编码1rp基因的新核苷酸序列的制作方法

专利名称：编码1rp基因的新核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明提供了编码lrp基因的核苷酸序列，和用棒状细菌发酵生产氨基酸、尤其是赖氨酸和异亮氨酸的方法，其中棒状细菌中lrp基因的表达被修饰。
L-氨基酸用于动物营养、食品工业、人用药物及制药工业。
已知这些氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于氨基酸的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物如赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-半胱氨酸有抗性或重要的调节氨基酸营养缺陷的并产生L-氨基酸的菌株。一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于棒杆菌的生产L-氨基酸的菌株的改良。
LRP(亮氨酸效应蛋白)是首先在大肠杆菌中描述的一全局调节子，其影响一系列基因的转录，其基因产物参与氨基酸的转运、生物合成和降解(Calvo and Matthews，微生物学综述58，466-490，1994)。
近年来，在其他生物体如Bradyrhizobium japonicum(King andO’Brian，细菌学杂志，179，1828-1831，1997)，产气克雷伯氏杆菌(Janes and Bender，细菌学杂志，181，1054-1058，1999)、酸热硫化热菌(Charlier等，基因，201，63-68，1997)和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(Belitsky等，细菌学杂志，179，5448-5457，1997)中也已鉴定了类似的基因。
在大肠杆菌中，lrp蛋白调节其自身的表达。Lrp对大肠杆菌中的许多基因也有正和负性影响。通常是在生物合成途径中有活性的基因产物的表达被刺激。具有分解代谢作用的基因产物通常被相应地负控制。在某些情况下，lrp的作用通过加入L-亮氨酸而增强，但是加入L-亮氨酸也可具有负作用(Newman等，见Neidhardt等，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞及分子生物学，美国微生物学会，华盛顿，1513-1525，1996)。在大肠杆菌中，lrp调节在氨基酸生物合成和氨基酸分解代谢中起中心作用的大量基因和操纵子。在大肠杆菌中的下列操纵子例如被负控制livJ，其编码支链氨基酸的高度复杂摄入系统中的一结合蛋白(Haney等，细菌学杂志，174，108-115，1992)，lysU，其编码赖氨酸tRNA合成酶(Gazeau等，FEBS通信，300，254-258，1994)。大肠杆菌中目前已知被正影响的基因包括ilvIH，gltBDF和leuABCD等(Lin等，细菌学杂志，174，1948-1955，1992)。
上述最后一个操纵子在谷氨酸棒杆菌的亮氨酸生物合成中令人非常感兴趣，并且在赖氨酸生物合成中也特别令人感兴趣。有怀疑在亮氨酸营养缺陷型和升高的赖氨酸产量之间有相关性(Schrumpf等，应用微生物学及生物技术，37，566-571，1992)。Patek等(应用及环境微生物学，60，133-140，1994)已证实在某些谷氨酸棒杆菌的赖氨酸生产菌中失活leuA导致赖氨酸产量增加。在乳发酵短杆菌的一突变株中，Tosaka等(农业生物化学43，265-270，1979)通过加入L-亮氨酸已能实现赖氨酸形成的降低，以及同时苏氨酸形成的增加。
本发明人目的在于为改良用棒状细菌发酵生产L-氨基酸、特别是L-赖氨酸和L-异亮氨酸而提供新措施。
本发明提供了来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包括选自如下一组的多核苷酸序列
a)与编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)编码含有与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)含有a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。
本发明还提供了根据权利要求1的多核苷酸，其优选是能复制的DNA，包括(i)SEQ ID NO1的核苷酸序列，或(ii)在遗传密码简并范围内相应于序列(i)的至少一个序列，或(iii)与互补于序列(i)或(ii)的序列杂交的至少一个序列，和任选地，(iv)(i)中有功能的中义突变。
本发明还提供了权利要求2的多核苷酸，含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，权利要求2的多核苷酸，其编码含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽。
本发明还提供了多核苷酸，其基本上由一个多核苷酸序列组成，其可通过用含有SEQ ID NO1所述多核苷酸的序列或其片段的探针杂交合适的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述的文库含有具有相应于SEQ ID NO1的多核苷酸序列的完整基因。本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码lrp蛋白的全长cDNA，以及分离与lrp基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。
本发明的多核苷酸序列还适用作通过聚合酶链反应(PCR)制备编码lrp蛋白的DNA或基因的引物。
作为探针或引物的这种寡核苷酸含有至少30个、优选至少20个、特别优选至少15个连续碱基。具有至少40或50个碱基对的寡核苷酸也是合适的。
“分离的”是指从其天然环境中分离出来。
“多核苷酸”一般地指多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
“多肽”应理解为含有经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。
本发明的多肽包括SEQ ID NO2的多肽，特别是具有lrp蛋白生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO2的多肽至少70％、优选至少80％相同、特别是与SEQ ID NO2的多肽90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本发明另外还提供了用尤其已生产L-氨基酸的棒状细菌发酵生产氨基酸、尤其L-赖氨酸和L-异亮氨酸的方法，其通过扩增或弱化作为靶物质功能的新lrp基因。
文中术语“扩增”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或用强启动子或编码高活性相应酶的基因，及如果需要组合使用这些方法。
文中术语“弱化”是指例如运用一个弱启动子或编码相应的低活性酶或失活相应的酶(蛋白质)的基因或等位基因或将这些措施任意组合而使某一微生物体内一个或多个酶(蛋白质)胞内活性降低或被抑制，其中酶由相应的DNA编码。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产L-赖氨酸，此微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
适当的棒杆菌菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌株，是例如已知的野生型菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032醋谷棒杆菌ATCC 15806嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870Corynebacterium melassecola ATCC17965嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539黄色短杆菌ATCC 14067乳发酵短杆菌ATCC 13869和扩展短杆菌ATCC 14020和从中获得的生产氨基酸的突变体或菌株如生产L-赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌FERM-P1709黄色短杆菌FERM-P1708乳发酵短杆菌FERM-P1712谷氨酸棒杆菌FERM-P6463谷氨酸棒杆菌FERM-P6464和谷氨酸棒杆菌DSM5715或生产L-异亮氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14309谷氨酸棒杆菌ATCC14310谷氨酸棒杆菌ATCC14311谷氨酸棒杆菌ATCC15168和产氨棒杆菌ATCC6871。
本发明人已成功地分离谷氨酸棒杆菌的编码lrp蛋白的新lrp基因。
为了分离谷氨酸棒杆菌的lrp基因或其他基因，首先在大肠杆菌中建立这一微生物的基因文库。可根据通常已知的教材和手册建立基因文库。例如由Winnacker所著教材基因与克隆，基因工程入门(Verlag Chemie，Weinheim，德国，1990)，或由Sambrook等所著手册分子克隆实验手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。一非常熟知的基因文库是已由Kohara等(细胞50，495-508(1987))在λ载体中建立的E．coli K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252255-265，1996)阐述了借助于粘粒载体SuperCos I(Wahl等，1987，Proceeding of the NationalAcademy of Sciences USA，842160-2164)，在E．coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。Bormann等(分子微生物学6(3)，317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohm和Collins，基因11，291-298(1980))制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。为在大肠杆菌中制备谷氨酸棒杆菌的基因文库，也可使用质粒如pBR322(Bolivar，生命科学25，807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19259-268)。合适的宿主尤其是限制和重组缺陷的大肠杆菌菌株，一个例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美国科学院院报7(1990)4645-4649)所述。借助于粘粒克隆的长DNA片段随后可亚克隆并用适于测序的通用载体测序，如Sanger等(美国科学院院报745463-5467，1977)所述。
以此方式可获得编码lrp基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO1，用前述方法从此DNA序列中也已衍生出相应蛋白质的氨基酸序列。所得lrp基因产物的氨基酸序列以SEQ IDNO2表示。
通过遗传密码的简并性产生的编码DNA序列也是本发明的一部分。同样，与SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。另外，蛋白质中的保守氨基酸置换，如用丙氨酸置换甘氨酸，或用谷氨酸置换天冬氨酸，本领域已知是“有义突变”，其不引起蛋白质活性的基本改变，即是功能中性的。另外已知蛋白质N和／或C-末端的改变基本不影响其功能，或者甚至可以稳定其功能，本领域技术人员可在以下文献中发现对此的论述，参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169751-757(1987))O’Regan等(基因77237-251．(1989))，Sahin-Toth等(蛋白质科学3240-247(1994))，Hochuli等(生物／技术61321-1325(1988))，及已知关于遗传和分子生物学的教材。以相应方式产生自SEQ IDNO2的氨基酸序列也是本发明的一部分。
同样，与SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分杂交的DNA序列也是本发明的组成部分。最后，用产生自SEQ ID NO1的引物经聚合酶链反应(PCR)制备的DNA序列也是本发明的组成部分。这种寡核苷酸典型地具有至少15bp的长度。
通过杂交鉴别DNA序列的指导可参见宝灵格曼海姆有限公司的手册“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国，1993)以及Liebl等(系统细菌学国际杂志(1991)41255-260)。用聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的指导参见Gait的手册寡核苷酸合成实用方法(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和GrahamPCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德国，1994)。
本发明人发现，lrp基因对于氨基酸特别是L-赖氨酸和L-异亮氨酸的生产特别重要。
本发明人还发现，特定生物合成途径、糖酵解、柠檬酸循环、回补代谢或氨基酸输出单独或组合的一或多种酶的额外过表达，对氨基酸特别是L-赖氨酸和L-异亮氨酸的生产是有益的。
因此，例如，当生产L-赖氨酸时，
·编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B0197335)可以同时超量表达，或·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Schwinde等，细菌学杂志1753905-3908(1993))可以同时超量表达，或·编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲生物化学杂志254，395-403(1998))可以同时超量表达，或·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19831609)可以同时超量表达，或·编码赖氨酸输出的lysE基因(DE-A-19548222)可以同时超量表达。
因此，例如，当生产L-异亮氨酸时，·编码苏氨酸脱水酶的ilvA基因(Mockel等，细菌学杂志(1992)8065-8072)或“反馈抗性”ilvA(Fbr)等位基因(Mockel等，(1994)分子微生物学13833-842)可以同时超量表达，或·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Schwinde等，细菌学杂志1753905-3908(1993))可以同时超量表达，或·编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲生物化学杂志254，395-403(1998))可以同时超量表达，或·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19831609)可以同时超量表达。
另外，抑制非所需的二级反应对氨基酸特别是L-赖氨酸和L-异亮氨酸的生产也是有益的(Nakayama“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。
为生产氨基酸，特别是L-赖氨酸和L-异亮氨酸，根据本发明产生的微生物可连续培养或用分批方法，或补料分批方法或重复补料分批方法分批培养。已知的培养法由Chmiel(Bioprozesstechnikl．Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen(Vieweg Verlag，Brunswick／Wiesbaden，1994))所著教材中提供。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求，关于各种微生物培养基的阐述见于，美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D．C．，USA，1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸，这些物质可单独或混合使用，可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用，可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，也可使用促进生长必需物质如氨基酸和维生素，此外，可将适当前体加入培养基中。上述物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的pH值，抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃～40℃，持续培养直至氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围达到。
氨基酸的分析可通过阴离子交换层析，随后经茚三酮衍生化作用进行，如Speckman等(分析化学，30，(1958)，1190)所述，或用反向HPLC进行，如Lindroth等(分析化学(1979)511167-1174)所述。
本发明方法用于发酵制备氨基酸，尤其是L-赖氨酸和L-异亮氨酸。
本发明借助于以下提供的实施例得以更详述阐述。
实施例1制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组粘粒基因文库如Tauch等(1995，质粒33168-179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA并用限制性内切酶Sau3AI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。购自Stratagene公司(La Jolla，USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编码251301)的粘粒载体SuperCosl(Wahl等(1987)美国科学院院报842160-2164)的DNA用限制性内切酶XbaI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述XbaI，编码27-0948-02)酶切并类似地用虾碱性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，编码27-0868-04)酶切。以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC13032 DNA片段混合并用T4 DNA连接酶(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编码27-0870-04)处理。连接混合物然后用Gigapack II XL包装提取物(Stratagene，La Jolla，USA，产品描述Gigapack II XL包装提取物，编码200217)包装进噬菌体中。为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)，将细胞悬浮于10mM MgSO4并与噬菌体悬液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100微克／毫升氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组克隆。
实施例2 lrp基因的分离和测序用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106，Qiagen，Hilden，德国)根据厂商指导分离各个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。凝胶电泳分离后，用QiaExII凝胶提取试剂盒(产品号20021，Qiagen，Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，其中DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biotech，Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通信，123343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美国科学院院报874645-4649)并在含有50微克／毫升zeocin的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1190)上铺板。重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品号900200，Qiagen，Hilden，德国)进行。测序用Zimmermann等(1990，核酸研究181067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报745463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司(产品号403044，Weiterstadt，德国)的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”。用购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism 377”测序仪在“RotiphoresisNF丙烯酰胺／双丙烯酰胺”凝胶(291)(产品号A124．1，Roth，Karlsruhe，德国)中进行凝胶电泳分离和序列分析。
得到的原始序列数据然后用Staden软件包(1986，核酸研究，14217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP软件(Staden，1986，核酸研究，14217-231)进行计算机辅助编码区分析。进一步的分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余NCBI数据库进行。
获得的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。对该核苷酸序列的分析显示-462碱基对的开放读框，其被称为lrp基因。lrp基因编码154个氨基酸的多肽。
序列表<110>德古萨-于尔斯股份公司<120>编码lrp基因的新核苷酸序列<130>990126 BT<140><141><160>2<170>PatentIn Ver．2．1<210>1<211>715<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>-35_信号<222>(62)．．(67)<220><221>-10_信号<222>(88)．．(93)<220><221>CDS<222>(151)．．(612)<400>1gccgataacc tttatcatct ggttccaggg ctgccttgga tggcgacacc tccaggcttg 60aatgaatctc ttgcgttttt tgcacactac aatcatcaca caattgccgg gtagttttgt 120tgccagtttg cgcacctcaa ctaggctatt gtg caa tat atg aag cta gat tcc 174Val Gln Tyr Met Lys Leu Asp Ser1 5att gat cgc gca att att gcg gag ctt agc gcg aat gcg cgc atc tca 222Ile Asp Arg Ala Ile Ile Ala Glu Leu Ser Ala Asn Ala Arg Ile Ser10 15 20aat ctc gca ctg gct gac aag gtg cat ctc act ccg gga cct tgc ttg 270Asn Leu Ala Leu Ala Asp Lys Val His Leu Thr Pro Gly Pro Cys Leu25 30 35 40agg agg gtg cag cgt ttg gaa gcc gaa gga atc att ttg ggc tac agc 318Arg Arg Val Gln Arg Leu Glu Ala Glu Gly Ile Ile Leu Gly Tyr Ser45 50 55gcg gac att cac cct gcg gtg atg aat cgt gga ttt gag gtg acc gtg 366Ala Asp Ile His Pro Ala Val Met Asn Arg Gly Phe Glu Val Thr Val60 65 70gat gtc act ctc agc aac ttc gac cgc tcc act gta gac aat ttt gaa 414Asp Val Thr Leu Ser Asn Phe Asp Arg Ser Thr Val Asp Asn Phe Glu75 80 85agc tcc gtt gcg cag cat gat gaa gta ctg gag ttg cac agg ctt ttt 462Ser Ser Val Ala Gln His Asp Glu Val Leu Glu Leu His Arg Leu Phe90 95 100ggt tcg cca gat tat ttt gtc cgc atc ggc gtt gct gat ttg gag gcg 510Gly Ser Pro Asp Tyr Phe Val Arg Ile Gly Val Ala Asp Leu Glu Ala105 110 115 120tat gag caa ttt tta tcc agt cac att caa acc gtg cca gga att gca 558Tyr Glu Gln Phe Leu Ser Ser His Ile Gln Thr Val Pro Gly Ile Ala125 130 135aag atc tca tca cgt ttt gct atg aaa gtg gtg aaa cca gct cgc ccc 606Lys Ile Ser Ser Arg Phe Ala Met Lys Val Val Lys Pro Ala Arg Pro140 145 150cag gtg tgaagcatgc attttgaagc atgaatcttt ttcatctagt gaaggactga662Gln Valtcccatgcgt atgaaatcaa tcgcagcaat tgcaatcgct accgccgccc tgg715<210>2<211>154<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>2Val Gln Tyr Met Lys Leu Asp Ser Ile Asp Arg Ala Ile Ile Ala Glu1 5 10 15Leu Ser Ala Asn Ala Arg Ile Ser Asn Leu Ala Leu Ala Asp Lys Val20 25 30His Leu Thr Pro Gly pro Cys Leu Arg Arg Val Gln Arg Leu Glu Ala35 40 45Glu Gly Ile Ile Leu Gly Tyr Ser Ala Asp Ile His Pro Ala Val Met50 55 60Asn Arg Gly Phe Glu Val Thr Val Asp Val Thr Leu Ser Asn Phe Asp65 70 75 80Arg Ser Thr Val Asp Asn Phe Glu Ser Ser Val Ala Gln His Asp Glu85 90 95Val Leu Glu Leu His Arg Leu Phe Gly Ser Pro Asp Tyr Phe Val Arg100 105 110Ile Gly Val Ala Asp Leu Glu Ala Tyr Glu Gln Phe Leu Ser Ser His115 120 125Ile Gln Thr val Pro Gly Ile Ala Lys Ile Ser Ser Arg Phe Ala Met130 135 140Lys Val Val Lys Pro Ala Arg Pro Gln Val145 150
权利要求
1.来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包括选自如下一组的多核苷酸序列a)与编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)编码含有与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)含有a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。
2.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是能在棒状细菌中复制的优选地为重组的DNA。
3.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。
4.权利要求2的多核苷酸，含有如SEQ ID NO1所示的核酸序列。
5.权利要求2的能复制的DNA，含有(i)如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或(ii)在遗传密码简并范围内相应于的序列(i)的至少一个序列，或(iii)与互补于序列(i)或(ii)的序列杂交的至少一个序列，和任选地(iv) (i)中有功能的中义突变。
6.权利要求2的多核苷酸序列，其编码含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
7.生产L-氨基酸的方法，其特征在于进行以下步骤(a)发酵产生所需L-氨基酸的细菌，该细菌中至少lrp基因是弱化的或扩增的，(b)富集培养基或细菌细胞中的所需产物，及(c)分离L-氨基酸。
8.权利要求7的方法，其特征在于所用细菌中所需的L-氨基酸生物合成途径的其它基因被额外扩增。
9.权利要求7的方法，其特征在于所用细菌中，降低所需氨基酸生成的代谢途径至少被部分抑制。
10.权利要求7的方法，其特征在于使用经质粒载体转化的菌株，且此质粒载体携带编码lrp基因的核苷酸序列。
11.权利要求7的方法，其特征在于在该细菌的lrp基因中产生缺失或插入以进行弱化。
12.权利要求8-11任一项的方法，其特征在于使用产生L-氨基酸的棒状细菌。
全文摘要
本发明涉及分离的多核苷酸,其含有选自如下一组的多核苷酸序列:a)与编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸,b)编码含有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸,c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸,以及d)包括a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。本发明还涉及用lrp基因的扩增或弱化而发酵制备L－氨基酸的方法。
文档编号C12R1/15GK1290746SQ0012464
公开日2001年4月11日 申请日期2000年9月26日 优先权日1999年10月5日
发明者布里吉特·巴特, 约恩·卡利诺夫斯基, 阿尔弗雷德·普尔勒, 贝蒂娜·默克尔, 瓦尔特·普费弗勒 申请人:德古萨－于尔斯股份公司