编码zwal基因的新核苷酸序列的制作方法

专利名称：编码zwal基因的新核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明提供了编码zwa1基因的核苷酸序列，和用棒状细菌经发酵生产氨基酸，尤其L-赖氨酸的方法，其中该棒状细菌中zwa1鉴于是扩增的。
氨基酸，尤其L-赖氨酸用于人用药物及制药工业，尤其用于动物营养。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵生产。由于其极其重要，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌及供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法获得对抗代谢物如赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-半胱氨酸有抗性，或重要的调节氨基酸缺陷的并产生L-氨基酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于棒杆菌生产氨基酸的菌株的改良，其通过扩增各个氨基酸生物合成基因，并研究对氨基酸生产的作用而进行改良。此方面的综述文章见Kinoshita(“谷氨酸细菌”，工业微生物的生物学，Demain和Soman编辑，BenjaminCummings英国伦敦，1985,115-142),Hilliger(生物技术2,40-44(1991)),Eggeling(氨基酸6:261-272(1994)),Jetten和Sinskey(生物技术的关键回顾15,73-103(1995))和Sahm等(纽约科学协会年报782,25-39(1996))。
本发明人目的在于提供改良的经发酵生产氨基酸，尤其L-赖氨酸的新措施。
氨基酸尤其L-赖氨酸用于人用药物，制药工业，特别是动物营养。因此提供生产氨基酸特别是L-赖氨酸的新改良方法是令人感兴趣的。
当下文提及L-赖氨酸或赖氨酸时，不仅指碱，也指盐，如赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明提供了来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包括选自如下一组的多核苷酸序列a)与编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)编码包括与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)互补于a)或b)的多核苷酸序列的多核苷酸，及d)包括a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
本发明还提供了如权利要求1的多核苷酸，其优选是能复制的DNA，包括(ⅰ)SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，及任选地(ⅳ)(ⅰ)序列中有功能的中性有义突变。
本发明还提供了如权利要求2的多核苷酸，其包括SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，其中该多核苷酸是在棒状细菌中能复制的优选地重组的DNA，如权利要求2的多核苷酸，其编码包括SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽，
一种含有编码谷氨酸棒杆菌zwa1基因的DNA序列的载体，其包含于载体(质粒)pCR2.1zwa1exp中，保藏于大肠杆菌Top10F’，保藏号DSM13115，及作为宿主细胞的棒状细菌，其含有权利要求6的载体，或其中zwa1基因是扩增的。
本发明还提供了多核苷酸，其基本上包括一多核苷酸序列，其可通过用包括SEQ ID NO:1所述多核苷酸序列或其部分的探针杂交相应的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述文库包括具有相应于SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的完整基因。
本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码zwa1基因产物的全长cDNA，以及分离那些具有与zwa1基因序列高度相似性的cDNA或基因。
本发明的多核苷酸序列还适用作引物，借助于其，通过聚合酶链反应(PCR)，可制备编码zwa1基因的基因DNA。
这种用作探针或引物的寡核苷酸包括至少30个，优选至少20个，更优选至少15个连续核苷酸。长度为至少40或50个核苷酸的寡核苷酸也是合适的。
“分离的”意为从其天然环境中分离出来。
“多核苷酸”一般指多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
“多肽”是指含有经肽键结合的两或多个氨基酸的肽或蛋白质。
本发明的多肽包括SEQ ID NO:2的多肽，特别是具有zwa1基因产物生物学活性的多肽，及那些至少70％，优选至少80％，更优选至少90～95％相同于如SEQ ID NO:2多肽，并具有所述活性的多肽。
本发明还提供了一种用棒状细菌经发酵制备氨基酸，尤其L-赖氨酸的方法，此棒状细菌尤其已生产氨基酸，且其中编码zwa1基因的核苷酸序列是扩增的，尤其是过表达的。
文中术语“扩增”阐述了例如通过提高基因的拷贝数，或用强启动子，或用编码高活性相应酶的基因，及任选组合使用这些方法，提高微生物中由相应DNA编码的一或多种酶的胞内活性。
本发明提供的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产L-赖氨酸。它们可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
适当的棒杆菌属，尤其谷氨酸棒杆菌种的菌株，例如是野生型菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032醋谷棒杆菌ATCC 15806嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 138070Corynebacterium melassecola ATCC 17965嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539黄色短杆菌ATCC 14067乳发酵短杆菌ATCC 13869和扩展短杆菌ATCC 14020和从中获得的生产L-赖氨酸的突变体或菌株，如谷氨酸棒杆菌FERM-P 1709黄色短杆菌FERM-P 1708乳发酵短杆菌FERM-P 1712谷氨酸棒杆菌FERM-P 6463谷氨酸棒杆菌FERM-P 6464和谷氨酸棒杆菌DSM5715本发明人已成功地分离了编码谷氨酸棒杆菌Zwa1基因产物的新zwa1基因。
为分离谷氨酸棒杆菌的zwa1基因或其他基因，首先在E.coli中建立此微生物的基因文库。建立基因文库可根据通常已知的教材和手册中所述。例如由Winnacker所著教材基因与克隆，基因工程入门(Verlag Chamie,Weinheim，德国，1990)，或由Sambrook等所著手册分子克隆实验手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。一熟知的基因文库是已由Kohara等(细胞50,495-508(1987))在λ载体中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252:255-265,1996)阐述了一谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库，其是借助于粘粒载体SuperCosl(Wahl等，1987,Proceedings of the National Academy of Sciences USA,84:2160-2164),在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等,1988,核酸研究16:1563-1575)中建立的。Bormann等(分子微生物学6(3),317-3267)阐述了用粘粒pHC79(Hohm和Collins，基因11,291-298(1980))建立的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。用质粒如pBR322(Bolivar,生命科学25,807-818(1979))或pUC9(Vieira等，1982,基因19:259-268)在E.coli中制备谷氨酸棒杆菌的基因文库也是可能的。适当的宿主尤其是那些限制及重组缺陷的E.coli菌株。例如是由Grant等所述的菌株DH5αMCR(美国科学院院报，87(1990)4645-4649)。借助于粘粒克隆的长DNA片段随后可亚克隆，并用适于测序的通用载体测序，如由Sanger等(美国科学院院报74:5463-5467,1977)所述。
以此方式可获得编码zwa1基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO:1，是本发明的一部分。zwa1基因的相应基因产物的氨基酸序列已从此DNA序列中衍生出。所得zwa1基因产物的氨基酸序列以SEQ ID NO:2表示。
通过遗传密码简并，得自SEQ ID NO:1的编码DNA序列也是本发明的一部分。同样，与SEQ ID NO:1或其部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。保守氨基酸置换，例如用丙氨酸置换蛋白质中甘氨酸，或用谷氨酸置换蛋白质中天冬氨酸，本领域已知是“有义突变”，其不引起蛋白质任何功能的改变，即是中性的。还已知蛋白质N和/或C-末端的改变基本不影响其功能或者甚至可稳定其功能。关于此方面的论述参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169:751-757(1987))，O’Regan等(基因77:237-251(1989)),Sahin-Toth等(蛋白质科学3:240-247(1994)),Hochuli等(生物/技术6:1321-1325(1988))，及已知的遗传和分子生物学的教材。以相应方式得自SEQ ID NO:2的氨基酸序列也是本发明的一部分。
同样，与SEQ ID NO:1或其部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。最后，用得自SEQ ID NO:1的引物经聚合酶链反应(PCR)制备的DNA序列也是本发明的组成部分。这种寡核苷酸典型地长度至少为15个的核苷酸。
通过杂交鉴别DNA序列的指导可见于宝灵格曼海姆有限公司(Mannheim，德国，1993)的手册“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”，及Liebl等所述(国际系统细菌学杂志(1991)41:255-260)。关于借助于PCR扩增DNA序列的指导见于Gait所著手册“寡核苷酸合成实用方法”(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和Graham所述PCR(Spektrum Akademischen Verlag,Heiclelberg，德国，1994)。
本发明人发现在zwa1基因过表达后，棒状细菌以改良方式生产氨基酸，尤其L-赖氨酸。
为达到过表达，可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，能在发酵生产氨基酸期间提高表达。通过目的在于延长mRNA寿命的措施也可改良表达。另外，通过防止酶蛋白质的分解，也可提高酶活性。基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增，或者，过表达基因还可通过改变培养基的组分和培养条件而获得。
相关指导可见于Martin等(生物/技术5,137-146(1987)),Guerrero等(基因138,35-41(1994)),Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6,428-430(1988)),Eikmanns等(基因102,93-98(1991)),欧洲专利说明书EPS 0472869,美国专利4,602,893,Schwarzer和Puhler(生物/技术9,84-87(1991)),Reinscheid等(应用及环境微生物学60,126-132(1994)),LaBarre等(细菌学杂志175,1001-1007(1993)),专利申请WO 96/15246,Malumbres等(基因134,15-24(1993))，日本特许公开JP-A-10-229891,Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58,191-195(1998)),Makrides(微生物学综述60:512-538(1996)),及已知的遗传及分子生物学的教材中所述。
例如，如Reinscheid等所述(应用与环境微生物60,126-132(1994))，借助于整合方法将本发明的zwa1基因复制或过表达。在此方法中，将完整基因克隆入能在宿主(典型为E.coli)中复制但在谷氨酸棒杆菌中不能复制的质粒载体中。可能的载体例如是pSUP301(Simon等，生物/技术1,784-791(1983)),pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145,69-73(1994)),pGEM-T(Promega公司，Madison,WI，美国),pCR 2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化学杂志269:32678-84；美国专利5,487,993)，pCRBlunt(Invitrogen,Groningen,荷兰；Bernard等，分子生物学杂志，234:534-541(1993)，或pEM1(Schrumpf等，1991，细菌学杂志173:4510-4516)。然后将含有要被扩增的基因的质粒载体，通过接合或转化转移入所需谷氨酸棒杆菌菌株。接合法例如由Schafer等所述(应用和环境微生物学60,756-759(1994))。转化法例如由Thierbach等(应用微生物学及生物技术学29,356-362(1988)),Dunican和Shivnan(生物/技术7,1067-1070(1989))及Tauch等[FEMS微生物学通信123,343-347(1994)所述。在通过“交换”同源重组之后，所得菌株含有两个相关基因拷贝。以此方式借助于整合质粒pCR2.1zwa1exp制备携带2个zwa1基因拷贝的菌株DSM5715::pCR2.1zwa1exp。
另外，除了Zwa1基因产物之外，扩增尤其是过表达糖酵解，添补代谢，柠檬酸循环或氨基酸输出的特定生物合成途径的一或多种酶，对氨基酸尤其L-赖氨酸的生产是有益的。
因此，同时过表达选自以下的一或多个基因，对L-赖氨酸的制备是有益的·编码dapA基因(EP-B 0197335)，·编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因，·编码四二氢-26-吡啶二羧酸琥珀酰化酶(tetradihydrodipicolinatesuccinylase)的dapD基因(Wehrmann等，细菌学杂志180:3159-3165(1998))，·编码琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰化酶的(Wehrmann等，细菌学杂志177:5991-5993(1995))，·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174:6076-6086)，·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174:6076-6086)，或·编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲生物化学杂志254,395-403(1998))，·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A-19548222)。
除zwa1基因之外，同时弱化以下基因对氨基酸，尤其L-赖氨酸的生产也有益处·编码磷酸丙酮酸羧激酶的基因(DE19950409.1；DSM13047]和/或·编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US09/396,478；DSM12969)。
除过表达zwa1基因之外，排除非所需二级反应对氨基酸尤其L-赖氨酸的生产也是有益的(Nakayama“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl,Sikyta,Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。
除扩增zwa1基因之外，弱化zwa2基因或zwa2基因相关基因产物的作用，也是有益的。相应基因及相关方法可见于平行申请的专利申请19959327.2。
一种适于插入诱变的整合载体pCR2.1zwa2int，已保藏在E.coliTOP10F′中，保藏号DSM 13113。
质粒pCR2.1zwa2int包含由Mead等所述(生物/技术9:657-663(1991)的质粒pCR2.1-TOPO，其中已掺入zwa2基因的内部片段，zwa2基因在德国专利申请19959327.2中示作SEQ ID NO:1。在染色体zwa2基因中转化及同源重组(插入)之后，该质粒导致丧失全部功能。例如，以此方式制备菌株DSM5715::pCR2.1zwa2int，其zwa2基因产物被消除。
根据本发明制备的微生物可连续培养，或以分批法(分批培养)或补料分批(补料法)或重复补料分批法(重复补料法)非连续培养，以生产氨基酸，尤其L-赖氨酸。已知培养法概述见于Chmiel所著教材“生物方法技术1，生物方法技术导论”(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart,1991)，或由Storhas所著教材“生物反应器与外周设备”(Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994)中所述。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株所要求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(WashingtonD.C.，美国，1981)。糖及碳水化合物如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸可用作碳源。这些物质可单独或混合使用。有机含氮化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵可用作氮源。这些氮源可单独或混合使用。磷酸，KH2PO4或K2HPO4或相应钠盐可用作磷源。培养基必须还含有金属盐如硫酸镁或硫酸铁，其为生长所必需。最后，除上述物质外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。另外，可将适当前体加入培养基中，所述起始物质可以单批形式，或在培养期间以适当方式加入。
可以适当方式应用碱性化合物如NaOH,KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物pH值。可应用抗泡沫剂如脂肪酸聚乙二醇酯，以控制泡沫产生。具有选择性作用的适当物质如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。为保持有氧条件，可向培养物中导入氧气或含氧混合气体如空气。培养温度通常在20℃-45℃，优选28℃-40℃。持续培养直至生成最多赖氨酸。此目的通常在10-160小时内达到。
通过阴离子交换层析，随后经如Spackman等所述(分析化学30(1958),1190)茚三酮衍生化作用，进行L-赖氨酸分析。
以下微生物根据布达佩斯条约，已保藏在德意志微生物保藏中心，(DSMZ，不伦瑞克，德国)E.coli菌株Top10F,/pCR 2.1 zwa1exp，保藏号DSM13115。
本发明的方法用于经发酵制备氨基酸，尤其L-赖氨酸。
除扩增zwa1基因之外，弱化zwa2基因也是有益的。相应基因或适于插入诱变的载体pCR2.1zwa2int，保藏于E.coli TOP10F’中，保藏号DSM13113。
本发明借助于以下实施例得以更详细阐述。
实施例1制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组粘粒基因文库。
如Tauch等(1995，质粒33:168-179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的染色体DNA，并用限制性内切酶Sau3AⅠ(AmershamPharmacia,Freiburg，德国，产品描述Sau3AⅠ，编码号27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals,德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。得自Stratagene公司(La Jolla,USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编码号251301)的粘粒载体SuperCosl(Wahl等(1987)美国科学院院报84:2160-2164)的DNA，用限制性内切酶XbaⅠ(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述XbaⅠ，编码27-0948-02)酶切，并类似地用虾碱性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性内切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg,德国，产品描述BamHⅠ，编码27-0868-04)酶切。将以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC 13032DNA片段混合，并用T4 DNA连接酶(Amersham Pharmacia,Freiburg,德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编码27-0870-04)处理。然后将连接混合物然后用GigapackⅡXL包装提取物(Stratagene,La Jolla,USA,产品描述Gigapack ⅡXL包装提取物，编码200217)包装进噬菌体中。为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)，将细胞置于10mM MgSO4中并与噬菌体悬液混合。如Sambrook等，(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定。细胞在含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox,1955,病毒学，1:190)上铺板，在37℃保温过夜后，选择重组克隆。
实施例2 zwa1基因的分离与测序用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106,Qiagen,Hilden，德国)，根据厂商指导分离各个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶Sau3AⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述Sau3AⅠ，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals,德国曼海姆，产品描述SAP，编码758250)将DNA片段去磷酸化。在经凝胶电泳分离后，用QiaExⅡ凝胶提取试剂盒(产品号20021,Qiagen,Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。得自Invitrogen公司(Groningen,荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号k2500-01)的测序载体pZero-1的DNA，用限制性内切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg,德国，产品描述BamHⅠ,产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，将DNA混合物与T4连接酶(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994,FEMS微生物学通信，123:343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant,1990,美国科学院院报87:4645-4649)，并在具有50μg/ml zercin的LB琼脂(Lennox,1955，病毒学，1:190)上铺板。用Biorobot 9600(产品号900200,Qiagen,Hilden，德国)制备重组克隆的质粒。用如Zimmermann等(1990，核酸研究18:1067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报74:5463-5467)的双脱氧链终止法进行测序。使用得自PE应用生物系统公司(产品号403044,Weiterstadt,德国)的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒。”在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt,德国)的“ABI Prism 377”测序仪的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/双丙烯酰胺”凝胶(29:1)(产品号A124.1,Roth,Karlsruhe,德国)中进行凝胶电泳分离和序列分析。
获得的原始序列数据然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14:217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden,1986，核酸研究，14:217-231)进行计算机辅助编码区分析，同源性分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25:3389-3402)，对“国家生物技术信息中心”(NCBI,Bethsda,MD,USA)的非冗余数据库进行。
所得zwa1基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1。对该核苷酸序列的分析显示-597碱基对的开放读框，其被称为zwa1基因，此zwa1基因编码199个氨基酸的多肽，如SEQ ID NO:2所示。
实施例3制备用于过表达zwa1的载体通过如Eikmanns等所述(微生物学140:1817-1828(1994))方法，从菌株ATCC 13032分离染色体DNA。基于实施例2中已知的谷氨酸棒杆菌的zwa1基因的序列，选择以下寡核苷酸进行PCR:
zwa1-d1:5’TCA CA CCG ATG ATT CAG GC 3’zwa1-d2:5’AGA TTT AGC CGA CGA AAG CG 3’
通过MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成所示引物，并通过Innis等所述标准PCR方法(PCR Protocols.A guide to methods andapplications,1990,Academic Press)，用Boehringer的Pwo聚合酶进行PCR反应。借助于PCR，分离大小近于1.0kb的DNA片段，其携带zwa1基因。
用Invitrogen公司的TOPO TA克隆试剂盒(Carlsbad,CA,USA；目录号K4500-01)，在载体pCR2.1-TOPO(Mead等(1991)生物技术9:657-663)中，连接扩增的DNA片段。然后用连接物电穿孔E.coli菌株Top10F’(Hanahan,DNA克隆实用技术，Vol.I.IRL-Press,Oxford,Washington DC,美国)。通过将转化混合物铺板于已补加25mg/ml卡那霉素的LB琼脂平板(Sambrook等，分子克隆实验手册，2ndEd,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)上，选择携带质粒的细胞。借助于Qiagen的QIAprep Spin微量制备试剂盒，从转化体中分离质粒DNA，并用限制酶EcoRⅠ限制，接着进行琼脂糖凝胶电泳(0.8％)。此质粒被称为pCR2.1zwa1exp。
实施例4在赖氨酸生产菌DSM5715中复制zwa1基因通过Tauch等所述电穿孔法(FEMS Microbiological Letters,123:343-347(1994))，将实施例3中所述载体pCR2.1zwa1exp电穿孔进谷氨酸棒杆菌DSM5715中。菌株DSM5715是一种抗AEC(氨乙基半胱氨酸)的赖氨酸生产菌。载体pCR2.1zwa1exp在DSM5715中不能独立地复制，且只在其已被整合入DSM5715染色体，才在细胞中存留。通过将电穿孔混合物铺板于已补加15mg/l卡那霉素的LB琼脂平板(Sambrook等，分子克隆实验手册2ndEd,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)上，选择具有整合入染色体的pCR2.1zwa1exp的克隆。为检测整合，通过Innis等的标准方法(PCR Protocols.A guide to methods and Applications,1990,Academic Press)，用Boehringer的Pwo聚合酶进行对照PCR。通过引物M13通用正向(5’-gttttcccagtcacgac-3’)(Invitrogen公司，Cat.No.N540-02)和M13通用反向(5’-caggaaacagctatgac-3’)(Invitrogen公司，Cat.No.N530-02)与只能在载体pCR2.1zwa1exp的序列内结合的引物zwa1-d1和zwa1-d2(参见实施例3)组合，可证实质粒pCR2.1zwa1exp已被插入赖氨酸生产菌DSM5715的染色体中。此菌株被称为DSM5715::pCR2.1zwa1exp。
实施例5制备赖氨酸将实施例4中所得谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715::pCR2.1zwa1exp，在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中赖氨酸含量。
为此，首先将菌株在具有适当抗生素的琼脂平板(具有25mg/l卡那霉素(25mg/l/l)的脑心琼脂平板)上，在33℃培养24小时。从这些琼脂培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶中)。将完全培养基CgⅢ用作预培养的培养基。向其中加入卡那霉素(25mg/l)。在摇床上以240rpm在33℃培养48小时。从此预培养物接种主培养物，从而主培养物的初始OD(660nm)为0.1。MM培养基用作主培养。MM培养基CSL(玉米浸液) 5g/lMOPS 20g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 50g/l盐(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSQ4·H2O 5.0mg/l生物素(过滤灭菌) 0.3mg/l盐酸硫胺素(过滤灭菌) 0.2mg/l
亮氨酸(过滤灭菌)0.1g/lCaCO325g/l用氨水将CSL,MOPS及盐溶液调节至pH为7，并高压灭菌。然后加入无菌底物及维生素溶液，以及干燥状态下高压灭菌的CaCO3。
在具有档板的100ml圆锥形烧瓶中，以10ml体积进行培养。加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃及80％大气湿度下培养。
48小时后，用Biomek 1000(Beckmann Intruments GmbH,Munich)在测定波长660nm测定OD。用Eppendorf Biotronik(Hamburg，德国)的氨基酸分析仪，通过离子交换层析，并用茚三酮检测柱后衍生化作用而确定形成的赖氨酸量。
试验结果示于表1。
表1
序列表<110>德古萨-于尔斯股份公司<120>编码zwa1基因的新核苷酸序列<130>990172 BT<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1260<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>-10_信号<222>(383)..(388)<220><221>-35_信号<222>(360)..(365)<220><221>CDS<222>(413)..(1009)<400>1ccgaaatatt ccaaatatgt aacataaatc acacccgatg attcaggcgg gatgacctgc 60gacttcaagg tcgcaccaaa gtcagattga tatagatttc gtaaataacg tgacacaatc 120gtgaccttcg ggttaccgtg tatcccaggc accgcaacag ttcatctgca agtccggctc 180atcgccaaac cctgtctggg gtcggaagtt gaacaacctc cttggtgcaa cagaacttta 240aaccacaaac tcccgcattc atgtgggcca tattgcagac agggacgggg aaaccaccca 300ccatcttttc acaaaagaag gcatggaggc caactccttg gggtgaagcc agacatccac 360tggcagagca actcctccgc tctaacccga cagctaacct cgacggcgac aa atg aga 418Met Arg1gga aaa ctt ttc atg gga cgt cac tcc act aag act agc tcc gcg ttc 466Gly Lys Leu Phe Met Gly Arg His Ser Thr Lys Thr Ser Ser Ala Phe5 10 15acc aag ctc gca gct tcc acc atc gct ttc ggt gct gct gca acc atc 514Thr Lys Leu Ala Ala Ser Thr Ile Ala Phe Gly Ala Ala Ala Thr Ile20 25 30atg gct cct tct gca tct gct gca cct gat tcc gac tgg gat cgc ctc 562Met Ala Pro Ser Ala Ser Ala Ala Pro Asp Ser Asp Trp Asp Arg Leu35 40 45 50gca cag tgc gag tcc ggt ggt aac tgg gca atc aac acc ggt aac ggc610Ala Gln Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp Ala Ile Ash Thr Gly Asn Gly55 60 65tac cac ggt ggt ctg cag ttc tcc gct agc acc tgg gct gct tac ggc658Tyr His Gly Gly Leu Gln Phe Ser Ala Ser Thr Trp Ala Ala Tyr Gly70 75 80ggc cag gag ttc gct acc tac gca tac cag gca acc cgt gag cag cag706Gly Gln Glu Phe Ala Thr Tyr Ala Tyr Gln Ala Thr Arg Glu Gln Gln85 90 95atc gct gtt gca gag cgc acc ttg gct ggt cag ggc tgg ggc gca tgg754Ile Ala Val Ala Glu Arg Thr Leu Ala Gly Gln Gly Trp Gly Ala Trp100 105 110cct gct tgc tcc gct tcc ctt gga ctg aac tcc gct cca acc cag cgt802Pro Ala Cys Ser Ala Ser Leu Gly Leu Asn Ser Ala Pro Thr Gln Arg115 120 125 130gac ctc tcc gct acc acc tcc acc cca gag cca gct gca gct gca cca850Asp Leu Ser Ala Thr Thr Ser Thr Pro Glu Pro Ala Ala Ala Ala Pro135 140 145gct gtt gct gag tac aac gct cct gca gcc aac atc gca gtt ggc tcc898Ala Val Ala Glu Tyr Asn Ala Pro Ala Ala Asn Ile Ala Val Gly Ser150 155 160acc gac ttg aac acc atc aag tcc acc tac ggc gct gtc acc ggc acc946Thr Asp Leu Asn Thr Ile Lys Ser Thr Tyr Gly Ala Val Thr Gly Thr165 170 175ctc gct cag tac ggc atc acc gtt cca gct gag gtt gag tct tac tac994Leu Ala Gln Tyr Gly Ile Thr Val Pro Ala Glu Val Glu Ser Tyr Tyr180 185 190aac gct ttc gtc ggc taaatctagc tgcacttttt aaaagggagg gaaccttaaa1049Asn Ala Phe Val Gly195cgggttccct ccctttttgc atgccatttc acgacgcgcc agtcatcctt ttgtgaattg 1109ggcaccaaga tttcctgatt ttggccacca ttttgccgaa accttggtgc cgaaagtacg 1169cccagtagaa aaaccgcatg aaaaaagagg caacaccgcc gaaacgggtt gcctcttttt 1229taagtttctt agcggttgat ccgggtgtac g 1260<210>2<211>199<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>2Met Arg Gly Lys Leu Phe Met Gly Arg His Ser Thr Lys Thr Ser Ser1 5 10 15Ala Phe Thr Lys Leu Ala Ala Ser Thr Ile Ala Phe Gly Ala Ala Ala20 25 30Thr Ile Met Ala Pro Ser Ala Ser Ala Ala Pro Asp Ser Asp Trp Asp35 40 45Arg Leu Ala Gln Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp Ala Ile Asn Thr Gly50 55 60Asn Gly Tyr His Gly Gly Leu Gln Phe Ser Ala Ser Thr Trp Ala Ala65 70 75 80Tyr Gly Gly Gln Glu Phe Ala Thr Tyr Ala Tyr Gln Ala Thr Arg Glu85 90 95Gln Gln Ile Ala Val Ala Glu Arg Thr Leu Ala Gly Gln Gly Trp Gly100 105 110Ala Trp Pro Ala Cys Ser Ala Ser Leu Gly Leu Asn Ser Ala Pro Thr115 120 125Gln Arg Asp Leu Ser Ala Thr Thr Ser Thr Pro Glu Pro Ala Ala Ala130 135 140Ala Pro Ala Val Ala Glu Tyr Asn Ala Pro Ala Ala Asn Ile Ala Val145 150 155 160Gly Ser Thr Asp Leu Asn Thr Ile Lys Ser Thr Tyr Gly Ala Val Thr165 170 175Gly Thr Leu Ala Gln Tyr Gly Ile Thr Val Pro Ala Glu Val Glu Ser180 185 190Tyr Tyr Asn Ala Phe Val Gly195
本申请有如下附1质粒pCR2.1zwa1exp的图谱长度数据为近似值。图中所用缩写及符号有如下含义ColE1 ori质粒ColE1的复制起点。lac Z:β-半乳糖苷酶基因的5’末端。f1 ori噬菌体f1的复制起点。KmR卡那霉素抗性ApR氨苄青霉素抗性EcoRⅠ限制酶EcoRⅠ的切割位点zwa1:zwa1基因
权利要求
1.包括选自以下一组多核苷酸序列的分离的多核苷酸a)与编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)编码包括与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)互补于a)或b)的多核苷酸序列的多核苷酸，及d)包括a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
2.如权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是在棒状细菌中能复制的优选重组的DNA。
3.如权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。
4.如权利要求1的多核苷酸，包括SEQ ID NO:1所示核酸序列。
5.权利要求2能复制的DNA，包括(ⅰ)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有义突变。
6.含有权利要求1的多核苷酸的载体，尤其pCR2.1zwa1exp，其特征在于具有如


图1所示限制图谱，保藏在E.coli中，保藏号DSM11315。
7.作为宿主细胞的棒状细菌，其含有权利要求6的载体或其中zwa1基因是扩增的。
8.制备L-氨基酸，尤其L-赖氨酸的方法，特征在于进行以下步骤a)发酵所需的生产L-氨基酸的细菌，该细菌中至少zwa1基因是扩增的，b)浓缩培养基或细菌细胞中的所需产物，并c)分离L-氨基酸。
9.权利要求8的方法，特征在于所用的细菌中所需L-氨基酸的生物合成途径的其它基因被额外扩增。
10.权利要求8的方法，特征在于所用的细菌中，降低L-赖氨酸生成的代谢途径至少被部分关闭。
11.权利要求8-12任一项的方法，特征在于使用产生L-赖氨酸的棒状细菌。
12.权利要求8的方法，特征在于为制备L-赖氨酸，发酵如下的细菌，该细菌中一或多个选自以下一组的基因是同时扩增的，尤其是过表达的12.1编码二氢-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，12.2编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因，12.3编码四-二氢-2,6-吡啶二羧酸琥珀酰化酶的dapD基因，12.4编码琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰化酶的dapE基因，12.5编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，12.6编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，12.7编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo基因，12.8编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因。
13.权利要求8的方法，特征在于为制备L-赖氨酸，发酵如下的细菌，该细菌中，选自以下一组的一或多个基因是同时弱化的13.1编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因13.2编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因。
14.前述一或多条权利要求的方法，特征在于应用谷氨酸棒杆菌的微生物。
15.权利要求1的多核苷酸序列或其部分作为杂交探针以分离编码Zwa1基因产物的cDNA的应用。
16.权利要求1的多核苷酸序列或其部分作为杂交探针以分离与zwa1基因序列高度相似的cDNA或基因的应用。
全文摘要
本发明涉及一种分离的多核苷酸,其包括选自以下一组的多核苷酸序列:a)与编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸,b)编码包括与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸,c)互补于a)或b)的多核苷酸序列的多核苷酸,及d)包括a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。本发明还涉及发酵制备L－氨基酸的方法,其中在所用棒状细菌中zwal基因是扩增的。
文档编号C12N15/11GK1304998SQ0013403
公开日2001年7月25日 申请日期2000年12月7日 优先权日1999年12月9日
发明者贝蒂娜·默克尔, 瓦尔特·普费弗勒, 阿希姆·马克思, 约恩·卡利诺夫斯基, 布里吉特·巴特, 阿尔弗雷德·普尔勒 申请人:德古萨－于尔斯股份公司