专利名称：从酵母菌中获得眼镜蛇毒神经多肽菌株及其获得方法
技术领域：
本发明为一种从酵母中获得的表达眼镜蛇毒神经多肽菌株Pichiapastoris WY-1的方法。
现有的获得眼镜蛇毒神经多肽的方法均为从天然蛇毒中体外提取，采用体外分离纯化方法获得，也有采用基因工程的手段从大肠杆菌表达获得，但没有得到令人满意的效果。
本发明的目的是提供一种能替代天然眼镜蛇毒神经多肽的，效果理想的合成的眼镜蛇毒神经多肽菌株、其获得方法。
本发明的从酵母菌中获得眼镜蛇毒神经多肽菌株，其特征在于其表达如下Pichia pastoris WY-1以CCTCC M 200036进行描述。其获得方法为，根据从天然眼镜蛇毒中分离纯化得到的神经毒多肽所测定的一级结构及酵母偏爱的密码子，设计出该多肽的全基因序列为XhoⅠ切点CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTTTGGAA TGTCACAACCAACAATCATC TCAAACTCCA ACCACTACTG GTTGTTCAGGTGGCGAGACC AATTGCTATA AAAAGAGATG GAGAAATCACAGAGGTTATA GAACCGAGAG AGGTTGTGGT TGCCCTTCAGTTAAGAACGG CATTGAAATT AACTGTTGCA CTACTGACAGATGCAACAAT TAGTAGCGGC CGCNotⅠ切点利用所设计的序列上的XhoⅠ和NotⅠ两个酶切位点，用Pichia pastoris酵母表达系统的pPIczα作载体，通过T4DNA连接酶在14～18℃下连接，构建了重组质粒pPIczα-Cbt，通过终浓度2000ug/ml抗菌素Zeocin在25～30℃下筛选，及终浓度为0.5％甲醇25～30℃下的诱导表达，获得了眼镜蛇毒神经多肽在酵母菌中的高效表达菌株(Pichia pastoris WY-1)，表达量为8mg/L。
本发明的效果是，通过本发明获得的神经多肽是一种具有天然活性的神经多肽(与天然眼镜蛇毒神经多肽具有同样的结构及性能)，可替代天然眼镜蛇毒神经多肽，可以满足逐渐增加的市场需求，又能保护蛇资源，是一种有应用前景的菌株。
图1为重组质粒pPIczα-Cbt的构建图。
实施例1、本实施例眼镜蛇毒神经多肽菌株以CCTCC M 200036进行描述。其获得方法为，根据从天然眼镜蛇毒粗毒中分离纯化得到的神经毒多肽所测定的一级结构及酵母偏爱的密码子，设计出该多肽的全基因序列为XhoⅠ切点CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTTTGGAA TGTCACAACCAACAATCATC TCAAACTCCA ACCACTACTG GTTGTTCAGGTGGCGAGACC AATTGCTATA AAAAGAGATG GAGAAATCACAGAGGTTATA GAACCGAGAG AGGTTGTGGT TGCCCTTCAGTTAAGAACGG CATTGAAATT AACTGTTGCA CTACTGACAGATGCAACAAT TAGTAGCGGC CGCNotⅠ切点将所设计的序列上的XhoⅠ和NotⅠ两个酶切点，用Pichia酵母表达系统的pPIczα作载体，通过T4DNA连接酶在15℃下连接，构建了重组质粒pPIczα-Cbt，通过终浓度2000ug/ml抗菌素Zeocin在30℃下筛选，及终浓度为0.5％甲醇30℃下的诱导表达，获得了眼镜蛇毒神经多肽在酵母菌中的高效表达菌株。
实施例2、本实施例眼镜蛇毒神经多肽菌株以CCTCC M 200036进行描述。
其获得方法为，根据从天然眼镜蛇毒粗毒中分离纯化得到的神经毒多肽所测定的序列及酵母偏爱的密码子，设计出该多肽的全基因序列，该序列如上例所述，将所设计的序列上的XhoⅠ和NotⅠ两个酶切点，用Pichia酵母表达系统的pPIczα作载体，通过T4DNA连接酶在15℃下连接，构建了重组质粒pPIczα-Cbt，通过终浓度2000ug/ml抗菌素Zeocin在30℃下筛选，及终浓度为0.5％甲醇30℃下的诱导表达，获得了眼镜蛇毒神经多肽在酵母菌中的高效表达菌株，表达量为8mg/L。
权利要求
1.一种从酵母菌中获得眼镜蛇毒神经多肽菌株，其特征是含有酵母偏爱密码子基因的Pichia pastoris WY-1以(CCTCC M 200036)进行描述。
2.如权利要求1所述的菌株的获得方法，其特征在于根据从天然眼镜蛇毒中分离纯化得到的神经毒多肽所测定的一级结构及酵母偏爱的密码子，设计出该多肽的全基因序列为XhoⅠ切点CTCGAGAAAA GAGAGGCTGA AGCTTTGGAA TGTCACAACCAACAATCATC TCAAACTCCA ACCACTACTG GTTGTTCAGGTGGCGAGACC AATTGCTATA AAAAGAGATG GAGAAATCACAGAGGTTATA GAACCGAGAG AGGTTGTGGT TGCCCTTCAGTTAAGAACGG CATTGAAATT AACTGTTGCA CTACTGACAGATGCAACAAT TAGTAGCGGC CGCNotⅠ切点利用所设计的序列上的XhoⅠ和NotⅠ两个酶切位点，用Pichia pastoris酵母表达系统的pPIczα作载体，通过T4DNA连接酶在14～18℃下连接，构建了重组质粒pPIczα-Cbt，通过终浓度2000ug/ml抗菌素Zeocin在25～30℃下筛选，及终浓度为0.5％甲醇25～30℃下的诱导表达，获得了眼镜蛇毒神经多肽在酵母菌中的高效表达菌株(Pichia pastoris WY-1)，表达量为8mg/L。
全文摘要
本发明为一种从酵母菌中获得眼镜蛇毒神经多肽菌株及其获得方法,主要是通过从天然眼镜蛇毒神经多肽所测定的一级结构及酵母偏爱的密码子设计的全基因序列,利用基因载体pPIczα,构建的重组质粒pPIczα－Cbt,并获得在该酵母菌中的高效表达产物。该菌株和天然眼镜蛇毒神经多肽有同样的结构和效果,可以替代天然眼镜蛇毒神经多肽,可以满足逐渐增加的市场需求,又能保护蛇资源,是一种有应用前景的菌株。
文档编号C12N15/31GK1298022SQ0013202
公开日2001年6月6日 申请日期2000年11月24日 优先权日2000年11月24日
发明者王婉瑜, 熊郁良, 李克坚, 魏继福 申请人:中国科学院昆明动物研究所