一种控制杀灭火蚁的方法及驱虫剂的制作方法
【技术领域】
[00011本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种以火蚁的HsTRPA-SiHsTRPA 为靶标控制杀灭火蚁的方法。
【背景技术】
[0002] 火蚁(Solenopsis invicta)是一种入侵物种，原产于南美洲。它极具破坏性，并且 传播广泛。现已在已在包括美国，澳大利亚，新西兰，台湾地区和中国大陆的许多国家和地 区中发现火蚁。由于世界贸易的发展，火蚁很可能进一步传播到其他国家。火蚁的入侵可能 带来以下影响：（1)削减本区域种多样化甚至本地物种灭绝，（2)造成农作物减产，（3)火蚁 种群可在陆地和建筑物中大量繁殖并且叮咬人类，从而严重影响人类活动。
[0003] 现有的火蚁控制方法包括使用杀虫剂(例如:氯吡硫磷和氟苯脲)和一些生物控制 法(例如使用蚤蝇和病原霉菌）。然而，这些防治方法并不是特别的针对火蚁;而且杀虫剂可 以广泛的杀灭所有昆虫，因而会破坏生态系统。
[0004]人们迫切的需要一种化合物既能特异有效的控制火蚁，又对环境和其他生物特别 是人类无害。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的第一方面问题在于克服现有杀灭火蚁的方法对生态系统的危 害性，提供一种特异性的杀灭火蚁、对其他物种无害的方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供的一种控制杀灭火蚁的方法，以火蚁的HsTRPA-SiHs TRPA为靶标控制杀灭火蚁的方法。
[0007] 本发明的一优选技术方案中，以癸酸作用于火蚁的HsTRPA-SiHsTRPA为靶标控制 杀灭火蚁。
[0008] 本发明优选技术方案中，所述癸酸浓度2 0.2mM，优选为0.2mM <癸酸浓度< ImM， 更优选为〇. 2mM <癸酸浓度< 0.5mM。
[0009] 本发明优选技术方案中，所述火蚁指火蚁属，包括五个种:红火蚁、热带火蚁、木火 蚁、黑火蚁、巴西火蚁。
[0010] 本发明的第二方面，提供控制杀灭蚁类的驱虫剂，其特征在于，其包含以火蚁的 Hs TRPA-SiHs TRPA为靶标进行作用的癸酸。
[0011 ] 本发明优选技术方案中，所述癸酸浓度20.2mM，优选为0.2mM ^癸酸浓度， 更优选为〇. 2mM <癸酸浓度< 0.5mM。
[0012] 本发明优选技术方案中，所述火蚁指火蚁属，包括五个种:红火蚁、热带火蚁、木火 蚁、黑火蚁、巴西火蚁。
[0013] 本发明的第三方面提供上述的驱虫剂用于以HsTRPA-SiHsTRPA靶标控制杀灭火 蚁。其中，所述癸酸浓度2 〇. 2mM，优选为0.2mM <癸酸浓度< ImM，更优选为0.2mM <癸酸浓 度仝0.5mM。
[0014]火蚁，是指膜翅目，蚁科，火蚁族，火蚁属(Solenopsis Westwood)。火蚁，则指被其 蜇伤后会出现火灼感的蚂蚁。火蚁在中国主要包括五个种:红火蚁、热带火蚁、木火蚁、黑火 蚁、巴西火蚁。红火蚁分布广泛，为极具破坏力入侵生物之一。在中国红火蚁是入侵生物。
[0015] 本发明中的"控制"是指对火蚁具有驱逐效果，导致其对伤害性刺激产生回避行 为。
[0016] 为了寻找合适的杀虫剂，发明人对瞬时受体电位(TRP)A通道进行研究，这个离子 通道还从未做为一个靶标用来研发针对蚁类的驱虫剂。一些TRPA通道（阳离子交换）功能 nocisensors昆虫导致回避行为对伤害性刺激。目前的驱虫剂作为激活味觉或嗅觉受体配 体诱导的避税行为。这些受体是G蛋白偶联受体激活细胞信号转导途径，因而他们的功能是 不同的TRP通道。我们筛选植物天然化合物能够激活火蚂蚁hstrpa信道识别潜在的蚂蚁驱 虫剂。这些化合物可以用来控制的蚂蚁，其他昆虫和环境的影响最小。
【附图说明】
[0017] 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
[0018] 图1为将10个火蚁防置在培养皿的中线处。中线左右两边滤纸被分别被20%DMS0 和ImM癸酸浸湿。测试时间为20分钟，每2分钟统计分布在中线两边滤纸上的火蚁数量。在对 照组中，线左右两边滤纸被都被20%DMS0浸湿。我们通过(DMS0浸湿滤纸上的火蚁数量-癸 酸浸湿滤纸上的火蚁数量)/总火蚁数量。
[0019] 图2为计算试验在不同癸酸浓度时的回避系数。误差线（土SEM)的计算是通过试验 在不同癸酸浓度时的回避系数。癸酸的浓度在〇. 03，0.2，0.5，and lmM(**)时P值(AN0VA)分 别为〈0 · 000004，〈0 · 002，〈0 · 00001，and〈0 · 000002。癸酸的浓度在0 · 03 时会吸引火蚁。
[0020] 图3显示了6种化合物的钙离子成像法图谱;其中，横坐标为时间，纵坐标为细胞内 钙离子荧光指示剂fura-2的荧光强度在化合物流入腔膛期间与未流入时的比值。化合物名 称下面的横线表示化合物流入腔膛所跨越的时间。其中测试的化合物，图3A为1-辛醛，3B 为壬醛，3C为辛酸，3D为癸酸，3E为月桂酸，3F为3，7-二甲基-6-辛烯醛。
【具体实施方式】
[0021] 为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指 出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论 述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
[0022] 本发明中实验火蚁采集于广州华南农业大学校区内及野外。
[0023] 结合附图，通过实施例对本发明进一步具体描述：
[0024] 实施例1趋向性试验
[0025] 将10只火蚁防置在培养皿内，培养皿划了一中线将其面积分为均等两份。在该中 线左右两边放置滤纸，实验组中，滤纸分别被20%DMS0和ImM癸酸浸湿;对照组中，中线左右 两边滤纸都被20 % DMSO浸湿。将10只火蚁防置在培养皿的中线处。
[0026]测试时间为20分钟，每2分钟统计分布在中线两边滤纸上的火蚁数量。通过(DMS0 浸湿滤纸上的火蚁数量-癸酸浸湿滤纸上的火蚁数量)/总火蚁数量进行计算。
[0027]图2为计算试验在不同癸酸浓度时的回避系数。误差线（土SEM)的计算是通过试验 在不同癸酸浓度时的回避系数。癸酸的浓度在0.03，0.2，0.5，and lmM(**)时P值(ANOVA)分 别为〈0 · 000004，〈0 · 002，〈0 · 00001，and〈0 · 000002。癸酸的浓度在0 · 03 时会吸引火蚁。
[0028]实施例2钙离子成像试验
[0029] 2.1提取火蚁总RNA
[0030] 根据厂家说明用试剂盒TriZOI (Invitrogen公司）提取火蚁总RNA:将火蚁在 Trizol中裂解，反复震荡，然后加入氯仿，上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加 0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15~30°C)放置10分钟后，12000g(2~8°C)离心10 分钟。去上清液后，让沉淀的RNA在室温在自然干燥。
[0031] 2.2火蚁全长SiHs TRPA的制备
[0032] 从NCBIs数据库中获得部分火蚁SiHsTRPA序列，然后由5'RACE(5'-FulI RACE试剂 盒，日本TAKARA公司）和3 ' RACE(SMARTer RACE试剂盒，Clontech公司）获得全长SiHsTRPA序 列。
[0033] 5RACE引物：
[0034] 5'-1外部引物（第一次PCR) :5，-GCGGATAATCCTTCGCTGCATAAGTGC-3,，（Seq ID No. I)
[0035] No. 2)
[0036] 3RACE引物：
[0037] 3'-1外部引物（第一次PCR) :5，-CCCTCGTCTGCGAATGACGACATCAAT-3,，（Seq ID No. 3)
[0038] 3'-2内部引物（第二次卩〇0:5，-6〇6八1^八〇6〇：61'1766(^6八八八〇八1'(：-3，，（56110 No. 4)
[0039] 经过两轮PCT后，最后得到火蚁的SiHsTRPA全长序列，如Seq ID No.5所示。
[0040] 2.3质粒构建
[0041 ] 根据已获得全长序列可以在NCBI ORF Finder网（http:// www.ncbi .111111.11；[11.80￥/^0奸/)进行0(18区域判断。然后在所判断起始子的上游和终子的下 游处设计一对引物进行PCR。由于PCR引物带有Not I和Xba I的酶切点。SiHsTRPA被内切酶 Not I和RcoRI (Themal)酶切后克隆到Ac5 · l/V5_His B载体（Invitrogen公司）中。这里， Ac5.1/V5-His B载体的果蝇肌蛋白5C启动子已经被换为CMV启动子。
[0042] PCR引物，正向：
[0043] 5'-TGAATTCACCATGTGTGAGAATGATAAAGATTCGTTAGG-3',(Seq ID No.6)
[0044] PCR引物，逆向：
[0045] 5/-AATTTGCGGCCGCCCTATAATGAGGTATTTTCTTCTTTCGCCAA-3 / .(Seq ID No.7)
[0046] 2.4钙离子成像
[0047]抚育在盖薄片上的HEK293(InVitr〇gen公司）细胞被所构建的质粒载体转染后加 入Dsred作为转染指示剂。Dsred可以指示被TRPAl转染的细胞，以便在钙项试验，只测试被 TRPAl转染的细胞。
[0048]在钙离子成像试验前的1-2小时添加细胞内钙离子荧光指示剂fura-2 (Invitrogen)。实验时，将覆盖有细胞的盖薄片置于连接到重力流动系统（RC-26G，Warner Instruments Inc. ,Hamden,CT)的腔膛内。用CCD照相机（CoolSNAP ES,Roper scientific photometries , Tucson ,AZ)在340和380nm下检测萤光。最后用IPlab软件（Scanalytics Inc .Rockvi I Ie ,MD)进行数据分析。
[0049]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明 的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和 改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同 物界定。
【主权项】
1. 一种控制杀灭火蚁的方法，其特征在于，以火蚁的HsTRPA-SiHsTRPA为靶标控制杀灭 火蚁。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以癸酸作用于火蚁的HsTRPA(SiHsTRPA)靶 标控制杀灭火蚁。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癸酸浓度为20.2mM。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癸酸浓度为:0.2mM<癸酸浓度<ImM。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述火蚁指火蚁属，包括五个种:红火蚁、 热带火蚁、木火蚁、黑火蚁、巴西火蚁。6. -种控制杀灭蚁类的驱虫剂，其特征在于，其包含以火蚁的HsTRPA-SiHsTRPA为靶标 进行作用的癸酸。7. 根据权利要求6所述的驱虫剂，其特征在于，所述癸酸浓度为20.2mM。8. 根据权利要求6所述的驱虫剂，其特征在于，所述癸酸浓度为：0.2mM《癸酸浓度< lmM〇9. 如权利要求6所述的驱虫剂用于以HsTRPA-SiHsTRPA靶标控制杀灭火蚁。10. 根据权利要求9所述的用途，其特征在于，癸酸浓度为20.2mM。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，本发明公开了一种以火蚁的HsTRPA-SiHsTRPA为靶标控制杀灭火蚁的方法，具体而言，以癸酸作用于火蚁的HsTRPA(SiHsTRPA)靶标控制杀灭火蚁，且所述癸酸浓度为≥0.2mM。本发明还公开了一种控制杀灭蚁类的驱虫剂，其包含癸酸，所述癸酸浓度为≥0.2mM，优选为0.2mM≤癸酸浓度为≤1mM。本发明选用植物天然化合物能够激活火蚂蚁hstrpa信道识别潜在的蚂蚁驱虫剂。这些化合物可以用来控制的蚂蚁，其他昆虫和环境的影响最小。
【IPC分类】A01P7/04, A01P17/00, A01N37/02
【公开号】CN105432613
【申请号】CN201510760506
【发明人】门胁辰彦, 董晓峰, 彭广大, 许益镌, 加塩麻纪子, 富永真琴
【申请人】西交利物浦大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年11月10日