一种稳定高效的草莓种质资源离体保存及恢复生长的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种稳定高效的草莓种质资源离体保存及恢复生长的方法，属于农业
技术领域。
【背景技术】
[0002] 从上世纪80年代初，我国建立国家果树草莓种质资源圃，分别设在北京（北京市 农林科学院林业果树研究所内）和江苏南京（江苏省农业科学院园艺研究所内），标志着 我国草莓资源的引种、保存等方面步入了一个新阶段。一些省级科研单位和大专院校以及 地方研究所或私人单位也保存了一些草莓种质资源，目前全国共收集保存野生草莓、地方 品种、引进品种、国内各研究所新育成的品种（系）等种质资源1000余份，通常采用田间 种植保存和室内离体保存两种保存方法。田间种植保存适用于无性繁殖的园艺植物，但是 田间种植保存存在以下局限性（Jarret和Florlowski，1990) :①易受自然灾害（包括病虫 害）的侵袭，造成种质资源丧失；②需耗费大量的人力、物力、财力；③长期无性繁殖过程中 出现人为混杂和种性退化现象；④不便于种质资源交流。室内离体保存是将种质资源的种 子、花粉、芽、根和枝条等繁殖材料分离开母体，或组织培养物，利用设备进行贮藏保存，其 好处是所占空间小，所需的人力资源少，而又能较好地保护物种及其遗传的多样性。离体保 存已成为种质资源保存的常用手段，但利用继代培养的方法一个比较普遍的问题就是继代 频繁。每一次继代都可能造成交叉污染引发遗传变异的安全风险。而当保存量较大时，多 次继代所消耗的人力和物力成本也很高。本世纪以来，研究者成功地对三叶青、金银花、川 芎、木薯、白术、石斛属、菊花和百合等种质资源离体保存，但利用改进了存放条件和保存容 器，延长保存时间尚未有报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于：针对草莓种质保存现有技术的不足之处，提供一种稳定高效 的草莓种质资源离体保存及恢复生长的方法。本发明首次利用改进了存放条件和保存容 器，延长继代培养周期达22-24个月，植株能够正常生长，保存后未发生遗传变异。
[0004] 为实现上述目标，本发明技术方案具体步骤包括：
[0005] (1)无菌苗的获得：是从植株上剪取新长出来的匍匐茎茎尖流水冲洗I. 5_2h，在 无菌操净工作台上，先用75%医用酒精消毒30s，然后再用0. 1%升汞水消毒8min，最后无 菌水冲洗3-4次后剥去外层包片，将茎尖接种在培养基①或②上，置于25±2°C、光照强度 约24001x、每天光照时间14-16h的培养室中进行初代培养，约25天获得无菌苗。
[0006] (2)生长培养：取上述无菌苗，切取带1至2叶的茎尖接种在装有培养基①或②的 组织培养袋中，后将培养袋置于上述相同条件下培养14天，促进茎尖生长长成具根和3-4 片叶的试管苗。
[0007] (3)抑制生长：生长培养结束后，置于22°C，光照强度约24001x，缩短光照至8h的 培养室中培养10天。
[0008] (4)低温保存：抑制生长结束后，置于4°C冰箱中弱光（光照强度约4001X)保存。
[0009] (5)检查恢复培养：每隔6个月，对保存的材料进行检查，对生长不好的进行恢复 培养。
[0010] (6)生根移栽：将上述保存达22-24个月的材料置于（3)抑制生长条件下培养5 天，然后转接③或④上置于（2)生长培养条件下生根培养25天，炼苗移栽。
[0011] 本发明所述的一种稳定高效的草莓种质资源离体保存及恢复生长的方法，其特征 在于：所述的培养基①是指1/2MS+0. 5mg/L 6-BA+O. lmg/L NAA+30g/L蔗糖+6. 2g/L琼脂， pH = 5. 8的培养基，用于野生资源的分化与保存。
[0012] 本发明所述的一种稳定高效的草莓种质资源离体保存及恢复生长的方法，其特征 在于：所述的培养基②是指MS+0. 5mg/L 6-BA+O. lmg/L NAA+30g/L蔗糖+6. 2g/L琼脂，pH =5. 8的培养基，用于栽培资源分化与保存。
[0013] 本发明所述的一种稳定高效的草莓种质资源离体保存及恢复生长的方法，其特征 在于：所述的培养基③是指l/2MS+30g/L蔗糖+6. 2g/L琼脂，pH = 5. 8的培养基，用于野生 资源生根。
[0014] 本发明所述的一种稳定高效的草莓种质资源离体保存及恢复生长的方法，其特征 在于：所述的培养基④是指MS+30g/L蔗糖+6. 2g/L琼脂，pH = 5. 8的培养基，用于栽培资 源生根。
[0015] 本发明所述的一种稳定高效的草莓种质资源离体保存及恢复生长的方法，其特征 在于：所述的组织培养袋是指一种专门用于组织培养专用袋，可以耐高温灭菌和低温存放， 一袋可以分为5个小格。
[0016] 本发明工艺流程简单，与本领域的现有技术知识和常用手段具有如下优点和效 果：
[0017] 本发明所述的培养基①②不添加植物生长抑制剂，通过低温弱光降低遗传变异的 安全风险。
[0018] 本发明所述（2)提及组织培养袋是一种专门用于组织培养专用袋（见附图），可以 耐高温灭菌一袋可以分为5个小格，可节省存放空间，降低污染率，有效提高资源保存安全 风险。
[0019] 本发明所提供的方法用于草莓离体保存，试管苗保存24个月后存活率仍为 100%，且植株生长正常，与常温条件保存3-4个月相比，大大延长了继代周期。因此该方法 不但防止多次继代后造成的种性退化及交叉污染引发遗传变异的安全风险，同时减少繁重 的继代工作，降低不必要的人力、物力，财力资源的浪费。
[0020] 本发明所提供用于草莓离体保存的方法，不受植物生长季节的限制，可随时提供 种质资源交流，携带方便，便于运输等优点。
【附图说明】
[0021] 图1是组织培养袋示意图；
【具体实施方式】
[0022] 实施例1
[0023] (1)无菌苗的获得：2011年11月从国家果树种质南京草莓资源圃江苏省农业科学 院园艺研究所内选用野生资源80份，栽培资源40份（具体材料见下表，编号栽培资源1-40 号，野生资源41-120号）每份资源重复保存8份，从植株上剪取新长出来的匍匐茎茎尖经 流水冲洗I. 5-2h，在无菌操净工作台上，先用75%医用酒精消毒30s，然后再用0. 1 %升汞 水消毒8min，最后无菌水冲洗3-4次后剥去外层包片，将茎尖接种在培养基①或②上，置于 25±2°C、光照强度约24001x、每天光照时间14-16h的培养室中进行初代培养，约25天获得 无菌苗。
[0024] (2)生长培养：取上述无菌苗，切取带1至2叶的茎尖接种在装有培养基①或②的 组织培养袋中，置于上述相同条件下培养14天后，长成具根（1-2_)和3-4片叶的试管苗。 (野生资源①，栽培资源②）
[0025] (3)抑制生长：生长培养结束后，置于22°C，光照强度约24001x，缩短光照至8h的 培养室中培养10天。
[0026] (4)低温保存：抑制生长结束后，置于4°C冰箱中弱光（光照强度约4001x)保存。
[0027] (5)检查恢复培养：每隔3个月，对保存的120份材料进行检查并拿出一份资源置 于（3)抑制生长条件下恢复生长5天，然后转接③或④上置于（2)生长培养条件下生根25 天，炼苗移栽，植株均表现正常。
[0028]
【主权项】
1. 一种稳定高效的草莓种质资源离体保存及恢复生长的方法，其特征在于，具体方法 包括（1)无菌苗的获得（2)生长培养（3)抑制生长（4)低温保存（5)检查恢复培养（6)生 根移栽等。其步骤如下： (1) 无菌苗的获得：是从植株上剪取新长出来的匍匐茎茎尖经流水冲洗I. 5-2h，在无 菌操净工作台上，先用75%医用酒精消毒30s，然后再用0. 1%升汞水消毒8min，最后无菌 水冲洗3-4次后剥去外层包片，将茎尖接种在培养基①或②上，置于25±2°C、光照强度约 24001x、每天光照时间14-16h的培养室中进行初代培养，约25天获得无菌苗。 (2) 生长培养：取上述无菌苗，切取带1至2叶的茎尖接种在装有培养基①或②的组织 培养袋中，后将培养袋置于上述相同条件下培养14天，促进茎尖生长。 (3) 抑制生长：生长培养结束后，置于22°C，光照强度约24001x，缩短光照至8h的培养 室中培养10天。 (4) 低温保存：抑制生长结束后，置于4°C冰箱中弱光（光照强度约4001x)保存。 (5) 检查恢复培养：每隔6个月，对保存的材料进行检查，对生长不好的进行恢复培养。 (6) 生根移栽：将上述保存达22-24个月的材料置于（3)抑制生长条件下培养5天，然 后转接③或④上置于（1)生长培养条件下生根培养25天，炼苗移栽。
2. 根据权利要求1所述的一种稳定高效的草莓种质资源离体保存及恢复生长的方法， 其特征在于：所述的培养基①是指1/2MS+0. 5mg/L6-BA+0.lmg/LNAA+30g/L蔗糖+6. 2g/L 琼脂，pH= 5. 8的培养基，用于野生资源的分化与保存。
3. 根据权利要求1所述的一种稳定高效的草莓种质资源离体保存及恢复生长的方法， 其特征在于：所述的培养基②是指MS+0. 5mg/L6-BA+0.lmg/LNAA+30g/L蔗糖+6. 2g/L琼 月旨，pH= 5. 8的培养基，用于栽培资源分化与保存。
4. 根据权利要求1所述的一种稳定高效的草莓种质资源离体保存及恢复生长的方法， 其特征在于：所述的培养基③是指l/2MS+30g/L蔗糖+6. 2g/L琼脂，pH= 5. 8的培养基，用 于野生资源生根。
5. 根据权利要求1所述的一种稳定高效的草莓种质资源离体保存及恢复生长的方法， 其特征在于：所述的培养基④是指MS+30g/L蔗糖+6. 2g/L琼脂，pH= 5. 8的培养基，用于 栽培资源生根。
6. 根据权利要求1所述的一种稳定高效的草莓种质资源离体保存及恢复生长的方法， 其特征在于：所述的组织培养袋是指一种专门用于组织培养专用袋，可以耐高温灭菌和低 温存放，一袋可以分为5个小格。
【专利摘要】本发明属于植物组织快繁和种质资源保护技术领域，公开了一种稳定高效的草莓种质资源离体保存及恢复生长的方法。具体方法包括(1)无菌苗的获得(2)生长培养(3)抑制生长(4)低温保存(5)检查恢复培养(6)生根移栽等步骤。本发明针对草莓种质资源离体保存存在的问题，不添加植物生长抑制剂通过改进了存放条件和保存容器，使继代培养周期达22-24个月，比已报道保存条件延长4-20个月，同时有效地提高种质资源保存的安全性。该方法操作简便，重复性强，技术稳定，适合大规模草莓种质资源的保存，便于国内外种质资源的交换，避免资源在运输过程中发生病虫害传播甚至死苗，同时还可解决保存占地面积大、费用高等问题。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104782482
【申请号】CN201410424013
【发明人】于红梅, 王静, 赵密珍, 袁华招, 钱亚明
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2014年8月25日