用于玉米基因渗入的性状堆叠策略的制作方法
【专利摘要】提供了一种方法来减少将3个或更多个期望性状从供体植物系渗入优良植物背景中所需的时间。该方法包括杂交两个供体植物，其中每一个供体植物已经被回交从而具有高的轮回亲本百分比，并共有一个待渗入到优良植物背景内的期望基因座。
【专利说明】用于玉米基因渗入的性状堆叠策略
[0001] 相关专利申请相互参考
[0002] 本申请要求根据35US巧119 (e)获得2013年12月30日提交的美国临时专利申请系 列号61/921,681的利益，其全部公开内容通过引用并入本文。
[000；3]背景
[0004] 植物育种是生产具有新组合期望特征的植物的技术和科学。植物育种可W通过许 多不同的技术实现，从简单地选择具有期望特征的植物用于繁殖，到更复杂的分子技术。虽 然分子生物学已经取得了长足进步，并具备了产生转基因植物的能力，但传统的植物育种 方法在植物品种开发中仍然具有一席之地。传统植物育种方法的一个重要用途设及利用回 交程序将转基因从在转化中使用的良好组织培养栽培种转移到优良的实验品系或栽培种。 对于许多作物，一旦转基因处于作物物种中，杂交转化优良品系便会比重组技术更加高效， 因为大部分转化方案是专为特定的实验室品系优化的(往往适应性较差并且产量较低）。很 多优良品系(高产的)并不适于转化。因此，遗传工程师通常转化实验室品系，而育种师将转 基因从实验室品系回交到优良品系中。
[0005] 然而，标准回交育种方法是费时的。为了将Ξ个基因渗入到优良近交种质中，从开 始到产生种子通常需要4年。因此，需要能够减少运个时间框的回交育种新方法。当有Ξ个 或更多个转基因事件要渗入轮回亲本时，本公开提供的方法可W省略一代或多代回交，并 为更多、更快地增加亲本种子创造条件。
[0006] 概要
[0007]根据一个实施方案，提供了改良的回交育种方法，其可W减少将Ξ个或更多个堆 叠性状或核酸区段渗入到优良近交植物系内所需的时间。在一个实施方案中，该方法包括 回交两个供体植物，其中运两个供体植物各自包含Ξ种共同的期望堆叠转基因事件中的一 种，并且每个供体已经与相同的轮回亲本进行了回交，从而产生具有高的轮回亲本百分比 并携带来自供体的感兴趣基因的回交供体系。然后，将两个回交供体系(每一个具有一组不 同的来自供体的基因）进行杂交，W产生包含最初存在于两个供体亲本系中的Ξ个转基因 事件并且轮回亲本百分比为至少94%的后代。
[000引在一个实施方案中，用于将Ξ个或更多个转基因事件从两个供体系基因渗入到单 个轮回植物种质内的方法包括:将第一供体/轮回植物与第二供体/轮回植物杂交，其中该 第一供体/轮回植物包含第一转基因事件和第二转基因事件，该第二供体/轮回植物包括所 述第二转基因事件和第Ξ转基因事件，两个供体/轮回植物均具有轮回植物基因组的大于 80%。在杂交两个供体/轮回植物之后，对产生的植物后代进行检查，W鉴定和选择包含所 述第一、第二和第Ξ转基因事件者。在一个实施方案中，所述第一供体/轮回植物和所述第 二供体/轮回植物是作为平行的植物系生成的，其中该第一供体植物和第二供体植物分别 与相同的轮回植物杂交，W分别产生第一后代和第二后代，其中所述第一供体植物包括所 述第一转基因事件和所述第二转基因事件，而所述第二供体植物包括所述第二转基因事件 和所述第Ξ转基因事件。然后，通过将所述第一植物后代和所述第二植物后代与所述轮回 亲本植物杂交，分别产生第一和第二回交植物，从而产生一个或多个回交世代。然后将第一 和第二回交植物与所述轮回植物回交，分别产生第一供体/轮回植物(包括所述第一转基因 事件、第二转基因事件，并具有轮回植物基因组的大于80%)和第二供体/轮回植物(包括所 述第二转基因事件、第Ξ转基因事件，并具有轮回植物基因组的大于80%)。在一个实施方 案中，在每次供体转换内用轮回植物进行的至少一个杂交中，轮回亲本植物是雌性植物。
[0009] 在一个实施方案中，提供了用于将Ξ个或更多个转基因事件基因渗入到轮回植物 种质内的方法，所述方法包括：
[0010] a)提供第一供体植物，其包括至少两个转基因事件的第一堆叠；
[0011] b)将该第一供体植物与选定的轮回亲本植物杂交，W产生包含该第一堆叠的转基 因事件的第一 F1后代植物；
[0012] C)将第一 F1后代植物与轮回亲本植物进行第一育种回交，并选择包含所述第一堆 叠的转基因事件的第一育种回交后代植物；
[0013] d)将所选第一育种回交后代与轮回亲本植物连续回交一次或多次，W产生包含所 述第一堆叠的转基因事件的BC2或更高代的第一回交后代植物；
[0014] e)选择包含至少2个转基因事件的第二堆叠的第二供体植物，其中所述第二堆叠 的转基因事件中的至少一个也存在于所述第一堆叠的转基因事件中；
[0015] f)将所述第二供体植物与选定的轮回亲本植物杂交，W产生包含所述第二堆叠的 转基因事件的第二F1后代植物；
[0016] g)将第二F1后代植物与轮回亲本植物进行第二育种回交，并选择包含所述第二堆 叠的转基因事件的第二育种回交后代植物；
[0017] h)将选定的第二育种回交后代与轮回亲本植物连续回交一次或多次，W产生包含 第二堆叠的转基因事件的BC2或更高代的第二回交后代植物；
[0018] i)将所述BC2或更高代的第一回交后代与所述BC2或更高代的第二回交后代杂交 W产生第Ξ后代植物，该第Ξ后代植物包含来自所述第一和第二堆叠的转基因事件的Ξ个 独特的转基因事件。
[0019] 附图简述
[0020] 图1.用于将Mon 88017和Mon89034与TC1507-起堆叠到优良种质中并回收98%轮 回亲本基因组的性状转换策略的示意图。
[0021] 图2.提供了用于Monl7(Mon88017: :TC1507)和Mon89(Mon88017: :Mon890：M)的平 行转换的BC2和BC3后代的标志物辅助选择方案的流程图。
[0022] 图3.提供了用于BC2的标志物辅助选择方案的流程图。
[0023] 图4.提供了用于BC3的标志物辅助选择方案的流程图。
[0024] 图5.提供了用于堆叠世代的标志物辅助选择方案的流程图。
[00巧]详细说明
[0026] 定义
[0027] 在本发明的描述和权利要求中，下列术语将根据下文提出的定义使用。
[0028] 如本文所使用的，术语"约"意思是大于或小于所述数值或数值范围的10%，但并 不意图将任何数值或数值范围仅指定于运个较广的定义内。前面有术语"约"的每个数值或 数值范围还意图包括所述绝对数值或数值范围的实施方案。
[0029] 如本文所使用的，术语"植物"包括整个植物和任何后代、细胞、组织或植物部分。 术语"植物部分"包括植物的任何部分，包括例如但不仅限于:种子(包括成熟的种子和不成 熟的种子）；植物插枝;植物细胞;植物细胞培养物;植物器官(例如，花粉、胚、花、果实、芽、 叶、根、茎和外植体）。植物组织或植物器官可W是种子、原生质体、愈伤组织，或者任何其它 可组织成结构或功能单元的植物细胞群。植物细胞或组织培养物可能能够再生具有该细胞 或组织所得植物的生理学和形态学特征的植物，W及再生具有与该植物基本上相同基因型 的植物。与此相反，某些植物细胞不能够再生产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生 细胞可W是胚，原生质体，分生细胞，愈伤组织，花粉，叶，花药，根，根尖，须，花，果仁，穗，穗 轴，壳，或茎。
[0030] 如本文所使用的，术语"天然的"或"自然的"定义了在自然界中发现的条件。"天然 DNA序列"是自然界中存在的DNA序列，其通过自然手段或传统育种技术产生，而不是通过遗 传工程化(例如，使用分子生物学/转化技术)产生。
[0031] 如本文所使用的，"内源序列"定义处于生物体的自然位置或者处于生物体基因组 内的多核巧酸、基因或多肤的天然形式。
[0032] 如本文所使用的，术语"分离的"意思是已从其自然环境中移出。
[0033] 如本文所使用的，术语"纯化的"定义分子或化合物的分离形式，该分子或化合物 实质上游离于在天然或自然环境中通常与之相伴随的污染物，并意味着由于和原始组合物 的其它组分分离而导致纯度增加。术语"纯化的核酸"在本文中用于描述与其它化合物分离 的核酸序列，包括但不仅限于，多肤、脂和碳水化合物。
[0034] 如本文所使用的，术语"外源DNA序列"是任何核酸序列，其已经从其自然位置移出 并插入到新的位置内，从而改变了被移出核酸序列两侧的序列。例如，外源DNA序列可W包 括来自另一物种的序列。
[0035] 如本文所使用的，"(经过)修饰的内源序列"是内源核酸序列的改变，包括内源基 因组序列的删除、插入、取代和重排，包括插入外源DNA序列。
[0036] 如本文所使用的，术语"转基因事件"意图指示编码一个或多个期望性状的基因 座。转基因事件可W包括代表单一改变的修饰内源序列，或者可W包括一系列共同分离的 修饰内源序列，包括例如，一个或多个紧密连锁的外源序列，其可W含有一个或多个转基 因。
[0037] 如本文所使用的，术语"(基因）渗入"指一个物种、变体或栽培种的性状、基因或 DNA序列通过与另一个物种、变体或栽培种杂交而被转移到该另一个物种、变体或栽培种的 基因组中的自然和人工过程，W及所得到的事件。运个过程任选地可W通过与轮回亲本回 交实现。基因渗入的实例包括基因、转基因、调节元件、标志物、性状、性状基因座或染色体 区段从一个植物的基因组进入或被引入另一个植物的基因组中。
[0038] "基因座"是指基因或DNA序列在基因组中的特定位置。基因座可W指特定的性状， 并可W存在于细胞核、叶绿体或线粒体DNA中。
[0039] 如本文所使用的，术语"轮回亲本"或"轮回植物"描述在杂交中作为受体植物系的 优良品系，其将被用作连续回交的亲本系W产生最终的期望品系。
[0040] 如本文所使用的，术语"杂交"是指雌性植物(或配子)被雄性植物(或配子)授精。 术语"配子"是指植物中通过减数分裂从配子体产生的单倍体生殖细胞(卵或花粉），并参与 有性繁殖，其中两个相反性别的配子融合形成二倍体合子。该术语一般包括花粉(包括精细 胞)和胚珠(包括卵）。因此，"杂交"一般指一个个体的胚珠从另一个个体的花粉受精，而"自 交"通常定义某一个体的胚珠从来自同一个体的花粉受精。当在实现基因组区域或区段的 基因渗入的语境中提到杂交时，技术人员会理解，为了实现一个植物仅一部分染色体基因 渗入到另一个植物的染色体中，两个亲本系的基因组的随机部分会在杂交过程中重组，运 是由于在亲本系中产生配子时会出现交换事件。因此，双亲的基因组通过杂交一定会被组 合在单个细胞内，在从该细胞产生配子之后，它们在受精中的融合将产生基因渗入事件。
[0041] 如本文所使用的，术语"受体"（recipient)是指从供体接受性状、转基因事件或基 因组区段的植物或植物系，受体自身可W具有或者不具有处于杂合或纯合状态的所述性 状、转基因事件或基因组区段。
[0042] 如本文所使用的，术语"育种系"或"优良系"是指具有商业上有价值的或者农学上 期望特征的栽培植物系，与野生型品种或具有和实验操作相关的有益品质的品种相对。该 术语也指称优良植物系，后者代表基本上纯合的，即近交或加倍单倍的植物系，用于产生F1 植物。
[0043] 如本文所使用的，术语"F1"意思是两个在遗传上不相似的个体之间杂交的任何后 代。
[0044] 如本文所使用的，术语"供体"是指性状、转基因事件或基因组区段所来源的植物 或植物系，并且该供体的所述性状、基因渗入或基因组区段可W处于杂合或纯合状态。
[0045] 如本文所使用的，术语"回交"定义了F1植物与其中一个原始亲本的杂交。回交用 于保持一个亲本(物种）的身份（identity),并纳入来自第二亲本(物种）的特定性状。如本 文所使用的，术语"回交世代"是指回交的后代。
[0046] 如本文所使用的，术语"自交的"（selfed)定义两个遗传上相同的植物的杂交。通 常，术语"自交的"定义了自花授粉事件，并且包括胚珠和花粉来自相同的植物或植物系的 受精过程。
[0047] 如本文所使用的，术语"轮回亲本百分比"是指回交后代植物与回交中使用的轮回 亲本植物相同的百分比。与轮回亲本的百分比同一性可W通过测量遗传标志物，例如RFLP， 而实验地加 W确定，或者可W根据数学公式理论计算。
[0048] 如本文所使用的，术语"后代"是指从杂交或自交产生的任何后代。
[0049] 如本文所使用的，术语"鉴定"是指证明植物的身份，或者区分植物的特征(例如显 示某些性状)的过程。
[0050] 如本文所使用的，术语"选择"是指从一群个体中炼选某些个体植物的过程，通常 是根据该个体的特定身份。
[0051] 如本文所使用的，术语"标志物辅助选择"是指一种诊断性的鉴定过程，任选地后 续W分子标志物的存在作为诊断特征或选择标准，从一群植物中选择某个植物。该过程通 常设及在某个植物的基因组中检测某些核酸序列或多态性的存在。
[0052] 如本文所使用的，术语"分子标志物"定义在方法中用于可视化核酸序列特征差异 的指标。运些指标的实例有：限制性片段长度多态性(RFLP)标志物，扩增片段长度多态性 (A化P)标志物，单核巧酸多态性（SNP)，微卫星标志物（例如SSR)，序列表征的扩增区域 (SCAR)标志物，分子标志物的下一代测序(NGS)，酶切扩增多态性序列(CAPS)标志物或同工 酶标志物，或本文所述标志物的组合，其可界定特定的遗传和染色体位置。
[0053] 如本文所使用的，术语"基因"是指由DM序列构成的遗传单位，其占据染色体上的 特定位置并含有关于生物体的特定特征的遗传指令。因此，术语"基因"包括核酸(例如DNA 或RNA)序列，其包括产生RNA、多肤或其前体所需的编码序列。功能性多肤可W由全长编码 序列或者由编码序列的任何部分编码，只要保留该多肤的期望活性或功能性质(例如，酶活 性，配体结合，信号转导等)即可。
[0054] 实施方案
[0055] 回交或家系选择是育种者向优良育种系添加期望的农学性状的一种方法。该方法 设及育种系与表达期望性状的品系杂交，随后将表达该性状的后代植物与轮回亲本回交。 本公开设及将Ξ个或更多个期望转基因事件基因渗入到优良植物种质内的改良方法。在一 个实施方案中，该方法包括平行制备两个供体系，其中运些供体系包括至少一个共享的待 转移到优良种质内的期望转基因事件。运两个供体系最初根据具有某些期望的可遗传性状 而被选择。随后将该第一和第二供体系与优良品系杂交W产生F1后代。分别对第一和第二 F1后代进行分析，并从两个品系各自选择出具有期望的堆叠转基因事件的植物，将运些植 物分别与轮回亲本回交，产生具有期望性状并具有原始优良品系的基本上全部生理学和形 态学特征的第一和第二回交后代植物。在一个实施方案中，至少一个所述回交步骤将使用 雌性轮回亲本植物进行。
[0056] 在一个实施方案中，通过与轮回亲本回交产生的最终第一和第二供体植物将包括 期望的堆叠转基因事件，并将会显示高的轮回亲本百分比（RPP)。理论RPP可W用简单的公 式，根据所实施的回交的次数进行计算。如果用于回交的亲本是纯合的，那么N代回交后的 轮回亲本百分比是1-(1/2)Μ+?χ 100。因此，需要6个回交世代才能获得大于99%的轮回亲本 百分比。用限制性片段长度多态性(RFLP)标志物对回交后代进行分析，是一种分析结果、并 将近交的理论量与观察到的近交实际水平相比较的方法。其它分子标志物也能够用于评估 RPP，包括例如，扩增片段长度多态性(Α化Ρ)标志物，单核巧酸多态性(SNP)，微卫星标志物 (例如SSR)，序列特征性扩增区域(SCAR)标志物，酶切扩增多态性序列(CAPS)标志物或同工 酶标志物，或其组合。下一代测序(NGS)技术也可W用于覆盖整个基因组。
[0057] 在一个实施方案中，将Ξ个转基因事件基因渗入轮回亲本内的方法包括平行制备 两个供体系，其中运两个供体系将被与相同的轮回亲本植物回交。所得的两个平行回交的 供体系在它们所含的期望转基因事件上将会有差异，但是它们会各自包含一个共同的转基 因事件，并且两个供体将会具有至少75，85，88，90，94，97或97.5 %的轮回亲本百分比。在一 个实施方案中，两个平行的供体植物系将会各自包含至少两个待基因渗入到优良品系内的 转基因事件，并且至少一个所述待基因渗入的转基因事件将会在两个供体植物中均存在。 [0化引转基因事件
[0059]最初的供体植物系包括至少两个期望的转基因事件，其期望被基因渗入到优良品 系中。在本公开的一个实施方案中，供体植物包含两个或更多个转基因事件，其中运些转基 因事件并不紧密连锁，而且更典型地，位于不同的染色体上。在其它实施方案中，供体植物 包括两个或多个转基因事件，其中运些转基因事件紧密连锁在相同染色体上。每个转基因 事件代表一个或多个期望的序列，它们充分连锁W至于一起分离。在一个实施方案中，转基 因事件是包含导致一个或多个性状表达的遗传组分的基因座。在一个实施方案中，转基因 事件包括一系列调控序列或基因，包括例如，一个或多个插入的外源序列，它们可W含有一 个或多个转基因。包括转基因事件的组分可w包括开放阅读框或经过修饰的内源序列。在 一个实施方案中，转基因事件包括一个或多个基因表达盒，所述基因表达盒进一步包括活 跃转录和/或翻译的基因序列。反过来，转基因事件可W包括运样的多核巧酸序列：其不包 含功能性基因表达盒或完整基因（例如，可W简单地包括调控序列如启动子），或者可W不 包含任何可识别的基因表达元件或任何活跃转录的基因序列。
[0060] 在一个实施方案中，转基因事件包括一个或多个编码除草剂耐受性、昆虫抗性、营 养物、抗生素或治疗性分子的基因。根据一个实施方案，供体植物系包括"堆叠"在供体植物 基因组内的多个转基因事件，其中该转基因事件包括两个或更多个编码可提供农学性状的 序列的基因。可W堆叠在供体植物基因组内的农学性状的实例包括，对草甘麟或其它除草 剂的抗性或耐受性，和/或提供对选定昆虫或疾病的抗性，和/或营养增强，和/或改良的农 学特性，和/或在饲料、食品、工业、医药或其它用途中有用的蛋白质或其它产物。两个或多 个感兴趣的核酸序列(例如，基因）在供体植物基因组内的"堆叠"可W通过，例如，使用两个 或更多个事件进行常规植物育种、用含有感兴趣序列的构建体转化植物、转基因植物再转 化、或者通过同源重组的祀向整合添加新的性状等来实现。
[0061] 根据本公开的转基因事件可W包括的序列包括，但不仅限于，如下实例：
[0062] 1.赋予害虫或疾病抗性的基因或编码序列(例如iRNA)
[0063] (A)植物疾病抗性基因。植物防御经常通过植物中疾病抗性基因(R)的产物与病原 体中相应的无毒性(Avr)基因的产物的特异相互作用而被激活。可W用克隆的抗性基因转 化植物品种，从而工程构建对特定病原体株有抗性的植物。运些基因的实例包括:提供黄枝 抱霉（Cladosporium fulvum)抗性的番茄 Cf-9 基因 （Jones et al.,1994Science 266: 789);，提供下香假单胞杆菌番茄致病变种抗性的番茄Pto基因，其编码一种蛋白激酶 (Madin et al.，1993Science 262:1432)，和提供下香假单胞菌抗性的拟南芥RSSP2基因 (Mindrinos et al.，1994Cell 78:1089)。
[0064] (B)苏云金芽抱杆菌蛋白质、其衍生物或W其为模本的人造多肤，例如化δ-内毒素 基因的多核巧酸序列(Geiser et al.，1986Gene 48:109)和植物杀虫(VIP)基因（见，例如， Estruch et al. (1996)Proc.化tl. Acad. Sci . 93:5389-94)。此外，编码δ-内毒素基因的DNA 分子可W从美国典型培养物保藏中屯、(Rockville，Md.)购得，ATCC登录号为40098,67136， 31995和31998。
[0065] (C)植物凝集素，例如，多种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合性植物凝集素基 因的核巧酸序列（化η Damme et al.，1994Plant Molec.Biol.24:825)。
[0066] (D)维生素结合蛋白质，例如亲和素及亲和素同源物，其可用作针对昆虫类害虫的 杀幼虫剂。见美国专利No. 5，659，026。
[0067] 化)酶抑制剂，例如蛋白酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。运些基因的实例包括水稻半脫 氨酸蛋白质酶抑制剂(Abe et al.，1987J.Biol.畑em.262:16793)，烟草蛋白酶抑制剂I (Huubetal.,1993PlantMolec.Biol.21:985)，和α-淀粉酶抑制剂（Sumitanietal., 1993Biosci.Biotech.Biochem.57:1243)〇
[0068] (F)昆虫特异性激素或信息素，例如蚁皮激素和保幼激素或其变体、基于它们的模 拟物，或其括抗剂或激动剂，例如杆状病毒表达的克隆保幼激素醋酶，保幼激素的失活子 (Hammock et al.,l990Na1:ure 344:458)。
[0069] (G)昆虫特异性肤或神经肤，其在表达时会扰乱受影响的害虫的生理机能 (J.Biol.化em. 269:9)。运些基因的实例包括昆虫利尿激素受体(Regan, 1994)，在太平洋折 翅赚(Diploptera punctata)中鉴定的咽侧体抑制素（allostatin) (Pratt, 1989)，和昆虫 特异性麻搏神经毒素(美国专利No. 5，266，361)。
[0070] 化)在自然界中由蛇、马蜂等产生的昆虫特异性毒液，例如蜗子昆虫毒性肤(Pang, 1992Gene 116:165)。
[0071] (I)负责超富集单祗、倍半祗、酱体、异径朽酸、苯丙烷衍生物或其它具有杀虫活性 的非蛋白质分子的酶。
[0072] (J)参与生物活性分子修饰(包括翻译后修饰）的酶；例如糖酵解酶、蛋白质水解 酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、醋酶、水解酶、憐酸酶、激酶、憐酸化酶、聚合酶、弹 性蛋白酶、几下质酶和葡聚糖酶，无论是天然的还是人造的。运些基因的实例包括马蹄莲 (callas)基因（PCT公开的申请W0 93/02197)，几下质酶编码序列（其可W从例如ATCCW登 录号3999637和67152获得），烟草钩虫几下质酶（Kramer et al.，1993Insect Molec.Biol.23:691)，和欧芹 ubi4-2多聚泛素基因 （Kawalleck et al.，1993Plant Molec.Biol.21:673)。
[0073] 化)刺激信号转导的分子。运些分子的实例包括绿豆巧调蛋白cDNA克隆的核巧酸 序列（Botella et al.，1994Plant Molec.Biol.24:757)，和玉米巧调蛋白cDNA克隆的核巧 酸序列（Griess et al.,1994Plant F*hysiol. 104:1467)。
[0074] (L)疏水矩肤化yho曲obic moment peptide)。见例如美国专利Nos.5,659,026和 5，607，914，后者教导了赋予疾病抗性的人造抗微生物肤。
[0075] (M)膜透性酶，通道形成剂或通道阻断剂，例如杀菌肤-β裂解肤类似物(Jaynes et al.，1993Plant Sci . 89:43)，其使转基因烟草植物对青枯病有抗性。
[0076] (N)病毒侵袭性蛋白质或由其衍生的复杂毒素。例如，在经转化的植物细胞中，病 毒衣壳蛋白的积累可赋予针对该衣壳蛋白所来源的病毒W及相关病毒所致的病毒感染和/ 或疾病发展的抗性。已经给转化植物赋予了衣壳蛋白介导的，针对首猜花叶病毒、黄瓜花叶 病毒、烟草条纹病毒、马铃馨X病毒、马铃馨Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶 病毒的抗性。参见，例如，Beachy et al. (1990)Ann.Rev.F*h}ftopathol.28:451。
[0077] (0)昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素。因此，祀向昆虫肠道关键代谢功能的 抗体可W使受影响的酶失活，杀死昆虫。例如，Taylor等人(1994)，在第屯届国际分子植物- 微生物相互作用研讨会（Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant Microbe Interactions)上的第497号摘要显示了转基因烟草中通过产生单链抗体片段的酶失活。
[0078] (P)病毒特异性抗体。见例如Tavladoraki et al. (1993)化 1:ure 266:469,其显示 了表达重组抗体基因的转基因植物被保护免于病毒攻击。
[0079] (Q)由病原体或寄生物自然产生的发育阻滞(developmen1:a；L-a;rrestive)蛋白质。 因此，真菌内切α-1，4-D多聚半乳糖醒酸酶通过溶解植物细胞壁的均聚-α-1，4-D-半乳糖醒 酸而促进真菌定殖和植物营养素释放化amb et al.,1992)Bio/Technology 10:1436。 1'〇加曰的等（1992口1曰11* J. 2:367)描述了豆类内切多聚半乳糖醒酸酶抑制蛋白的编码基因 的克隆和表征。
[0080] (R)由植物自然产生的发育阻滞(developmental-arrestive)蛋白质，例如大麦核 糖体失活基因，其提供了增加的针对真菌疾病的抗性化ongemann et al.，1992) .Bio/ Technology 10:3305。
[0081 ] (S)RNA干扰，其中用RNA分子抑制祀基因的表达。一个实施例中的RNA分子是部分 或完全双链的，其触发沉默响应，导致dsRNA被切割成小的干扰RNA，它们随后被纳入到祀向 复合体中，祀向复合体破坏同源的mRNA。见例如Fire等人，美国专利6,506,559; Graham等 人，美国专利6,573,099。
[0082] 2.赋予除草剂抗性的基因
[0083] ( A )编码针对抑制生长点或分生组织的除草剂，例如咪挫嘟酬类 (imidazalinone)、横酷苯胺类（3111的11日]1；[11(1日）或横酷脈类除草剂的抗性或耐受性的基 因。运类基因的实例编码一种突变乙酷乳酸合酶(ALSKLee et al.，1988EMB0J.7:1241)， 其也称乙酷径酸合酶(AHALKM化i et al.，1990Theor.Appl.Genet.80:449)。
[0084] (B)-种或多种额外的编码针对草甘麟抗性或耐受性的基因，所述抗性或耐受性 是由突变体EPSP合酶和aroA基因赋予的，或者是通过一些基因如DGT-28，2mEPSPS，GAT(草 甘麟乙酷转移酶)或G0X(草甘麟氧化酶)和其它麟酷基化合物，如草胺麟(pat, bar,和dsm-2 基因），和芳氧基苯氧基丙酸和环己二酬(ACC酶抑制剂编码基因）所致的代谢失活而获得 的。见例如美国专利齡.4,940,835，其公开了可赋予草甘麟抗性的6?5?形式的核巧酸序列。 编码突变体aroA基因的DNA分子能够WATCC登录号39256获得，突变体基因的核巧酸序列在 美国专利No. 4，769，061中公开。欧洲专利申请No. 0 333 033和美国专利No. 4，975，374公开 了可赋予除草剂如レ草锭麟抗性的谷氨酷胺合酶基因的核巧酸序列。欧洲专利申请No.0 242 246提供了草锭麟乙酷转移酶基因的核巧酸序列。De Greef et al.(1989)Bio/ Technology 7:61中描述了表达编码草锭麟乙酷转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物 的产生。赋予针对芳氧基苯氧基丙酸和环己二酬如稀禾定和甲禾灵化aloxyfop)的抗性的 示例性基因是Accl-Sl，Accl-S2和Accl-S3基因，如Marshall et al.( 1992) Theor.Appl .Genet.83:435所述。
[0085] (C)编码针对可抑制光合作用的除草剂例如Ξ嗦(psbA和gs+基因）和节腊(腊水解 酶基因）的抗性的基因。Prz化illaetal.α991)PlantCell3:169描述了使用编码突变 体psbA基因的质粒转化衣藻。在美国专利No. 4，810，648中公开了腊水解酶基因的核巧酸序 列，含有运些基因的DNA分子可W通过ATCC登录号53435、6744巧日67442获得。化yes et al. (1992)81〇油6111.1285:173中描述了编码谷脫甘肤5-转移酶的0臟的克隆和表达。
[0086] (D)编码针对可结合径基苯基丙酬酸二加氧酶化PPD)的除草剂的抗性基因 ，HPPD 是催化对-?基苯基丙酬酸（HPP)转化形成尿黑酸的反应的酶。运包括例如异嗯挫 化P418175，EP470856，EP487352，EP527036，EP560482，EP682659，美国专利No. 5,424，276)， 特别是异嗯挫草酬，其是玉米的选择性除草剂，二酬腊（diketonitrileKEP496630, EP496631)，特别是2-氯基-3-环丙基-1-(2-S02C册-4-CF3苯基）丙烷-1，3-二酬和2-氯基- 3-环丙基-1-(2-S02C 册-4-2，3C12 苯基）丙烷-1，3-二酬，Ξ 酬类化 P625505，EP625508，美国 专利No. 5，506，195)，特别是横草酬、和pyrazolinate等除草剂。在植物中产生过量HPPD的 基因能够提供针对运些除草剂的耐受性或抗性，包括例如美国专利Nos. 6,268,549和6， 245,968和美国专利申请公开No. 20030066102中描述的基因。
[0087] 化)编码针对苯氧基生长素除草剂，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受 性的基因，其也可W赋予针对芳氧基苯氧基丙酸类(ΑΟΡΡ)除草剂的抗性或耐受性。运些基 因的实例包括α-酬戊二酸依赖性的双加氧酶(aad-1)基因，如美国专利No. 7，838，733所述。
[0088] (F)编码针对苯氧基生长素除草剂如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受 性的基因，其也可W赋予针对化晚基氧基生长素除草剂，如氣草烟或绿草定的抗性或耐受 性。运些基因的实例包括α-酬戊二酸依赖性的双加氧酶(aad-12)基因，如W02007/053482- A2所述。
[0089] (G)编码针对麦草畏的抗性或耐受性的基因（见例如美国专利公开 No.20030135879)〇
[0090] 化)编码针对抑制原化嘟原氧化酶(PP0)的除草剂的抗性或耐受性的基因（见美国 专利No. 5,767,373)。
[0091] (I)提供针对可结合光系统II反应中屯、(PS II)核屯、蛋白质的Ξ嗦除草剂(例如莽 去津）和尿素衍生物（如敌草隆）除草剂的抗性或耐受性的基因。见化ussian et al.， (1989)EMB0 J.1989,8(4):1237-1245。
[0092] 3.可赋予或贡献数量叠加性状(化lue Added Trait)的基因
[0093] (A)修饰的脂肪酸代谢，例如通过用反义基因或硬脂酷-ACP去饱和酶转化玉米或 芸苔属植物从而增加植物的硬脂酸含量（K η U 1 t Z 0 η e t a 1 .，1 9 9 2 ) Proc. Nat. Acad.Sci.USA89:2624 〇
[0094] (B)降低的植酸含量
[00巧](1)引入植酸酶编码基因，如黑曲霉植酸酶基因 （Van Hartingsveldt et al.， 1993Gene 127:87)，提高植酸降解，向被转化植物添加更多游离憐酸盐。
[0096] (2)可引入降低植酸含量的基因。在玉米中，运可W通过，例如，克隆然后重新导入 如下所述的单个等位基因的相关DNA来实现:该单个等位基因导致W植酸水平低为特征的 玉米突变体的原因 （Raboy et al.，1990Maydica 35:383)。
[0097] (C)改良的碳水化合物组成，例如通过用编码改变淀粉的分支模式的酶的基因转 化植物而实现。运些酶的实例包括，粘液链球菌(Streptococcus mucus)果糖基转移酶基因 (化iroza et al.,1988)J.Bacte;riol.170:810,枯草芽抱杆菌果聚糖薦糖酶基因 (Steinmetz et al.,1985Mol.Gen.Genel.200:220)，地衣芽抱杆菌α-淀粉酶（Pen et al., 1992Bio/Technology 10:292)，番茄转化酶基因化lliot et al. ,1993)，大麦淀粉酶基因 (Sogaard et al.，1993J.Biol.化em.268:22480)，和玉米胚乳淀粉分支酶iKFisher et al.，1993Plant I^ysiol.102:10450)。
[0098] 在一个实施方案中，转基因事件包括一个或多个选自下组的转基因：杀虫剂抗性 转基因，除草剂耐受性转基因，氮利用效率转基因，水分利用效率转基因，营养质量转基因， DNA结合转基因，和选择性标志物转基因。
[0099] 供体植物
[0100] 根据一个实施方案，选择包含至少两个转基因事件的堆叠组的供体植物。运些供 体植物能够使用标准重组或育种技术或其任何组合来产生。在一个实施方案中，供体植物 包含2,3,4,5,6或更多个堆叠的转基因事件。而且，每个转基因事件可^包括多个紧密连锁 并且一起分离的组分。在一个实施方案中，每个转基因事件包括一系列基因，它们在功能上 有关或者与特定的期望性状相关。供体系的遗传背景有助于创建具有转基因的植物。然而， 为了完全把握与转基因事件相关的性状的利益，必须将转基因事件基因渗入到优良育种系 内。
[0101] 在根据一个实施方案，提供了一种方法来减少在传统回交选择方法学中所需的杂 交次数。该方法包括平行制备两个供体植物系，其中期望用于基因渗入的转基因事件在运 两个供体植物之间分配，运两个供体共享至少一个转基因。在一个实施方案中，第一供体植 物包括第一和第二转基因事件，而第二供体植物包含相同的第二转基因事件和第Ξ转基因 事件。在一个实施方案中，第一供体植物包括第一、第二和第Ξ转基因事件，而第二供体植 物包括相同的第Ξ转基因事件，W及第四转基因事件。在一个实施方案中，第一供体植物包 括第一、第二和第Ξ转基因事件，而第二供体植物包括相同的第Ξ转基因事件，W及第四和 第五转基因事件。在一个实施方案中，第一供体植物包括第一、第二、第Ξ和第四转基因事 件，而第二供体植物包括相同的第Ξ和第四转基因事件，W及第五和第六转基因事件。
[0102] 根据一个实施方案，第一和第二供体植物作为两个不同的系被维持，每个系被与 相同的轮回亲本系回交W产生第一和第二供体系，其每一个具有高轮回亲本百分比。更具 体地，在一个实施方案中，第一和第二供体植物的每一个与相同的优良植物系杂交，并且将 保留期望转基因事件的第一和第二F1后代进一步与轮回亲本系回交，W产生第一和第二回 交后代植物，其包括所述期望的性状和所述优良品系的基本上全部的生理学和形态学特 征，除了来自期望转基因事件的特性之外。所得第一供体/轮回植物可W随后与所述第二供 体/轮回植物杂交，W产生期望的转基因事件被固定在期望的优良植物种质内的后代。
[0103] 根据一个实施方案，提供了用于将Ξ个或更多个转基因事件从供体系基因渗入到 单一优良植物种质内的方法。该方法包括：
[0104] a)提供第一供体/轮回植物，其包括第一转基因事件，第二转基因事件，并且具有 大于80% ,88% ,90% ,94% ,97%或97.5%的轮回亲本百分比；
[0105] b)提供第二供体/轮回植物，其包括所述第二转基因事件，第Ξ转基因事件，并且 具有大于80% ,88% ,90% ,94% ,97%或97.5%的轮回亲本百分比；
[0106] C)将所述第一供体/轮回植物与所述第二供体/轮回植物杂交，W产生后代；
[0107] d)从步骤(C)中培育的植物、或任选地，步骤(C)的植物的自交后代中鉴定和选择 包括所述第一、第二和第Ξ转基因事件的产物植物。
[0108] 根据一个实施方案，第一和第二供体/轮回植物是运样产生的:使最初的第一和第 二供体植物与优良品系杂交，W产生第一和第二F1后代品系。然后，基于具有期望的性状从 第一和第二F1后代选择出一个或多个后代植物，并将它们进一步与轮回亲本平行（即，第一 F1后代和第二F1后代二者作为两个单独的系繁殖)杂交，W产生回交后代植物;随后选择具 有所述期望性状的回交后代植物，并将回交步骤重复一次、两次或更多次，W产生选定的第 二、第Ξ或更高代的回交后代植物，其除了来自供体植物的特性之外，包含期望的性状和基 本上全部的优良品系生理学和形态学特征。根据一个实施方案，在回交中使用的轮回亲本 植物是至少一次所述回交的雌性植物。
[0109] 根据一个实施方案，通过使用标志物辅助选择来筛选和选择包含期望性状的后代 植物。在一个实施方案中，所用的标志物辅助选择技术选自下组:SNP标志物辅助选择，SSR 标志物辅助选择，RFLP标志物辅助选择，RAPD标志物辅助选择，和AFLP标志物辅助选择。下 一代测序(NGS)技术也可W用于在回交过程中覆盖整个基因组。
[0110] 根据一个实施方案，回交供体植物包含与轮回亲本系享有超过80 % ,88% ,90%， 94% ,97%，或97.5%的序列同一性的基因组序列。根据一个实施方案，第一和第二回交供 体植物分别包含少于5cM，lOcM，20cM，25cM，30cM，35cM，40cM，45cM，或50cM的来自第一或第 二供体亲本植物的连锁累寶。根据一个实施方案，回交供体植物包含期望的转基因事件，同 时与轮回亲本植物共有超过88% ,90% ,95% ,97%，或97.5%的分子标志物。在一个实施方 案中，回交供体植物包含期望的转基因事件，同时具有基本上全部的优良品系生理学和形 态学特征。
[0111] 根据一个实施方案，提供了包含至少2个转基因事件的第一堆叠的第一供体植物， 并且将该第一供体植物与选定的轮回亲本植物杂交，产生包含所述转基因事件的第一堆叠 的第一 F1后代植物。用第一 F1后代植物与轮回亲本植物进行第一育种回交，并且选择包含 所述转基因事件的第一堆叠的第一育种回交后代。然后将第一育种回交后代与所述轮回亲 本植物连续回交一次或多次，W产生包含所述转基因事件的第一堆叠的BC2、BC3或BC4或更 高代的第一回交后代植物。根据一个实施方案，一次或多次所述回交是使用雌性轮回植物 进行的。
[0112] 按照相似的方式，选择包括至少2个转基因事件的第二堆叠的第二植物，其中该第 二堆叠中的至少一个转基因事件也存在于所述第一供体植物的转基因事件的第一堆叠中。 将第二供体植物与相同的选定轮回亲本植物杂交W产生第一 F1后代植物。此杂交产生了包 含所述转基因事件的第二堆叠的第二F1后代植物。用第二F1后代植物与轮回亲本植物进行 第二育种回交，并且选择包含所述转基因事件的第二堆叠的第二育种回交后代。然后将第 二育种回交后代与所述轮回亲本植物连续回交一次或多次，W产生包含所述转基因事件的 第二堆叠的BC2、BC3或BC4或更高代的第二回交后代植物。根据一个实施方案，一次或多次 所述回交是使用雌性轮回植物进行的。
[0113] BC2、BC3或BC4或更高代的第一和第二回交后代植物将具有高的轮回亲本百分比， 与轮回亲本植物共有大于88%，90%，95%，97%或97.5%的分子标志物，并且/或者分别来 自第一或第二供体亲本植物的连锁累寶少于20cM。然后将BC2、BC3或BC4或更高代的第一回 交后代植物与BC2、BC3或BC4或更高代的第二回交后代植物杂交，W产生第Ξ后代植物，其 包含来自所述转基因事件第一和第二堆叠的独特的Ξ个(或更多个)转基因事件。任选地， 将所述第Ξ后代植物自交或者与轮回亲本回交，同时选择包含期望的基因渗入的转基因事 件的后代植物。在一个实施方案中，第Ξ后代植物具有至少97.5%的轮回亲本百分比。在一 个实施方案中，一个或多个所述转基因事件W纯合状态被固定在最终的育种系中。在一个 实施方案中，所述转基因事件全部W纯合状态被固定。在一个实施方案中，包含基因渗入的 期望转基因事件的植物W及轮回亲本种质包含少于5cM，10cM，15cM，20cM，25cM，30cM, 35cM，40cM，45cM，或50cM的来自第一和/或第二供体亲本植物的连锁累寶。
[0114] 根据一个实施方案，包含期望转基因事件的植物和轮回亲本种质可W和紧密亲缘 的物种而非相同的物种杂交。例如，在一个实施方案中，玉米植物可W和亲缘的植物，例如 类蜀泰(teosinte)，杂交。并且/或者，在一个实施方案中，包含期望转基因事件的第一和第 二供体植物可W来自紧密亲缘的但不相同的物种。
[0115] 根据一个实施方案，所述的将Ξ个或多个转基因事件基因渗入到优良品系中的方 法可W对任何能够通过回交选择进行育种的植物物种使用。在一个实施方案中，植物是作 物物种，并且可w选自单子叶植物或双子叶植物。例如，可根据本公开使用的单子叶植物包 括选自下组的任何植物:玉米植物，小麦植物，或水稻植物。可W使用的单子叶植物的进一 步的具体实例包括，但不仅限于，玉米（Zea mays)，水稻（OiTza sativa)，黑麦（Secale cereale)，高梁（Sor曲um bicolo;r,Sorghum vulgare)，小米（例如，珍珠粟（Pennisetum glaucum)，泰（Panicum mi 1 iaceum)，粟（Setar ia i tal ica)，龙爪稷（E1 eusine coracana))，小麦（Triticum aestivum)，甘薦（甘薦属），燕麦(Avena)，大麦化ordeum)，凤 梨(Ananas comosus)，香蕉（香蕉属），栋桐，观赏植物，和草。在一个实施方案中，单子叶植 物是玉米。可W根据本公开使用的双子叶植物的实例包括任何选自下组的植物:大豆植物， 番茄植物，首猜植物，芥花(canola)植物，油菜(rapeseed)植物，芸苔属植物，棉花植物，和 向日葵植物。可W根据本公开使用的双子叶植物的其它实例包括，但不仅限于，芥花，棉花， 马铃馨，昆诺阿襲，宽，养麦，红花，大豆，甜菜，向日葵，芥花，油菜，烟草，拟南芥，芸苔属和 棉花。在一个实施方案中，双子叶植物是大豆。实施例1
[0116] 在玉米中RR册3近交系与Mon88017:Mon89034的标志物辅助性状转换
[0117] Sma;rtStax 8
[0118] SmartStax 8(SSX 8)是一种通过标志物辅助回交育种将8个基因[TC1507(PAT， 打y IF)，DAS591227(PAT，Cry34Abl，打y35Abl)，Mon89034(Cry 1A.105，Cry2Ab2)， Mon88017化PSPS,C巧3Bbl)]渗入到高产玉米系中而产生的玉米植物。SmartStax 8的最终 目的是保护玉米免于主要害虫，例如玉米惧、根虫、夜盗虫、玉米穗蛾和粘虫的伤害。 SmadStax 8还可W提供对草甘麟除草剂的抗性，并纳入草锭麟作为选择性标志物。
[0119] 标志物辅助回交育种(MABB)
[0120] 通过经典育种方法的作物改良在上个世纪取得了显著进展。然而，考虑到人口稳 定增长和可供作物种植的±地不断减少，采用新的策略W满足需求是当务之急。在短时间 内开发具有期望性状的高产品种是育种计划的一个重要关注点。标志物辅助选择(mas)有 助于在比传统方法更短的时间内开发出优越品种。为了有利地使用MAS,必须有可用的基因 组资源，例如中性(基于DNA)分子标志物(特别是共显性标志物）。回交育种业已成为将一个 或数个基因从供体纳入到适应品种内的常用方法，在植物育种中已经应用了将近一个世 纪。虽然性状的基因渗入可W通过传统的回交育种方法实现，但是该方法需要长达6代才能 获得99%的轮回亲本百分比(RPP)。然而，MAS预期可W在仅仅3个回交世代内回收超过99% 的RPP，表明分子标志物可W极大地提高回交效率(Bassett et al.2000)。
[0121] 目标
[0122] 通过标志物辅助回交将Mon89034和Mon88017基因渗入到玉米优良近交系SMA07BM 中，运些基因最终将在BC3代与Mon88017和TC1507基因堆叠，获得具有全部Ξ个基因 Mon88017: :Mon890：M: :TC1507、并且回收超过98%轮回亲本基因组(RPP)的SMA07BM。
[0123] 转换策略
[0124] 在SSX8的雌性侧，关注点是将Mon88017和Mon89034与TC1507-起堆叠到某一优良 种质内，并回收98%或更高的轮回亲本基因组。为此，分别进行Monl7(Mon88017: :TC1507) 和Mon89(Mon88017: :Mon89034)的平行转换，并且从BC2和BC3开始标志物辅助选择策略并 在BC3实现堆叠（图1)。在由于不可预知的原因导致不可能在BC3实现堆叠的情况下，各品系 在BC4或BC5进行堆叠。或者，运个策略还可W使用标志物在BC1和BC2上实施，并在BC2进行 堆叠。因为Mon88017在两侧均存在，所W我们能够选择对于Mon88017: :TC1507: :Mon89034 而言分别是纯合：：杂合：：杂合的等位基因状态的堆叠品系。
[0125] 材料和方法
[0126] BC2
[0127] DNA提取和制备
[0128] 从8〔23畑631〇1188017::]\1〇1189034群体采取422个样品。使用1日旨41化日。1咖方案在 Agilent Biocel Robot?(Bohl et al 2010)上从新鲜组织提取DNA。对样品进行高通量分 子分析化TMA)测试，考察Mon89034的存在化inch巧2002)。接着，将对Mon89034测试为杂合 的188个DNA样品拾取化it-picked)到2个96孔板内。
[01巧]用蒸馈水Wl:10的比例稀释DNA。接着，从MA化存储DNA(MA化stock DNA)获得 6RC162Mon88017: :Mon89034(群体供体)和RR册3(轮回亲本），并添加到平板1的A1和A2孔和 平板2的化0和化1孔。
[0130] SNP标志物和基因型分型平台
[0131] 标志物分析使用KASPar?SNP平台进行。标志物选择在下面的表1中列出。所得数据 用Kraken Kluster (filler?软件上传和分析。使用Marker Sl:udy Manager为每个样品组装 染色体表，并计算轮回亲本百分比(RPP)。
[0132] 连锁累寶分析
[0133] 为了实施连锁累寶化D)分析，使用标志物选择在整个基因组中可扩增基因座的多 态性标志物。LD在染色体1和4上实施，因为事件Mon89034先前被定位到染色体1大约342cM 处，事件Mon88017先前被定位到染色体4大约llOcM处。所选标志物在染色体1和4上相隔大 约lOcM。
[0134] 基因组分析
[0135] 将具有最高RPP的45个样品从提取平板拾取化itpiclO到1块96孔板中，供HTMA实 验室检查Mon88017的存在，并拾取到另一块用于jinxing基因组分析(GA)dGA在染色体2-3， 5-10上使用KASPar? SNP分析来实施。选定的标志物相隔大约20cM，并且在下文表1中列出。 所得的数据用Kraken Kluster (filler?软件上传和分析。使用Marker Sl:udy Manager?为 每个样品组装染色体表，该染色体表既包括先前的LD又包括新的GA分析，并计算轮回亲本 百分比(RPP)。
[0136] 选择10个具有最高RPP并且对Mon88017和Mon89034均测试为杂合的植物。
[0137] BC3
[013引 DNA提取和制备
[0139] 接下来，从BC3RR册3Mon88017: :Mon89034群体，W及轮回亲本RR册3，采取188个样 品。使用MagAttract?方案在Agilent Biocel Robot?上从新鲜组织提取DM。提取的DNA用 蒸馈水:10的比例稀释。从存储DNA获得6RC172Mon88017: :Mon89034(群体供体），并添加 到平板1的A2孔和平板2的化1孔。
[0140] SNP标志物和基因型分型平台
[0141] BC3标志物分析使用KASPar? SNP分析进行。标志物的选择在下面的表1中列出。所 得数据用Kraken Kluster (filler?软件上传和分析。使用Marker Sl:udy Manager为每个样 品组装染色体表并计算轮回亲本百分比(RPP)。
[0142] 连锁累寶分析
[0143] 使用MarkerDB?选择在整个基因组中扩增了多个基因座的多态性标志物。LD在染 色体1和4上执行，因为事件Mon89034先前被定位到染色体1大约342cM处，而事件Mon88017 先前被定位到染色体4大约llOcM处。选定的标志物在染色体1和4上相隔大约lOcM，并且在 基因组的所有其余部分上每隔大约20cM分布。评估了来自BC2的用作BC3代的供体的植物的 基因型。将在全部BC3群体供体中对A等位基因为纯合的标志物从分析中淘汰，并添加到最 终的结果中作为历史的非分离标志物。
[0144] 选择具有最高RPP的 10个植物。将Mon88017: :Mon89034群体和Mon88017: :TC1507 群体的最佳选择投入到堆叠程序中，W发现最佳的可能堆叠组合。
[0145] 表1.在BC2连锁累寶分析、BC2基因组分析和BC3连锁累寶/基因组分析中用于 KASPar? SNP平台的标志物W及基因座染色体和染色体位置
[0146]
[0147] 堆叠
[0148] 如图1所示进行R畑63与Mon 17: :TC1507的平行回交转换。目标是在R畑63的双侧 均实现堆叠，并获得可产生RPP大于98%的品系的堆叠组合。使用Mon 17侧和Mon 89侧的10 个最佳选择来进行堆叠组合程序，W统计学确定可产生〉98%RPP的组合的获得概率。对所 得的堆叠群体执行标志物分析。
[0149] 表型分型
[0150] 亲if起点育苗(new start nursery)
[0151] 此育苗是将感兴趣的性状转移到目标轮回亲本(RPP)近交系的初始步骤。使用定 量化ISA测试对所有可能的供体植物筛选基因表达。仅有高表达的供体植物被用于给轮回 亲本授粉。应当从供体转移花粉到RPP，W捕获RPP胞质。进行最少10次授粉，对穗进行批量 脱壳(bu化-shell)。
[0152] 从F1到BC1育苗
[0153] 对每一个F1群体进行测试，W确认感兴趣的基因的存在。运通过喷洒合适的选择 性除草剂标志物(民饥ind-Up⑧，用于Mon 88017;或者Libe;rtyLi]lk?，用于TC1507)或者使 用定量化ISA测试(Mon 89034)来实现。如果没有错误，则被测试的全部植物都应该具有感 兴趣的基因。在开花时，通过从RPP花粉转移到F1材料中进行最少10次授粉。
[0154] 从BC巧化C2育苗
[01W]运里再一次实施选择性除草剂标志物和定量化SIA，并且在后续的全部育苗中也 实施。植物将关于每种基因的存在Wl:l的比例分离。在开花时，选择20个阳性植物并进行 授粉。在收获时，根据穗的类型选择10个植物并进行批量脱壳。
[0156] 从BC2至化C3育苗
[0157] 运是群体接受基因型分型的第一代。种植的行数必须足W在测定了基因的存在 (通过除草剂应用或定量化ISA)之后获得至少186株的阳性植物。在3-4周龄的植物上收集 叶组织样品。实验室选择开花最好的植物，并且只用那些植物授粉。在运个阶段，最好的植 物W两种方式使用：用RPP对其授粉W进行反向回交;用它们给RPP授粉W实施最高达5次回 交授粉。使用每个群体的最好的10个植物进行授粉并收获，但是仅再次种植最佳的3个植 物。在BC2中使用表型选择作为标志物选择的补充，仅抛弃那些具有严重表型问题的植物。 [015引 BC3堆叠育苗
[0159] 随着堆叠基因数目的增加，堆叠设计变得越来越复杂。当有3个或更多个性状需要 基因渗入到某个品系中时，最好应当在开始时将基因渗入分成两个不同的标志物基因渗入 项目，并通过堆叠实现最终的基因组合。通常，堆叠在BC3(或者更晚，例如BC4)代进行，使用 对其各自的基因而言为半合的植物。
[0160] 当使用BC3(半合)植物实施堆叠时，重要的是在授粉之前对待在堆叠中使用的植 物进行全基因组分析。具体的杂交组合当在基因组分析结果出来之后，与实验团队协商来 确定。待堆叠的品系必须经过选择，使它们具有"互补"的供体提亲本背景渗入。运将为随后 在S1植物的标志物的帮助下近乎完全地消除供体遗传背景创造条件。
[0161] 结果
[0162] 基因型分型数据W辅助在选择中进行定量遗传
[0163] LD BC2
[0164] 在少数基因座中，RPP(来自田间）和供体等位基因是单态的，但群体是分离的。对 于运些情况，在化IM中将RPP的等位基因强制判读为杂合一一W符合预期判读并符合群体 分离。在大多数情况下，亲本是多态的，在群体中存在BB。运些田间的基因型最有可能来自 在早前世代中使用的不净的RPPnMon89在染色体1上标志物覆盖低并且没有右侧标志物。数 据返回率是99.1 %。选择最好的45个植物用于授粉和接合性测试。
[01 化]GA BC2
[0166] 数据返回率是98.2%。由于异常的群体分离一一特别是染色体4和染色体9上的cM 110附近，去掉了数个标志物。
[0167] LDGA BC3
[016引数据返回率是99.1%。下列植物:94305117,94308841,94308798是劣种(rogue)样 品。Mon 89的右侧没有标志物。在运些劣种植物中观察到了出乎意料的分离;所有其它的家 族群与历史分离模式相符。分离标志物7594,2479对于运个杂交似乎不是多态性标志物(在 BC2和BC3之间提供了不同的RPP来源）。根据开花情况选择了最佳的10个植物用于堆叠。另 夕h如果有超过10个植物具有l00%RPP，则选择它们，W便能够基于表型选择植物。
[0169] 选择
[0170] 在下面的表2中列出了最佳的植物选择，W及它们的RPP，用于BC2和BC3LDGA。表3 列出了最佳的堆叠组合。
[0171] 表2.最终从R畑63Mon88017: :Mon89034群体挑选，并通知育种者获取BC2和BC2世 代育种的10个植物，W及每个植物的轮回亲本百分比和选择排名
[0172]
[0173] 堆叠组合
[0174] 通过堆叠组合程序，使用Mon 17侧和Mon 89侧的10个最佳选择，为W统计学方式 确定了所有组合的获得可产生〉98%RPP的组合的概率。使用概率最高的组合在田间进行实 际杂交。表3指示了在田间使用的堆叠组合。
[01巧]表3.最佳堆叠组合，显示为植物编号，来自每个转换（Mon88017:TC1507和 Mon89034: Mon88017)的配对在一起
[0176]
[0177] 讨论
[0178] RRH63X SLBOl转换是窄杂交，因此只有相对较少的多态性标志物可用于分析。假 设基因组中没有多态性标志物覆盖的大部分区域在两个品系间没有差异，因此不必转换。 BC2到BC3的RPP进展显著，并且在为堆叠设定的98%最小RPP内。
[0179] 自交和测交育苗
[0180] 运是要种植的最后一代。运个育苗用于将项目材料从自交的S1水平推进到S2水 平，同时产生杂交种子用于在目标环境中进行产量性状测试。通常，种植从最好的5个S1植 物获得的全部种子，并且运些植物构成用于产量试验的5个选择。
[0181] 对此项育苗的全部植物测试接合性。在授粉时，对就Mon88107和Mon 89034而言均 为纯合、并且就TC1507而言为纯合或无效的植物进行自花授粉，并送去进行最终育苗。群体 中的其它植物用作雌性，通过从雄性测试者传递花粉来产生杂交种子。
【主权项】
1. 一种用于将三个或更多个转基因事件从供体系渗入到轮回植物基因组内的方法，所 述方法包括： a) 提供第一供体/轮回植物，其包括第一转基因事件、第二转基因事件，并且具有大于 80%的轮回亲本百分比； b) 提供第二供体/轮回植物，其包括所述第二转基因事件、第三转基因事件，并且具有 大于80%的轮回亲本百分比； c) 将所述第一供体/轮回植物与所述第二供体/轮回植物杂交，以产生后代植物； d) 从步骤(c)中的那些后代植物、或者任选地步骤(c)的后代植物的自交后代中鉴定并 选择包括所述第一、第二和第三转基因事件的后代植物。2. 权利要求1的方法，其中： i) 所述第一供体/轮回植物是如下产生的： e) 使第一供体植物与轮回植物杂交产生第一后代，其中所述第一供体植物包括所述第 一转基因事件和所述第二转基因事件； f) 通过将步骤(e)的第一后代、或者任选地，步骤(e)的第一后代的自交后代与所述轮 回植物杂交而提供一个或多个回交世代，从而提供第一回交植物，并将所述第一回交植物 与所述轮回植物杂交，从而产生包含所述第一转基因事件、所述第二转基因事件，并且具有 大于80 %的轮回亲本百分比的所述第一供体/轮回植物;和 ii) 第二供体/轮回植物是如下产生的： g) 使第二供体植物与所述轮回植物杂交以产生第二后代，其中所述第二供体植物包括 所述第二转基因事件和所述第三转基因事件； h) 通过将步骤(g)的第二后代、或者任选地，步骤(g)的第二后代的自交后代与所述轮 回植物杂交而提供一个或多个回交世代，从而提供第二回交植物，并将所述第二回交植物 与所述轮回植物杂交，从而产生包含所述第二转基因事件、所述第三转基因事件，并且具有 大于80%的轮回亲本百分比的所述第二供体/轮回植物。3. 权利要求2的方法，其中所述轮回亲本植物在步骤(e)到(h)的至少一个步骤中是雌 性育种植物。4. 权利要求3的方法，其中所述第一和第二后代植物各自与所述轮回植物回交至少2次 以产生平行的BC2系或更高代的第一回交后代植物，分别代表所述第一供体/轮回植物和第 二供体/轮回植物。5. 权利要求2的方法，其中第一供体/轮回植物的第一或第二转基因事件中的至少一个 作为纯合性状被固定。6. 权利要求2的方法，其中第二供体/轮回植物的第二或第三转基因事件中的至少一个 作为纯合性状被固定。7. 权利要求1的方法，其中在包含所述第一、第二和第三转基因事件的后代植物中，该 第一、第二和第三转基因事件作为纯合性状被固定。8. 权利要求1-7中任一项的方法，其中包含所述第一、第二和第三转基因事件的后代植 物具有大于94%的轮回亲本百分比。9. 权利要求1-7中任一项的方法，其中包含所述第一、第二和第三转基因事件的后代植 物具有大于97.5%的轮回亲本百分比。10. 权利要求9的方法，其中该植物是单子叶植物。11. 权利要求1 〇的方法，其中该单子叶植物选自下组:玉米植物、小麦植物、草植物和水 稻植物。12. 权利要求9的方法，其中该植物是双子叶植物。13. 权利要求12的方法，其中该双子叶植物选自下组:大豆植物，芥花植物，烟草植物， 番茄植物，油菜植物，芸苔属植物，苜蓿植物，糖用甜菜植物，和棉花植物。14. 权利要求1的方法，其中所述第一、第二和第三转基因性状中的至少一个包括选自 下组的转基因：杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效 率转基因、营养品质转基因、DNA结合蛋白转基因、和选择标志物转基因。15. 权利要求1的方法，其中所述第一和第二供体/轮回植物中的一个还包括第四转基 因事件。16. 权利要求15的方法，其中所述第一和第二供体/轮回植物中的一个还包括第五转基 因事件。17. -种用于将三个或更多个转基因事件渗入到植物内的方法，所述方法包括： a) 提供第一供体植物，其包括至少两个转基因事件的第一堆叠； b) 将该第一供体植物与选定的轮回亲本植物杂交，以产生包含所述转基因事件的第一 堆叠的第一F1后代植物； c) 将第一 F1后代植物与所述轮回亲本植物进行第一育种回交，并选择包含所述转基因 事件的第一堆叠的第一育种回交后代植物； d) 将选定的第一育种回交后代与所述轮回亲本植物连续回交一次或多次，以产生包含 所述转基因事件的第一堆叠的BC2或更高代的第一回交后代植物； e) 选择包含至少两个转基因事件的第二堆叠的第二供体植物，其中该第二堆叠的转基 因事件中的至少一个也存在于所述第一堆叠的转基因事件中； f) 将该第二供体植物与所述选定的轮回亲本植物杂交，以产生包含所述转基因事件的 第二堆叠的第二F1后代植物； g) 将第二F1后代植物与所述轮回亲本植物进行第二育种回交，并选择包含所述转基因 事件第二堆叠的第二育种回交后代植物； h) 将选定的第二育种回交后代与所述轮回亲本植物连续回交一次或多次，以产生包含 所述转基因事件的第二堆叠的BC2或更高代的第二回交后代植物； i) 将所述BC2或更高代的第一回交后代与所述BC2或更高代的第二回交后代杂交，以产 生包含来自所述转基因事件的第一和第二堆叠的三个转基因事件的第三后代植物。18. 权利要求17的方法，其中该第三后代植物包含至少97.5 %的重组亲本基因组。19. 权利要求17的方法，其中该轮回亲本植物在步骤(c)到(h)中的至少一个中是雌性 育种植物。20. 权利要求17的方法，其中该植物是单子叶植物。21. 权利要求20的方法，其中该单子叶植物选自下组:玉米植物、小麦植物、草植物和水 稻植物。22. 权利要求17的方法，其中该植物是双子叶植物。23. 权利要求22的方法，其中该双子叶植物选自下组:大豆植物，芥花植物，烟草植物， 番茄植物，油菜植物，芸苔属植物，苜蓿植物，糖用甜菜植物，和棉花植物。24. 权利要求17的方法，其中所述第一、第二和第三转基因性状的至少一个包括选自下 组的转基因：杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率 转基因、营养品质转基因、DNA结合蛋白转基因、和选择标志物转基因。25. 权利要求17-24中任一项的方法，其中第一堆叠的转基因事件中的至少一个在第一 回交后代植物中作为纯合性状被固定。26. 权利要求17-24中任一项的方法，其中第二堆叠的转基因事件中的至少一个在第一 回交后代植物中作为纯合性状被固定。27. 权利要求17-24中任一项的方法，其中第三后代植物包含所有作为纯合性状被固定 的转基因事件。28. 权利要求17的方法，其中该第三后代植物包括少于20cM的来自第一供体植物的连 锁累赘。29. 权利要求17的方法，其中该第三后代植物包括少于20cM的来自第二供体植物的连 锁累赘。30. 权利要求17的方法，其中步骤(e)的第一回交后代植物和步骤（i)的第二回交后代 植物是通过标志物辅助选择而选择的。31. 权利要求30的方法，其中该标志物辅助选择选自下组：SNP标志物辅助选择，SSR标 志物辅助选择，RFLP标志物辅助选择，下一代测序辅助选择，RAH)标志物辅助选择，和AFLP 标志物辅助选择。32. 通过权利要求17的方法产生的植物，其中该植物包括所述转基因事件的第一和第 二堆叠。
【文档编号】A01H5/00GK106028797SQ201480076355
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2014年12月24日
【发明人】J·迈耶, J·W·宾
【申请人】美国陶氏益农公司