专利名称：一种构建苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌的方法
技术领域：
本发明属于苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌的构建方法领域，与微生物农药基因工程方法有关。
苏云金芽胞杆菌是目前世界上应用范围最广泛的微生物杀虫剂。最初都是使用筛选的野生型菌株进行生产，随着分子生物学的发展，人们逐渐利用基因工程的手段对野生型菌株进行改造，如Ecogen公司利用结合转移的方法，将菌株EG2158中携带杀鞘翅目昆虫毒素基因cry3A基因的88Mda质粒转入HD-263-8，所得到的新菌株EG2421带有含cry3A基因的88MDa质粒及本身带有的60MDa质粒上存在的crylAc基因。90年代，随着电脉冲技术的成熟，人们可以直接将含有目的基因的质粒直接转入野生型菌株。1995年，Ecogen公司注册了以工程菌EG7673为生产菌株的生物杀虫剂RAVEN，它含多拷贝重组cry3Ba基因质粒，能够产生异常高水平的Cry3杀虫晶体蛋白。
目前，国内外大多利用通过增加某种杀虫晶体蛋白基因的拷贝数来提高蛋白产量，但试验表明，苏云金芽胞杆菌细胞中杀虫晶体蛋白基因的拷贝数有一最大阈值，超过此值，蛋白的合成不再增加，而且苏云金杆菌的高毒力原于各种不同cry基因的协同作用，某种基因过量表达将抑制其它基因的正常表达。利用辅助蛋白的作用即可提高基因的表达，又不会在转录水平影响其它基因的表达。因此，现有的方法所构建的工程菌杀虫效率和生产成本都有待进一步提高。
本发明的目的在于克服现有技术之不足，利用帮助蛋白构建一种苏云金芽胞杀虫工程菌，以提高其杀虫晶体蛋白的表达量，促进晶体形成，提高杀虫效率，降低生产成本。
本发明通过以下技术方案实施一种苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌的构建方法，其过程包括PCR，其步骤包括1)从苏云金芽胞杆菌以色列亚种中克隆出p19、p20两个与野生型菌株的基因型一的辅助蛋白基因；2)将辅助基因进行限制性内切酶酶切，并连接到如穿梭质粒或解离载体上，使辅助基因能够在苏云金芽胞杆菌中正常表达；3)将含p19、p20的穿梭质粒分别电转化入野生型菌株；4)通过质粒图谱、PCR、Southern杂交和聚丙烯酰氨凝胶电泳筛选、鉴定转化子；5)通过摇瓶培养、生物测定筛选发酵性能优良、毒力高的转化子。所述的含p19、p20的穿梭质粒及p19、p20基因与cry基因的穿梭质粒分别电转化入野生型菌株的方法包括以272mM蔗糖，15％甘油配制的溶液作为缓冲液，在0.4cm电脉冲杯中置50-80μl感受态细胞，加入质粒5μl(约1μl)。电脉冲采用25μF，200Ω，6.25-9KV/cm的条件电击一次。
所述的通过质粒图谱、PCR、Southern杂交(DNA-DNA杂交)及聚丙烯酰氮凝胶电泳进行转化子的筛选与鉴定步骤包括以1％D蛋白栋，0.5％酵母粉，1％NaCl，pH7的培养液过夜培养活化菌种，再用活化菌液接种(1/100)LB培养液。待菌体生长至对数中期，收集菌体，TE(10mM Tris·Cl，1mMEDTA，pH8.0)洗菌一次。菌体悬于100μl溶液I(50mMGlucose，25mM Tris·Cl(pH8.0)，10mM EDTA)，加入5-10μl溶菌酶(20mg/ml)，以后的操作按碱法质粒抽提进行。
所述的大肠杆菌的质粒抽提沿用常规的方法。
所述的PCR的条件是94℃1分钟，49℃1分钟，72℃1分钟，25个循环。
所述的(DNA-DNA杂交方法包括质粒电泳采用0.55％琼脂糖凝胶，杂交膜使用硝酸纤维素膜(Hybond)，具体转膜步骤和杂交及显色按常规方法。
所述的聚丙烯酰氨凝胶电泳方法包括L8培养基发酵液200μl离心，沉淀用1MNaCl和无菌水各洗两次，沉淀物再悬于1ml无菌水中，取100μl与等量上样缓冲(2×)混合，沸水中处理3分钟，取10-20μ1点样电泳，溶液配制及其它具体操作按常规方法。
所述的摇瓶培养、生物测定筛选发酵性能优良、毒力高的转化子的步骤包括生物测定的的培养基配方为黄豆饼粉4％，玉米淀粉2％，鱼粉1％，蛋白胨0.1％，酵母粉0.2％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O0.07％，CaCO30.2％，此为L8培养基。
小菜蛾和棉铃虫的生测方法按常规方法。甜菜夜蛾生测方法按常规方法。但在感染饲料配方上调整为，将防腐剂由尼泊金，甲醛等换成醋酸(终浓度0.005％)。观察时间改为72小时。
所述的菌株发酵培养基配方为碳源5.0％、氮源A4.0％、氮源B2.0％、氮源C0.2％、生长因子0.1％、KH2PO40.2％、CaCO30.2％。将上述培养基装量于20ml/500ml三角瓶，pH值7.0，接种量1％。
所述的培养条件为在30℃下培养按以上培养基与对照培养基在同一条件下比较，本发明的培养基发酵效价达4000IU/μl以上，比对照培养基提高了8.7％。
本发明具有以下积极的效果(1)由于辅助基因可以解决菌株的高表达问题，本发明利用辅助基因构建了一系列的苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌，如BMB21882、BMB15358、BMB83383、YBT803-1-19，表明发明在构建工程菌的过程中切实可行，重复性好。经继代培养，辅助基因能够在工程菌中稳定存在，表达正常，对受体菌的生长无重大影响。
(2)利用p20构建的防治棉花和蔬菜害虫高效苏云金芽胞杆菌工程菌WG-001，其田间防治小菜蛾效果比美国Abbott公司产品Dipel提高2.65倍，比化学农药20％速灭杀丁EC提高3.1倍，防治效果达85％-90％。对棉铃虫的防治效果比Dipel提高20％，与40％的甲胺磷的800倍稀释液的毒力相当，防效在80％-91％。
(3)上述几个不同的工程菌的LC50值均有大幅度地提高。
以下结合图表和实施例对本发明作进一步地说明本发明中p19帮助蛋白对野生菌株表达的影响表1 受体菌YBT803-1和转化子YBT803-1-19对小菜蛾的毒力
本发明中p20帮助蛋白对野生型菌株的影响表2 天然菌株及其pBMB1808转化子伴胞晶体的大小菌株/stainYBT1520BMB21882 YBT1535 BMB15358 YBT833 BMB83383长/Length 1.852.45 1.76 2.34 1.87 2.39宽/Width 0.8 1.06 0.75 1.12 0.80 0.95长/宽L/W 2.31∶1 2.31∶12.35∶1 2.01∶1 2.34∶1 2.51∶1体积/V 0.390.92 0.33 0.98 0.24 0.72*每种样品随机测量30个晶体；长度单位为μm，体积单位为μm3。*pBMB1808是含有p20基因的解离载体。*BMB21882、BMB15358、BMB83383分别是野生型菌株YBT1520、YBT1535、YBT833的含有pBMB1808的转化子。
表3天然菌株及其pBMB1808转化子对小菜蛾的毒力菌株/strain 回归方程LC50RYBT1520y＝5.87＋1.43X 0.249 0.96BMB21882 y＝5.60＋0.84X 0.210 0.95YBT1535y＝6.14＋1.72X 0.214 0.97BMB15358 y＝5.84＋1.32X 0.229 0.99YBT833 y＝6.80＋2.50X 0.247 0.95BMB83383 y＝5.66＋1.45X 0.339 0.92*供试幼虫为三龄小菜蛾，供试样品为洗涤过的PM培养物的胞晶混合物。感染48h后统计死亡率。LC50单位为μl/ml，指每ml中所含发酵液的μl数。
表4 天然菌株及其pBMB1808转化子对棉铃虫的毒力/strain 回归方程 LC50RYBT1520y＝3.58＋1.14X 2.941 0.97BMB21882 y＝4.12＋0.56X 40.0000.94YBT1535y＝4.33＋1.71X 2.457 0.97BMB15358 y＝4.03＋0.57X 52.6310.97YBT833 y＝4.28＋1.44X 3.086 0.94BMB83383 y＝4.00＋0.89X 12.5000.91*供试幼虫为初孵棉铃虫，供试样品为洗涤过的PM培养物的胞晶混合物。感染72h后统计死亡率。三次重复；LC50单位为μl/ml，指每ml中所含发酵液的μl数。
权利要求
1.一种构建苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌的方法，其过程包括PCR，其特征在于所述的步骤包括1)从苏云金芽胞杆菌以色列亚种中克隆出p19、p20两个与野生型菌株的基因型一致的辅助蛋白基因；2)将辅助基因进行限制性内切酶酶切，并连接到适当的载体上，使辅助基因能够在苏云金芽胞杆菌中正常表达；3)将含p19、p20的穿梭质粒分别电转化入野生型菌株；4)通过质粒图谱、PCR、DNA-DNA杂交和聚丙烯酰氨凝胶电泳筛选、鉴定转化子；5)通过摇瓶培养、生物测定筛选发酵性能优良、毒力高的转化子。
1.根据权利要求1所述的一种构建苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌的方法，其特征在于步骤3)所述的方法包括以272mM蔗糖，15％甘油配制的溶液作为缓冲液，在0.4cm电脉冲杯中置50-80μl感受态细胞，加入质粒5μl，采在25μF，200Ω，6.25-9KV/cm的电脉冲条件下电击一次。
3.根据权利要求1所述的一种构建苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌的方法，其特征在于步骤4)所述的方法包括以1％D蛋白栋，0.5％酵母粉，1％NaCl，pH7.的培养液过夜培养活化菌种，再用活化菌液接种(1/100)LB培养液。待菌体生长至对数中期，收集菌体，TE(10mM Tris·Cl，1mMEDTA，pH8.0)洗菌一次，菌体悬于100μl溶液I(50mMGlucose，25mM Tris·Cl(pH8.0)，10mM EDTA)，加入5-10μl溶菌酶(20mg/ml)，以后的操作按碱法质粒抽提进行。
4.根据权利要求4所述的一种构建苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌的方法，其特征在于该步骤中的PCR的条件是94℃1分钟，49℃1分钟，72℃1分钟，25个循环。
6.根据权利要求1所述的种苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌的构建方法，其特征在于所述步骤5)中的生物测定采用的培养基配方为黄豆饼粉4、玉米淀粉2％，鱼粉1％，蛋白胨0.1％，酵母粉0.2、KH2PO40.1、MgSO4·7H2O0.07％，CaCO30.2％。
7.根据权利要求1所述的一种构建苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌的方法，其特征在于所述的步骤5)中的发酵培养基配方为碳源5.0％、氮源A4.0％、氮源B2.0％、氮源C0.2％、生长因子0.1％、KH2PO40.2％、CaCO30.2％。
全文摘要
本发明属于微生物杀虫农药技术领域,具体涉及一种构建苏云金芽胞杆菌杀虫工程菌的方法,其特点是,利用PCR技术从苏云金芽胞以色列亚种中克隆p19,p20两个辅助蛋白基因,通过基因工程方法构建具有特异毒力的工程菌,与已有技术相比,本发明提高了苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的表达量,促进了晶体的形成,提高了杀虫效率,降低了生产成本。
文档编号C12N15/75GK1337466SQ0011595
公开日2002年2月27日 申请日期2000年8月15日 优先权日2000年8月15日
发明者喻子牛, 刘子铎, 孙明, 邵宗泽, 徐世瑾, 江昊, 郑嵘 申请人:华中农业大学