羊踯躅叶片再生植株的方法
【专利摘要】本发明公开了一种羊踯躅叶片再生植株的方法，以羊踯躅叶片为外植体，经过暗培养、分化培养、继代培养、增殖培养、生根培养和炼苗移栽等步骤获得羊踯躅再生植株，解决了羊踯躅叶片离体再生芽的困难，不仅为快速繁殖优良羊踯躅提供了途径，而且为以后通过基因工程技术改良羊踯躅的抗性、花型及花色等性状，以及为羊踯躅遗传体系的建立打下了坚实的基础。本发明以羊踯躅叶片为外植体，可以在羊踯躅任意生长阶段进行选材扩繁，短时间内获得大量再生植株，繁殖系数高，移栽生长良好，为工厂化育苗奠定了基础。
【专利说明】
羊踯躅叶片再生植株的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种羊踯躅叶片再生植株的方法。属于植物组织培养领域。
【背景技术】
[0002]杜鹃花是中国十大传统名贵花卉之一，其花色繁多，花期长，被广泛用于地栽、城市道路、风景区以及住宅小区的绿化造景中，有“花木之王”的美名。我国是世界上拥有杜鹃花种群数量最多的国家，也是世界杜鹃花的发祥地和现代分布中心，全世界共有杜鹃花属植物960余种，我国约有562种。
[0003]羊掷躅(Rhododendron molle(Blume)G.Don)又名闹羊花、黄杜鹊、黄色映山红、隶属杜鹃花科杜鹃花属羊踯躅亚属，落叶灌木，是杜鹃花属植物中极少数开黄色花的珍贵物种，具有较高的观赏价值。然而羊踯躅的扦插困难，难生根，严重制约了羊踯躅在生产上推广应用。中国专利文献CNl03651115A公开了一种杜鹃花金踯躅的组培快繁方法，该方法选用金踯躅的带叶茎段作为外植体进行组培，初步解决金踯躅的快繁问题，但其诱导过程实质是芽到芽的增殖，并没有解决金踯躅愈伤组织再生植株的问题。关于木本植物通过叶片再生植株一直是林业研究工作中的一个难题，羊踯躅通过叶片直接诱导不定芽再生植株的有效方法迄今尚未报道，本发明主要以羊踯躅叶片为外植体，直接诱导不定芽，不仅为快速繁殖优良羊踯躅植株提供了一条新的途径，而且为以后通过基因工程技术利用叶盘法转基因来改良羊踯躅的抗性、花型及花色等性状打下坚实的基础。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种羊踯躅叶片再生植株的方法。
[0005]本发明的目的通过以下技术方案实现:
[0006]—种羊踯躅叶片再生植株的方法，其步骤包括:
[0007](I)暗培养:将羊踯躅无菌苗叶片，用无菌解剖刀在叶片上划刻几刀，接种到预培养基中，暗培养3-7天，其中预培养基为:1/2WPM+1.0?5.0mg/L ΖΤ+0.02?1.0mg/L IBA+20?30g/L 蔗糖+4.0?7.0g/L 琼脂，pH 为 5.2?5.6;
[0008](2)分化培养:将步骤(I)叶片接种到分化培养基中进行愈伤组织及芽诱导，其中分化培养基为:木本植物常用培养基(WPM)+1.0?5.0mg/L玉米素(ZT)+0.02?1.0mg/L卩引噪丁酸(IBA)+20 ?30g/L 蔗糖+4.0?7.0g/L 琼脂，pH 为 5.2?5.6;
[0009](3)继代培养:将步骤(2)叶片接种到继代培养基中继续进行愈伤组织及芽诱导，其中继代培养基为:WPM+1.0?5.0mg/L ΖΤ+0.02?I.0mg/L IBA+20?30g/L蔗糖+4.0?
7.(^/1琼脂，？!1为5.2?5.6;
[0010](4)增殖培养基:将步骤(3)诱导分化的带芽愈伤组织接种到增殖培养上进行增殖培养，增殖培养基为:WPM+0.1 ?2.0mg/L ΖΤ+0.02?1.0mg/L IBA+20?30g/L蔗糖+4.0?
7.(^/1琼脂，？!1为5.2?5.6;
[0011 ] (5)生根培养:将步骤(4)增殖的不定芽接种到生根培养基中，接种后光照培养；[0012 ] (6)炼苗移栽:从步骤(5)获得的组培苗中选取根系健壮的进行炼苗移栽。
[0013]优选的，所述步骤(I)中暗培养条件为温度20?25°C，湿度40?50%。
[0014]优选的，所述步骤(2)中培养条件为:光照12?14h/天，光照强度3000?5000Ix，温度23?25°C，湿度40?50%，培养至叶片切口处卷曲加剧，开始出现颗粒状的愈伤组织。
[0015]优选的，所述步骤(3)中培养条件为:光照12?14h/天，光照强度3000?5000Ix，温度23?25°C，湿度40?50%，培养至叶片切口处愈伤组织长出不定芽。
[0016]优选的，所述步骤(4)中培养条件为:光照12?14h/天，光照强度3000?50001x，温度23?25°C，湿度40?50%，培养至带有不定芽的愈伤组织长出丛生芽。
[0017]优选的，所述步骤(5)中生根培养基为:1/3￥?1+0.5?4.011^/1 IBA+20?30g//L蔗糖+6.0g/L琼脂+2g//L活性碳，pH为5.2?5.6，培养至不定芽株高达到3cm以上且生长出须根。
[0018]优选的，所述步骤(6)具体为:选择根系健壮且株高达到3.0cm的组培苗，敞开培养瓶瓶盖，炼苗10天，洗净组培苗根部的琼脂，之后将其移栽到淋湿的珍珠岩基质中，向小苗进行喷雾，覆盖塑料薄膜进行保温保湿，随后几天逐步撤去薄膜进行通风透光，20?30天后，将其移栽至草炭土:珍珠岩=3:1组成的混合基质中，移栽操作在温度20?25°C下进行，栽植后浇透水，日常养护注意保证基质湿润。
[0019]本发明以羊踯躅叶片为外植体，经过暗培养、分化培养、继代培养、增殖培养、生根培养和炼苗移栽等步骤获得羊踯躅再生植株，解决了羊踯躅叶片离体再生芽的困难，不仅为快速繁殖优良羊踯躅提供了途径，而且为以后通过基因工程技术改良羊踯躅的抗性、花型及花色等性状，以及为羊踯躅遗传体系的建立打下了坚实的基础。本发明以羊踯躅叶片为外植体，可以在羊踯躅任意生长阶段进行选材扩繁，短时间内获得大量再生植株，繁殖系数高，移栽生长良好，为工厂化育苗奠定了基础。
【具体实施方式】
[0020]实施例1
[0021]本羊踯躅叶片再生植株的方法，其步骤包括:
[0022](I)暗培养:将羊踯躅无菌苗叶片，用无菌解剖刀在叶片上划刻几刀，接种到预培养基中，暗培养7天，温度23°C，湿度40 %，经过暗培养，叶片切口处开始卷曲，预培养基为:1/2WPM+2.0mg/L ZT+0.02mg/L 18八+258/1蔗糖+4.(^/1琼脂4!1为5.4。
[0023](2)分化培养:将步骤(I)叶片接种于分化培养基中，进行愈伤组织及芽诱导，接种后置于光照14h/天，光照强度30001x，温度23°C，湿度40%，诱导15天后，叶片切口处开始卷曲，有少量颗粒状的愈伤组织。所述分化培养基为:WPM+2.0mg/L ZT+0.02mg/L IBA+20g/L鹿糖+5.0g/L琼脂，pH为5.4。
[0024](3)继代培养:步骤(2)叶片培养20天后，将其接种到继代培养基中进行芽诱导，接种后置于光照1处/天，光照强度300011，温度23°(:，湿度40%，15天后，从颗粒状的愈伤组织中有芽点突起，逐渐长成绿色嫩芽，30天后统计不定芽分化率为90.56%。所述的继代培养基为:WPM+1.0mg/L ZT+0.02mg/L 四4+258/1蔗糖+4.(^/1琼脂，？!1为5.4。
[0025](4)增殖培养基:将步骤(3)诱导分化的带芽愈伤组织接种到增殖培养上进行增殖培养，接种后光照14h/天，光照强度30001x，温度23 °C，湿度40 %。30天后统计不定芽增殖系数为5.3 ο 所述增殖培养基:WPM+2.0mg/L ZT+1.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+5.0g/L琼脂，pH为5.4。
[0026](5)生根培养:将步骤(4)增殖的不定芽接种到生根培养基中，接种后光照16h/天，光照强度60001x，温度23°C，湿度45%。40天后统计生根率为85%。所述的生根培养基:I/3WPM+1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+6.08/1琼脂+28/1活性碳，？!1为5.6。
[0027](6)炼苗移栽:选择步骤(5)诱导的根系健壮且株高达到3.0cm的组培苗，敞开培养瓶瓶盖，炼苗10天，再洗净组培苗根部的琼脂，之后将其移栽到淋湿的珍珠岩基质中，向小苗进行喷雾，覆盖塑料薄膜进行保温保湿，之后几天逐步撤去薄膜进行通风透光，20天后，将其移栽至草炭土:珍珠岩=3:1组成的混合基质中，栽植后浇透水，日常养护注意保证基质湿润。30天后统计羊踯躅成活率为90%。
[0028]实施例2
[0029]本羊踯躅叶片再生植株的方法，其步骤包括:
[0030](I)暗培养:将羊踯躅无菌苗叶片，用无菌解剖刀在叶片上划刻几刀，接种到预培养基中，暗培养5天，温度250C，湿度50 %，预培养基为:1/2WPM+1.0mg/L ZT+0.5mg/L IBA+20g/L 蔗糖+5.0g/L 琼脂，pH 为 5.2。
[0031](2)分化培养:将步骤(I)叶片接种于分化培养基中，进行愈伤组织及芽诱导，接种后置于光照13h/天，光照强度50001x，温度25°C，湿度50%，诱导15天后，叶片切口处开始卷曲，有少量颗粒状的愈伤组织。所述分化培养基为:WPM+1.0mg/L ZT+0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.0g/L 琼脂，pH 为 5.6。
[0032](3)继代培养:步骤(2)叶片培养20天后，将其接种到继代培养基中进行芽诱导，接种后置于光照1311/天，光照强度500011，温度25°(:，湿度50%，15天后，从颗粒状的愈伤组织中有芽点突起，逐渐长成绿色嫩芽，30天后统计不定芽分化率为87.85%。所述的继代培养基为:WPM+5.0mg/L ZT+1.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.6。
[0033](4)增殖培养基:将步骤(3)诱导分化的带芽愈伤组织接种到增殖培养上进行增殖培养，接种后光照13h/天，光照强度50001x，温度25 °C，湿度50 %。30天后统计不定芽增殖系数为4.7 ο 所述增殖培养基:WPM+1.0mg/L ZT+0.5mg/L IBA+25g/L蔗糖+4.0g/L琼脂，pH为
5.6ο
[0034](5)生根培养:将步骤(4)增殖的不定芽接种到生根培养基中，接种后光照15h/天，光照强度50001x，温度25°C，湿度50%。40天后统计生根率为89%。所述的生根培养基:I/3WPM+4.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+2g/L活性碳，pH为5.4。
[0035](6)炼苗移栽:选择步骤(5)诱导的根系健壮且株高达到3.0cm的组培苗，敞开培养瓶瓶盖，炼苗10天，再洗净组培苗根部的琼脂，之后将其移栽到淋湿的珍珠岩基质中，向小苗进行喷雾，覆盖塑料薄膜进行保温保湿，之后几天逐步撤去薄膜进行通风透光，20天后，将其移栽至草炭土:珍珠岩=3:1组成的混合基质中，栽植后浇透水，日常养护注意保证基质湿润。30天后统计羊踯躅成活率为92%。
[0036]实施例3
[0037]本羊踯躅叶片再生植株的方法，其步骤包括:
[0038](I)暗培养:将羊踯躅无菌苗叶片，用无菌解剖刀在叶片上划刻几刀，接种到预培养基中，暗培养3天，温度24°C，湿度45 %，预培养基为:1/2WPM+5.0mg/L ZT+1.0mg/L IBA+30g/L 鹿糖+7.0g/L 琼脂，pH 为5.6。
[0039](2)分化培养:将步骤(I)叶片接种于分化培养基中，进行愈伤组织及芽诱导，接种后置于光照12h/天，光照强度40001x，温度25°C，湿度50%，诱导15天后，叶片切口处开始卷曲，有少量颗粒状的愈伤组织。所述分化培养基为:WPM+5.0mg/L ZT+1.0mg/L IBA+25g/L蔗糖+4.0g/L 琼脂，pH 为 5.2。
[0040](3)继代培养:步骤(2)叶片培养20天后，将其接种到继代培养基中进行芽诱导，接种后置于光照1211/天，光照强度40001^温度25°(:，湿度50%，15天后，从颗粒状的愈伤组织中有芽点突起，逐渐长成绿色嫩芽，30天后统计不定芽分化率为93.26%。所述的继代培养基为:WPM+3.0mg/L ZT+0.5mg/L IBA+20g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.2。
[0041](4)增殖培养基:将步骤(3)诱导分化的带芽愈伤组织接种到增殖培养上进行增殖培养，接种后光照12h/天，光照强度40001x，温度25 °C，湿度50 %。30天后统计不定芽增殖系数为3.2。所述增殖培养基:WPM+0.lmg/L ZT+0.02mg/L IBA+20g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为
5.2ο
[0042](5)生根培养:将步骤(4)增殖的不定芽接种到生根培养基中，接种后光照14h/天，光照强度40001x，温度25°C，湿度50%。40天后统计生根率为82%。所述的生根培养基:I/3WPM+0.5mg/L IBA+25g/L蔗糖+7.0g/L琼脂+2g/L活性碳，pH为5.2。
[0043](6)炼苗移栽:选择步骤(5)诱导的根系健壮且株高达到3.0cm的组培苗，敞开培养瓶瓶盖，炼苗10天，再洗净组培苗根部的琼脂，之后将其移栽到淋湿的珍珠岩基质中，向小苗进行喷雾，覆盖塑料薄膜进行保温保湿，之后几天逐步撤去薄膜进行通风透光，20天后，将其移栽至草炭土:珍珠岩=3:1组成的混合基质中，栽植后浇透水，日常养护注意保证基质湿润。30天后统计羊踯躅成活率为87%。
【主权项】
1.一种羊踯躅叶片再生植株的方法，其步骤包括: (1)暗培养:将羊踯躅无菌苗叶片，用无菌解剖刀在叶片上划刻几刀，接种到预培养基中，暗培养3-7天，其中预培养基为:1/2WPM+1.0?5.0mg/L ΖΤ+0.02?I.0mg/L IBA+20?30g/L 蔗糖+4.0?7.0g/L 琼脂，pH 为 5.2?5.6; (2)分化培养:将步骤(I)叶片接种到分化培养基中进行愈伤组织及芽诱导，其中分化培养基为:WPM+1.0?5.0mg/L ΖΤ+0.02?I.0mg/L IBA+20?30g/L蔗糖+4.0?7.0g/L琼脂，pH为5.2?5.6; (3)继代培养:将步骤(2)叶片接种到继代培养基中继续进行愈伤组织及芽诱导，其中继代培养基为:WPM+1.0?5.0mg/L ΖΤ+0.02?I.0mg/L IBA+20?30g/L蔗糖+4.0?7.0g/L琼脂，pH为5.2?5.6; (4)增殖培养基:将步骤(3)诱导分化的带芽愈伤组织接种到增殖培养上进行增殖培养，增殖培养基为:WPM+0.1 ?2.0mg/L ΖΤ+0.02?I.0mg/L IBA+20?30g/L 蔗糖+4.0?7.(^/1琼脂，？!1为5.2?5.6; (5)生根培养:将步骤(4)增殖的不定芽接种到生根培养基中，接种后光照培养； (6)炼苗移栽:从步骤(5)获得的组培苗中选取根系健壮的植株进行炼苗移栽。2.根据权利要求1所述的羊踯躅叶片再生植株的方法，其特征在于:所述步骤(I)中暗培养条件为温度20?25 °C，湿度40?50%。3.根据权利要求2所述的羊踯躅叶片再生植株的方法，其特征在于:所述步骤(2)中培养条件为:光照12?14h/天，光照强度3000?50001x，温度23?25°C，湿度40?50%，培养至叶片切口处卷曲加剧，开始出现颗粒状的愈伤组织。4.根据权利要求3所述的羊踯躅叶片再生植株的方法，其特征在于:所述步骤(3)中培养条件为:光照12?14h/天，光照强度3000?50001x，温度23?25°C，湿度40?50%，培养至叶片切口处愈伤组织长出不定芽。5.根据权利要求4所述的羊踯躅叶片再生植株的方法，其特征在于:所述步骤(4)中培养条件为:光照12?14h/天，光照强度3000?50001x，温度23?25°C，湿度40?50%，培养至带有不定芽的愈伤组织长出丛生芽。6.根据权利要求5所述的羊踯躅叶片再生植株的方法，其特征在于:所述步骤(5)中生根培养基为:1/3WPM+0.5?4.0mg/L IBA+20?30g//L蔗糖+4.0?7.0g/L琼脂+2g/L活性碳，pH为5.2?5.6，培养至不定芽株高达到3cm以上且生长出须根。7.根据权利要求6所述的羊踯躅叶片再生植株的方法，其特征在于:所述步骤(6)具体为:选择根系健壮且株高达到3.0cm的组培苗，敞开培养瓶瓶盖，炼苗10天，洗净组培苗根部的琼脂，之后将其移栽到淋湿的珍珠岩基质中，向小苗进行喷雾，覆盖塑料薄膜进行保温保湿，随后几天逐步撤去薄膜进行通风透光，20?30天后，将其移栽至草炭土:珍珠岩=3:1组成的混合基质中，移栽操作在温度20?25°C下进行，栽植后浇透水，日常养护注意保证基质湿润。
【文档编号】A01H4/00GK105830917SQ201610173982
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月24日
【发明人】肖政, 苏家乐, 孙晓波, 刘晓青, 李畅
【申请人】江苏省农业科学院