专利名称：与棉花高强纤维主效基因连锁的分子标记的制作方法
技术领域：
本发明公开了与棉花高强纤维主效基因连锁的分子标记，用于提高棉花纤维品质的分子育种，专用于棉花高强度纤维主效基因的筛选。
棉纤维是重要的纺织工业原料。美国棉花品质育种的研究已有50多年的历史。Culp等人从1946年开始PD种质改良计划，历时40余年，发放了30多个种质系和3个品种。这些种质系或品种的纤维品质，尤其是纤维强度较常规品种有较大的提高，产量达到推广品种的水平。1982年以来，为适应纺织工业设备的改造，美国加快了对棉花纤维品质的改良。仅1982-1986年度鼓励棉纤维强度育种的奖金就高达560万美元。从1980年起，美国纤维比强度每年提高0．25tex／g，到1991年平均达到了21. 7cN／tex。
随着分子生物学研究的进展，国内外都很重视开展优质纤维基因的分子标记筛选以用于标记辅助选择。Yu等(1998)在构建陆地棉×海岛棉种间杂种遗传图谱的基础上，鉴定出与海岛棉优质纤维基因(QTL)连锁的分子标记11个，其中3个纤维强度，3个纤维长度，5个纤维细度。这些QTL可解释(TM-1×3-79)海陆杂种F2总遗传变异的35％-50％。Jiang等(1998)的研究也证明四倍体棉种(AADD)中，大部分纤维品质、产量的QTL位于D染色体亚组，而四倍体棉种中A染色体亚组的祖先是有纤维的，而D染色体亚组则是光子，没有纤维。他们鉴定出的3个纤维强度QTL可解释海陆杂种F2总遗传变异的30．9％。上述这两个研究结果都利用种间杂种F2单株纤维品质表现而得出，重复性如何有待证实。但是，遗传效应值小的QTL，往往会随着环境的变化而检测不到。Shappley等(1998)在陆地棉品种间杂交后代中鉴定出与纤维品质连锁的RFLP标记。这些研究结果为纤维品质的辅助选择乃至克隆纤维品质基因打下了基础。
近15年来我国育成的棉花品种产量略高于美国，纤维品质则有些差距。我国当家品种的纤维品质中等，基本能满足纺织工业的要求，但品质单一，纤维强度偏低，纺高支纱的优质棉需大量进口(项时康、余楠、胡育昌等．1999．论我国棉花质量现状．棉花学报．11(1)1-10)。随着纺工部门引入喷气纺、气流纺等高效快速的纺纱技术，以及人民群众对衣着要求的普遍提高，对我国棉花品种的总体纤维品质，尤其是纤维强度提出了更高的要求。从1999年起国际市场上棉价又将原来的按纤维长度定价改为按纤维强度的高低定价。因此，如何在近期内大幅度提高我国棉花品种的纤维强度刻不容缓。要提高现有陆地棉(G．hirsutum L)品种的纤维品质水平，首先要收集具有高纤维强度基因的种质系作亲本与现有的栽培品种进行一系列杂交和互交，以便打破强度与产量之间的负相关，但在每轮回交中，都要对纤维品质进行检验，成本很高，而且要等到收花期结束一段时间后才能知道结果，因而，要求育种群体大，盲目性也大。因此品质育种的成本很高，费时，难度也较大，进展缓慢。通过筛选出一个或几个与高强纤维主效基因紧密连锁且不受环境影响的分子标记用于辅助选择，可大大提高高强纤维的选择效率。
本发明的目的是筛选出一个或几个与棉花高强纤维主效基因紧密连锁且不受环境影响的分子标记，这些分子标记用于棉花辅助选择育种，可以大大提高高强纤维的选择效率，从而尽快提高我国棉花品种的纤维品质水平。
本发明的实施方案如下。
与棉花高强纤维主效基因连锁的分子标记，是通过以下方法筛选出的(1)对引自江苏省农科院经济作物研究所的陆地棉高强纤维种质系7235，与引自美国农业部南方平原农业研究中心作物种质资源研究室的遗传标准系TM-1进行杂交，F1种子自交产生F2。
(2)用CTAB法提取(7235×TM-1)F2分离群体的单株DNA。
(3)采用SSR和RAPD两种分子标记进行棉花高强纤维标记的筛选。首先用211对SSR引物对7235和TM-1亲本的DNA多态性进行初步分析。SSR反应体系为DNA 94℃预变性4min后，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，循环35次，最后72℃延伸7min。在PE9600扩增仪上进行扩增，扩增产物在Metaphor agrose(FML，Maine，USA)胶上进行分离鉴定。RAPD标记的筛选是采用美国OPERON公司开发的10bp寡核苷酸序列作为随机引物，在PE-9600热循环仪上进行PCR扩增。PCR反应体积为20ul，其中10×buffer(含25mM MgCl2)2．0ul，2mM dNTPs1．0ul，10uM Primer1ul，5mM TMACI和10mg／ml BSA各0．2ul，Taq酶(5unit／ul)0．2ul，模板DNA 20ng，加ddH2O至20ul。PCR反应热循环程序为94℃ 2min预变性后，接着94℃ 30sec，36℃ 30sec，72℃ 70sec，10个循环，再89℃ 20sec，36℃ 20sec，72℃ 60sec，35个循环，再72℃ 7min。PCR扩增产物在1．4％琼脂糖凝胶中电泳，然后在紫外透射仪上照相，记录结果。
(4)共发现有3个SSR标记NAU／SSR／Fs1130，NAU／SSR／Fs2190，NAU／SSR／Fs3220和6个RAPD标记，NAU／RAPD／Fs1933，NAU／RAPD／Fs21920，NAU／RAPD／Fs31320，NAU／RAPD／Fs4983，NAU／RAPD／Fs5821，NAU／RAPD／Fs61047与棉花的高强纤维主效基因连锁。
本发明选用的是一个异常棉(G．anomalum)基因渐渗、有Acala3080和PD4381遗传背景的优质纤维种质系7235(钱思颖、黄骏骐、彭跃进等。1992。陆地棉(G．hirsutum L．)与异常棉(G．anomalumWawr．&Peyr．)种间杂种的研究及其在育种上的应用。中国农业科学，25(6)44-51)开展棉花高强纤维的QTL分子标记筛选。与目前技术相比，其优点是(1)标记稳定。本研究在陆地棉的遗传背景上鉴定出与两个纤维强度QTLs连锁的SSR标记3个，RAPD标记6个，尤其是标记的一个主效QTL所占的遗传变异大，(7235×TM-1)组合在1998，1999年分别在中国南京，海南，美国德克萨斯洲配置，产生F2分离群体，用这些标记进行检测，表明该标记表现稳定，不受年份，环境条件的影响，再加上有SSR引物，辅助选择方便，应是提高我国棉花品种纤维强度水平的有利基因资源。
(2)辅助育种选择目标明确，节约成本。在提高强力和皮棉产量相结合的育种方法中，首先要收集具有强力基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交和互交，并进行多次的回交和复合杂交，以便打破强力与产量之间的负相关。但在每轮回交中都要对纤维强力进行单株选择。用国产的仪器进行纤维强力的测定，效率很低，即使一个熟练工人也只能测10-20个样品，而进口的HV900仪器(价格昂贵，一般单位买不起)效率高，但成本也高，而且要等到收花期结束一段时间才能知道结果，这样要求群体就大，盲目性也大，因此品质育种的成本很高，费时，难度也较大。通过本发明筛选出的与高强纤维基因紧密连锁且不受环境影响的分子标记用于辅助选择，可以在苗期就鉴定出高纤维强度的单株，从而大大提高棉花高强纤维的选择效率。
本发明的实施程序是对引自江苏省农科院经济作物研究所的陆地棉高强纤维种质系7235，通过单株选择，株行农艺性状的鉴定和纤维品质检验，选出纯合的7235株系。据我们1998年测定结果，7235纤维强度为27．3cN／tex，纤维长度为35mm，纤维细度(麦克隆值，下同)为4．1；陆地棉遗传标准系TM-1的纤维强度则为20．7cN／tex，纤维长度为30．5mm，纤维细度为5．0。TM-1引自美国农业部南方平原农业研究中心作物种质资源研究室。
1997年7235与TM-1进行杂交，年底F1种子送到海南岛，自交产生F2种子。1998年将(7235×TM-1)F2分离群体种在南京农业大学江浦试验站。用CTAB法提取这一分离群体的单株DNA。吐絮后，单株收花、取样、进行纤维品质测验。1998年冬和1999年夏分别在海南岛三亚和南京农业大学江浦试验站种植(7235×TM-1)F3株行，以便用F3株行中单株的纤维强度的平均值来估算(7235×TM-1)F2的单株水平。为了鉴定纤维品质在异地的遗传表现，1999年还将来自同一群体的(7235×TM-1)F2种于美国德克萨斯州大学城(CollegeStation)农业部南方平原农业研究中心实验田。所有国内棉样均送到河南安阳农业部纤维品质和种子质量检测中心进行纤维品质检验。分子标记主要利用微卫星标记(SSR)和RAPD标记。
用211对SSR引物首先对7235和TM-1亲本的DNA多态性进行初步分析。211对微卫星(SSR)标记引物购自美国Research Genetics公司。Taq酶，dNTPs，PCR反应的其他试剂均购自Sigma公司。SSR反应体系为DNA 94℃变性4min后，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，循环35次，最后72℃延伸7min。在PE9600扩增仪上进行扩增，扩增产物在Metaphor agrose(FML，Maine，USA)胶上进行分离鉴定。本试验采用的随机引物为美国OPERON公司开发的10bp寡核苷酸序列，PCR反应在PE-9600热循环仪中进行。PCR反应体积为20ul，其中10×buffer(含25mM MgCl2)2．0ul，2mM dNTPs1．0ul，10uM Primer1ul，5mM TMACI和10mg／ml BSA各0．2ul，Taq酶(5unit／ul)0．2ul，模板DNA 20ng，加ddH2O至20ul。PCR反应热循环程序为94℃ 2min预变性后，接着94℃ 30sec，36℃30sec，72℃ 70sec，10个循环，再89℃ 20sec，36℃ 20sec，72℃ 60sec，35个循环，再72℃ 7min。PCR扩增产物在1．4％琼脂糖凝胶中电泳，然后在紫外透射仪上照相，记录实验结果。对7235有特异扩增带的SSR，RAPD引物，分别选用高纤维强度／低纤维强度池进一步进行扩增鉴定。构建高／低纤维强度池时，同时参照了1998年(7235×TM-1)F2在南京的单株表现，1998年冬和1999年夏分别种在海南岛和南京农业大学江浦实验站(7235×TM-1)F3株行单株纤维强度的平均表现，各选5～6株构成。7235亲本特异扩增带在高强纤维池中能重复，而在低强池中不表现的引物，就用1998年的(7235×TM-1)F2单株DNA进行扩增。分子标记筛选结果表明，有26对(12．32％)SSR引物在双亲上有差异。共发现有3个SSR标记NAU／SSR／Fs1130(用SSR1521引物可扩增出130对核苷酸长的DNA片段)，NAU／SSR／Fs2190(用SSR2961引物可扩增出190对核苷酸长的DNA片段)，NAU／SSR／Fs3220(用SSR3255引物可扩增出220对核苷酸长的DNA片段)和6个RAPD标记，NAU／RAPD／Fs1933(用UBC301引物可扩增出933对核苷酸长的DNA片段)，NAU／RAPD／Fs21920(用UBC431引物可扩增出1920对核苷酸长的DNA片段)，NAU／RAPD／Fs31320(用UBC757引物可扩增出1320对核苷酸长的DNA片段)，NAU／RAPD／Fs4983(用OPAP01引物可扩增出983对核苷酸长的DNA片段)，NAU／RAPD／Fs5821(用OPAL19引物可扩增出821对核苷酸长的DNA片段)，NAU／RAPD／Fs61047(用OPM07引物可扩增出1047对核苷酸长的DNA片段)与棉花的高强纤维连锁。利用MAPMAKER／QTL3．0程序它们进行连锁检测，发现有2个SSR标记NAU／SSR／Fs1130，NAU／SSR／Fs2190和以上6个RAPD标记与一个主效QTL紧密连锁，在这个连锁群上；标记的QTL占(7235×TM-1)F2分离群体总遗传变异的30％以上。此外，这一标记的QTL在不同年份，不同环境表现稳定，因此，这是我们发现的一个控制棉花高强纤维表现的主效位点。该QTL以加性和隐性遗传效应为主。因此，用分子标记辅助选择可有效地开展棉花的高强纤维育种。利用这一标记的QTL，预计可迅速提高我国棉花品种纤维强度2-3cN／tex。NAU／SSR／Fs3220标记另一个连锁群的高强纤维QTL。
权利要求
1.与棉花高强纤维主效基因连锁的分子标记，是通过以下方法筛选出的(1)引自江苏省农科院经济作物研究所的陆地棉高强纤维种质系7235，与引自美国农业部南方平原农业研究中心作物种质资源研究室的遗传标准系TM-1进行杂交，F1种子自交产生F2；(2)用CTAB法提取(7235×TM-1)F2分离群体的单株DNA；(3)采用SSR和RAPD两种分子标记进行棉花高强纤维标记的筛选；(4)共筛选出3个SSR标记NAU／SSR／Fs1130，NAU／SSR／Fs2190，NAU／SSR／Fs3220和6个RAPD标记，NAU／RAPD／Fs1933，NAU／RAPD／Fs21920，NAU／RAPD／Fs31320，NAU／RAPD／Fs4983，NAU／RAPD／Fs5821，NAU／RAPD／Fs61047与棉花的高强纤维主效基因连锁。
2.根据权利要求1所述与棉花高强纤维主效基因连锁的分子标记，其中采用的SSR和RAPD两种分子标记进行棉花高强纤维标记的筛选方法为首先用211对SSR引物对7235和TM-1亲本的DNA多态性进行初步分析，SSR反应体系为DNA94℃预变性4min后，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，循环35次，最后72℃延伸7min；在PE9600扩增仪上进行扩增，扩增产物在Metaphor agrose(FML，Maine，USA)胶上进行分离鉴定；RAPD标记的筛选是采用美国OPERON公司开发的10bp寡核苷酸序列作为随机引物，在PE-9600热循环仪上进行PCR扩增，PCR反应体积为20ul，其中10×buffer(含25mMMgCl2)2．0ul，2mM dNTPs 1．0ul，10uM Primer 1ul，5mM TMACI和10mg／ml BSA各0．2ul，Taq酶(5unit／ul)0．2ul，模板DNA 20ng，加ddH2O至20ul，PCR反应热循环程序为94℃ 2min预变性后，接着94℃30sec，36℃ 30sec，72℃ 70sec，10个循环，再89℃ 20sec，36℃ 20sec，72℃ 60sec，35个循环，再72℃ 7min；PCR扩增产物在1．4％琼脂糖凝胶中电泳，然后在紫外透射仪上照相，记录结果。
全文摘要
本发明与棉花高强纤维主效基因连锁的分子标记,用于提高棉花纤维品质的分子育种。利用种质系7235为材料,开展分子标记的筛选,鉴定出与棉花高强纤维基因连锁的SSR标记3个,NAU/SSR/Fs文档编号C12Q1/68GK1293256SQ0013029
公开日2001年5月2日 申请日期2000年11月10日 优先权日2000年11月10日
发明者张天真, 袁有禄, 郭旺珍 申请人:南京农业大学