专利名称：一种栝楼毛状根诱导和培养生产核酸抑制蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种栝楼毛状根诱导和培养生产核酸抑制蛋白的方法，属生物制药工程技术领域。
栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim．)是我国传统的中草药，自古以来用于治疗异位妊辰，抗臃肿等。近年发现其有效成分是天花粉蛋白(TCN)。1989年，McGrath等人首次发现了TCN对于人类免疫缺陷病毒HIV—1的抑制作用，受到了科学界和医疗领域的极大关注，很快进入临床实验，作为医药用TCN的商品名为GLQ223，其有效成分是高度纯化的26KD蛋白质。近年，又发现栝楼块根中含有的TAP29核酸抑制蛋白，不但具有很强的抗爱滋病病毒活性，而且其副作用远远小于GLQ223。由于TCN具有以上重要的医疗价值，所以其原料生产研究也倍受注目。目前所使用的TCN基本从栝楼块根中提取获得。栝楼属于多年生植物，只有生长5年的块根才有医用价值，而且其TCN的活性很低。此外，由于产地不同其TCN的含量差别很大，为提取分离和纯化造成很大困难。因此，利用生物技术生产TCN成为研究热点。
通过细菌转化诱导毛状根，再利用毛状根的培养生产有用代谢产物已经成为植物细胞培养工程的研究热点。由于毛状根具有生长速度快，生长稳定，不需要添加植物激素等优点，在植物细胞工程领域具有较大的优势。目前，通过细菌转化诱导栝楼毛状根来生产有用代谢产物的报到已有数篇，但是，所使用的栝楼种类为Trichosanthes kirilowii Maxim．Var Japonica，主要研究了细菌转化效果或TCN的含量等。对于如何优化毛状根的培养条件或者如何提高毛状根中TCN的合成研究还不充分。
本发明的目的是提出一种栝楼毛状根诱导和培养生产核酸抑制蛋白的方法，利用栝楼毛状根生长速度快，核酸抑制蛋白活性高的特点，解决栝蒌块根生长速度缓慢(5年生才能药用)，核酸抑制蛋白含量低，销售价格过高等问题。特别是在栝蒌的毛状根中含有较多的TAP29核酸抑制蛋白，具有开发出新型抗爱滋病药物的光明前景，还能够开发成治疗肿瘤的良药。
本发明提出的栝楼毛状根诱导和培养生产核酸抑制蛋白的方法，包括以下各步骤1)在每升植物培养基上加入20g／l蔗糖和8g／l琼脂，在125℃，0．1mpa压力下消毒15—18分钟，经冷却后作成平板培养基；2)将栝楼种子用乙醇和次氯酸钠消毒后，接种在第1步的培养基上，于20—25℃，用日光灯照射，亮度为1000—3000lx，每日光照12—16小时培养20—30天，种子萌芽长成无菌植株备用；
3)在每升细菌培养基上加入10g／l琼脂，经125℃，0．1mPa压力下消毒15—18分钟，经冷却后作成斜面培养基；4)将发根农杆菌LBA9402菌接种在第3步的培养基上，在35—37℃，避光条件下培养3天，将细菌活化；5)将第2步培养出的无菌植株，从每个节间留下2枚叶片剪断，作成外殖体，并且在节位处涂上LBA9402细菌，用接种针刺伤沾菌的节位处，然后接种在第1步的培养基上，在20—25℃，日光灯下，强度为500—1000lx，培养10—30天，从被刺伤的节位处形成不定根；6)在每升植物培养基上加入蔗糖20g／l和氨卞青霉素30—150mg／l制成杀菌培养基，将第5步形成的不定根剪下，放在杀菌培养基内，培养3—10天，更换同样的杀菌培养基内反复除菌培养2—5次，彻底除掉细菌后，转接在第1步的培养基内筛选生长速度最快的根系；上述筛选的根系用匀浆机破碎，离心后，取上清液分离出细胞液，用高压纸电泳法检测根系内是否含有胭脂碱或章鱼碱(正常的栝楼根系不能合成，而只有发根农杆菌的基因转移到细胞内萌发出的根系中才能够合成)，鉴定出含有胭脂碱或章鱼碱的根系，也就是需要的毛状根；或者将根系破碎分离出DNA，利用萨瑟恩DNA印迹杂交技术(Southern blotting)，利用LBA9402农杆菌的Ri质粒的分子探针与毛状根的DNA进行分子杂交，确认毛状根内确实含有Ri质粒上的基因片段；7)在每升植物培养基中加入20g／l蔗糖，制成培养液，加入筛选出的毛状根，在20—25℃，日光灯照射，光强为500—1500lx，在转速为90—150rmp的摇床上，培养15—25天，获得50—100倍重量的毛状根；8)在生物反应器内，加入第1步的培养液，再添加维生素、氨基酸、诱导子，经高温灭菌处理后，按照培养液重量的2—10％接种上第8步的毛状根，在20—25℃，弱光或黑暗条件下培养15—30天，就会获得50—100倍重量的毛状根；9)将毛状根经冷冻后进行破碎处理，然后在4℃低温下提取和分离蛋白质，经过纯化处理即获得本发明的26kd、27kd和29kd的核酸抑制蛋白。
利用本发明的方法培养毛状根，其产量可以达到200—300g／L／20日，其中核酸抑制蛋白含量达到0．5—1．0‰。
下面介绍本发明的实施例。
实施例一1)在Murashige & Skoog(MS)培养基上加入20g／L蔗糖和7g／L琼脂，在125℃，0．1mPa压力下消毒15分钟，经冷却后作成平板培养基；2)将栝楼种子用70％乙醇杀菌1分钟，再用次氯酸钠消毒15分钟，然后接种在第1步的培养基上，于25℃，2000lx照度下，每日照光14小时培养20天，种子萌芽长成无菌植株备用；3)在LB细菌培养基上加入10g／L琼脂，经125℃，0．1mPa压力下消毒15分钟，经冷却后作成斜面培养基；
4)将发根农杆菌LBA9402菌接种在第3步的培养基上，在35℃，避光条件下培养3天，将细菌活化。
5)将第2步培养出的无菌植株，从每个节间留下2枚叶片剪断，作成外殖体，并且在节位处涂上LBA9402细菌，用接种针刺伤沾菌的节位处，然后接种在第1步的培养基上，在25℃，弱光条件下(500lx)培养30天，就会从被刺伤的节位处形成不定根。
6)将第5步形成的不定根剪下，放在含有50mg／L的氨卞青霉素的第1步的培养基内(不加琼脂)，培养4天，更换同样的含有氨卞青霉素的培养基内反复除菌培养3次，彻底除掉细菌后，转接在第1步的培养基内(不加琼脂)筛选生长速度最快的根系。
7)将筛选出的根系破碎后分离出细胞液，用高压纸电泳法检测根系内是否含有胭脂碱或章鱼碱(正常的栝楼根系不能合成，而只有发根农杆菌的基因转移到细胞内萌发出的根系中才能够合成)，鉴定出含有胭脂碱或章鱼碱的根系，也就是我们需要的毛状根。
还可以将根系破碎分离出DNA，利用萨瑟恩DNA印迹杂交技术(Southernblotting)，利用LBA9402农杆菌的Ri质粒的分子探针与毛状根的DNA进行分子杂交，确认毛状根内确实含有Ri质粒上的基因片段。
8)在第1步的培养液内(无琼脂)，加入筛选出的毛状根，在25℃，弱光(500lx)，90rmp条件下培养25天，就可以获得50倍重量的毛状根。
9)在大型生物反应器(5L以上)内，加入第1步的培养液(无琼脂)，再添加1mg／L维生素B1，丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、天冬酰氨和异亮氨酸各10mg／L的混合液，0．2％的水杨酸(诱导子)，经高温灭菌处理后，按照培养液重量的10％接种上第8步的毛状根，在25℃，弱光或黑暗条件下培养20天，就会获得50—100倍重量的毛状根。
10)将毛状根经冷冻后进行破碎处理，然后在4℃低温下提取和分离蛋白质，经过纯化处理就可以获得26kd、27kd和29kd的核酸抑制蛋白。
实施例二1)在Murashige & Skoog(MS)培养基上加入20g／L蔗糖和7g／L琼脂，在125℃，0．1mPa压力下消毒15分钟，经冷却后作成平板培养基；2)将栝楼种子用70％乙醇杀菌1分钟，再用次氯酸钠消毒15分钟，然后接种在第1步的培养基上，于25℃，2000lx照度下，每日照光14小时培养20天，种子萌芽长成无菌植株备用；3)在LB细菌培养基上加入10g／L琼脂，经125℃，0．1mPa压力下消毒15分钟，经冷却后作成斜面培养基；4)将发根农杆菌LBA9402菌接种在第3步的培养基上，在35℃，避光条件下培养3天，将细菌活化。
5)将第2步培养出的无菌植株，从每个节间留下2枚叶片剪断，作成外殖体，并且在节位处涂上LBA9402细菌，用接种针刺伤沾菌的节位处，然后接种在第1步的培养基上，在25℃，弱光条件下(500lx)培养30天，就会从被刺伤的节位处形成不定根。
6)将第5步形成的不定根剪下，放在含有50mg／L的氨卞青霉素的第1步的培养基内(不加琼脂)，培养4天，更换同样的含有氨卞青霉素的培养基内反复除菌培养3次，彻底除掉细菌后，转接在第1步的培养基内(不加琼脂)筛选生长速度最快的根系。
7)将筛选出的根系破碎后分离出细胞液，用高压纸电泳法检测根系内是否含有胭脂碱或章鱼碱(正常的栝楼根系不能合成，而只有发根农杆菌的基因转移到细胞内萌发出的根系中才能够合成)，鉴定出含有胭脂碱或章鱼碱的根系，也就是我们需要的毛状根。
还可以将根系破碎分离出DNA，利用萨瑟恩DNA印迹杂交技术(Southernblotting)，利用LBA9402农杆菌的Ri质粒的分子探针与毛状根的DNA进行分子杂交，确认毛状根内确实含有Ri质粒上的基因片段。
8)在第1步的培养液内(无琼脂)，加入筛选出的毛状根，在25℃，弱光(500lx)，90rmp条件下培养25天，就可以获得50倍重量的毛状根。
9)在大型生物反应器(5L以上)内，加入第1步的培养液(无琼脂)，再添加6mg／L维生素B5，丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、天冬酰氨和异亮氨酸各20mg／L的混合液，5g／L酵母浸膏(诱导子)，经高温灭菌处理后，按照培养液重量的10％接种上第8步的毛状根，在25℃，弱光或黑暗条件下培养20天，就会获得50—100倍重量的毛状根。
10)将毛状根经冷冻后进行破碎处理，然后在4℃低温下提取和分离蛋白质，经过纯化处理就可以获得26kd、27kd和29kd的核酸抑制蛋白。
实施例三1)在Murashige & Skoog(MS)培养基上加入20g／L蔗糖和7g／L琼脂，在125℃，0．1mPa压力下消毒15分钟，经冷却后作成平板培养基；2)将栝楼种子用70％乙醇杀菌1分钟，再用次氯酸钠消毒15分钟，然后接种在第1步的培养基上，于25℃，2000lx照度下，每日照光14小时培养20天，种子萌芽长成无菌植株备用；3)在LB细菌培养基上加入10g／L琼脂，经125℃，0．1mPa压力下消毒15分钟，经冷却后作成斜面培养基；4)将发根农杆菌LBA9402菌接种在第3步的培养基上，在35℃，避光条件下培养3天，将细菌活化。
5)将第2步培养出的无菌植株，从每个节间留下2枚叶片剪断，作成外殖体，并且在节位处涂上LBA9402细菌，用接种针刺伤沾菌的节位处，然后接种在第1步的培养基上，在25℃，弱光条件下(500lx)培养30天，就会从被刺伤的节位处形成不定根。
6)将第5步形成的不定根剪下，放在含有50mg／L的氨卞青霉素的第1步的培养基内(不加琼脂)，培养4天，更换同样的含有氨卞青霉素的培养基内反复除菌培养3次，彻底除掉细菌后，转接在第1步的培养基内(不加琼脂)筛选生长速度最快的根系。
7)将筛选出的根系破碎后分离出细胞液，用高压纸电泳法检测根系内是否含有胭脂碱或章鱼碱(正常的栝楼根系不能合成，而只有发根农杆菌的基因转移到细胞内萌发出的根系中才能够合成)，鉴定出含有胭脂碱或章鱼碱的根系，也就是我们需要的毛状根。
还可以将根系破碎分离出DNA，利用萨瑟恩DNA印迹杂交技术(Southernblotting)，利用LBA9402农杆菌的Ri质粒的分子探针与毛状根的DNA进行分子杂交，确认毛状根内确实含有Ri质粒上的基因片段。
8)在第1步的培养液内(无琼脂)，加入筛选出的毛状根，在25℃，弱光(5001x)，90rmp条件下培养25天，就可以获得50倍重量的毛状根。
9)在大型生物反应器(5L以上)内，加入第1步的培养液(无琼脂)，再添加2mg／L矮壮素，丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸、天冬酰氨和异亮氨酸各30mg／L的混合液，50ml／L立枯丝菌菌液(诱导子)，经高温灭菌处理后，按照培养液重量的10％接种上第8步的毛状根，在25℃，弱光或黑暗条件下培养20天，就会获得50—100倍重量的毛状根。
10)将毛状根经冷冻后进行破碎处理，然后在4℃低温下提取和分离蛋白质，经过纯化处理就可以获得26kd、27kd和29kd的核酸抑制蛋白。
权利要求
1.一种栝楼毛状根诱导和培养生产核酸抑制蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下各步骤(1)在每升植物培养基上加入20g／l蔗糖和8g／l琼脂，在125℃，0．1mPa压力下消毒15—18分钟，经冷却后作成平板培养基；将栝楼种子用乙醇和次氯酸钠消毒后，接种在第1步的培养基上，于20—25℃，用日光灯照射，亮度为1000—3000lx，每日光照12—16小时培养20—30天，种子萌芽长成无菌植株备用；(2)在每升细菌培养基上加入10g／l琼脂，经125℃，0．1mPa压力下消毒15—18分钟，经冷却后作成斜面培养基；(3)将发根农杆菌LBA9402菌接种在第3步的培养基上，在35—37℃，避光条件下培养3天，将细菌活化；(4)将第2步培养出的无菌植株，从每个节间留下2枚叶片剪断，作成外殖体，并且在节位处涂上LBA9402细菌，用接种针刺伤沾菌的节位处，然后接种在第1步的培养基上，在20—25℃，日光灯下，强度为500—10001x，培养10—30天，从被刺伤的节位处形成不定根；(5)在每升植物培养基上加入蔗糖20g／l和氨卞青霉素30—150mg／l制成杀菌培养基，将第5步形成的不定根剪下，放在杀菌培养基内，培养3—10天，更换同样的杀菌培养基内反复除菌培养2—5次，彻底除掉细菌后，转接在第1步的培养基内筛选生长速度最快的根系；(6)在每升植物培养基中加入20g／l蔗糖，制成培养液，加入筛选出的毛状根，在20—25℃，日光灯照射，光强为500—1500lx，在转速为90—150rmp的摇床上，培养15—25天，获得50—100倍重量的毛状根；(7)在生物反应器内，加入第1步的培养液，再添加维生素、氨基酸、诱导子，经高温灭菌处理后，按照培养液重量的2—10％接种上第8步的毛状根，在20—25℃，弱光或黑暗条件下培养15—30天，就会获得50—100倍重量的毛状根；(8)将毛状根经冷冻后进行破碎处理，然后在4℃低温下提取和分离蛋白质，经过纯化处理即获得本发明的26kd、27kd和29kd的核酸抑制蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种栝楼毛状根诱导和培养生产核酸抑制蛋白的方法,首先在植物培养基上加入蔗糖和琼脂制成培养基,将栝楼种子接种在培养基上,将发根农杆菌接种在培养基上,使细菌活化,将栝楼种子的无菌植株作成外殖体,接种针刺伤沾菌的节位处,从节位处形成不定根,将其接种在营养液中得到毛状根,经纯化处理即获得核酸抑制蛋白。本发明的方法培养毛状根,其产量可以达到200—300g/L/20日,其中核酸抑制蛋白含量达到0.5—1.0‰。
文档编号C12N1/20GK1280191SQ0010960
公开日2001年1月17日 申请日期2000年6月16日 优先权日2000年6月16日
发明者郭志刚 申请人:清华大学