麻疹病毒l4株融合蛋白基因的制作方法

文档序号:426534阅读:336来源:国知局
专利名称:麻疹病毒l4株融合蛋白基因的制作方法
技术领域
本发明总的涉及基因工程技术,特别是涉及麻疹病毒的重组DNA基因工程疫苗。
麻疹是严重危害人类健康的传染病,已在世界范围内纳入儿童计划免疫。三十多年来,麻疹减毒活疫苗的广泛应用虽然已成功地控制了麻疹大规模流行,但始终未能彻底消灭麻疹,麻疹局部暴发流行的情况常有发生,在一些国家和地区麻疹仍是造成婴儿死亡的重要原因。据世界卫生组织估计,全世界每年因麻疹死亡的人数约100-150万。造成这一情况的重要原因之一是现有的麻疹减毒活疫苗存在着免疫不全面,免疫持久性不够,加强免疫效果不理想以及不能早期(出生后6个月内)使用等问题,使用基因工程麻疹疫苗是解决上述问题的重要途径。近年来麻疹基因工程疫苗,特别是在麻疹病毒保护性抗原基因克隆及表达的研究中已获得多方面的进展。
1986年Alkhatib等[1]首先公开了麻疹病毒Edmonston株血凝素(HA)基因的克隆与DNA序列。序列分析表明,该基因由1854个碱基对(bp)组成,编码617个氨基酸(图1)。同年Gerald等[2]从麻疹病毒Halle’株克隆了HA基因,并与Edmonston株的DNA序列进行了比较,结果显示两毒株有13个bp不同,并导致8个氨基酸变异。1986年Richardson等[3]公开了Edmonston株融合蛋白(F)基因的克隆和DNA序列,序列分析结果表明最长一个开放读码框架的F基因由1662个bp组成,编码553个氨基酸(图2)。1987年Bucklan等[4]克隆了Halle’株的F基因,并与Edmonston株的序列进行了比较,发现二者有4个bp不同,但未导致氨基酸的变异。
在基因工程麻疹疫苗研究中主要使用Halle’株或Edmonston株的HA和F进行。至今尚未见对麻疹病毒L4株HA和F基因进行克隆和序列分析的报导。
1988年,Drillien等[6]在痘苗病毒中分别表达了麻疹病毒HA和F基因。其特点是HA和F基因均来自Halle′毒株,载体病毒为痘苗病毒哥本哈根株,HA和F基因均使用痘苗病毒7.5K蛋白启动子驱动,并分别在不同重组毒株的TK基因区单独表达。表达HA或表达F的重组痘苗病毒免疫BalB/c小鼠后均能产生对致死剂量的亚急性硬化性脑脊髓膜炎麻疹毒株的脑内攻击保护。重组痘苗表达的HA和F的理化性质及在感染细胞内的分布与麻疹病毒细胞感染后的相似。
1992年,wild等[5]构建了在同一区能同时表达麻疹病毒HA和F的重组痘苗病毒。其特点是HA和F基因均来自Halle′株,两基因头对头相连,其上游均分别使用7.5K启动子驱动,表达区为痘苗病毒TK区(图3)。病毒重组使用了痘苗病毒哥本哈根株的温度敏感突变株VVts7,先在鸡胚细胞中重组,然后在Ltk细胞中根据TK性状选择重组痘苗病毒。与单独表达HA或F的重组病毒的比较资料表明,每一种方式表达HA的分子量均约为80KD,F的分子量则有三种,60KD,40KD和20KD,分别与未裂解的F0,裂解后的F1和F2相对应。HA和F同时表达的重组痘苗病毒产生更好的免疫效果。
1991年,Wild等[7]已先期报导了使用上述结构同时表达HA和F可以在感染细胞上产生与麻疹病毒感染后引起的类似的融合病灶。
1990年,Spehner等[8]的结果表明,在TK区使用7.5K启动子在同一个方向顺序表达Lac-Z和F基因造成F基因在病毒传代中丢失现象,但将Lac-Z和F头对头(与上述Wild等的结构相似)表达时(见图4),F的表达量下降约50%。目前文献报导的同时在痘苗病毒中同一区域表达HA和F基因的结构都存在干扰外源基因表达的不利影响。
1992年,Taylor等[9]报导了在金丝雀痘病毒不同区,同时表达麻疹病毒HA和F的重组病毒。其特点是HA和F基因均来自麻疹病毒Edmonston株,两基因均分别受痘苗病毒H6启动子控制,并同时在金丝雀痘病毒基因组pVUII的3.4K片段和0.9K片段两个区获得表达。病毒重组在鸡胚细胞中进行,首先将F基因送到金丝雀痘病毒基因组pVUII的3.4K片段,获得表达F基因的重组vCP40,再用vCP40与HA基因重组,将HA送到该病毒pVUII的0.9K片段,获得HA和F同时表达的重组病毒vCP57,在使用该病毒免疫时,获得了与表达HA和F的重组痘苗病毒免疫后产生的相同的免疫保护效果。该病毒已开始进行小剂量人体免疫观察。
如前所述,近年来麻疹基因工程疫苗的研究已取得很大进展,特别是使用痘苗病毒为载体进行的基因工程麻疹疫苗的研究展现了较好的前景。但是现有麻疹病毒HA和F基因克隆的免疫效果不够好,同时表达HA和F基因的结构不合理,重组病毒的筛选与纯化方法较复杂,痘苗病毒株的选用亦尚待确定。
为了克服上述现有技术中的不足之处,本发明的目的1、选择麻疹病毒L4株为出发株,以获得更好免疫效果的麻疹病毒HA和F基因。
2、组建新的表达结构,以获得麻疹病毒HA和F基因在重组痘苗病毒同一区域中高效表达。3、建立一套简单有效的获得同时表达麻疹病毒HA和F基因的重组痘苗病毒人用疫苗株的重组、筛选、纯化和毒种制备方法。4、使用痘苗病毒天坛株为亲本株,构建同时表达麻疹病毒HA和F基因并能够用于人体免疫观察的安全、有效的重组痘苗病毒人用疫苗株。
本发明的目的能通过以下方法来实现从麻疹病毒L4株中克隆具有良好生物学性状及免疫效果的HA和F基因,构建能够将HA和F基因转入重组痘苗病毒同一个区域尾对尾高效表达的重组质粒,利用融合性状建立一套简单有效的适用于麻疹病毒HA和F基因同时在重组痘苗中表达的病毒重组、筛选、纯化及制备方法,并通过该方法将重组质粒与痘苗病毒人用疫苗株-天坛株重组,获得能够高效、稳定表达麻疹病毒HA和F基因的安全、有效的重组痘苗病毒疫苗毒株。
本发明的优点在于获得的表达麻疹病毒HA和F的重组痘苗病毒在外源基因、表达结构、重组病毒的筛选与纯化方法及选用的痘苗病毒毒株四个主要方面比现有技术有明显的改进,具有刨造性和实用价值。它简化了重组病毒筛选和纯化的方法,提高了获得重组病毒的机率,所获得的表达HA和F基因的重组痘苗病毒天坛株表达水平高,免疫效果好,毒力低,遗传性状稳定,是可用于人体免疫观察的基因工程麻疹疫苗毒株。
下面结合附图对本发明作进一步详述(一)麻疹病毒L4株血凝素(HA)和融合蛋白(F)基因克隆的DNA序列特点1、麻疹病毒L4株。该毒株是在中国广泛应用的麻疹减毒活疫苗株“长-47”的亲本株,在苏联列宁格勒分离获得,并于五十年代引入中国。该毒株先用人胚肾细胞传26代后,再在人羊膜细胞上传代,是部分减毒毒株,比Edmonston等毒株具有更好的血凝和血溶活性(表一)。本发明使用的毒种为人羊膜72代,由中国药品和生物制品检定所提供。
表一、不同麻疹毒株血溶和血凝活性比较毒株 血溶活性血凝滴度(以O.D540m表示)L4 0.529 1∶128Edmonston0.143 1∶15CAM -0.025 1∶1长47 -0.017 1∶1沪191 0.003 1∶1细胞对照 0.000 -2、麻疹病毒L4株HA和F基因的克隆和DNA序列特点用麻疹病毒L4株克隆到HA和F基因(详细程序见实施例1),进行了基因DNA序列测定,并与Edmonston株的相应序列进行了比较(见图1、2和表二)。HA基因的DNA序列全长1854个碱基对(bp),编码617个氨基酸,其中第1080、1474、1655及1799位的四个bp与现有技术的Edmonston株的HA基因的相应的四个bp不同,并导致三个氨基酸变异,分别为第492位的谷氨酸(Glu)变异为赖氨酸(Lys);第552位的苯丙氨酸(Phe)变异为丝氨酸(Ser);第600位的谷氨酸(Glu)变异为缬氨酸(Val);HA基因在痘苗病毒中表达的产物具有良好的血凝活性,免疫后能产生较高的中和抗体及血凝抑制抗体。F基因的DNA序列全长1662个bp,,编码553个氨基酸,其中第194、255、734、966、1098、1311、1575位的七个bp与Edmonston株相应的bp不同,并导致二个氨基酸变异,分别为第65位的异亮氨酸(Ile)变异为苏氨酸(Thr),第245位的异亮氨酸(Ile)变异为苏氨酸(Thr)。该基因在痘苗病毒中表达后,表达产物被正常切割成F1和F2蛋白亚单位,免疫家兔后产生高滴度的麻疹抗体该抗体具有较强的中和作用和血溶抑制作用,表明克隆的L4株基因能在痘苗中有效表达,并具有较好的免疫原性。
表二 二株麻疹病毒HA及F蛋白基因的核苷酸和氨基酸变异序列比较病毒株基因及大小核苷酸变 氨基酸变(bp) 异位置 异位置 Edmonston L4(code-aa) (code-aa)HA(1854)1080360 GAT-Asp GAC-Asp*1474492 GAA-Glu AAA-Lys*1655552 TTT-Phe TCT-Ser*1799600 GAG-Glu GTG-ValF(1662)*194 65ATA-Tle ACA-Thr255 85ACT-Thr ACA-Thr*734 245 ATC-Ile ACA-Thr966 352 GTC-Val GTT-Val1098366 ACT-Thr ACC-Thr1311437 AGC-Ser AGT-Ser1575525 AAT-Asn AAC-Asn(二)能在重组痘苗病毒同一区域同时表达麻疹病毒L4株HA和F基因的重组质粒pJML11HA75F的构建及特点(该质粒的构建见实施例2),该重组质粒的主要特点是①麻疹病毒L4株HA和F基因分别由串联在一起但启动活性相反的痘苗病毒11KD蛋白基因启动子(P11)和7.5KD蛋白基因启动子(P7.5)控制,从串联启动子两端分别向两侧不同方向表达,因此两基因在RNA转录水平上无干扰现象,这与文献5,7采用的非串联启动子结构明显不同,文献结构会引起RNA转录水平的干扰,影响HA和F基因的表达率,降低约50%。②在HA和F基因两侧分别连接了痘苗病毒J片段的TK基因左侧及右侧同源重组序列,以便通过同源重组将其送到TK基因区进行表达。同源重组序列可以根据需要更换,因而能将HA和F基因送到其他区域进行表达。pMMLHA75F就是在表达结构HA和F基因两侧分别含有M片段同源重组序列的质粒,该质粒除同源重组序列不同外,HA和F的表达结构与pJML11HA75F的完全相同,可将HA和F基因送到痘苗病毒天坛株M片段进行表达。
(三)同时表达麻疹病毒HA和F基因的重组痘苗病毒的重组、筛选、纯化及制备病毒毒种的方法。
目前重组痘苗病毒人用疫苗株的重组和筛选大多在疫苗生产许可的细胞中进行重组,然后使用杂交与表达产物检测相结合的方法进行筛选和纯化,程序比较复杂,而且效率不高。
本发明的研究结果表明麻疹病毒HA和F基因在重组痘苗病毒中同时表达后在一些细胞中产生明显的融合病灶,但在产生融合病灶的细胞中重组病毒HA和F表达不稳定,而在不产生融合性状的细胞中HA和F表达比较稳定的特点。本发明建立了适合于同时表达麻疹病毒HA和F基因的重组痘苗病毒的重组、筛选、纯化及毒种制备的方法。(具体程序见实施例3)。
本方法的基本特点是在可引起融合病灶的细胞中进行病毒重组,通过产生明显的融合病灶判定并筛选重组病毒(性状不稳定),然后在不产生明显融合病灶的细胞中纯化并增殖重组病毒(性状稳定),其纯度再使用产生融合性状的细胞检测。
(四)使用痘苗病毒天坛株及其衍生毒株构建的同时表达麻疹病毒L4株HA和F基因的重组痘苗病毒。
1、重组使用的痘苗病毒毒株和细胞。
①痘苗病毒天坛株该毒株是曾在中国广泛用于种痘预防天花的疫苗株,由中国药品和生物制品检定所提供,批号7601。
②痘苗病毒天坛株的衍生体RVJ123毒株RVJ123毒株是痘苗病毒天坛株在其基因组J片段TK基因区插入了adr亚型乙肝表面抗原基因(S)构建而成,该毒株除在TK区含有乙肝S基因外,其余基因组结构与天坛株完全一致。RVJ123在鼠及兔皮内的毒力均较天坛株降低约1个对数左右。进行了小剂量人体免疫观察,人体毒力与其亲本株(天坛株)差别不显著。
③痘苗病毒天坛株的衍生体RVJ123KIL2毒株RVJ123KIL2毒株是天坛株的衍生毒株RVJ123在其基因组K片段右侧第一个BglII位点插入人白细胞介素2(IL-2)基因构建而成(图6),该毒株除基因组含IL-2基因外,基因组其余结构均与RVJ123完全一致。该毒株除鼠脑内毒力与RVJ123相近外,兔皮内及裸鼠内毒力均较天坛株及RVJ123毒株明显减弱。进行了小剂量人体免疫观察,人体毒力较RVJ123明显减弱,(RVJ123人体毒力与天坛株相近)。
④重组用细胞人胚肺细胞(2BS),绿猴肾细胞(Vero)和原代鸡胚细胞(CEF),均为痘苗生产许可细胞,购自北京生物制品研究所,其中2BS和Vero细胞在感染表达麻疹病毒HLA和F基因的重组病毒时产生融合病灶,而CEF不产生融合病灶。
2、同时表达麻疹病毒L4株HA和F基因的重组痘苗病毒的构建以RVJ123KIL2毒株作为重组用病毒,pJML11HA75F为重组用质粒,通过本发明的方法进行病毒重组、筛选、纯化和毒种制备,获得同时表达麻疹L4株HA和F基因的重组痘苗病毒人用疫苗毒株RVJMLHAFKIL2(该毒株含有IL-2基因);使用痘苗病毒天坛株为重组用病毒,与pJML11HA75F或pMML11HA75F进行重组分别获得了痘苗病毒天坛株TK区和M片段同时表达麻疹病毒L4株HA和F基因的重组痘苗病毒实验毒株RVJMLHAF和RVMMLHAF(两毒株均不含IL-2基因)。
3、同时表达麻疹病毒L4株HA和F基因的重组痘苗病毒人用疫苗株RVJMLHAFKIL2的主要特征及免疫效果①HA和F的表达,产物的生物学活性及表达稳定性经免疫酶斑检测重组病毒RVJMHAFKIL2的HA表达滴度为1∶16-1∶64,F滴度为1∶16,Western blot显示HA分子量约为90KD和80KD两种,分别为糖化和非糖化形式,F分子量则有60KD,44KD和23KD三种,分别为未裂解的前体F0,裂解后的F1和F2的分子量相对应;重组病毒RVJMLHAFKIL2同时具有良好的血凝活性(1∶8)和血溶活性(OD540nm=0.370),明显高于现有麻疹减毒活苗(表三),该重组病毒表表三.麻疹重组痘苗病毒HA及F的生物学活性检测病毒 血凝效价 血溶活性RVJHA 1/8 NDRVJMLHAFKIL21/80.370vvTK+- 0.00HA标准品1/32ND注RVJHA病毒是单表达麻疹病毒HA的重组痘苗病毒达HA和F的上述特点经传15代后未见明显变化。
②IL-2表达产物活性及表达稳定性Western blot检定表明重组病毒RVJMLHAFKIL2表达的IL-2有糖化和非糖化两种,分子量分别为17KD和14kD,与天然IL-2类似,毒种连续传15代后,经Western blot检查,IL2表达水平稳定。
③重组病毒的毒力(1)兔皮内毒力RVJMLHAFKIL2与RVJ123(结构类似,但无IL-2),相比,免皮内红肿和皮损反应减弱,反应时间缩短2-4天,毒力明显降低(表四)。
表四.重组痘苗兔皮毒力比较病毒 皮肤红肿范围 发痘高峰期 红肿消退RVJ123破损,溃烂较大6-7天 慢RVJMLHAFKIL2不破损 较小 4天 快(2)小鼠脑内毒力RVJMLHAFKIL2与RVJ123相比,毒力略有降低(表五)。表五. 重组痘苗病毒接种Balb/c裸鼠尾根部3周后不同组织中病毒滴度病毒 pfu/皮 pfu/尾 pfu/肝 pfu/肾pfu/脑RVJ123 2.1×1071×1082.5×1031×1036.8×104RVJHFKIL2ND6.5×10 0 0 0
(3)裸鼠毒力裸鼠脊柱两侧及尾根部接种后,RVJMLHAFKIL2仅表现为局部结节,无明显红肿溃烂,亦不发生扩散,而RVJ123局部红肿溃烂外,还向远处皮肤及肝、脑、肾等脏器扩散(表六)。
表六.重组痘苗病毒接种Balb/c裸鼠尾根部3周后观察结果病毒平均体重皮肤 皮损部位查出病毒存在的器官RVJ12318g 皱褶尾,爪,头,背,臀 脑,肝,肾RVJHFKIL2 23g 平滑无 无(4)重组病毒的免疫效果a、小鼠刮尾免疫效果使用107pfu/ml病毒刮尾免疫C57小鼠,RVJMLHAFKIL2免疫后4周抗体阳转。抗体具有较高的ELISA(1∶6400)、中和(NT,1∶128)、血凝抑制(HI,1∶160)及血溶抑制(HLI,1∶60)抗体滴度(或效价)(表七)。
表七. 重组病毒RVJMLHAFKIL2免疫效果动物免疫方式 采血期 ELISANT HI HLI免前- - - -C57鼠刮尾 4周 >640100 160 320-6406周 6400 128 160 320-640新西兰兔免前- - - -皮内 4周 <40 - - -B号兔 6周 1600 25680-160 640C号兔 6周 1600 51280-160 640D号兔 6周 6400 2048 640-12802560
b、兔皮内免疫效果106pfu/ml病毒兔皮内免疫RVJMLHAFKIL2免疫6周后,血清抗体阳转,抗体具有较高的ELISA(1∶1600),中和(NT,1∶256-512)、血凝抑制(HI,1∶80-160)及血溶抑制(HLI,1∶640)抗体滴度(或效价)。免疫后抗体既能有效地中和L4株,也能有效地中和麻疹疫苗株沪-191,以及中国和日本新分离的麻疹流行株(表七)。
免疫结果显示重组病毒RVJMLHAFKIL2具有良好免疫原性,其诱发机体产生较高滴度的HI和HLI抗体HLI与HI比值(4.0-8.0)明显高于麻疹疫苗株人体接种后产生的比值(0.4-1.1),而与人自然感染的比值(3.6-9.0)相近。
以上结果表明,麻疹重组痘苗病毒疫苗毒株RVJMLHAFKIL2免疫效果好,毒力低,遗传性稳定,无外源因子污染,是一株可用于人体免疫观察的麻疹疫苗毒株。该毒株已经卫生部药政局批准,开始进行小剂量人体免疫观察。
实施例1,麻疹病毒L4株HA和F基因的克隆用麻疹病毒L4株感染Vero细胞,37℃培养到80-90%细胞病变后,提取胞浆RNA,对麻疹病毒mRNA进行逆转录及PCR扩增,克隆到HA和F基因,再进行序列测定[10]。
实施例2,能在重组痘苗病毒同一区域同时表达麻疹病毒L4株HA和F基因的重组质粒pJML11HA75F的构建将逆转录-PCR合成的麻疹L4株F基因(1662bp)用Smal酶切割,插入pJSA1175质粒P7.5启动子下游的Smal位点,得到重组质粒pJSA1175LmF,将逆转录-PCR合成获得的L4株HA基因克隆pJSA1175HA用Xhol酶切割,将HA基因(1854bp)插入pJSB1175质粒P11启动子下游的Xhol位点,得到重组质粒pJSB11LHA75(图5),将pJSA1175LmF和pJSB11LHA75质粒分别用EcoRI酶水解后,取pJSA1175LmF水解小片段及pJSB11LHA75水解大片段用T4连接酶连接,构建成在P11启动子下游表达HA和P7.5启动子下游表达F的重组质粒pJSB11LHA75LF(简称pJML11HA75F)。
实施例3,同时表达麻疹病毒HA和F基因的重组痘苗病毒的重组、筛选、纯化及毒种制备的方法具体程序是刚刚长成单层的2BS细胞,每个细胞感染约0.1pfu的痘苗病毒,吸附1.5小时后应用脂质体转染技术将pJML11HA75F质粒转入细胞,37℃48小时后,原瓶冻化细胞三次,低速离心去除残渣,上清液为重组液,重组液对数稀释后感染2BS细胞,37℃48小时后铺营养琼脂,2小时后,挑出镜下可见的典型的沙粒融合病毒斑(在2BS细胞中,麻疹病毒HA和F基因在痘苗病毒中同时表达可产生典型融合病灶);在2BS细胞中以融合性状为指标,连续单斑纯化3代后,再在鸡胚细胞中单斑纯化3-5代,以获得高纯度的重组病毒;单斑重组病毒在CEF细胞上常规增殖4代,以获得批量毒种;纯化及传代的同时取得部分毒种感染Vero细胞(可产生融合灶)通过镜下观察融合病灶与非融合病灶的比例来确定重组病毒的纯度。
说明书


图1.麻疹病毒L4株(上行)和Edmonston株(下行)血凝素(HA)基因DNA序列比较。两基因全长均1854bp,其中有4个碱基对不同,位于第1080,1474,1655及1799位,已用长方框标出。
图2.麻疹病毒L4株(上行)和Edmonston株(下行)融合蛋白(F)基因DNA序列比较。两基因全长均为1662bp,其中7个碱基对不同,位于第194,255,734,966,1098,1311,1575位,已用长方框标出。
图3.国外(Wild等[5])在痘苗病毒中表达HA和F的结构特点,其中结构4和结构8含有HA和F同时表达的结构,特点是HA和F基因头对头表达(HA和F基因相互干扰)。
图4.国外(Spehner)等[8]在痘苗病毒表达HA和F的结构特点,左下结构(pTG2195),为Lac-Z和F基因顺序表达(F不稳定),右下结构(pTG3113)为Lac-Z和F基因头对头表达,(F表达受一定程序抑制)。
图5.本发明要保护的麻疹病毒L4株HA和F基因同时表达的质粒结构(pJSB11LHA75LF)该结构系由EcoRI酶切原始克隆pJSB11LHA75质粒,获得含HA的载体,然后与EcoRI酶切原始克隆pJSA1175mF质粒获得的F基因重组而成。其主要特点是HA和F基因之间连接双向串联的痘苗病毒11k和7.5K两个启动子,分别由11K和7.5K串联启动子两端向外驱动HA和F基因表达,HA和F基因末端分别连接有痘苗病毒J片段的TK基因左侧和右侧同源重组序列,可将HA和F基因送到痘苗病毒J片段TK基因处表达。
图6.重组痘苗病毒RVJMLHAFKIL2中HA,F和IL2基因的位置,HA和F在J片段,IL2在K片段。
参 考 文 献1. Alkhatib,G.and Briedis,D.J.,1986,The Predicted Primary Structure ofthe Measles Virus Hemagglutinin. Virology 150,479-490.2. Gerald.C.,Buckland.R.,Barker.R.,Freeman.G.,and Wild.T.F.,1986,MeaslesVirus Haemagglutinin GeneCloning,Complete Nucleotide Sequence Analysis andExpression in COS Cells.J.Gen.Virol 67.2695-2703.3. Richardson.C.,Hull.D.,Greer.P.,Hasel.K.,Berkovich.A.,Englund.G.,Bellini.W.,Rima.B.and Lazzarini.R.,1986,The Nucleotide Sequence ofthe mRNA Encoding the Fusion Protein of Measles Virus(Edmonston Strain)A Comparison of Fusion Proteins from Several Different Paramyxoviruses.Virology 155,508-523.4. Buckland.R.,Gerald.C.,Barker.R.and Wild.T.F.,1987,Fusion Glycoproteinof Measles VirusNucleotide Sequence of the Gene and Comparison with OtherParamyxoviruses.J.Gen.Virol.68,1695-1703.5. Wild.T.F.,Bernard.A.,Spehner.D.and Drillien.R.,1992,Construction ofVaccinia Virus Recombinants Expressing Several Measles Virus Proteins andAnalysis of There Efficacy in Vaccination of Mice.Journal of GeneralVirology 73,359-367.6. Drillienm.R.,Spehner.D.,Kirn.D.,Giraudon.P.,Buckland.R.,Wild.F.,and Lecocq.J.P.,1988,Protection og Mice from Fatal Measles Encephalitisby Vaccination with Vaccinia Virus Recombinants Encoding Either theemagglutinin or the Fusion Protein.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,1252-1256.7. Wild.T.F.,Malvoisin.E.and Buckland.R.,1991,Measles Virusboth theaemagglutinin and Fusion Glycoproteins are required for Fusion.Journal ofGeneral Virology 72,439-442.8. Spehner.D.,Drillien.R.and Lecocq.J.P.,1990.Construction of Fowlpox VirusVectors with Intergenic InsertionsExpression of the β-Galactosidase Geneand the Measles Virus Fusion Gene.Journal of Virology 64,527-533.9. Taylor.J.,Weinberg.R.,Tartaglia.J.,Richardson.C.,Alkhatib.G.,Briedis.D.,Appel.M.,Norton.E.and Paoletti.E.,1992.Nonreplicating ViralVectors as Potential VaccinesRecombinant Canarypox Virus ExpressingMeasles Virus Fusion(F)and Hemagglutinin(HA)Glycoproteins.Virology 187,321-328.10. Sambrook J eta1Molecular Cloning,A Laboratory manual,Snd ed.,ColdSpring Harbar Laboratory Press,1989
权利要求
1.一种麻疹病毒L4株的融合蛋白F基因,其特点是基因的DNA序列全长1662个碱基对,编码553个氨基酸,其DNA序列中第194、255、734、966、1098、1311、1575位的七个碱基与文献报道的Edmonston株融合蛋白F基因的DNA序列不同,并导致这两种毒株的融合蛋白氨基酸序列间两个氨基酸不同,分别为第65位的异亮氨酸Ile变异为苏氨酸Thr,第245位的异亮氨酸Ile变异为苏氨酸(Thr)。
2.按权利要求1所述的麻疹病毒L4株融合蛋白F基因,其特征是由该基因表达的麻疹病毒L4株融合蛋白F的血溶活性明显比Edmonston株的高,麻疹病毒L4株融合蛋白F基因可用于基因工程诊断试剂和疫苗研究。
全文摘要
麻疹病毒L4株比Edmonston株具有更高的血溶活性,本发明从麻疹病毒L4株克隆了融合蛋白F基因,发现该基因的DNA序列中有七个碱基与文献报道的Edmonston株融合蛋白F基因的DNA序列不同,并导致这两种毒株的融合蛋白氨基酸序列间两个氨基酸不同,该麻疹病毒L4株融合蛋白F基因在重组痘苗病毒天坛株载体中表达后具有高滴度血溶活性,免疫后产生高滴度血溶抑制抗体。本发明可用于麻疹病毒生物学、分子生物学和基因工程麻疹疫苗的研究与开发。
文档编号C12Q1/68GK1332245SQ0012466
公开日2002年1月23日 申请日期2000年9月27日 优先权日2000年9月27日
发明者阮力, 朱既明, 杨克俭, 徐水婵, 朱诚 申请人:中国预防医学科学院病毒学研究所
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