田间苎麻叶片愈伤组织再生的消毒剂、制备方法与快速消毒方法
【专利摘要】本发明公开了田间苎麻叶片愈伤组织再生的消毒剂、制备方法与快速消毒方法，称取NaCl：38?40g/L，NaCO3：20?22g/L，Na2SiO3：24?25g/L，NaClO：49?50g/L，聚乙烯吡咯烷酮：1?3g/L将苎麻大田叶片冲洗；从无菌水中取出叶片放入配好的消毒剂中浸泡10min，再用无菌水涮洗5次；叶片切成小块接种在盛有普通MS培养基的培养皿上；培养基pH值5.8，培养室温度25±2℃，光照强度1000?2000lx，光照时间16h/d，湿度75％的条件下培养。解决组织培养中，外植体消毒所面临的染菌、褐化等问题，同时淘汰相关有毒灭菌剂HgCl2，以避免对环境造成二次污染。
【专利说明】
田间苎麻叶片愈伤组织再生的消毒剂、制备方法与快速消毒 方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种田间苎麻叶片愈伤组织再生的消毒剂、及其 制备方法以及田间苎麻叶片愈伤组织再生的快速消毒培养方法。
【背景技术】
[0002] 芒麻(Boehmeria nivea(L. )Gand)，是我国最重要的多年生纤维作物之一，芒麻离 体组织培养可作为苎麻快繁、再生和遗传转化的重要手段。
[0003] 外植体的消毒是植物组织培养成功的关键步骤;段维兴等以水果型番木瓜顶芽和 侧芽为外植体，用不同消毒剂处理结果表明，先用〇. 1 %KMn04浸泡lOmin，再用5 %NaCIO浸 泡1〇11^11，最后用0.1%取(：12浸泡81^11的灭菌效果最好，外植体成活率最高，为47.27%。邹 永梅等以万寿菊茎段为外植体，通过实验探讨了不同溶度的升汞、次氯酸钠、84消毒液在不 同消毒时间下的灭菌效果，结果表明，在70%酒精中浸润30s后，再用0.1%HgCl 2处理lOmin 或20 %的84消毒液处理30min灭菌效果均很好，均为90 %。刘学敏以甜叶菊叶片为外植体， 研究不同灭菌剂、灭菌时间对灭菌效果的影响，结果表明以75 %酒精与0.1 %HgCl2组合污 染率和枯死率较低，愈伤组织诱导率达86.7 %。2009年，伍旭东等以中苎一号叶片为外植 体，用75%酒精消毒10s，再用0.1%HgCl2灭菌8min，同时滴入1-2滴HC1，虽然能取得很好的 效果，但在诱导过程中仍然有大量的外植体染菌或者死亡，所以更好的苎麻叶片灭菌方法 还有待于进一步的研究和探索。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明的目的是提供一种田间苎麻叶片愈伤组织再生的消毒 剂，解决组织培养中，外植体消毒所面临的染菌、褐化等问题，同时淘汰相关有毒灭菌剂 HgCl 2,以避免对环境造成二次污染。
[0005] 本发明的另一目的是提供上述消毒剂的制备方法。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种采用上述消毒剂的快速消毒方法。
[0007] 本发明所采用的技术方案是，一种田间苎麻叶片愈伤组织再生的消毒剂，由以下 成份组成：NaCl: 38-40g/L，NaC03:20-22g/L，Na2Si03:24-25g/L，NaCIO: 49-50g/L，聚乙烯吡 咯烷酮：l_3g/L。
[0008] 优选的，由以下成份组成：NaCl 39.0g/L，NaC03 21.2g/L、Na2Si〇3 24.4g/L、NaC10 49.7g/L、聚乙烯吡咯烷酮2g/L。
[0009] 本发明所采用的另一技术方案是，一种田间苎麻叶片愈伤组织再生的消毒剂的制 备方法，具体按照以下步骤进行：
[0010] 按照比例称取NaCl: 38-40g/L，Na⑶3: 20-22g/L，Na2Si〇3:24-25g/L，NaCIO: 49-50g/L，聚乙烯吡咯烷酮：l-3g/L;混匀定容即可。
[0011] 本发明所采用的又一技术方案是，一种田间苎麻叶片愈伤组织再生的消毒剂的快 速消毒方法，具体按照以下步骤进行：
[0012] 步骤1，将刚采下苎麻大田叶片用流动的水冲洗半个小时，再用无菌水冲洗一遍；
[0013] 步骤2,接着将叶片放入盛有无菌水的烧杯中置于超净工作台待用；
[0014] 步骤3,从无菌水中取出叶片放入配好的消毒剂中浸泡lOmin，再用无菌水涮洗5 次；
[0015] 步骤4,然后将叶片切成约0.2平方厘米的小块接种在盛有普通MS培养基的培养皿 上；
[0016] 步骤5，最后培养基pH值5.8，培养室温度25 ± 2°C，光照强度1000-2000lx，光照时 间16h/d，湿度75 %的条件下培养。
[0017] 本发明的有益效果:采用盆栽中苎一号的大田叶片为外植体，以不同消毒剂，即本 发明的消毒剂、HgCl2、次氯酸钠、双氧水，以及不同的处理时间（0min、5min、10min、15min、 20min、25min)对中苎一号苎麻田间叶片进行灭菌处理，探索出了一种环保、简便、高效的消 毒法案，筛选出最适宜的消毒剂方式，仅用本发明的消毒剂消毒lOmin即可达到很好的消毒 效果。
【附图说明】
[0018] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以 根据这些附图获得其他的附图
[0019] 图1是0 · 1 %HgCh灭菌6min处理25天后愈伤诱导情况图。
[0020] 图2是NaCIO灭菌20min处理25天后愈伤诱导情况图。
[0021]图3是本发明消毒剂灭菌lOmin处理25天后愈伤诱导情况。
[0022]图 4-图 9分别为不同的处理时间 0min、5min、lOmin、15min、20min、25mir^t*i5- 号苎麻田间叶片进行灭菌处理图。
【具体实施方式】
[0023]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0024]本发明一种田间苎麻叶片愈伤组织再生的消毒剂，由以下成份组成：
[0025] NaCl: 38-40g/L，NaC03:20-22g/L，Na2Si03:24-25g/L，NaC10:49-50g/L，聚乙烯吡 咯烷酮：l-3g/L。
[0026] 优选的，NaCl 39.0g/L，NaC03 21.2g/L、Na2Si03 24.4g/L、NaC10 49.7g/L、PVP(聚 乙烯吡咯烷酮)2g/L。
[0027] 上述消毒剂，具体按照以下方法制备：
[0028] 按照比例称取NaCl: 38-40g/L，Na⑶3: 20-22g/L，Na2Si03:24-25g/L，NaCIO: 49-50g/L，聚乙烯吡咯烷酮：l-3g/L;混匀定容即可。
[0029] 实施例1
[0030] 按照比例称取 NaCl:38g/L，NaC03:20g/L，Na2Si03:24g/L，NaC10:50g/L，聚乙烯吡 咯烷酮:3g/L;混匀定容即可。
[0031] 实施例2
[0032]按照比例称取 NaCl:40g/L，NaC03:22g/L，Na2Si03:25g/L，NaC10:49g/L，聚乙烯吡 咯烷酮：1 g/L;混匀定容即可。
[0033] 实施例3
[0034]按照比例称取NaCl: 39g/L，Na⑶3:2lg/L，Na2Si03:24 · 5g/L，NaCIO: 49 · 5g/L，聚乙 烯吡咯烷酮:2g/L;混匀定容即可。
[0035]本发明消毒剂的快速消毒方法，具体按照以下步骤进行：
[0036]步骤1，将刚采下苎麻大田叶片用流动的水冲洗半个小时左右，再用无菌水冲洗一 遍。
[0037] 步骤2,接着将叶片放入盛有无菌水的烧杯中置于超净工作台待用。
[0038] 步骤3,从无菌水中取出叶片放入配好的本发明消毒剂中浸泡lOmin，再用无菌水 涮洗5次。
[0039] 步骤4,然后将叶片切成约0.2平方厘米左右的小块接种在盛有普通MS培养基的培 养皿上。
[0040] 步骤5，最后培养基pH值5.8，培养室温度(25 ± 2) °C，光照强度1000-20001X，光照 时间16h/d，湿度75 %的条件下培养。
[0041 ]本文制得的消毒剂与现有消毒剂的实施例对比：
[0042] 1.实验材料与试剂：
[0043]实验材料：中苎一号大田苗叶片。
[0044]实验试剂:本发明的消毒剂、0.1 % HgCl2、NaC10、双氧水。
[0045]消毒剂的有效成份:39 · 0g/LNaCl、21 · 2g/LNaC03、24.4g/LNa2Si03、49 · 7g/LNaC10、 2g/LPVP(聚乙烯吡咯烷酮）。
[0046] 2.实验方法：
[0047] 将采下的叶片用流动的水冲洗20min，用无菌水冲洗一次，然后将叶片放入盛有无 菌水的烧杯中置于超净工作台。按照实验要求对叶片进行不同消毒剂，不同消毒时间的浸 泡消毒后再用无菌水涮洗5次。切成约0.2平方厘米左右的小块接种在1/2MS4H值5.8,培养 室温度（25±2) °C，光照强度1000-20001x，光照时间16h/d，湿度75%。
[0048] 2.1实验设计
[0049] (1 )0.1 %的HgCl2不同消毒时间对愈伤形成的影响实验。
[0050] 对消毒剂升汞的消毒时间，设计6个处理，分别为0、2、4、6、8、lOmin。每个处理40片 (每盘接种20片，共2盘），实验重复两次，共12盘。以盆栽苗的顶端未长全的叶片为外植体， 每个外植体按照以上处理时间进行消毒。一周后，统计污染率、死亡率和存活率，筛选出消 毒剂升汞的最适消毒时间。
[0051] (2)含活性氯1.67%的次氯酸钠不同消毒时间对愈伤形成的影响实验。
[0052] 对消毒剂次氯酸钠的消毒时间，设计6个处理，分别为0、5、10、15、20、25min。每个 处理40片(每盘接种20片，共2盘），实验重复两次，共12盘。以盆栽苗的顶端未长全的叶片为 外植体，每个外植体按照以上处理时间进行消毒。一周后，统计污染率、死亡率和存活率，筛 选出消毒剂次氯酸钠的最适消毒时间。
[0053] (3)本发明消毒剂不同消毒时间对愈伤形成的影响实验。
[0054] 对消毒剂的消毒时间，设计6个处理，分别0、5、10、15、20、25min。每个处理40片(每 盘接种20片，共2盘），实验重复两次，共12盘。以盆栽苗的顶端未长全的叶片为外植体，每个 外植体按照以上处理时间进行消毒。一周后，统计污染率、死亡率和存活率，筛选出消毒剂A 的最适消毒时间。
[0055] (4)双氧水不同消毒时间对愈伤形成的影响实验。
[0056] 对消毒剂双氧水的消毒时间，设计4个处理，分别为0、5、10、15min。每个处理40片 (每盘接种20片，共2盘），实验重复两次，共8盘。以盆栽苗的顶端未长全的叶片为外植体，每 个外植体按照以上处理时间进行消毒。一周后，统计污染率、死亡率和存活率，筛选出消毒 剂双氧水的最适消毒时间。
[0057] 2.2数据统计与分析
[0058] 采用Excel统计染菌率、死亡率及存活率。
[0059] 染菌率=染菌的叶片数/接种的叶片总数X 100%
[0060] 死亡率=死亡的叶片数/接种的叶片总数X100%
[0061 ]存活率=存活的叶片数/接种的叶片总数)< 10〇%
[0062]出愈率=愈伤组织叶片数/接种的叶片总数X 100%
[0063] 3.实验结果：
[0064] 表1 0.1 %HgCl2不同消毒时间对中苎一号叶片愈伤形成的影响
[0065]
[0066] 表2次氯酸钠在不同消毒时间对中苎一号叶片愈伤形成的影响
[0067]
[0068]
[0069] 表3双氧水在不同消毒时间对中芒一号叶片愈伤形成的影响
[0070]
[0071] 表4本发明消毒剂在不同消毒时间对中苎一号叶片愈伤形成的影响
[0072]
[0073]图1为0.1 %HgCl2最佳消毒时间处理苎麻叶片后愈伤组织生长情况，从色泽上看 偏白，而且有部分呈现褐色，理论上正常的愈伤组织为浅绿或绿色;愈伤存活率仅为70%。 [0074]图2为NaCIO最佳消毒时间处理苎麻叶片后愈伤组织生长情况，同样存在色泽偏白 且部分呈现褐色，愈伤存活率仅70 %。
[0075]图3为本发明消毒剂最佳消毒时间处理苎麻叶片后愈伤组织生长情况，从图中可 以看出愈伤组织色泽浅绿，愈伤存活率高达100%。
[0076] 图4-图9为表4中不同的处理时间（0min、5min、lOmin、15min、20min、25min)对中芒 一号苎麻田间叶片进行灭菌处理，可以看出，1〇、15分钟可以达到最好的效果。
[0077] 前人的研究表明，其他植物的芽、茎、叶的最佳消毒剂里HgCl2是必不可少的一种 消毒剂，且消毒方案比较繁琐;而对苎麻叶片作为外植体，不同消毒剂灭菌的研究并没有。 本研究采用苎麻叶片作为外植体，不同消毒剂(本发明的消毒剂、HgCl 2、次氯酸钠、双氧水） 处理，由表3可得，双氧水作为消毒剂的存活率太低，最高不超过20%，因此可以直接淘汰， 而从表1、表2、表4可知，本发明的消毒剂的灭菌效果大于HgCl 2,而HgCl2的灭菌效果大于次 氯酸钠。这一结果表明，仅用本发明的消毒剂消毒l〇-15min消毒效果达到了最佳，此消毒方 式即简化了消毒的步骤又避免了重金属带来的二次污染。
[0078] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在 本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围 内。
【主权项】
1. 一种田间苎麻叶片愈伤组织再生的消毒剂，其特征在于，由以下成份组成： NaCl: 38-40g/L，Na⑶3:20-22g/L，Na2Si03:24-25g/L，NaCIO: 49-50g/L，聚乙烯吡咯烷 酮：l-3g/L。2. 根据权利要求1所述的一种田间苎麻叶片愈伤组织再生的消毒剂，其特征在于，由以 下成份组成：NaCl 39.0g/L，NaC03 21.2g/L、Na2Si03 24.4g/L、NaC10 49.7g/L、聚乙烯吡咯 烷酮2g/L。3. -种如权利要求1所述的田间苎麻叶片愈伤组织再生的消毒剂的制备方法，其特征 在于，具体按照以下步骤进行： 按照比例称取NaCl: 38-40g/L，NaC03:20-22g/L，Na2Si03:24-25g/L，NaCIO: 49-50g/L， 聚乙烯吡咯烷酮：1 -3g/L;混匀定容即可。4. 一种如权利要求1所述的田间苎麻叶片愈伤组织再生的消毒剂的快速消毒方法，其 特征在于，具体按照以下步骤进行： 步骤1，将刚采下苎麻大田叶片用流动的水冲洗半个小时，再用无菌水冲洗一遍； 步骤2,接着将叶片放入盛有无菌水的烧杯中置于超净工作台待用； 步骤3,从无菌水中取出叶片放入配好的消毒剂中浸泡lOmin，再用无菌水涮洗5次； 步骤4，然后将叶片切成0.2平方厘米的小块接种在盛有普通MS培养基的培养皿上； 步骤5，最后培养基pH值5.8，培养室温度25 ± 2 °C，光照强度1000-20001x，光照时间 16h/d，湿度75%的条件下培养。
【文档编号】A01N59/08GK106070316SQ201610387440
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月2日 公开号201610387440.6, CN 106070316 A, CN 106070316A, CN 201610387440, CN-A-106070316, CN106070316 A, CN106070316A, CN201610387440, CN201610387440.6
【发明人】邢虎成, 孙群香, 揭雨成
【申请人】湖南农业大学