一种实验室快速检测转抗草甘膦基因棉花方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及检测转基因棉花领域，具体涉及一种实验室快速检测转抗草甘膦基因棉花方法。
【背景技术】
[0002]目前，国内对转抗草甘膦基因棉花的检测主要采取两种方法，分子检测和生物学检测。常用的抗草甘膦棉花分子检测主要是检测相应基因片段的大小及插入位点等，分子检测需要专业分子生物学技术人员来操作，通常需要专业仪器进行分子标记检测、southern杂交检测、western杂交检测等等。生物学检测周期长，需要将其种入大田，在棉花生长季节中多次喷施草甘膦2%。以检测不同生长阶段的耐受性，检测效果较易受到周围环境及自然因素的影响造成检测的较大差异；所需种子量较多，较难以在早期获得转基因植株收到极少量种子时检测。
【发明内容】
[0003]本发明为了解决现有检测转抗草甘膦基因棉花技术繁琐、周期长、准确度低、耗资多、所需种子量大等问题，提供了一种实验室快速检测转抗草甘膦基因棉花的方法。
[0004]为了解决【背景技术】中所存在的问题，它具体包括以下操作流程:
[0005]步骤一、种子的准备:种子经硫酸脱绒一晾干一选取生长健壮的种子适当量放入三角瓶一加入占种子总重75%的乙醇消毒30s —再放入占种子总重15%的过氧化氢中消毒3_4h —无菌水中洗3次；
[0006]步骤二、检测培养基的制备:MS(524)粉末、硝酸钾、有机元素、葡萄糖，调节pH值至5.8，添加琼脂作为凝固剂，琼脂的浓度为7g/L，高压灭菌15分钟；检测培养基中添加草甘膦的浓度依次为 1%。、0.8%。、0.6%。、0.4%。、0.2%。、0.1%。、0。
[0007]步骤三、播种:无菌操作台上把种子剥去外壳一放入检测培养基上(每个三角瓶中放入3粒种子)—三角瓶封口后放于培养架光照培养5-7天；
[0008]步骤四、检测:依棉花植株生长受损情况进行检测。
[0009]由于采用了以上技术方案，本发明具有以下有益效果:
[0010](1)不抗草甘膦棉花只有在不加草甘膦的培养基上能够正常生长，在添加任何浓度草甘膦的培养基上都表现出严重生长不良。抗草甘膦棉花在不加草甘膦及草甘膦浓度为0.4%。、0.2%。、0.1%。时，生长差异不大，均未受影响，0.6%。浓度时表现较明显受抑制表型，0.8%。和1%。浓度时抑制更加明显。因此，可将0.6%。的浓度作为实验室快速筛选抗草甘膦棉花的浓度；
[0011](2)这种方法简单，使用种子少，时间短，能快速在实验室进行检测，耗资也低。
【附图说明】
[0012]为了更清楚地说明本发明，下面将结合附图对实施例作简单的介绍。
[0013]图1是75%乙醇消毒棉花种子；
[0014]图2是15%过氧化氢消毒棉花种子；
[0015]图3是无囷水浸泡棉花种子；
[0016]图4是棉花种子去壳播种于培养基；
[0017]图5是不抗草甘膦棉花在草甘膦浓度为0的培养基中发育情况；
[0018]图6是不抗草甘膦棉花在草甘膦浓度为0.1%。的培养基中发育情况；
[0019]图7是不抗草甘膦棉花在草甘膦浓度为0.2%。的培养基中发育情况；
[0020]图8是不抗草甘膦棉花在草甘膦浓度为0.4%。的培养基中发育情况；
[0021]图9是不抗草甘膦棉花在草甘膦浓度为0.6%。的培养基中发育情况；
[0022]图10是不抗草甘膦棉花在草甘膦浓度为0.8%。的培养基中发育情况；
[0023]图11是不抗草甘膦棉花在草甘膦浓度为1%。的培养基中发育情况；
[0024]图12是抗草甘膦棉花在草甘膦浓度为0的培养基中发育情况；
[0025]图13是抗草甘膦棉花在草甘膦浓度为0.%。的培养基中发育情况；
[0026]图14是抗草甘膦棉花在草甘膦浓度为0.2%。的培养基中发育情况；
[0027]图15是抗草甘膦棉花在草甘膦浓度为0.4%。的培养基中发育情况；
[0028]图16是抗草甘膦棉花在草甘膦浓度为0.6%。的培养基中发育情况；
[0029]图17是抗草甘膦棉花在草甘膦浓度为0.8%。的培养基中发育情况；
[0030]图18是抗草甘膦棉花在草甘膦浓度为1%。的培养基中发育情况。
【具体实施方式】
[0031]为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0032]实施例1
[0033]—种实验室快速检测转抗草甘膦基因棉花方法，它具体包括以下操作流程:
[0034]步骤一、种子的准备:种子经硫酸脱绒一晾干一选取生长健壮的种子适当量放入三角瓶一加入75%乙醇消毒30s (参看图1)—再放入15%过氧化氢中消毒3-4h(参看图2)—无菌水中洗3次(参看图3);
[0035]步骤二、检测培养基的制备:MS(524)粉末、硝酸钾、有机元素、葡萄糖，调节pH值至5.8，添加琼脂作为凝固剂，琼脂的浓度为7g/L，然后高压灭菌15分钟，检测培养基中添加草甘膦的浓度依次为 1%。、0.8%。、0.6%。、0.4%。、0.2%。、0.1%。、0。
[0036]步骤三、播种:无菌操作台上把抗草甘膦棉花种子剥去外壳一放入检测培养基上(每个三角瓶中放入3粒种子)—三角瓶封口后放于培养架光照培养5-7天；另取一组不抗草甘膦棉花种子播种于相同检测培养基作为对照(参看图4);
[0037]步骤四、检测:培养7天后依棉花植株生长受损情况进行检测。具体方法是观察幼苗发育情况。参看图5-11，不抗草甘膦棉花受抑制较明显，在未加草甘膦的萌发培养基中可以正常生根萌发，根系长根毛多，初生叶大，鲜绿，下胚轴长；在0.1%。?1%。草甘膦浓度的培养基上生长均严重受到抑制，根系不发育，根部变黑无根毛，初生叶小且发黄，下胚轴未伸长。参看图12-18，抗草甘膦棉花具有一定的抗性，在0.1%。、0.2%。、0.4%。草甘膦浓度的培养基中生长基本未受影响，幼苗发育情况与不加草甘膦的培养基中幼苗发育一致，根系长根毛多，初生叶大，鲜绿，下胚轴长，幼苗生长良好；在0.6%。草甘膦浓度培养基中发育受到一定影响，根部变黑，根毛减少，下胚轴较短；在0.8%。草甘膦浓度培养基中，根部进一步变黑，根毛基本没有，下胚轴更短，初生叶发黄；在1%。草甘膦浓度培养基中根部基本不发育，根部变黑无根毛，初生叶发黄，下胚轴不伸长。因此，在萌发培养基中加入0.6%。浓度草甘勝，可以实现实验室快速检测抗草甘勝棉花。
[0038]所述MS(524)粉末、硝酸钾、有机元素、葡萄糖的种类和添加量为本领域实验人员所公知的常识，调节pH值、配制草甘膦浓度技术为实验室常用技术，所述的草甘膦浓度单位％，为质量体积比(w/v)，其体积为添加草甘膦前培养基的总体积。
[0039]实施例2
[0040]—种实验室快速检测转抗草甘膦基因棉花方法，在实验室把转草甘膦基因棉花种子经消毒后种入特制的检测培养基中，于培养间常规培养5-7天时依据棉花生长受损情况进行检测。棉株生长正常为耐草甘膦，非正常为不耐草甘膦。通过筛选发现，可将0.6%。的浓度作为实验室快速筛选抗草甘膦棉花的浓度。这是一种简单、快速、低耗较为理想的实验室检测技术。
[0041]通过筛选发现，不抗草甘膦棉花只有在不加草甘膦的培养基上能够正常生长，在添加任何浓度草甘膦的培养基上都表现出严重生长不良。抗草甘膦棉花在不加草甘膦及草甘膦浓度为0.4%。、0.2%。、0.1 %。时，生长差异不大，均未受影响，0.6%。浓度时表现较明显受抑制表型，0.8%。和1%。浓度时抑制更加明显。因此，可将0.6%。的浓度作为实验室快速筛选抗草甘膦棉花的浓度。
[0042]最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
【主权项】
1.一种实验室快速检测转抗草甘膦基因棉花方法，其特征在于它具体包括以下操作流程: 步骤一、种子的准备:种子经硫酸脱绒一晾干一选取生长健壮的种子适当量放入三角瓶一加入占种子总重75%的乙醇消毒30s —再放入占种子总重15%的过氧化氢中消毒.3-4h —无菌水中洗3次； 步骤二、检测培养基的制备:MS(524)粉末、硝酸钾、有机元素、葡萄糖，调节pH值至.5.8，添加琼脂作为凝固剂，琼脂的浓度为7g/L，高压灭菌15分钟；检测培养基中添加草甘膦的浓度依次为 1‰、0.8‰、0.6‰、0.4‰、0.2‰、0.1‰、0。 步骤三、播种:无菌操作台上把种子剥去外壳一放入检测培养基上(每个三角瓶中放入3粒种子)—三角瓶封口后放于培养架光照培养5-7天； 步骤四、检测:依棉花植株生长受损情况进行检测。
【专利摘要】本发明公开了一种实验室快速检测转抗草甘膦基因棉花方法，具体包括以下操作流程：步骤一、种子的准备：种子经硫酸脱绒→晾干→选取生长健壮的种子适当量放入三角瓶→加入占种子总重75％的乙醇消毒30s→再放入占种子总重15％的过氧化氢中消毒3-4h→无菌水中洗3次；步骤二、检测培养基的制备：MS(524)粉末、硝酸钾、有机元素、葡萄糖，调节pH值至5.8，添加琼脂作为凝固剂，琼脂的浓度为7g/L，高压灭菌15分钟；检测培养基中添加草甘膦的浓度依次为1‰、0.8‰、0.6‰、0.4‰、0.2‰、0.1‰、0；步骤三、播种。本发明方法简单，使用种子少，时间短，能快速在实验室进行检测，耗资也低。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105340743
【申请号】CN201510791495
【发明人】张树伟, 马燕斌, 张义茹, 王新胜, 吴霞, 张相斌, 韩青龙, 李燕娥
【申请人】山西省农业科学院棉花研究所
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月11日