精子冷冻保护剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及辅助生殖技术精子冷冻保存领域，特别是涉及一种精子冷冻保护剂及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 人类精子的冷冻保存对于人类生殖健康有着重要的作用，而在冷冻过程中添加的 冷冻保护剂为影响冷冻保存效果的关键因素之一。
[0003] 目前各精子库和生殖中心所采用的精子冷冻保护剂多采用卵黄、甘油、蔗糖配方， 由于必须添加卵黄，导致冷冻保护剂的成分相当复杂，存在动物源性致病菌感染的风险。
【发明内容】
[0004] 基于此，有必要针对上述问题，提供一种精子冷冻保护剂及其制备方法，本发明精 子冷冻保护剂不含卵黄，不存在动物源性致病菌感染的风险。
[0005] 为实现上述技术目的，具体技术方案如下：
[0006] 一种精子冷冻保护剂，每125mL所述精子冷冻保护剂含有下列成分：
[0007] 鹿糖16±0· lg，碳酸氢钠0· 5±0.05g，甘油36±0.5mL，人血白蛋白25±0· 2mL，五 蒸水余量。
[0008] 在其中一些实施例中，每125mL所述精子冷冻保护剂含有下列成分：
[0009] 蔗糖16g，碳酸氢钠0.5g，甘油36mL，人血白蛋白25mL，五蒸水余量。
[0010] 在其中一些实施例中，所述人血白蛋白为20g/100mL人血白蛋白。
[0011] 本发明还提供一种上述精子冷冻保护剂的制备方法，包括以下步骤：
[0012] (1)按照上述成分配比称取所述蔗糖、碳酸氢钠、甘油、人血白蛋白以及五蒸水备 用；
[0013] (2)依次放入所述五蒸水、蔗糖、甘油、碳酸氢钠，搅拌均匀；
[0014] (3)过滤，在滤过液中加入所述人血白蛋白，搅拌；
[0015] (4)分装，冷冻保存。
[0016] 在其中一些实施例中，所述人血白蛋白为20g/100mL人血白蛋白。
[0017] 在其中一些实施例中，所述步骤(2)中的搅拌时间为14~16分钟。
[0018] 在其中一些实施例中，所述步骤(3)中的搅拌时间为14~16分钟。
[0019] 在其中一些实施例中，所述步骤(4)中的冷冻保存温度为-74~_76°C。
[0020] 在其中一些实施例中，所述过滤为用孔径为0.45um的滤芯过滤。
[0021] 本发明相较现有技术的优点以及有益效果为：
[0022] 本发明所采用的新型的精子冷冻保护剂配方，不含卵黄，仅包含蔗糖、碳酸氢钠、 甘油、20% (g/mL)人血白蛋白等几种常用的且化学成分明确的试剂，不存在动物源性致病 菌感染的风险，而且所得到的冷冻效果与现有配方相仿，精子冷冻复苏率平均值在75%~ 80% 〇
[0023] 本发明制备方法简单，整个制备过程可在1小时内完成，简单高效。
【具体实施方式】
[0024] 实施例中所用原料均为市售常规原料。
[0025] 以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0026]本发明实施例中所用的20% (g/mL)人血白蛋白购自瑞士杰特贝林生物制品有限 公司。
[0027] 实施例1
[0028] -种精子冷冻保护剂，其配方成分及含量如下：
[0029] 鹿糖16g，碳酸氢钠0.5g，甘油36mL，20% (g/mL)人血白蛋白25mL，五蒸水60mL。
[0030]上述精子冷冻保护剂的制备方法包括以下步骤：
[0031 ] 1、电子天平称取鹿糖16g，碳酸氢钠0.5g;
[0032] 2、量筒量取甘油36mL，20 % (g/mL)人血白蛋白25mL，及60mL五蒸水(按常规方法自 制，将水反复蒸馏五次所得)备用；
[0033] 3、先将60mL五蒸水加入250mL烧杯中，然后放入搅拌磁珠；
[0034] 4、将烧杯放置于磁力搅拌器上，先将转速调至最低，打开电源，再将转速调至适当 速度，以保持较大转速而烧杯中液体不飞溅出来；
[0035] 5、依次加入蔗糖，甘油及碳酸氢钠，共搅拌15分钟使之充分溶解；
[0036] 6、用孔径为0.45um的滤芯过滤，在滤过液中加入人血白蛋白，再次搅拌15分钟；
[0037] 7、在无菌的环境下分装成25mL装小瓶，保存于_75°C备用。
[0038] 以下通过实验来检测实施例的精子冷冻效果 [0039]检测方法:冷冻实验
[0040] 1、选用市面上常用的含卵黄的精子冷冻保护剂(称为对比例1)和按本配方实施例 1所配制的精子冷冻保护剂各10mL;
[0041 ] 2、选取精子密度为40-80 X 106个/mL，活率为30-60 %，体积为2-5mL的精液标本共 25份，并登记其常规参数；
[0042] 3、按照精子冷冻保护剂:精液=1:3 (体积比）的比例将精子冷冻保护剂与精液混 合，即每管lmL的混合液体中，包含0.25mL的精子冷冻保护剂和0.75mL的精液，每份标本均 各做两管不同精子冷冻保护剂的冷冻实验;充分混合均匀后，按程序冷冻仪预设的程序进 行冷冻；
[0043] 4、将混合液体降温至_196°C并达到稳定之后，从液氮中取出冷冻精液，在水浴摇 床中解冻(37°C);
[0044] 5、解冻后，再次利用相差显微镜，对精子密度、活率等常规参数进行检验并登记为 冻后；
[0045] 6、冻后活率+冻前活率X 100% =冷冻复苏率。
[0046]检测所用仪器 [0047]
[0048] 具体实验数据请见下表：
[0049]
[0050]
[0051 ] 数据检测方法:两组冷冻复苏率采用SPSS17.0进行配对T检验，p = 0.12，p>0.05， 两者无统计学差异。
[0052] 由上表可知，本发明所采用的新型的精子冷冻保护剂配方，不含卵黄，仅包含蔗 糖、碳酸氢钠、甘油、20% (g/mL)人血白蛋白等几种常用的且化学成分明确的试剂，不存在 动物源性致病菌感染的风险，而且所得到的冷冻效果与现有配方相仿，精子冷冻复苏率平 均值在75 %~80 %。
[0053] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实 施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存 在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0054] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护 范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种精子冷冻保护剂，其特征在于，每125mL所述精子冷冻保护剂含有下列成分： 鹿糖16±0. lg，碳酸氢钠0.5±0.05g，甘油36±0.5mL，人血白蛋白25±0.2mL，五蒸水 余量。2. 根据权利要求1所述的精子冷冻保护剂，其特征在于，每125mL所述精子冷冻保护剂 含有下列成分： 鹿糖16g，碳酸氢钠0.5g，甘油36mL，人血白蛋白25mL，五蒸水余量。3. 根据权利要求1或2所述的精子冷冻保护剂，其特征在于，所述人血白蛋白为20g/ lOOmL人血白蛋白。4. 一种权利要求1~3任一项所述的精子冷冻保护剂的制备方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1) 按照权利要求1或2的成分配比称取所述蔗糖、碳酸氢钠、甘油、人血白蛋白以及五 蒸水备用； (2) 依次放入所述五蒸水、蔗糖、甘油、碳酸氢钠，搅拌均匀； (3) 过滤，在滤过液中加入所述人血白蛋白，搅拌； (4) 分装，冷冻保存。5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述人血白蛋白为20g/100mL人血白 蛋白。6. 根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的搅拌时间为14~ 16分钟。7. 根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的搅拌时间为14~ 16分钟。8. 根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的冷冻保存温度 为-74 ~-76°C〇9. 根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述过滤为用孔径为0.45um的滤 芯过滤。
【专利摘要】本发明涉及一种精子冷冻保护剂及其制备方法，所述每125mL精子冷冻保护剂含有下列成分：蔗糖，碳酸氢钠，甘油，人血白蛋白以及五蒸水。本发明所采用的新型的精子冷冻保护剂配方，不含卵黄，仅包含蔗糖、碳酸氢钠、甘油、20％(g/mL)人血白蛋白等几种常用的且化学成分明确的试剂，不存在动物源性致病菌感染的风险，而且所得到的冷冻效果与现有配方相仿，精子冷冻复苏率平均值在75％-80％左右。
【IPC分类】A01N1/02
【公开号】CN105532643
【申请号】CN201511028340
【发明人】朱文兵, 卢光琇, 范立青, 彭向杰
【申请人】中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年12月31日