专利名称：一种新的多肽——连接酶辅酶a32和编码这种多肽的多核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明描述了一种新的多肽——连接酶辅酶A32，以及编码此多肽的多核苷酸序列。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的制备方法和应用。
连接酶辅酶A类蛋白是一种致密的球形蛋白，它催化有氧代谢中重要的反应，例如柠檬酸循环的底物水平磷酸化步骤等。催化反应由位于酶的磷酸化中间体上的组氨酸残基进行，该组氨酸残基位于蛋白的α亚基上，在催化过程中被磷酸化。
该家族的四级结构为α2及β2的异四聚体，由两个αβ二聚体组装成一个大二聚体，在这一四聚体中，α亚基只与β亚基相互作用，而β亚基之间相互作用以形成αβ二聚体。两个活性位点囊位于α及β亚基之间的连接区域。辅酶A的一个分子在典型的核苷酸结合模板处与每个α亚基结合，每个α亚基中的特定的一个组氨酸被磷酸化。这个磷酸化组氨酸，是一个催化中间物，它被两个螺旋偶极子固定，每个偶极子分别源于两种亚基。一个αβ二聚体中的β亚基的一段短片段与另一个αβ二聚体的辅酶A结合位点十分接近。真核生物中连接酶辅酶A类蛋白的亚基在核中编码并在细胞质中作为前体合成而先于线粒体转运，加工以及组装。
该家族包括辅酶A连接酶，琥珀酰辅酶A合成酶α及β链，苹果酸辅酶A连接酶以及ATP柠檬酸裂合酶。家族中有些成员利用ATP，另一些则利用GTP。
本发明的多肽中含有连接酶辅酶A家族的结构特征以及保守的特征序列，该多肽及其激动剂拮抗剂抑制剂可用于诊断防治与能量代谢有关的疾病。
由于如上所述连接酶辅酶A32蛋白在机体内重要功能中起重要作用，而且相信这些调节过程中涉及大量的蛋白，因而本领域中一直需要鉴定更多参与这些过程的连接酶辅酶A32蛋白，特别是鉴定这种蛋白的氨基酸序列。新连接酶辅酶A32蛋白编码基因的分离也为研究确定该蛋白在健康和疾病状态下的作用提供了基础。这种蛋白可能构成开发疾病诊断和/或治疗药的基础，因此分离其编码DNA是非常重要的。
本发明的一个目的是提供分离的新的多肽——连接酶辅酶A32以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一个目的是提供编码该多肽的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供含有编码连接酶辅酶A32的多核苷酸的重组载体。
本发明的另一个目的是提供含有编码连接酶辅酶A32的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供生产连接酶辅酶A32的方法。
本发明的另一个目的是提供针对本发明的多肽——连接酶辅酶A32的抗体。
本发明的另一个目的是提供了针对本发明多肽——连接酶辅酶A32的模拟化合物、拮抗剂、激动剂、抑制剂。
本发明的另一个目的是提供诊断治疗与连接酶辅酶A32异常相关的疾病的方法。
本发明涉及一种分离的多肽，该多肽是人源的，它包含具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变体、生物活性片段或衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽。
本发明还涉及一种分离的多核苷酸，它包含选自下组的一种核苷酸序列或其变体(a)编码具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；(c)与(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少70％相同性的多核苷酸。
更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO:1中91-954位的序列；和(b)具有SEQ ID NO:1中1-1720位的序列。
本发明另外涉及一种含有本发明多核苷酸的载体，特别是表达载体；一种用该载体遗传工程化的宿主细胞，包括转化、转导或转染的宿主细胞；一种包括培养所述宿主细胞和回收表达产物的制备本发明多肽的方法。
本发明还涉及一种能与本发明多肽特异性结合的抗体。
本发明还涉及一种筛选的模拟、激活、拮抗或抑制连接酶辅酶A32蛋白活性的化合物的方法，其包括利用本发明的多肽。本发明还涉及用该方法获得的化合物。
本发明还涉及一种体外检测与连接酶辅酶A32蛋白异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，包括检测生物样品中所述多肽或其编码多核苷酸序列中的突变，或者检测生物样品中本发明多肽的量或生物活性。
本发明也涉及一种药物组合物，它含有本发明多肽或其模拟物、激活剂、拮抗剂或抑制剂以及药学上可接受的载体。
本发明还涉及本发明的多肽和/或多核苷酸在制备用于治疗癌症、发育性疾病或免疫性疾病或其它由于连接酶辅酶A32表达异常所引起疾病的药物的用途。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
本说明书和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，代表有义链或反义链。类似地，术语“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列及其片段或部分。当本发明中的“氨基酸序列”涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，这种“多肽”或“蛋白质”不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸。
蛋白质或多核苷酸“变体”是指一种具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列。所述改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替换。变体可具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸。变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失。
“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。“替换”是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。
“生物活性”是指具有天然分子的结构、调控或生物化学功能的蛋白质。类似地，术语“免疫学活性”是指天然的、重组的或合成蛋白质及其片段在合适的动物或细胞中诱导特定免疫反应以及与特异性抗体结合的能力。
“激动剂”是指当与连接酶辅酶A32结合时，一种可引起该蛋白质改变从而调节该蛋白质活性的分子。激动剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合连接酶辅酶A32的分子。
“拮抗剂”或“抑制物”是指当与连接酶辅酶A32结合时，一种可封闭或调节连接酶辅酶A32的生物学活性或免疫学活性的分子。拮抗剂和抑制物可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合连接酶辅酶A32的分子。
“调节”是指连接酶辅酶A32的功能发生改变，包括蛋白质活性的升高或降低、结合特性的改变及连接酶辅酶A32的任何其它生物学性质、功能或免疫性质的改变。
"基本上纯"是指基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化连接酶辅酶A32。基本上纯的连接酶辅酶A32在非还原性聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。连接酶辅酶A32多肽的纯度可用氨基酸序列分析。
“互补的”或“互补”是指在允许的盐浓度和温度条件下通过碱基配对的多核苷酸天然结合。例如，序列“C-T-G-A”可与互补的序列“G-A-C-T”结合。两个单链分子之间的互补可以是部分的或全部的。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间杂交的效率及强度有明显影响。
“同源性”是指互补的程度，可以是部分同源或完全同源。“部分同源”是指一种部分互补的序列，其至少可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交。这种杂交的抑制可通过在严格性程度降低的条件下进行杂交(Southern印迹或Northern印迹等)来检测。基本上同源的序列或杂交探针可竞争和抑制完全同源的序列与靶序列在的严格性程度降低的条件下的结合。这并不意味严格性程度降低的条件允许非特异性结合，因为严格性程度降低的条件要求两条序列相互的结合为特异性或选择性相互作用。
“相同性百分率”是指在两种或多种氨基酸或核酸序列比较中序列相同或相似的百分率。可用电子方法测定相同性百分率，如通过MEGALIGN程序(Lasergene softwarepackage,DNASTAR,Inc.,Madi son Wis.)。MEGALIGN程序可根据不同的方法如C1uster法比较两种或多种序列(Higgins,D.G.和P.M.Sharp(1988)Gene 73:237-244)。Cluster法通过检查所有配对之间的距离将各组序列排列成簇。然后将各簇以成对或成组分配。两个氨基酸序列如序列A和序列B之间的相同性百分率通过下式计算 也可以通过Cluster法或用本领域周知的方法如Jotun Hein测定核酸序列之间的相同性百分率(Hein J.,(1990)Methods in emzumology 183:625-645)。
“相似性”是指氨基酸序列之间排列对比时相应位置氨基酸残基的相同或保守性取代的程度。用于保守性取代的氨基酸例如，带负电荷的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸可包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电荷的头部基团有相似亲水性的氨基酸可包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。
“反义”是指与特定的DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。“反义链”是指与“有义链”互补的核酸链。
“衍生物”是指HFP或编码其的核酸的化学修饰物。这种化学修饰物可以是用烷基、酰基或氨基替换氢原子。核酸衍生物可编码保留天然分子的主要生物学特性的多肽。
“抗体”是指完整的抗体分子及其片段，如Fa、F(ab’)2及Fv，其能特异性结合连接酶辅酶A32的抗原决定簇。
“人源化抗体”是指非抗原结合区域的氨基酸序列被替换变得与人抗体更为相似，但仍保留原始结合活性的抗体。
“分离的”一词指将物质从它原来的环境(例如，若是自然产生的就指其天然环境)之中移出。比如说，一个自然产生的多核苷酸或多肽存在于活动物中就是没有被分离出来，但同样的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系统中与之共存的物质分开就是分离的。这样的多核苷酸可能是某一载体的一部分，也可能这样的多核苷酸或多肽是某一组合物的一部分。既然载体或组合物不是它天然环境的成分，它们仍然是分离的。
如本发明所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的连接酶辅酶A32”是指连接酶辅酶A32基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化连接酶辅酶A32。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。连接酶辅酶A32多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明提供了一种新的多肽——连接酶辅酶A32，其基本上是由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括连接酶辅酶A32的片段、衍生物和类似物。如本发明所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的连接酶辅酶A32相同的生物学功能或活性的多肽。本发明多肽的片段、衍生物或类似物可以是(Ⅰ)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；或者(Ⅱ)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代包含取代基；或者(Ⅲ)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(Ⅳ)这样一种，其中附加的氨基酸序列融合进成熟多肽而形成的多肽序列(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)通过本文的阐述，这样的片段、衍生物和类似物被认为在本领域技术人员的知识范围之内。
本发明提供了分离的核酸(多核苷酸)，基本由编码具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽的多核苷酸组成。本发明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列。本发明的多核苷酸是从人胎脑组织的cDNA文库中发现的。它包含的多核苷酸序列全长为1720个碱基，其开放读框91-954编码了287个氨基酸。此多肽具有连接酶辅酶A家族的特征序列，可推断出该连接酶辅酶A32具有连接酶辅酶A家族所代表的结构和功能。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本发明所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质或多肽，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”是指包括编码此多肽的多核苷酸和包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述描述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(两个序列之间具有至少50％，优选具有70％的相同性)。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll,42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的核酸片段。如本发明所用，”核酸片段”的长度至少含10个核苷酸，较好是至少20-30个核苷酸，更好是至少50-60个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码连接酶辅酶A32的多核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的编码连接酶辅酶A32的特异的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局限于1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的多核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段。
本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA。
上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。更经常选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook,et al.,MolecularCloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。还可得到商业供应的cDNA文库，如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因功能的出现或丧失；(3)测定连接酶辅酶A32的转录本的水平；(4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。
在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少10个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸。此外，探针的长度通常在2000个核苷酸之内，较佳的为1000个核苷酸之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
在第(4)种方法中，检测连接酶辅酶A32基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science1985；230:1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的多核苷酸序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的多核苷酸序列可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS,1977,74:5463-5467)测定。这类多核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或直接用连接酶辅酶A32编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
本发明中，编码连接酶辅酶A32的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体(Rosenberg,et al.Gene,1987,56:125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码连接酶辅酶A32的DNA序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a LaboratoryManual,cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件(如启动子、增强子等)和选择性标记基因。
本发明中，编码连接酶辅酶A32的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。
用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的连接酶辅酶A32(Science,1984；224:1431)。一般来说有以下步骤(1)．用本发明的编码人连接酶辅酶A32的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)．在合适的培养基中培养宿主细胞；(3)．从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
在步骤(2)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在步骤(3)中，重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但并不限于常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的多肽以及该多肽的拮抗剂、激动剂和抑制剂可直接用于疾病治疗，例如，可治疗恶性肿瘤、肾上腺缺乏症、皮肤病、各类炎症、HIV感染和免疫性疾病等。
连接酶辅酶A类蛋白催化有氧代谢中重要的反应，例如柠檬酸循环的底物水平磷酸化步骤等。该家族包括辅酶A连接酶，琥珀酰辅酶A合成酶α及β链，苹果酸辅酶A连接酶以及ATP柠檬酸裂合酶。家族中有些成员利用ATP，另一些则利用GTP。
连接酶辅酶A蛋白家族的特征性序列是形成其生物活性所必需。
本发明的多肽是含连接酶辅酶A蛋白家族的特征性序列的多肽，其表达异常将导致三羧酸循环中物质与能量代谢的障碍，影响有氧代谢过程，并产生相关的疾病。
由此可见，本发明的连接酶辅酶A32的表达异常将产生各种疾病尤其是物质代谢紊乱症、各种肿瘤、胚胎发育紊乱症、生长发育障碍性疾病、免疫性疾病，这些疾病包括但不限于物质代谢紊乱症异戊酸血症，丙酸血症，甲基丙二酸尿症，联合羧化酶缺陷，戊二酸血症Ⅰ型，苯丙酮尿症，白化病，色氨基血症，甘氨酸血症，高肌氨酸血症，尿素循环的代谢缺陷病，组氨酸代谢缺陷病，粘脂贮积症，雷-尼综合症，黄嘌呤尿症，乳清酸尿症，高脂蛋白血症，遗传性果糖不耐受，半乳糖血症，果糖代谢缺陷，糖原贮积症胚胎发育紊乱症先天性流产，腭裂，肢体缺如，肢体分化障碍，隐睾，房间隔缺损，神经管缺陷，先天性脑积水，虹膜缺损，先天性青光眼或白内障，先天性耳聋生长发育障碍性疾病精神发育迟缓，脑发育障碍，斜视，皮肤、脂肪和肌肉发育不良性疾病如先天性皮肤松弛症、白化病、早老症、先天性角化不良，骨与关节发育不良性疾病如软骨发育不全、骨骺发育不良、代谢性骨病，呆小症，侏儒症，性发育迟缓症各种组织的肿瘤胃癌，肝癌，肺癌，食管癌，乳腺癌，白血病，淋巴瘤，甲状腺肿瘤，子宫肌瘤，神经细胞瘤，星形细胞瘤，室管膜瘤，胶质细胞瘤，神经纤维瘤，结肠癌，子宫内膜癌，鼻咽癌，喉癌，气管肿瘤，纤维瘤，纤维肉瘤，脂肪瘤，脂肪肉瘤免疫性疾病类风湿性关节炎，慢性活动性肝炎，感染后心肌炎，系统性红斑狼疮，硬皮病，重症肌无力，格林-巴利综合症，自身免疫性溶血性贫血，获得性免疫缺陷综合症，支气管哮喘，阿斯匹林哮喘，变应性鼻炎，弥漫性肺间质纤维化，荨麻疹，特异性皮炎本发明的连接酶辅酶A32的表达异常还将产生某些遗传性，血液性疾病等。
本发明的多肽以及该多肽的拮抗剂、激动剂和抑制剂可直接用于疾病治疗，例如，可治疗各种疾病尤其是物质代谢紊乱症、各种肿瘤、胚胎发育紊乱症、生长发育障碍性疾病、免疫性疾病，某些遗传性，血液性疾病等。
本发明也提供了筛选化合物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)连接酶辅酶A32的药剂的方法。激动剂提高连接酶辅酶A32刺激细胞增殖等生物功能，而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。例如，能在药物的存在下，将哺乳动物细胞或表达连接酶辅酶A32的膜制剂与标记的连接酶辅酶A32一起培养。然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。
连接酶辅酶A32的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。连接酶辅酶A32的拮抗剂可以与连接酶辅酶A32结合并消除其功能，或是抑制该多肽的产生，或是与该多肽的活性位点结合使该多肽不能发挥生物学功能。
在筛选作为拮抗剂的化合物时，可以将连接酶辅酶A32加入生物分析测定中，通过测定化合物对连接酶辅酶A32和其受体之间相互作用的影响来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。能与连接酶辅酶A32结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，一般应对连接酶辅酶A32分子进行标记。
本发明提供了用多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞作为抗原以生产抗体的方法。这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还提供了针对连接酶辅酶A32抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。
多克隆抗体的生产可用连接酶辅酶A32直接注射免疫动物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。制备连接酶辅酶A32的单克隆抗体的技术包括但不限于杂交瘤技术(Kohler andMilstein.Nature,1975,256:495-497)，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al,PNAS,1985,81:6851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.Pat No.4946778)也可用于生产抗连接酶辅酶A32的单链抗体。
抗连接酶辅酶A32的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的连接酶辅酶A32。
与连接酶辅酶A32结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。
抗体还可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如连接酶辅酶A32高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭连接酶辅酶A32阳性的细胞。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与连接酶辅酶A32相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断连接酶辅酶A32的产生或活性。
本发明还涉及定量和定位检测连接酶辅酶A32水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的连接酶辅酶A32水平，可以用作解释连接酶辅酶A32在各种疾病中的重要性和用于诊断连接酶辅酶A32起作用的疾病。
本发明的多肽还可用作肽谱分析，例如，多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割，并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析，更好的是进行质谱分析。
编码连接酶辅酶A32的多核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于连接酶辅酶A32的无表达或异常/无活性表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计用于表达变异的连接酶辅酶A32，以抑制内源性的连接酶辅酶A32活性。例如，一种变异的连接酶辅酶A32可以是缩短的、缺失了信号传导功能域的连接酶辅酶A32，虽可与下游的底物结合，但缺乏信号传导活性。因此重组的基因治疗载体可用于治疗连接酶辅酶A32表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将编码连接酶辅酶A32的多核苷酸转移至细胞内。构建携带编码连接酶辅酶A32的多核苷酸的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook,et al.)。另外重组编码连接酶辅酶A32的多核苷酸可包装到脂质体中转移至细胞内。
多核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
抑制连接酶辅酶A32 mRNA的寡核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
编码连接酶辅酶A32的多核苷酸可用于与连接酶辅酶A32的相关疾病的诊断。编码连接酶辅酶A32的多核苷酸可用于检测连接酶辅酶A32的表达与否或在疾病状态下连接酶辅酶A32的异常表达。如编码连接酶辅酶A32的DNA序列可用于对活检标本进行杂交以判断连接酶辅酶A32的表达状况。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用连接酶辅酶A32特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测连接酶辅酶A32的转录产物。
检测连接酶辅酶A32基因的突变也可用于诊断连接酶辅酶A32相关的疾病。连接酶辅酶A32突变的形式包括与正常野生型连接酶辅酶A32 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条人染色体具体位置且并可以与其杂交。目前，需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。现在，只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置。根据本发明，为了将这些序列与疾病相关基因相关联，其重要的第一步就是将这些DNA序列定位于染色体上。
简而言之，根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
体细胞杂合细胞的PCR定位法，是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的cDNA库。
将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述，参见Verma等，Human Chromosomes:a Manualof Basic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick,MendelianInheritance in Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
接着，需要测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变，而该突变在任何正常个体中未观察到，则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体，通常涉及首先寻找染色体中结构的变化，如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。根据目前的物理作图和基因定位技术的分辨能力，被精确定位至与疾病有关的染色体区域的cDNA，可以是50至500个潜在致病基因间之一种(假定1兆碱基作图分辨能力和每20kb对应于一个基因)。
可以将本发明的多肽、多核苷酸及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。连接酶辅酶A32以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的连接酶辅酶A32的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1是本发明连接酶辅酶A32和结构域连接酶辅酶A家族的氨基酸序列同源性比较图。上方序列是连接酶辅酶A32，下方序列是结构域连接酶辅酶A家族。相同氨基酸在两个序列间用单字符氨基酸表示，相似氨基酸用“+”表示。
图2为分离的连接酶辅酶A32的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。32KDa为蛋白质的分子量。箭头所指为分离出的蛋白条带。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1连接酶辅酶A32的克隆用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎脑总RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene公司产品)从总RNA中分离poly(A)mRNA。2μg poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA。用Smart cDNA克隆试剂盒(购自Clontech)将cDNA片段定向插入到pBSK(+)载体(Clontech公司产品)的多克隆位点上，转化DH5α，细菌形成cDNA文库。用Dyeterminate cycle reaction sequencing kit(Perkin-Elmer公司产品)和ABI 377自动测序仪(Perkin-Elmer公司)测定所有克隆的5′和3′末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库(Genebank)进行比较，结果发现其中一个克隆0685g11的cDNA序列为新的DNA。通过合成一系列引物对该克隆所含的插入cDNA片段进行双向测定。结果表明，0685g11克隆所含的全长cDNA为1720bp(如Seq ID NO:1所示)，从第91bp至954bp有一个864bp的开放阅读框架(ORF)，编码一个新的蛋白质(如SeqID NO:2所示)。我们将此克隆命名为pBS-0685g11，编码的蛋白质命名为连接酶辅酶A32。实施例2cDNA克隆的结构域分析将本发明的连接酶辅酶A32的序列及其编码的蛋白序列，用GCG中的profile scan程序(Ba siclocal Alignment search tool)[Alt schul,SF et al.J.Mol.Biol.1990；215:403-10]，在prosite等数据库进行结构域分析。本发明的连接酶辅酶A32与结构域连接酶辅酶A家族有同源，同源结果示于
图1。实施例3:用RT-PCR方法克隆编码连接酶辅酶A32的基因用胎脑细胞总RNA为模板，以oligo-dT为引物进行逆转录反应合成cDNA，用Qiagene的试剂盒纯化后，用下列引物进行PCR扩增Primer1:5’-ATCAAACTTTGTAAAAAGGTCAAT-3’(SEQ ID NO:3)Primer2:5’-GTATAGAAATTTATTTGAATTCAA-3’(SEQ ID NO:4)Primer1为位于SEQ ID NO:1的5’端的第1bp开始的正向序列；Primer2为SEQ ID NO:1的中的3’端反向序列。
扩增反应的条件在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl,10mmol/LTris-Cl,(pH8.5),1.5mmol/L MgCl2,200μmol/L dNTP,10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司产品)。在PE9600型DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司)上按下列条件反应25个周期94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 2min。在RT-PCR时同时设β-actin为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化，用TA克隆试剂盒连接到pCR载体上(Invitrogen公司产品)。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与SEQ ID NO:1所示的1-1720bp完全相同。实施例4Northern印迹法分析连接酶辅酶A32基因的表达用一步法提取总RNA[Anal.Biochem 1987,162,156-159]。该法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M异硫氰酸胍-25mM柠檬酸钠，0.2M乙酸钠(pH4.0)对组织进行匀浆，加入1倍体积的苯酚和1/5体积的氯仿-异戊醇(49∶1)，混合后离心。吸出水相层，加入异丙醇(0.8体积)并将混合物离心得到RNA沉淀。将得到的RNA沉淀用70％乙醇洗涤，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸钠-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳。然后转移至硝酸纤维素膜上。用α-32P dATP通过随机引物法制备32P-标记的DNA探针。所用的DNA探针为
图1所示的PCR扩增的连接酶辅酶A32编码区序列(91bp至954bp)。将32P-标记的探针(约2×106cpm/ml)与转移了RNA的硝酸纤维素膜在一溶液中于42℃杂交过夜，该溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鲑精DNA。杂交之后，将滤膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager进行分析和定量。实施例5重组连接酶辅酶A32的体外表达、分离和纯化根据SEQ ID NO:1和
图1所示的编码区序列，设计出一对特异性扩增引物，序列如下Primer3:5’-CCCCATATGATGGGGAATCCAATGGCAAAAAAT-3’(Seq ID No:5)Primer4:5’-CATGGATCCTCAGAAGGTCTCCTCCTCTCGTAG-3’(Seq ID No:6)此两段引物的5’端分别含有NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点，其后分别为目的基因5’端和3’端的编码序列，NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点相应于表达载体质粒pET 28b(+)(Novagen公司产品，Cat.No.69865.3)上的选择性内切酶位点。以含有全长目的基因的pBS-0685g11质粒为模板，进行PCR反应。PCR反应条件为总体积50μl中含pBS-0685g11质粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分别为10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司产品)1μl。循环参数94℃ 20s,60℃ 30s,68℃ 2min，共25个循环。用NdeⅠ和BamHⅠ分别对扩增产物和质粒pET-28(+)进行双酶切，分别回收大片段，并用T4连接酶连接。连接产物转化用氯化钙法大肠杆细菌DH5α，在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB平板培养过夜后，用菌落PCR方法筛选阳性克隆，并进行测序。挑选序列正确的阳性克隆(pET-0685g11)用氯化钙法将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司产品)。在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB液体培养基中，宿主菌BL21(pET-0685g11)在37℃培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养5小时。离心收集菌体，经超声波破菌，离心收集上清，用能与6个组氨酸(6His-Tag)结合的亲和层析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司产品)进行层析，得到了纯化的目的蛋白连接酶辅酶A32。经SDS-PAGE电泳，在32KDa处得到一单一的条带(图2)。将该条带转移至PVDF膜上用Edams水解法进行N-端氨基酸序列分析，结果N-端15个氨基酸与SEQ ID NO:2所示的N-端15个氨基酸残基完全相同。实施例6 抗连接酶辅酶A32抗体的产生用多肽合成仪(PE公司产品)合成下述连接酶辅酶A32特异性的多肽NH2-Met-Gly-Asn-Pro-Met-Ala-Lys-Asn-Leu-Met-Lys-Hi s-Gly-Tyr-Pro-COOH(SEQ ID NO:7)。将该多肽分别与血蓝蛋白和牛血清白蛋白耦合形成复合，方法参见Avrameas,et al.Immunochemistry,1969；6:43。用4mg上述血蓝蛋白多肽复合物加上完全弗氏佐剂免疫家兔，15天后再用血蓝蛋白多肽复合物加不完全弗氏佐剂加强免疫一次。采用经15μg/ml牛血清白蛋白多肽复合物包被的滴定板做ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG。将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离抗多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性地与连接酶辅酶A32结合。实施例7本发明的多核苷酸片段用作杂交探针的应用从本发明的多核苷酸中挑选出合适的寡核苷酸片段用作杂交探针有多方面的用途，如用该探针可与不同来源的正常组织或病理组织的基因组或cDNA文库杂交以鉴定其是否含有本发明的多核苷酸序列和检出同源的多核苷酸序列，进一步还可用该探针检测本发明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列在正常组织或病理组织细胞中的表达是否异常。
本实施例的目的是从本发明的多核苷酸SEQ ID NO:1中挑选出合适的寡核苷酸片段用作杂交探针，并用滤膜杂交方法鉴定一些组织中是否含有本发明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列。滤膜杂交方法包括斑点印迹法、Southern印迹法、Northern印迹法和复印方法等，它们都是将待测的多核苷酸样品固定在滤膜上后使用基本相同的步骤杂交。这些相同的步骤是固定了样品的滤膜首先用不含探针的杂交缓冲液进行预杂交，以使滤膜上样品的非特异性的结合部位被载体和合成的多聚物所饱和。然后预杂交液被含有标记探针的杂交缓冲液替换，并保温使探针与靶核酸杂交。杂交步骤之后，未杂交上的探针被一系列洗膜步骤除掉。本实施例利用较高强度的洗膜条件(如较低盐浓度和较高的温度)，以使杂交背景降低且只保留特异性强的信号。本实施例选用的探针包括两类第一类探针是完全与本发明的多核苷酸SEQ ID NO:1相同或互补的寡核苷酸片段；第二类探针是部分与本发明的多核苷酸SEQ ID NO:1相同或互补的寡核苷酸片段。本实施例选用斑点印迹法将样品固定在滤膜上，在较高强度的的洗膜条件下，第一类探针与样品的杂交特异性最强而得以保留。一、探针的选用从本发明的多核苷酸SEQ ID NO:1中选择寡核苷酸片段用作杂交探针，应遵循以下原则和需要考虑的几个方面1，探针大小优选范围为18-50个核苷酸；2，GC含量为30％-70％，超过则非特异性杂交增加；3，探针内部应无互补区域；4，符合以上条件的可作为初选探针，然后进一步作计算机序列分析，包括将该初选探针分别与其来源序列区域(即SEQ ID NO:1)和其它已知的基因组序列及其互补区进行同源性比较，若与非靶分子区域的同源性大于85％或者有超过15个连续碱基完全相同，则该初选探针一般就不应该使用；5，初选探针是否最终选定为有实际应用价值的探针还应进一步由实验确定。完成以上各方面的分析后挑选并合成以下二个探针探针1(probe1)，属于第一类探针，与SEQ ID NO:1的基因片段完全同源或互补(41Nt):
5’-TGGGGAATCCAATGGCAAAAAATCTCATGAAACATGGCTAT-3’(SEQ ID NO:8)探针2(probe2)，属于第二类探针，相当于SEQ ID NO:1的基因片段或其互补片段的替换突变序列(41Nt):
5’-TGGGGAATCCAATGGCAAAACATCTCATGAAACATGGCTAT-3’(SEQ ID NO:9)与以下具体实验步骤有关的其它未列出的常用试剂及其配制方法请参考文献DNA PROBES G.H.Keller；M.M.Manak；Stockton Press,1989(USA)以及更常用的分子克隆实验手册书籍如《分子克隆实验指南》(1998年第二版)[美]萨姆布鲁克等著，科学出版社。
样品制备1，从新鲜或冰冻组织中提取DNA步骤1)将新鲜或新鲜解冻的正常肝组织放入浸在冰上并盛有磷酸盐缓冲液(PBS)的平皿中。用剪刀或手术刀将组织切成小块。操作中应保持组织湿润。2)以1000g离心切碎组织10分钟。3)用冷匀浆缓冲液(0.25mol/L蔗糖；25mmol/LTris-HCl,pH7.5；25mmol/LnaCl；25mmol/L MgCl2)悬浮沉淀(大约10ml/g)。4)在4℃用电动匀浆器以全速匀浆组织悬液，直至组织被完全破碎。5)1000g离心10分钟。6)用重悬细胞沉淀(每0.1g最初组织样品加1-5ml)，再以1000g离心10分钟。7)用裂解缓冲液重悬沉淀(每0.1g最初组织样品加1ml)，然后接以下的苯酚抽提法。2，DNA的苯酚抽提法步骤1)用1-10ml冷PBS洗细胞，1000g离心10分钟。2)用冷细胞裂解液重悬浮沉淀的细胞(1×108细胞/ml)最少应用100ul裂解缓冲液。3)加SDS至终浓度为1％，如果在重悬细胞之前将SDS直接加入到细胞沉淀中，细胞可能会形成大的团块而难以破碎，并降低的总产率。这一点在抽提＞107细胞时特别严重。4)加蛋白酶K至终浓度200ug/ml。5)50℃保温反应1小时或在37℃轻轻振摇过夜。6)用等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，在小离心机管中离心10分钟。两相应清楚分离，否则重新进行离心。7)将水相转移至新管。8)用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，离心10分钟。9)将含DNA的水相转移至新管。然后进行DNA的纯化和乙醇沉淀。3，DNA的纯化和乙醇沉淀步骤1)将1/10体积2mol/L醋酸钠和2倍体积冷100％乙醇加到DNA溶液中，混匀。在-20℃放置1小时或至过夜。2)离心10分钟。3)小心吸出或倒出乙醇。4)用70％冷乙醇500μl洗涤沉淀，离心5分钟。5)小心吸出或倒出乙醇。用500μl冷乙醇洗涤沉淀，离心5分钟。6)小心吸出或倒出乙醇，然后在吸水纸上倒置使残余乙醇流尽。空气干燥10-15分钟，以使表面乙醇挥发。注意不要使沉淀完全干燥，否则较难重新溶解。7)以小体积TE或水重悬DNA沉淀。低速涡旋振荡或用滴管吹吸，同时逐渐增加TE，混合至DNA充分溶解，每1-5×106细胞所提取的大约加1μl。
以下第8-13步骤仅用于必须除去污染时，否则可直接进行第14步骤。8)将RNA酶A加到DNA溶液中，终浓度为100μg/ml,37℃保温30分钟。9)加入SDS和蛋白酶K，终浓度分别为0.5％和100μg/ml。37℃保温30分钟。10)用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提反应液，离心10分钟。11)小心移出水相，用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)重新抽提，离心10分钟。12)小心移出水相，加1/10体积2mol/L醋酸钠和2.5体积冷乙醇，混匀置-20℃ 1小时。13)用70％乙醇及100％乙醇洗涤沉淀，空气干燥，重悬核酸，过程同第3-6步骤。14)测定A260和A280以检测DNA的纯度及产率。15)分装后存放于-20℃。样膜的制备1)取4×2张适当大小的硝酸纤维素膜(NC膜)，用铅笔在其上轻轻标出点样位置及样号，每一探针需两张NC膜，以便在后面的实验步骤中分别用高强度条件和强度条件洗膜。
2)吸取及对照各15微升，点于样膜上，在室温中晾干。
3)置于浸润有0.1mol/LNaOH,1.5mol/LNaCl的滤纸上5分钟(两次)，晾干置于浸润有0.5mol/L Tris-HCl(pH7.0),3mol/LNaCl的滤纸上5分钟(两次)，晾干。
4)夹于干净滤纸中，以铝箔包好，60-80℃真空干燥2小时。
探针的标记1)3μlProbe(0.1OD/10μl)，加入2μlKinase缓冲液，8-10μCiγ-32P-dATP+2UKinase，以补加至终体积20μl。
2)37℃保温2小时。
3)加1/5体积的溴酚蓝指示剂(BPB)。
4)过Sephadex G-50柱。
5)至有32P-Probe洗出前开始收集第一峰(可用Monitor监测)。
6)5滴/管，收集10-15管。
7)用液体闪烁仪监测同位素量8)合并第一峰的收集液后即为所需制备的32P-Probe(第二峰为游离γ-32P-dATP)。
预杂交将样膜置于塑料袋中，加入3-10mg预杂交液(10×Denhardt’s；6×SSC，0.1mg/mlCT DNA(小牛胸腺DNA)。)，封好袋口后，68℃水浴摇2小时。
杂交将塑料袋剪去一角，加入制备好的探针，封好袋口后，42℃水浴摇过夜。
洗膜高强度洗膜1)取出已杂交好的样膜。
2)2×SSC,0.1％SDS中，40℃洗15分钟(2次)。
3)0.1×SSC,0.1％SDS中，40℃洗15分钟(2次)。
4)0.1×SSC,0.1％SDS中，55℃洗30分钟(2次)，室温晾干。低强度洗膜1)取出已杂交好的样膜。
2)2×SSC,0.1％SDS中，37℃洗15分钟(2次)。
3)0.1×SSC,0.1％SDS中，37℃洗15分钟(2次)。
4)0.1×SSC,0.1％SDS中，40℃洗15分钟(2次)，室温晾干。
X-光自显影-70℃,X-光自显影(压片时间根据杂交斑放射性强弱而定)。
实验结果采用低强度洗膜条件所进行的杂交实验，以上两个探针杂交斑放射性强弱没有明显区别；而采用高强度洗膜条件所进行的杂交实验，探针1的杂交斑放射性强度明显强于另一个探针杂交斑的放射性强度。因而可用探针1定性和定量地分析本发明的多核苷酸在不同组织中的存在和差异表达。实施例8 DNA Microarray基因芯片或基因微矩阵(DNA Microarray)是目前许多国家实验室和大制药公司都在着手研制和开发的新技术，它是指将大量的靶基因片段有序地、高密度地排列在玻璃、硅等载体上，然后用荧光检测和计算机软件进行数据的比较和分析，以达到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。本发明的多核苷酸可作为靶DNA用于基因芯片技术用于高通量研究新基因功能；寻找和筛选组织特异性新基因特别是肿瘤等疾病相关新基因；疾病的诊断，如遗传性疾病。其具体方法步骤在文献中已有多种报道，如可参阅文献DeRisi,J.L.,Lyer,V.&Brown,P.O.(1997)Science278,680-686.及文献Helle,R.A.,Schema,M.,Chai,A.,Shalom,D.,(1997)PNAS 94:2150-2155.(一)点样各种不同的全长cDNA共计4000条多核苷酸序列作为靶DNA，其中包括本发明的多核苷酸。将它们分别通过PCR进行扩增，纯化所得扩增产物后将其浓度调到500ng/μl左右，用Cartesian 7500点样仪(购自美国Cartesian公司)点于玻璃介质上，点与点之间的距离为280μm。将点样后的玻片进行水合、干燥、置于紫外交联仪中交联，洗脱后干燥使DNA固定在玻璃片上制备成芯片。其具体方法步骤在文献中已有多种报道，本实施例的点样后处理步骤是1．潮湿环境中水合4小时；2．0.2％SDS洗涤1分钟；3．ddH2O洗涤两次，每次1分钟；4．NaBH4封闭5分钟；5．95℃水中2分钟；6．0.2％SDS洗涤1分钟；7．ddH2O冲洗两次；8．凉干，25℃储存于暗处备用。(二)探针标记用一步法分别从正常肝与肝癌中抽提总mRNA，并用Oligotex mRNA Midi Kit(购自QiaGen公司)纯化mRNA，通过反转录分别将荧光试剂Cy3dUTP(5-Amino-propargyl-2’-deoxyuridine 5’-triphate coupled to Cy3 fluorescent dye，购自Amersham Phamacia Biotech公司)标记正常肝组织的mRNA，用荧光试剂Cy5dUTP(5-Amino-propargyl-2’-deoxyuridine 5’-triphate coupled to Cy5fluorescent dye，购自Amer sham Phamacia Biotech公司)标记肝癌组织mRNA，经纯化后制备出探针。具体步骤参照及方法见Schena,M.,Shalon,D.,Heller,R.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.93:10614-10619.Schena,M.,Shalon,Dari.,Davis,R.W.(1995)Science.270.(20):467-480.(三)杂交分别将来自以上两种组织的探针与芯片一起在UniHybTMHybridizationSolution(购自TeleChem公司)杂交液中进行杂交16小时，室温用洗涤液(1×SSC,0.2％SDS)洗涤后用ScanArray 3000扫描仪(购自美国General Scanning公司)进行扫描，扫描的图象用Imagene软件(美国Biodiscovery公司)进行数据分析处理，算出每个点的Cy3/Cy5比值，该比值小于0.5大于2的点被认为是表达有差异的基因。实验结果表明，Cy3 signal=4399.21(取四次实验的平均值)，Cy5signal=8236.66(取四次实验的平均值)，Cy3/Cy5=0.5341，本发明的多核苷酸在以上两种组织中的表达无明显差异。
序列表(1)一般信息(ⅱ)发明名称连接酶辅酶A32及其编码序列(ⅲ)序列数目9(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅱ)序列特征(A)长度1720bp(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(xⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:1 ATCAAACTTTGTAAAAAGGTCAATTAAGCTAGTTAGCAGAGACTATCAGTGGCTTCAAAG61 ACTCCAGTTGGATTCATTGGACTGGGCAACATGGGGAATCCAATGGCAAAAAATCTCATG121 AAACATGGCTATCCACTTATTATTTATGATGTGTTCCCTGATGCCTGCAAAGAGTTTCAA181 GATGCAGGTGAACAGGTAGTATCTTCCCCAGCAGATGTTGCTGAAAAAGCTGACAGAATT241 ATTACAATGCTGCCCACCAGTATCAATGCAATAGAAGCTTATTCCGGAGCAAATGGGATT301 CTAAAAAAAGTGAAGAAGGGCTCATTATTAATAGATTCCAGCACTATTGATCCTGCAGTT361 TCAAAAGAATTGGCCAAAGAAGTTGAGAAAATGGGAGCAGTTTTCATGGATGCCCCTGTT421 TCTGGTGGTGTAGGAGCTGCACGATCTGGGAACCTCACGTTTATGGTGGGAGGAGTTGAA481 GATGAATTTGCTGCTGCCCAAGAGTTGCTGGGGTGCATGGGCTCCAATGTGGTGTACTGT541 GGAGCTGTTGGGACTGGGCAGGCGGCAAAGATCTGCAACAACATGCTGTTAGCTATTAGT601 ATGATTGGAACTGCTGAAGCTATGAATCTTGGAATCAGGTTAGGGCTTGACCCAAAACTA661 CTGGCTAAAATCCTAAATATGAGCTCAGGACGGTGTTGGTCAAGTGACACTTATAATCCT721 GTACCTGGAGTGATGGATGGCGTTCCCTCGGCTAATAACTATCAGGGTGGATTTGGAACA781 ACACTCATGGCTAAGGATCTGGGATTGGCACAAGACTCTGCTACCAGCACAAAGAGCCCA841 ATCCTTCTTGGCAGTCTGGCCCATCAGATCTACAGGATGATGTGTGCAAAGGGCTACTCA901 AAGAAAGACTTCTCATCCGTGTTCCAGTTCCTACGAGAGGAGGAGACCTTCTGAGTGTGC961 CCTTTGGCCACGGACACTGTTGGGAACCAAACTCTGTCTTGGAGCCTCCTTTTAGCTCAC1021 TCCACAAGTAAATGGATTTAATCAAAGGTCACCTATCTGCTTTTGATTGTCTAGGTCACA1081 GTAATCCCTAGGATTTTTCACCGCTTATTCTTTTTGTCTTTTTAACAAACATATTATCCG1141 AATTTTTTTTCTGCAAGCCACTGATAGTCTCTGCTAACTAGCTTAATTGACCTTTTTACA1201 AAGTTTGATCCCCAAGCATCCTCAACTAAATCATTGAATACTTCAATCAGGATATTATCT1261 GCTTTACTTTACAAATAAAACCAAATCTTTTGTCAACAGGATGAAACCCATCTTAAAGGA1321 AAGAAAAGGAATTGGTGTGAAGAGAGAAGTTAGAGAAGGGAAATGCAGTGAATTACTATC1381 TGTGTCCATCAGGAAGTTTGTCCTGTTAACCAAATGGTTACTGCACTACCAGGGTTACTG1441 GTTTATTTTCCAGGGAGCTGATAAAGCAGGAGAACTGTTGCTGCATGTTTTCTATTTGGA1501 CTCCGTCACAATATGGTAGGATATCCCTCACCAACTCCCGACACTCAGCAGACTTGTTTT1561 TATATTTTTTTCTTTCTTGTACATTCTTACTACGTATTTTTTGACTTAAGAATGACATCT1621 TTAGACGCATTTCAGAGCCAATGATGATATTTGCTTTAGATAATTATTATATTATTATAA1681 ATATAGCCATATTATTTTGAATTCAAATAAATTTCTATAC(3)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度222个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型多肽(xⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:1 Met Gly Asn Pro Met Ala Lys Asn Leu Met Lys His Gly Tyr Pro16 Leu Ile Ile Tyr Asp Val Phe Pro Asp Ala Cys Lys Glu Phe Gln31 Asp Ala Gly Glu Gln Val Val Ser Ser Pro Ala Asp Val Ala Glu46 Lys Ala Asp Arg Ile Ile Thr Met Leu Pro Thr Ser Ile Asn Ala61 Ile Glu Ala Tyr Ser Gly Ala Asn Gly Ile Leu Lys Lys Val Lys76 Lys Gly Ser Leu Leu Ile Asp Ser Ser Thr Ile Asp Pro Ala Val91 Ser Lys Glu Leu Ala Lys Glu Val Glu Lys Met Gly Ala Val Phe106 Met Asp Ala Pro Val Ser Gly Gly Val Gly Ala Ala Arg Ser Gly121 Asn Leu Thr Phe Met Val Gly Gly Val Glu Asp Glu Phe Ala Ala136 Ala Gln Glu Leu Leu Gly Cys Met Gly Ser Asn Val Val Tyr Cys151 Gly Ala Val Gly Thr Gly Gln Ala Ala Lys Ile Cys Asn Asn Met166 Leu Leu Ala Ile Ser Met Ile Gly Thr Ala Glu Ala Met Asn Leu181 Gly Ile Arg Leu Gly Leu Asp Pro Lys Leu Leu Ala Lys Ile Leu196 Asn Met Ser Ser Gly Arg Cys Trp Ser Ser Asp Thr Tyr Asn Pro211 Val Pro Gly Val Met Asp Gly Val Pro Ser Ala Asn Asn Tyr Gln226 Gly Gly Phe Gly Thr Thr Leu Met Ala Lys Asp Leu Gly Leu Ala241 Gln Asp Ser Ala Thr Ser Thr Lys Ser Pro Ile Leu Leu Gly Ser256 Leu Ala His Gln Ile Tyr Arg Met Met Cys Ala Lys Gly Tyr Ser271 Lys Lys Asp Phe Ser Ser Val Phe Gln Phe Leu Arg Glu Glu Glu286 Thr Phe(4)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度24碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(xⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:ATCAAACTTTGTAAAAAGGTCAAT24(5)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度24碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(xⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GTATAGAAATTTATTTGAATTCAA24(6)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征
(A)长度33碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(xⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:CCCCATATGATGGGGAATCCAATGGCAAAAAAT 33(7)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度33碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(xⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:CATGGATCCTCAGAAGGTCTCCTCCTCTCGTAG 33(8)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型多肽(xⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Met-Gly-Asn-Pro-Met-Ala-Lys-Asn-Leu-Met-Lys-Hi s-Gly-Tyr-Pro15(9)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度41碱基(B)类型核酸
(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(xⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:TGGGGAATCCAATGGCAAAAAATCTCATGAAACATGGCTAT 41(10)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度41碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(xⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:TGGGGAATCCAATGGCAAAACATCTCATGAAACATGGCTAT 4权利要求
1.一种分离的多肽-连接酶辅酶A32，其特征在于它包含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、类似物或衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽、类似物或衍生物的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少95％的相同性。
3.如权利要求2所述的多肽，其特征在于它包含具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含选自下组中的一种(a)编码具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽或其片段、类似物、衍生物的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；或(c)与(a)或(b)有至少70％相同性的多核苷酸。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含编码具有SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的多核苷酸。
6.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸的序列包含有SEQ ID NO:1中91-954位的序列或SEQ ID NO:1中1-1720位的序列。
7.一种含有外源多核苷酸的重组载体，其特征在于它是由权利要求4-6中的任一权利要求所述多核苷酸与质粒、病毒或运载体表达载体构建而成的重组载体。
8.一种含有外源多核苷酸的遗传工程化宿主细胞，其特征在于它是选自于下列一种宿主细胞(a)用权利要求7所述的重组载体转化或转导的宿主细胞；或(b)用权利要求4-6中的任一权利要求所述多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
9.一种具有连接酶辅酶A32活性的多肽的制备方法，其特征在于所述方法包括(a)在表达连接酶辅酶A32条件下，培养权利要求8所述的工程化宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有连接酶辅酶A32活性的多肽。
10.一种能与多肽结合的抗体，其特征在于所述抗体是能与连接酶辅酶A32特异性结合的抗体。
11.一类模拟或调节多肽活性或表达的化合物，其特征在于它们是模拟、促进、拮抗或抑制连接酶辅酶A32的活性的化合物。
12.如权利要求11所述的化合物，其特征在于它是SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列或其片段的反义序列。
13.一种权利要求11所述化合物的应用，其特征在于所述化合物用于调节连接酶辅酶A32在体内、体外活性的方法。
14.一种检测与权利要求1-3中的任一权利要求所述多肽相关的疾病或疾病易感性的方法，其特征在于其包括检测所述多肽的表达量，或者检测所述多肽的活性，或者检测多核苷酸中引起所述多肽表达量或活性异常的核苷酸变异。
15.如权利要求1-3中的任一权利要求所述多肽的应用，其特征在于它应用于筛选连接酶辅酶A32的模拟物、激动剂，拮抗剂或抑制剂；或者用于肽指纹图谱鉴定。
16.如权利要求4-6中的任一权利要求所述的核酸分子的应用，其特征在于它作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
17.如权利要求1-6及11中的任一权利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的应用，其特征在于用所述多肽、多核苷酸或其模拟物、激动剂、拮抗剂或抑制剂以安全有效剂量与药学上可接受的载体组成作为诊断或治疗与连接酶辅酶A32异常相关的疾病的药物组合物。
18.权利要求1-6及11中的任一权利要求所述的多肽、多核苷酸或化合物的应用，其特征在于用所述多肽、多核苷酸或化合物制备用于治疗如恶性肿瘤，血液病，HIV感染和免疫性疾病和各类炎症的药物。
全文摘要
本发明公开了一种新的多肽——连接酶辅酶A32,编码此多肽的多核苷酸和经DNA重组技术产生这种多肽的方法。本发明还公开了此多肽用于治疗多种疾病的方法,如恶性肿瘤,血液病,HIV感染和免疫性疾病和各类炎症等。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码这种新的连接酶辅酶A32的多核苷酸的用途。
文档编号C12Q1/25GK1307105SQ00111530
公开日2001年8月8日 申请日期2000年1月26日 优先权日2000年1月26日
发明者毛裕民, 谢毅 申请人:上海博道基因技术有限公司