一种稳定、纯合烟草染色体单片段代换系的培育方法
【专利摘要】本发明公开了一种稳定、纯合烟草染色体单片段代换系的培育方法，是以综合形状优良的烤烟种质Y3为轮回亲本，优质烤烟品种K326及抗病雪茄烟品种Beinhart 1000?1为供体亲本，采用杂交、回交及分子标记辅助选择技术，利用构建的烟草遗传连锁图谱获得的分子标记对回交2代及其后续回交世代、自交1代及其后代进行辅助选择，鉴别染色体代换片段特征，获得稳定、纯合烟草染色体单片段代换系。本发明可拓宽烟草品种的遗传基础，快速实现外源优良种质向栽培品种渗透，为烟草的优质、抗病聚合定向改良提供便捷、实用、科学、高效的途径，增加育种过程的选择性，提高育种效率，加快优质、抗病烟草新品种培育与种子产业化进程。
【专利说明】
一种稳定、纯合烟草染色体单片段代换系的培育方法
技术领域
[0001] 本发明属于分子遗传育种技术领域，具体涉及一种稳定、纯合烟草染色体单片段 代换系的培育方法。
【背景技术】
[0002] 烟草是我国重要的经济作物之一，育种工作取得了一定成绩，但与K326等国外引 进的优良品种相比仍有一定差距，无法完全满足国内烟叶生产对品种的需求(王元英，周 健.中美主要烟草品种亲源分析与烟草育种.中国烟草学报，1995,13(5): 11-22)。烟草的 产量、品质和抗性等重要育种目标性状绝大部分为多基因控制的数量性状，遗传方式复杂， 受多基因位点和环境的共同影响，且数量性状位点(QTL)鉴定难度较大(Tong Z J，et al. Mapping of quantitative trait loci conferring resistance to brown spot in flue-cured tobacco (Nicotiana tabacum L.). Plant Breeding, 2012， 131(2): 335-339)。利用传统的分离群体进行QTL定位时，因为数量性状本身复杂及分离群体遗传背景复 杂，很难取得满意结果。染色体片段代换系（chromosome segment substitution lines， CSSLs)是在受体的遗传背景中代换某个或某些供体亲本的染色体片段，并利用回交和分子 标记辅助选择(MAS)技术建立的覆盖作物整个基因组的一系列近等基因系（廖长见等.作 物染色体导入系的构建及其应用.分子植物育种，2007，5(6): 139-144)。与分离群体相比， 因其具有遗传背景简单、群体遗传稳定、QTL定位及遗传效应分析准确等优点而在番茄、油 菜、莴苣、大麦、小麦、棉花、黄瓜和水稻等作物中得到了广泛应用，同时，也是QTL的精确定 位、挖掘和利用新基因资源、实现分子标记技术和作物育种链接的理想材料(王玉民等.作 物单片段代换系的构建及应用.中国农学通报，2008, 24(3) :67-71)。
[0003] 迄今，国内外尚未见烟草染色体片段代换系的相关研究报道。虽然烟草基因组测 序为构建高密度烟草分子标记遗传图谱奠定了基础（Sierro, N, et al. The tobacco genome sequence and its comparison with those of tomato and potato. Nature Communication, 2014, 5:3833 doi: 10.1038/ncomms4833)，但因其遗传基础狭窄、栽培 种间多态性低、QTL定位等基础研究相对落后，且目前仅有的少数QTL定位主要基于初级定 位群体而其结果无法直接应用于烟叶生产中（Tong Z J, et al.. Large-scale development of microsatellite markers in Nicotiana tabacum and construction of a genetic map of flue-cured tobacco. Plant Breeding, 2012, 131(5): 674-680)。鉴于此，开发一种烟草染色体片段代换系是非常必要的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种稳定、纯合烟草染色体单片段代换系的培育方法。
[0005] 本发明的目的是这样实现的，所述的稳定、纯合烟草染色体单片段代换系的培育 方法是以综合形状优良的烤烟种质Y3为轮回亲本，优质烤烟品种K326及抗病雪茄烟品种 Beinhart 1000-1为供体亲本，采用杂交、回交及分子标记辅助选择技术，利用构建的烟草 遗传连锁图谱获得的分子标记对回交2代及其后续回交世代、自交1代及其后代进行辅助选 择，鉴别染色体代换片段特征，获得稳定、纯合烟草染色体单片段代换系。
[0006] 本发明提供了一种分子标记辅助选择的烟草染色体片段代换系培育方法，选择抗 病的品种和优质的品种作为供体，可拓宽烟草品种的遗传基础，快速实现外源优良种质向 栽培品种渗透，为烟草的优质、抗病聚合定向改良提供便捷、实用、科学、高效的途径，增加 育种过程的选择性，提高育种效率;采用分子标记辅助目标片段选择，消除了遗传背景的干 扰，可实现全基因组、优质基因、抗病基因等的QTL精细定位，具有早期鉴定、快速鉴定及其 高稳定性、精准确性等特点，将加快优质、抗病烟草新品种培育与种子产业化进程。
[0007] 本发明利用优质烤烟品种K326和抗病雪茄烟品种Beinhart 1000-1为供体亲本， 优良烤烟品种Y3为受体亲本，经多代回交、自交，并结合SSR标记辅助选择构建一套烟草染 色体片段代换系，可拓宽烟草品种的遗传基础，快速实现外源优良种质向栽培品种渗透，为 烟草的优质、抗病聚合定向改良提供新途径，可实现全基因组、优质基因、抗病基因等的QTL 精细定位，加快优质、抗病烟草新品种培育与种子产业化进程。
【附图说明】
[0008] 图1为本发明的烟草染色体片段代换系培育方法流程示意图； 图2-1~图2-4为基于Y3/K326群体构建的烟草SSR标记遗传连锁图谱(YK); 其中，图2-1为YK图谱中第1号至第6号染色体；图2-2为YK图谱中第7号至第12号染色 体;图2-3为YK图谱中第13至18号染色体;图2-4为YK图谱中第19号至24号染色体； 图3-1~图3-4为基于Y3/Beinhart 1000-1群体构建的烟草SSR标记遗传连锁图谱(YB); 其中，图3-1为YB图谱中第1号至第6号染色体；图3-2为YB图谱中第7号至第12号染色 体;图3-3为YB图谱中第13至18号染色体;图3-4为YB图谱中第19号至24号染色体； 图4-1~图4-7为256份代换系的代换片段在烟草基因组上的位置示意图； 其中，图4-1为基于YK图谱上的第1号至第3号染色体上供体导入片段分布情况；图4-2 为基于YK图谱上的第4号至第6号染色体上供体导入片段分布情况；图4-3为基于YK图谱上 的第7号至第10号染色体上供体导入片段分布情况;图4-4为基于YK图谱上的第11号至第14 号染色体上供体导入片段分布情况；图4-5为基于YK图谱上的第15号至第18号染色体上供 体导入片段分布情况；图4-6为基于YK图谱上的第19号至第21号染色体上供体导入片段分 布情况;图4-7为基于YK图谱上的第22号至第24号染色体上供体导入片段分布情况。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以 限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0010] 本发明所述的稳定、纯合烟草染色体单片段代换系的培育方法，是以综合形状优 良的烤烟种质Y3为轮回亲本，优质烤烟品种K326及抗病雪茄烟品种Beinhart 1000-1为供 体亲本，采用杂交、回交及分子标记辅助选择技术，利用构建的烟草遗传连锁图谱获得的分 子标记对回交2代及其后续回交世代、自交1代及其后代进行辅助选择，鉴别染色体代换片 段特征，获得稳定、纯合烟草染色体单片段代换系。
[0011 ] 所述的抗病雪前烟品种Beinhart 1000-1是一种抗多种病害的品种，可抗黑腔病 0、1号生理小钟和抗赤星病。
[0012] 所述构建的烟草遗传连锁图谱是以优良烤烟品种Y3为轮回亲本，分别与优质烤烟 品种K326和抗病雪茄烟品种Beinhart 1000-1为供体亲本进行杂交、回交，以获得的BC1F1 为作图群体，构建两张基于SSR标记的遗传连锁图谱。
[0013] 所述的两张基于SSR标记的遗传连锁图谱为Y3/K326为亲本的遗传连锁图谱(YK图 谱)和Y3/Beinhart 1000-1为亲本的遗传连锁图谱(YB图谱），Y3/K326为亲本的遗传连锁图 谱（YK图谱）包含了626个SSR标记，覆盖烟草全基因组的长度为1120.45 cM cm; Y3/ Beinhart 1000-1为亲本的遗传连锁图谱(YB图谱)包含了562个SSR标记，覆盖烟草全基因 组的长度为1341.18cm〇
[0014]所述的鉴别染色体代换片段特征是从BC2F1开始对导入的供体片段进行筛选，即 在已构建的两张烟草遗传图谱的24个连锁群上每隔10~20 cM cm选取一个标记，对两个群 体中的各单株分别进行代换片段的追踪和检测，对仅含有1个代换片段的单株直接自交纯 化建立单片段代换系，而对含有多个供体染色体片段(>5个片段）的单株仍需继续回交，并 利用分子标记辅助选择进行筛选。
[0015]所述的烟草染色体单片段代换系是利用已构建的两张烟草图谱中共有的416个 SSR标记从BC4F1开始对单株中的代换片段进行追踪和检测，对仅含有1个代换片段的单株 直接自交纯化建立单片段代换系，而对含有多个供体染色体片段(> 5个片段）的单株仍需 继续回交、并利用分子标记辅助选择进行筛选，直至筛选获得稳定、纯合的具有烤烟Y3遗传 背景、并渐渗有K326和Beinhart 1000-1染色体片段的代换系群体。
[0016]下面以具体实施案例对本发明做进一步说明： 1、 亲本材料 三份烟草材料均是由云南省烟草农业科学研究院提供(表1)。受体亲本Y3,也是轮回亲 本，是综合性状优良的烤烟种质资源，该资源生育期适中、株型优良、节距较大、叶数多且 宽、鲜烟叶柔软，但叶片较薄、香气质中等、香气量欠足且易感烟草黑胫病和赤星病等叶斑 病害。供体亲本K326香气质好、香气量足、燃烧性强，是目前世界上种植区域最广、种植面积 较大的烤烟品种。供体亲本Beinhart 1000-1是叶片肥厚且抗烟草黑胫病0、1号生理小种和 赤星病的雪茄烟品种。培育烟草染色体片段代换系方法流程见附图1。
[0017]表1用于构建染色体片段代换系的亲本材料的来源、类型及特性
2、 遗传图谱的构建 (1)样品米集 2013年9月在云南省烟草农业科学研究院的实验基地温室内采集三个亲本、两个F1和 两个BC1F1群体(Y3/K326和Y3/Beinhart 1000-1)单株的新鲜幼嫩叶片，其中每个群体随机 采集213个单株，采样时，应尽量迅速的将单株的鲜嫩叶片放于液氮中，然后放置于-80°C的 超低温冰箱中以备DNA提取之用。
[0018] (2)DNA的提取和纯化 在Maguire 等（Maguire T， Collins G， Sedgley M. A modified CTAB DNA extraction procedure for plants belonging to the family proteaceae. Plant Molecular Biology Reporter, 1994，12:106-109.)所提供的CTAB法基础上稍加改良进 行的。
[0019] (3)PCR 扩增 SSR-PCR反应体系为：PCR扩增体系为20uL，其中包含2.0yL的lXbuffer (10 mM Tris-Cl, pH=8.4， 50 mM KC1, 1.5 mM MgCl2)，200iiM 的dNTPs(Takara Biotechnology Co. Ltd., Dalian, China)，0.5 yM 的上下游引物（Takara)，1.0 U 的rTaq聚合酶 (Takara)，20-50 ng模板DNA，最后用ddH20补齐20 uL。
[0020] PCR反应程序为:95°C预变性5分钟，30个循环(95°C变性30秒，复性30s，72°C延伸 30s)，72°C延伸5分钟，4°C保存。
[0021] PCR扩增产物检测:PCR扩增产物加1/6体积的6 X Loading Buffer，取2.5yL利用 6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(non-denaturing PAGE，220V，3.5h)在DYY-12型电泳仪(北京 六一厂)上电泳分离，然后参照Xu等（许绍斌等，简单快速的DNA银染和胶保存方法.遗传， 2002，24(3):335-336.)的方法进行银染检测。
[0022] (4)遗传图谱的构建 首先，将多态性SSR标记在BC1F1单株的电泳图转化成数据。也即将具有亲本Y3带型记 为a，具有杂合基因型(F1)带型的记为h，缺失的记为u。其次，根据BC1F1群体的分离比例，对 所获得的分子标记分离数据进行卡方测验，分析标记是否符合1:1的分离比例。再次，利用 作图软件JoinMap? v 4.0(Van Ooijen JW. JoinMap? 4.0，Software for the 90 calculation of genetic linkage maps in experimental populations. Kyazma B.V, Wageningen, 2006.)分析符合1:1分离比例的标记间的遗传连锁关系。在基于L0D从2.0到 10.0逐渐增加的条件下，采用软件中的Grouping Module将参试的标记大致划分为24个连 锁群。利用Regression Mapping算法，对各连锁群上标记的顺序和标记间的遗传距离进行 了计算，相关的参数设置如下：Kosambi's mapping function (Kosambi DD. The estimation of map distance from recombination values. Ann. Eugen, 1994, 12: 172-175.)； Goodness-of-fit Jump threshold for removal loci = 5.0；Number of added loci after which to perform a ripple = 1; Recombination frequency < 0.35;10〇8。〇代2 2.0和！11；^(11'〇1111(1 = ￥68。最后，利用]〇;[11]\^卩?和]\^卩〇1&1'1：￥2.22 (Voorrips RE. MapChart: Software for the graphical presentation of linkage maps and QTLs. The Journal of Heredity, 2002，93 (1):77-78.)软件绘制该连锁图 谱。基于Y3/K326和Y3/Beinhart100 0-1两个BC1F1作图群体而构建的两张遗传连锁图谱(YK 图和YB图）的详细信息如附图2和图3。
[0023] 3、单株中导入供体片段的追踪、检测 2014年1月（BC2F1)开始对导入的供体片段进行筛选，即在前期已构建的两张烟草遗传 图谱的24个连锁群上每隔10-20 cM选取一个标记，共计100个SSR标记，对两个群体中的各 单株分别进行代换片段的追踪和检测，对仅含有1个代换片段的单株直接自交纯化建立单 片段代换系，而对含有多个供体染色体片段(>5个片段）的单株仍需继续回交并利用MAS进 行筛选。2014年6月，将从BC2F1挑选出的240个株系(每个群体120个株系）播种组成1200株 BC3F1群体。2014年12月，从1200个BC3F1株系中筛选出240个株系并种植成1200株BC4F1群 体。2015年3月，利用已构建的两张烟草图谱中共有的416个SSR标记对1200株BC4F1单株进 行代换片段的追踪和检测。至2015年10月，筛选获得256个含有1-5个供体片段的烟草染色 体片段代换系并将其进行自交得到BC4F2群体。2016年3月，再利用416个标记对1280个 BC4F2单株(每个株系随机选5株)进行供体片段的追踪和检测，直至筛选获得稳定、纯合的 烟草染色体(单）片段代换系。通过4个世代(BC2F1、BC3F1、BC4F1和BC4F2)的分子标记辅助 选择，筛选出由256个单株组成的一套分别含有烤烟K326和雪茄烟Beinhart100 0-1导入片 段的烤烟染色体片段代换系（附图4)。其中，含有K326片段的代换系有131个株系，含有 Beinhart 1000-1片段的代换系有125个株系。在筛选出的256份BC4F1单株中，单片段代换 单株有31个，2-4片段代换单株有183个，5片段代换单株有42个。其中，具有烤烟K326片段的 代换系中，单片段代换单株有17个，2-4片段代换单株有95个，5片段代换单株有19个;具有 雪茄烟Beinhart 1000-1片段的代换系中，单片段代换单株有14个，2-4片段代换单株有88 个，5片段代换单株有23个。烟草基因组导入的377个代换片段总长度为2922.57 cM，长度范 围为0.05-36.88 cM，平均长度为7.75 cM，最长的代换片段位于第13号连锁群上，最短的代 换片段位于第20号连锁群上的中下部。377个代换片段在烟草24条连锁群上的分布不等，各 连锁群平均导入15-16个片段。代换片段在烟草基因组24条连锁群上覆盖了 1114.32 cM的 距离，覆盖率为 99 ? 45%( 1114 ? 32/1120 ? 45)。
【主权项】
1. 一种稳定、纯合烟草染色体单片段代换系的培育方法，其特征在于所述的稳定、纯合 烟草染色体单片段代换系的培育方法是以综合形状优良的烤烟种质Y3为轮回亲本，优质烤 烟品种K326及抗病雪前烟品种Beinhart 1000-1为供体亲本，采用杂交、回交及分子标记辅 助选择技术，利用构建的烟草遗传连锁图谱获得的分子标记对回交2代及其后续回交世代、 自交1代及其后代进行辅助选择，鉴别染色体代换片段特征，获得稳定、纯合烟草染色体单 片段代换系。2. 根据权利要求1所述的稳定、纯合烟草染色体单片段代换系的培育方法，其特征在于 所述的抗病雪茄烟品种Beinhart 1000-1是一种抗多种病害的品种，可抗黑胫病0、1号生理 小钟和抗赤星病。3. 根据权利要求1所述的稳定、纯合烟草染色体单片段代换系的培育方法，其特征在于 所述构建的烟草遗传连锁图谱是以优良烤烟品种Y3为轮回亲本，分别与优质烤烟品种K326 和抗病雪茄烟品种Beinhart 1000-1为供体亲本进行杂交、回交，以获得的BC1F1为作图群 体，构建两张基于SSR标记的遗传连锁图谱。4. 根据权利要求3所述的稳定、纯合烟草染色体单片段代换系的培育方法，其特征在于 所述的两张基于SSR标记的遗传连锁图谱为Y3/K326为亲本的遗传连锁图谱和Y3/Beinhart 1000-1为亲本的遗传连锁图谱，Y3/K326为亲本的遗传连锁图谱包含了626个SSR标记，覆盖 烟草全基因组的长度为1120.45 〇1〇11;￥3/8611111&竹1000-1为亲本的遗传连锁图谱包含 了562个SSR标记，覆盖烟草全基因组的长度为1341.18cm。5. 根据权利要求1所述的稳定、纯合烟草染色体单片段代换系的培育方法，其特征在于 所述的鉴别染色体代换片段特征是从BC2F1开始对导入的供体片段进行筛选，即在已构建 的两张烟草遗传图谱的24个连锁群上每隔10~20 cM cm选取一个标记，对两个群体中的各 单株分别进行代换片段的追踪和检测，对仅含有1个代换片段的单株直接自交纯化建立单 片段代换系，而对含有多个供体染色体片段的单株仍需继续回交，并利用分子标记辅助选 择进行筛选。6. 根据权利要求1所述的稳定、纯合烟草染色体单片段代换系的培育方法，其特征在于 所述的烟草染色体单片段代换系是利用已构建的两张烟草图谱中共有的416个SSR标记从 BC4F1开始对单株中的代换片段进行追踪和检测，对仅含有1个代换片段的单株直接自交纯 化建立单片段代换系，而对含有多个供体染色体片段的单株仍需继续回交、并利用分子标 记辅助选择进行筛选，直至筛选获得稳定、纯合的具有烤烟Y3遗传背景、并渐渗有K326和 Beinhart 1000-1染色体片段的代换系群体。
【文档编号】A01H1/02GK105850722SQ201610276479
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】童治军, 肖炳光, 陈学军, 焦芳婵, 曾建敏, 方敦煌
【申请人】云南省烟草农业科学研究院