专利名称：编码pfk基因的新核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明提供了编码pfk基因的核苷酸序列，和通过具有增强的pfk基因的棒状细菌发酵生产氨基酸特别是L-赖氨酸的方法。
氨基酸特别是L-赖氨酸用于人用药物和制药工业，特别是动物营养。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物如赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)半胱氨酸有抗性或重要的调节代谢物营养缺陷的并产生L-氨基酸如L-赖氨酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于棒杆菌生产氨基酸的菌株的改良，其是通过扩增各个生物合成基因并研究对氨基酸生产的作用而进行。这一主题的综述文章可在Kinoshita(“谷氨酸细菌”，工业微生物的生物学，Demain和Soloman编辑，BenjaminCummings，英国伦敦，1985，115-142)，Hilliger(BioTec 2，40-44(1991))，Eggeling(氨基酸6261-272(1994))，Jetten和Sinskey(生物技术学关键综述15，73-103(1995))和Sahm等(纽约科学学会年报782，25-39(1996))。
本发明人目的在于为改良氨基酸尤其是L-赖氨酸的发酵生产而提供新措施。
氨基酸、尤其是L-赖氨酸用于人用药物及制药工业，特别是动物营养，因此提供生产氨基酸特别是L-赖氨酸的新改良方法总是令人感兴趣的。
当下文提到L-赖氨酸或赖氨酸时，不仅是指碱，也指盐，如赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明提供了一种来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包括选自如下一组的多核苷酸序列a)与编码包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)编码包括与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)包括a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
本发明还提供了根据权利要求1的多核苷酸，其优选包括能复制的DNA，包括(ⅰ)SEQ ID NO1的核苷酸序列，或(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地，(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有义突变。
本发明还提供了权利要求4的多核苷酸，包括SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，权利要求6的多核苷酸，其编码包括SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽，包括权利要求1的多核苷酸序列的载体，特别是穿梭载体或质粒载体，
以及作为宿主细胞的含有载体的棒状细菌。
本发明还提供了基本上包括多核苷酸序列的多核苷酸，其可通过用包括相应于SEQ ID NO1所述多核苷酸或其片段的序列的探针杂交合适的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述的文库包括具有相应于SEQ ID NO1的所述多核苷酸序列的完整基因。
本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码果糖磷酸激酶的全长cDNA，以及分离与果糖磷酸激酶基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。
本发明的多核苷酸序列还适用作通过聚合酶链反应(PCR)制备编码磷酸果糖激酶的基因的DNA的引物。
作为探针或引物的这种寡核苷酸包括至少30个、优选至少20个、特别优选至少15个连续核苷酸。具有至少40或50个核苷酸的寡核苷酸也是合适的。
“分离的”是指从其天然环境中分离出来。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
“多肽”应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。
本发明的多肽包括SEQ ID NO2的多肽，特别是具有果糖磷酸激酶生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO2的多肽至少70％相同的多肽，优选地与SEQ ID NO2的多肽至少80％、特别是90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本发明另外还提供了用尤其已生产氨基酸的棒状细菌发酵生产氨基酸特别是L-赖氨酸的方法，在该棒状细菌中编码pfk基因的核苷酸序列是增强的，尤其是过表达的。
文中术语“增强”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶的胞内活性的增加，例如通过增加一或多个基因的拷贝数，通过用强启动子或编码具有升高的活性的相应酶的基因或等位基因，及任选地组合使用这些方法。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产L-氨基酸特别是L-赖氨酸。此微生物可以是棒状细菌尤其是棒杆菌属的代表菌。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
适当的棒杆菌菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌株，是例如已知的野生型菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032醋谷棒杆菌ATCC15806嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539Corynebacterium melassecola ATCC17965黄色短杆菌ATCC14067乳发酵短杆菌ATCC13869和扩展短杆菌ATCC14020和从中获得的生产L-赖氨酸的突变体或菌株如谷氨酸棒杆菌FERM-P1709黄色短杆菌FERM-P1708乳发酵短杆菌FERM-P1712谷氨酸棒杆菌FERM-P6463谷氨酸棒杆菌FERM-P6464和谷氨酸棒杆菌DSM5715。
本发明人已成功地分离谷氨酸棒杆菌的编码果糖磷酸激酶的新pfk基因。
为了分离谷氨酸棒杆菌的pfk基因或其他基因，首先在大肠杆菌中建立这一微生物的基因文库。可根据通常已知的教材和手册建立基因文库。例如由Winnacker所著教材基因与克隆，基因工程入门(Verlag Chamie,Weinheim,德国,1990)，或由Sambrook等所著手册分子克隆实验手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。一非常熟知的基因文库是已由Kohara等(细胞50，495-508(1987))在λ载体中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252255-265，1996)阐述了借助于粘粒载体SuperCos I(Wahl等，1987，Proceeding of the NationalAcademy of Sciences USA，842160-2164)，在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。Bormann等(分子微生物学6(3)，317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。为在大肠杆菌中制备谷氨酸棒杆菌的基因文库，也可使用质粒如pBR322(Bolivar，生命科学25，807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19259-268)。合适的宿主尤其是限制和重组缺陷的大肠杆菌菌株，一个例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美国科学院院报7(1990)4645-4649)所述。借助于粘粒克隆的长DNA片段随后可亚克隆并用适于测序的通用载体测序，如Sanger等(美国科学院院报745463-5467，1977)所述。
以此方式可获得编码pfk基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO1，是本发明的一部分，用前述方法从此DNA序列中也已衍生出相应蛋白质的氨基酸序列。所得pfk基因产物的氨基酸序列以SEQ ID NO2表示。
通过遗传密码的简并性从SEQ ID NO1产生的编码DNA序列也是本发明的一部分。同样，与SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。另外，蛋白质中的保守氨基酸置换，如用丙氨酸置换蛋白质中甘氨酸，或用谷氨酸置换蛋白质中天冬氨酸，本领域已知是“有义突变”，其不引起蛋白质任何功能的改变，即是中性的。另外已知蛋白质N和/或C-末端的改变基本不影响其功能，或者甚至可以稳定其功能，本领域技术人员可在以下文献中发现对此的论述，参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169751-757(1987))O’Regan等(基因77237-251.(1989))，Sahin-Toth等(蛋白质科学3240-247(1994))，Hochuli等(生物/技术61321-1325(1988))，及已知关于遗传和分子生物学的教材。以相应方式产生自SEQ ID NO2的氨基酸序列也是本发明的一部分。
同样，与SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的部分杂交的DNA序列也是本发明的组成部分。最后，用产生自SEQ ID NO1的引物经聚合酶链反应(PCR)制备的DNA序列也是本发明的组成部分。这种寡核苷酸典型地具有至少15个核苷酸的长度。
通过杂交鉴别DNA序列的指导可参见宝灵格曼海姆有限公司的手册“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国，1993)以及Liebl等(系统细菌学国际杂志(1991)41255-260)。用聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的指导参见Gait的手册寡核苷酸合成实用方法(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和GrahamPCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德国，1994)。
本发明人发现，在pfk过表达后，棒状细菌以改良方式生产氨基酸尤其是L-赖氨酸。
为获得过表达，可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，在L-赖氨酸发酵生产期间增强表达也是可能的。通过目的在于延长mRNA寿命的措施，也可改良表达。通过防止酶蛋白的分解也可提高酶活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的过表达。
本领域熟练技术人员从以下文献中可发现对此的详述，参见Martin等(生物/技术5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，欧洲专利说明书EPS0472869，美国专利4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技术9，84-87(1991))，Reinscheid等(应用及环境微生物学60，126-132(1994))，LaBarre等(细菌学杂志175，1001-1007(1993))，专利申请WO96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特许公开JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58，191-195(1998))，Makrides(微生物学综述60512-538(1996))及已知关于遗传及分子生物学的教材。
例如，本发明的pfk基因可借助于质粒过表达。
合适的质粒是在棒状细菌中复制的质粒。各种已知的质粒载体，如pZl(Menkel等，应用及环境微生物学(1989)64549-554)，pEKExl(Eikmanns等，基因10293-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因10769-74(1991))是基于隐蔽质粒pHM1519，pBL1或pGA1。其它质粒载体如基于pCG4(US-A4,489,160)，或pNG2(Serwold-Davis等，FEMS微生物学通信66，119-124(1990))或pAG1(US-A5,158,891)可以同样方式使用。
其他合适的质粒载体是那些可通过整合进染色体而进行基因扩增的质粒载体，例如，由Reinscheid等(应用及环境微生物学60126-132(1994))所述的用于复制或扩增hom-thrB操纵子的质粒载体。在这一方法中，将完整基因克隆进能在宿主(典型地是大肠杆菌)中复制而在谷氨酸棒杆菌中不能复制的质粒载体中。可考虑的载体例如是pSUP301(Simon等，生物/技术1,784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145，69-73(1994))，pGEM-T(Promega公司，Madison，WI，USA)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化学杂志26932678-84；US-A5,487,993)，pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，荷兰；Bernard等，分子生物学杂志，234534-541(1993))或pEM1(Schrumpf等，1991，细菌学杂志1734510-4516)。含有待扩增基因的质粒载体然后可经接合或转化转移进希望的谷氨酸棒杆菌菌株。接合方法例如如Schafer等(应用及环境微生物学60，756-759(1994))所述。转化方法例如如Thierbach等(应用微生物学及细菌学29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(生物/技术7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS微生物学通信123，343-347(1994))所述。经“交换”而同源重组后，得到的菌株含有至少两个拷贝的所需基因。
另外，不仅是pfk基因，而且特定生物合成途径、糖酵解、回补代谢、柠檬酸循环或氨基酸输出的一或多种酶的扩增或过表达，对氨基酸特别是L-赖氨酸的生产可以是有益的。
因此，为生产L-赖氨酸，例如可同时过表达一或多种选自如下一组的基因·编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，或·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，或·编码三糖磷酸异构酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，或
·编码3-磷酸甘油激酶的pgk基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，或·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，或·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A-19548222)。
对于氨基酸特别是L-赖氨酸的生产，除了扩增pfk基因外，还有利的是同时弱化·编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE 19950409.1，DSM13047)和/或·编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US09/396,478,DSM12969)。
除pfk基因的过表达之外，抑制非所需的二级反应对氨基酸特别是L-赖氨酸的生产也是有益的(Nakayama“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。
根据本发明产生的微生物可连续培养或用分批方法，补料分批方法或重复补料分批法分批培养以生产氨基酸特别是L-赖氨酸。已知的培养法由Chmiel(Bioprozesstechnik l.Einfuhrung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991)所著教材，或由Storhas(生物反应器和外围设备(Vieweg Verlag,Braunswick/Wiesbaden，1994))所著教材中提供。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求，关于各种微生物培养基的阐述见于，美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C.,USA,1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸，这些物质可单独或混合使用，可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用，可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素，此外，可将适当前体加入培养基中上述物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值，抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃～40℃，持续培养直至赖氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围达到。
L-赖氨酸的分析可通过阴离子交换层析，随后经如Speckman等(分析化学，30，(1958)，1190)所述茚三酮衍生化作用进行。
本发明方法用于发酵制备氨基酸尤其是L-赖氨酸。
本发明借助于以下提供的实施例得以更详述阐述。
实施例1制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组粘粒基因文库如Tauch等(1995，质粒33168-179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA并用限制性内切酶Sau3AI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。得自Stratagene公司(La Jolla，USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编码251301)的粘粒载体SuperCosl(Wahl等(1987)美国科学院院报842160-2164)的DNA用限制性内切酶XbaI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述XbaI，编码27-0948-02)酶切并类似地用虾碱性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述BamHI，编码27-0868-04)酶切。以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC13032 DNA片段混合并用T4 DNA连接酶(AmershamPharmacia,Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编码27-0870-04)处理。连接混合物然后用Gigapack Ⅱ XL包装提取物(Stratagene,La Jolla,USA，产品描述Gigapack Ⅱ XL包装提取物，编码200217)包装进噬菌体中。为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)，将细胞置于10mM MgSO4并与噬菌体悬液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组克隆。
实施例2 pfk基因的分离和测序用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106，Qiagen,Hilden，德国)根据厂商指导分离各个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。凝胶电泳分离后，用QiaExⅡ凝胶提取试剂盒(产品号20021，Qiagen,Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述BamHI，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biotech,Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通信，123343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant,1990，美国科学院院报874645-4649)并在含有50微克/毫升zeocin的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1190)上铺板。重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品号900200，Qiagen，Hilden，德国)进行。测序用Zimmermann等(1990，核酸研究181067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报745463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司(产品号403044，Weiterstadt，德国)的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”。在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism 377”测序仪的“Rotiphoresis NF”丙烯酰胺/双丙烯酰胺凝胶(29∶1)(产品号A124.1，Roth,Karlsruhe，德国)中进行凝胶电泳分离和序列分析。
原始数据资料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14217-231)进行计算机辅助编码区分析。同源性分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余数据库进行。
获得的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。对该核苷酸序列的分析显示一990碱基对的开放读框，其被称为pfk基因。pfk基因编码330个氨基酸的多肽。
实施例3用于在谷氨酸棒杆菌中增强pfk基因的表达载体pZ-pfkex的制备3.1pfk基因的克隆如Eikmanns等(微生物学1401817-1828(1994))所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA。基于实施例2已知的谷氨酸棒杆菌pfk基因的序列，选择下述寡核苷酸用于聚合酶链反应pfk-ex5′-GAT CTA GAA TTC AAC TTT CAG GTG GTA ACC CA-3′pfk-glp25′-GAT CTA GTC GAC CGG ACA AGC GAG GAA TTA T-3′经过ARK生物系统科学有限公司(Darmstadt,德国)合成所述的引物。引物pfk-ex含限制性内切酶EcoRI裂解位点的序列，引物pfk-glp2含限制性内切酶SalI的裂解位点，这些位点在上面所示的核苷酸序列中下面划线。经Innis等的标准PCR方法(PCR方法，方法和应用指南，1990，学术出版社)用Roche诊断学有限公司(Mannheim，德国)Pwo-聚合酶进行PCR反应。借助于聚合酶链反应，该引物允许扩增大约1.05kb大小的DNA片段，它携带谷氨酸棒状杆菌的pfk基因。以0.8％琼脂糖凝胶电泳测定以这种方式扩增的产物。
用限制性酶EcoRI和SalI完全裂解以这种方式获得的PCR片段。用QiaExⅡ凝胶提取试剂盒(产品号200021，Qiagen，Hilden，德国)从琼脂糖凝胶分离大约1.05kb大小的pfk片段。
3.2 在载体pZ8-1中克隆pfk大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭表达载体pZ8-1(EP0375889)用作基础载体用于在谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌中表达。用限制性酶EcoRI和SalI完全裂解该质粒的DNA，然后用虾碱性磷酸酶(RocheDiagnostics GmbH,Manmheim，德国，产品描述SAP，产品号，1758250)去磷酸化。将在实施例3.1中从琼脂糖凝胶分离的pfk片段与以这种方式制备的载体pZ8-1混合并用T4 DNA连接酶(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编号27-0870-04)处理该混合物。
连接混合物转化进大肠杆菌菌株DH5αmcr(Hanahan，见DNA克隆实践方法，Vol.I,IRL-Press,Oxford,Washington DC,USA)。经过在含50mg/l卡那霉素的LB琼脂(Lennox,1955，病毒学，1190)上涂布转化混合物选择携带质粒的细胞。37℃培养过夜后，选择重组的单个克隆。用Qiaprep Spin Miniprep试剂盒(产品号27106，Qiagen,Hiden，德国)按厂家说明从转化子分离质粒DNA并经限制性裂解分析。所得的质粒称为pZ-pfkex。它在
图1中显示。
实施例4 用质粒pZ-pfkex转化菌株DSM5715通过Liebl等所述的电穿孔法(FEMS微生物学通信，53299-303(1989))用质粒pZ-pfkex转化菌株DSM5715。在补加25mg/l卡那霉素的LBHIS琼脂(18.5g/l脑心浸液，0.5M山梨醇，5g/l Bacto-胰胨，2.5g/l Bacto-酵母膏，5g/l NaCl，18g/l Bacto-琼脂))上筛选转化子。在33℃保温2天。
用常规方法(Peters-Wendich等，1998，微生物学，144，915-927)从转化子分离质粒DNA，用限制性内切酶EcoRI和SalI切割并经随后的琼脂糖凝胶电泳检查质粒。获得的菌株称为DSM5715/pZ-pfkex。
实施例5 生产赖氨酸实施例4中制备的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715/pZ-pfkex在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中的赖氨酸含量。
为此，首先在33℃在具有合适抗生素的琼脂板(具有卡那霉素(25mg/l)的脑心琼脂)上培养菌株24小时。从这些琼脂板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgⅢ。
培养基CgⅢNaCl 2.5g/lBacto-肽胨 10g/lBacto-酵母膏 10g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 2％(w/v)pH调至7.4。
加入卡那霉素(25mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。从此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(测量波长660nm)是0.05。培养基MM用作主培养物。培养基MMCSL(玉米浆) 5g/lMOPS(吗啉代丙磺酸) 20g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 50g/lNH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O1.0g/lCaCl2·2H2O10mg/lFeSO4·7H2O10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(过滤灭菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(过滤灭菌)0.2mg/lL-亮氨酸(过滤灭菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至pH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养，加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek 1000(Beckman仪器有限公司，慕尼黑)确定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的赖氨酸量。
所得结果示于表1。
表1
本发明包括如下附图
图1质粒pZ-pfkex图。
图中所采用的缩写和符号有如下含义Kan卡那霉素抗性基因Ptactac启动子pfk谷氨酸棒杆菌ATCC13032的pfk基因rrnB-T1T2大肠杆菌rrnB基因的终止子T1T2rep谷氨酸棒杆菌质粒编码的复制起点(pHM1519的复制起点)perpGA1的控制拷贝数的基因EcoRI限制酶EcoRI的酶切位点SalI限制酶SalI的酶切位点序列表<110>德古萨-于尔斯股份公司<120>编码pfk基因的新核苷酸序列<130>990179 BT<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1120<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>CDS<222>(68)..(1057)<400>1ttgttaccga tgaccacacg ctagattttc cagttttgcc cgaccacaac tttcaggtgg 60taacccc atg arc arc aca ttc acc cca aac ccg agt att gat tcc acg 109Met Ile Ile Thr Phe Thr Pro Asn Pro Ser Ile Asp Ser Thr1 5 10ctg tcg ctc ggc gaa gag ctc tCc cgt gga tcc gtc caa cga ctt gat 157Leu Ser Leu Gly Glu Glu Leu Ser Arg Gly Ser Val Gln Arg Leu Asp15 20 25 30tcc gtc acc gct gtc gca ggt ggt aaa ggc atc aat gtc gcc cac gct 205Ser Val Thr Ala Val Ala Gly Gly Lys Gly Ile Asn Val Ala His Ala35 40 45gtc ttg ctt gcg ggc ttt gaa acc ttg gct gtg ttc cca gcc ggc aag 253Val Leu Leu Ala Gly Phe Glu Thr Leu Ala Val Phe Pro Ala Gly Lys50 55 60ctc gac ccc ttc gtc cca ctg gtc cgc gac atc ggc ttg ccc gtg gaa 301Leu Asp Pro Phe Val Pro Leu Val Arg Asp Ile Gly Leu Pro Val Glu65 70 75act gtt gtg atc aac aag aac gtc cgc acc aac acc aca gtc acc gaa 349Thr Val Val Ile Asn Lys Asn Val Arg Thr Asn Thr Thr Val Thr Glu80 85 90ccg gac ggc acc acc acc aag ctc aac ggc ccc ggc gcg ccg ctc agc 397Pro Asp Gly Thr Thr Thr Lys Leu Asn Gly Pro Gly Ala Pro Leu Ser95 100 105 110gag cag aag ctc cgt agc ttg gaa aag gtg ctt atc gac gcg ctc cgc 445Glu Gln Lys Leu Arg Ser Leu Glu Lys Val Leu Ile Asp Ala Leu Arg115 120 125ccc gaa gtc acc tgg gtt gtc ctg gcg ggc tcg ctg cca cca ggg gca 493Pro Glu Val Thr Trp Val Val Leu Ala Gly Ser Leu Pro Pro Gly Ala130 135 140cca gtt gac tgg tac gcg cgt ctc acc gcg ttg atc cat tca gca cgc 541Pro Val Asp Trp Tyr Ala Arg Leu Thr Ala Leu Ile His Ser Ala Arg145 150 155cct gac gtt cgc gtg gct gtc gat acc tca gac aag cca ctg atg gcg 589Pro Asp Val Arg Val Ala Val Asp Thr Ser Asp Lys Pro Leu Met Ala160 165 170ttg ggc gag agc ttg gat aca cct ggc gct gct ccg aac ctg att aag 637Leu Gly Glu Ser Leu Asp Thr Pro Gly Ala Ala Pro Asn Leu Ile Lys175 180 185 190cca aat ggt ctg gaa ctg ggc cag ctg gct aac act gat ggt gaa gag 685Pro Asn Gly Leu Glu Leu Gly Gln Leu Ala Asn Thr Asp Gly Glu Glu195 200 205ctg gag gcg cgt gct gcg caa ggc gat tac gac gcc atc atc gca gct 733Leu Glu Ala Arg Ala Ala Gln Gly Asp Tyr Asp Ala Ile Ile Ala Ala210 215 220gcg gac gta ctg gtt aac cgt ggc atc gaa cag gtg ctt gtc acc ttg 781Ala Asp Val Leu Val Asn Arg Gly Ile Glu Gln Val Leu Val Thr Leu225 230 235ggt gcc gca gga gcg gtg ttg gtc aac gca gaa ggt gcg tgg act gct 829Gly Ala Ala Gly Ala Val Leu Val ASn Ala Glu Gly Ala Trp Thr Ala240 245 250act tct cca aag att gat gtt gta tcc acc gtt gga gct gga gac tgt 877Thr Ser Pro Lys Ile Asp Val Val Ser Thr Val Gly Ala Gly Asp Cys255 260 265 270gct ctt gca ggt ttt gtt atg gca cgt tcc cag aag aaa aca ctg gag 925Ala Leu Ala Gly Phe Val Met Ala Arg Ser Gln Lys Lys Thr Leu Glu275 280 285gaa tct ctg ctg aat gcc gtg tct tac ggc tcg act gcg gcg tct ctt 973Glu Ser Leu Leu Asn Ala Val Ser Tyr Gly Ser Thr Ala Ala Ser Leu290 295 300cct ggc act acc att cct cgt cct gac caa ctc gcc aca gct ggt gca 1021Pro Gly Thr Thr Ile Pro Arg Pro Asp Gln Leu Ala Thr Ala Gly Ala305 310 315acg gtc acc caa gtc aaa gga ttg aaa gaa tca gca tgaatagcgt1067Thr Val Thr Gln Val Lys Gly Leu Lys Glu Ser Ala320 325 330aaataattcc tcgcttgtcc ggctggatgt cgatttcggc gactccacca cgg1120<210>2<211>330<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>2Met Ile Ile Thr Phe Thr Pro Asn Pro Ser Ile Asp Ser Thr Leu Ser1 5 10 15Leu Gly Glu Glu Leu Ser Arg Gly Ser Val Gln Arg Leu Asp Ser Val20 25 30Thr Ala Val Ala Gly Gly Lys Gly Ile Asn Val Ala His Ala Val Leu35 40 45Leu Ala Gly Phe Glu Thr Leu Ala Val Phe Pro Ala Gly Lys Leu Asp50 55 60Pro PTe Val Pro Leu Val Arg Asp Ile Gly Leu Pro Val Glu Thr Val65 70 75 80Val Ile Asn Lys Asn Val Arg Thr Asn Thr Thr Val Thr Glu Pro Asp85 90 95Gly Thr Thr Thr Lys Leu Asn Gly Pro Gly Ala Pro Leu Ser Glu Gln100 105 110Lys Leu Arg Ser Leu Glu Lys Val Leu Ile Asp Ala Leu Arg Pro Glu115 120 125Val Thr Trp Val Val Leu Ala Gly Ser Leu Pro Pro Gly Ala Pro Val130 135 140Asp Trp Tyr Ala Arg Leu Thr Ala Leu Ile His Ser Ala Arg Pro Asp145 150 155 160Val Arg Val Ala Val Asp Thr Ser Asp Lys Pro Leu Met Ala Leu Gly165 170 175Glu Ser Leu Asp Thr Pro Gly Ala Ala Pro Asn Leu Ile Lys Pro Asn180 185 190Gly Leu Glu Leu Gly Gln Leu Ala Asn Thr Asp Gly Glu Glu Leu Glu195 200 205Ala Arg Ala Ala Gln Gly Asp Tyr Asp Ala Ile Ile Ala Ala Ala Asp210 215 220Val Leu Val Asn Arg Gly Ile Glu Gln Val Leu Val Thr Leu Gly Ala225 230 235 240Ala Gly Ala Val Leu Val Asn Ala Glu Gly Ala Trp Thr Ala Thr Ser245 250 255Pro Lys Ile Asp Val Val Ser Thr Val Gly Ala Gly Asp Cys Ala Leu260 265 270Ala Gly Phe Val Met Ala Arg Ser Gln Lys Lys Thr Leu Glu Glu Ser275 280 285Leu Leu Asn Ala Val Ser Tyr Gly Ser Thr Ala Ala Ser Leu Pro Gly290 295 300Thr Thr Ile Pro Arg Pro Asp Gln Leu Ala Thr Ala Gly Ala Thr Val305 310 315 320Thr Gln Val Lys Gly Leu Lys Glu Ser Ala325 330
权利要求
1.来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包括选自如下一组的多核苷酸序列a)与编码包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)编码包括与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)包括a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。
2.权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是能在棒状细菌中复制的优选地是重组的DNA。
3.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。
4.权利要求2的多核苷酸，包括如SEQ ID NO1所示的核酸序列。
5.权利要求2的可复制的DNA，包括(ⅰ)如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于的(ⅰ)序列的至少一个序列，或(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有义突变。
6.权利要求2的多核苷酸序列，其编码包括示于SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽。
7.发酵生产L-氨基酸特别是L-赖氨酸的方法，其特征在于进行以下步骤(a)发酵生产L-氨基酸的棒状细菌，该细菌中至少pfk基因或其编码核苷酸序列是增强的，特别是过表达的，(b)在培养基或细菌细胞中积累L-氨基酸，及(c)分离L-氨基酸。
8.权利要求7的方法，特征在于所用细菌中所需的L-氨基酸生物合成途径的其它基因是额外增强的。
9.权利要求7的方法，其特征在于所用细菌中降低L-赖氨酸生成的代谢途径至少被部分抑制。
10.权利要求7的方法，其特征在于使用经质粒载体转化的菌株，且此质粒载体携带编码pfk基因的核苷酸序列。
11.权利要求7-10任一项的方法，其特征在于使用产生L-赖氨酸的棒状细菌。
12.权利要求6的方法，其特征在于发酵这样的细菌生产赖氨酸，所述细菌中选自如下一组的一或多个基因同时增强，特别是过表达或扩增12.1编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，12.2编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，12.3编码三糖磷酸异构酶的tpi基因，12.4编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，12.5编码3-磷酸甘油激酶的pgk基因，12.6编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因。
13.权利要求9的方法，其特征在于发酵这样的细菌生产L-赖氨酸，所述细菌中选自如下一组的一或多个基因同时弱化13.1编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因，13.2编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因。
14.前述一或多条权利要求的方法，其特征在于使用谷氨酸棒杆菌的微生物。
15.权利要求1的多核苷酸序列作为经聚合酶链反应产生编码果糖磷酸激酶的基因的DNA的引物的应用。
16.权利要求1的多核苷酸序列作为杂交探针的应用。
全文摘要
本发明涉及分离的多核苷酸,其包括选自如下一组的多核苷酸序列:a)与编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸,b)编码包括与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸,c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸,以及d)包括a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。本发明还提供了经增强pfk基因发酵生产L－氨基酸的方法,以及本发明多核苷酸作为引物或杂交探针的应用。
文档编号C12N1/21GK1297055SQ0013250
公开日2001年5月30日 申请日期2000年11月23日 优先权日1999年11月23日
发明者贝蒂娜·默克尔, 瓦尔特·普费弗勒 申请人:德古萨－于尔斯股份公司