘米，高10厘米的无纺布 育苗营养钵中，人工穴播，播深1-2厘米；营养钵置于40厘米X60厘米X10厘米营养托盘 中，一天喷水3-4次；所述育苗营养土的组分配比以重量份计为：蛭石：泥炭：珍珠岩：腐 熟有机堆肥=1:2:2:3。
[0029] 5)移栽：待紫花苜蓿苗长出四片真叶后，将其移入起垄好的大田；苗生长期间加 强肥水管理。
[0030] 6)收种：在苗子生长发育的各阶段进行突变体鉴定、筛选、编号，单株收种并记载 相关性状。
[0031] 7)将获得的各突变体分别编号并记载性状，建立紫花苜蓿甲基磺酸乙酯（EMS)突 变体库，用于后续的紫花苜蓿选择育种和基因功能组学研宄。
[0032]上述试验中所用EMS浓度分别为 0、0? 4%、0. 8%、1. 2%、1. 6%、2. 0%、2. 4%、 2. 8%、3. 2%，处理紫花苜蓿中苜一号种子的时间梯度为8小时、12小时、18小时，每个处理 重复3次，每个重复处理的种子为200粒。
[0033] 由上述EMS处理的浓度、时间及实验结果统计分析后得出：选择诱导紫花苜蓿中 苜一号种子产生突变的甲基磺酸乙酯（EMS)半致死剂量浓度1.6%和8小时的处理时间，故 本发明将其确定为构建紫花苜蓿EMS突变体库的最佳处理条件（见表1)。
[0034] 表1:不同EMS浓度、不同时间梯度对中苜一号种子成苗率的影响（％ )
[0035]
【主权项】
1. 一种紫花苜蓿EMS突变体库构建的方法，步骤是： 1) 种子准备：选择饱满度高的紫花苜蓿种子，并按设定量称取该种子作为诱导剂处理 材料； 2) 甲基磺酸乙酯（EMS)溶液准备：配制0. lmol/L、pH5. 8的磷酸缓冲液并将诱导剂甲 基磺酸乙酯（EMS)溶于该磷酸缓冲液中，制得甲基磺酸乙酯（EMS)溶液； 3) 处理种子：用甲基磺酸乙酯（EMS)溶液处理紫花苜蓿种子； 4) 播种：对处理之后的紫花苜蓿种子分别编号，并播种于含育苗营养土的营养钵中育 苗； 5) 移栽：待紫花苜蓿苗长出四片真叶后，将其移入起垄好的大田；苗生长期间加强肥 水管理； 6) 收种：在苗生长发育的各阶段进行突变体鉴定、筛选、编号，单株收种并记载相关性 状； 7) 将获得的各突变体分别编号并记载性状，建立紫花苜蓿甲基磺酸乙酯（EMS)突变体 库，用于后续的紫花苜蓿选择育种和基因功能组学研宄； 其特征在于： 步骤2)所述甲基磺酸乙酯（EMS)溶液浓度以重量百分比计为1.6% ; 步骤3)所述处理种子的方法是：现将紫花苜蓿种子用蒸馏水浸泡24±4小时，然后去 除蒸馏水并用步骤2)所述EMS溶液浸泡处理8±2小时，处理期间将含种子的容器置于摇 床上以60 ±5rpm的转速轻摇；EMS溶液处理结束后，倒掉EMS溶液，将蒸馏水加入含种子的 容器中并浸没种子，将该容器置于摇床上以60±5rpm的转速轻摇，每次30分钟，之后倒掉 蒸馏水，再向该容器中加入蒸馏水并浸没种子，置于摇床上以60±5rpm的转速轻摇，每次 30分钟，之后如此重复用蒸馏水冲洗EMS处理后的种子3-4次直至去除种子中残留的EMS ; 步骤4)所述播种方法是：将处理后的种子播于直径6厘米，高10厘米的无纺布育苗营 养钵中，人工穴播，播深1-2厘米；一天喷水3-4次；其中所述育苗营养土的组分配比以重 量份计为：蛭石：泥炭：珍珠岩：腐熟有机堆肥=1:2:2:3。
2. 根据权利要求1所述紫花苜蓿EMS突变体库构建的方法，其特征在于：步骤3)所述 处理种子的方法是：现将紫花苜蓿种子用蒸馏水浸泡24小时，然后去除蒸馏水并用步骤2) 所述EMS溶液浸泡处理8小时。
【专利摘要】本发明公开了一种紫花苜蓿EMS突变体库构建的方法，是以现有的紫花苜蓿栽培品种为材料，经一定浓度的EMS溶液处理一定时间，利用苗生长发育的各阶段进行突变体鉴定、筛选而获得该品种紫花苜蓿EMS突变体库的方法。本发明的方法具有操作简便、高效稳定、成本低等特点。利用该方法，可通过生物学性状和农艺性状的鉴定、筛选，得到用于该品种遗传改良的育种材料，同时，为紫花苜蓿的正向遗传学和功能基因组学分析提供丰富的研究材料。
【IPC分类】A01H1-06
【公开号】CN104642104
【申请号】CN201510070291
【发明人】夏阳, 孙超, 燕丽萍, 李丽, 刘翠兰, 吴兴兰
【申请人】山东省林业科学研究院
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月10日