专利名称：用于鉴定正品大黄的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于鉴定正品大黄的方法和试剂盒。
大黄是闻名世界的我国特产药材，其医药应用可追溯到几千年前。早在《神农本草经》中已有记载。其后，历代医药书籍中也都相沿记载，并陆续补充新内容(楼之岑，1993)。大黄自古以来用作“破瘀活血，攻下泻热”的主药，认为有“推陈致新之力，夺关斩将之能”，并与人参、熟地、附子一起被誉为临床中药的“四大金刚”，力峻功奇(殷卫和郑俊华，1993)。正品大黄是指中国药典规定的可供药用的植物种类，包括蓼科(Polygonaceae)大黄属的三个种Rheum officinale，R.palmatum，R.tanguticum(中华人民共和国卫生部药典委员会，2000)。目前，由于大量的采挖，正品大黄远远不能满足市场的需要，因此，市场上常有伪品大黄冒充正品大黄出售。由于伪品大黄不含或含少量结合型蒽醌甙类，所以无或仅有微弱的泻下作用，有的甚至有毒副作用(郑俊华，1999)。因此，正品大黄的正确鉴定是保障人民用药安全的前提。
现有的常用的中药鉴定的四大方法是原(动)植物鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定(郑俊华，1999)。但是，这些传统的物种特异性标记是特定的基因型在不同环境、条件下的表现型，因而受部位、发育阶段、环境因素的影响，即物种内存在变异，给鉴定带来困难。同时，传统的鉴定方法对同属多来源物种、道地药材、动物药等难以鉴定。此外，这些方法对从业人员要求较高，难以普及。国内外由误用中药引发的中毒、死亡案件时有发生。
DNA分子标记技术用于中药鉴定是在最近五、六年发展起来的，虽然起步较晚，但发展迅速。研究的方法主要有RAPD、PCR-RFLP和DNA测序。从已有的报道看，对中药的分子鉴定方法多集中在RFLP，RAPD等。但RFLP技术难度大，成本高，且每次分析产生的多态性不高；而RAPD技术对反应条件过于灵敏，因而重复性差；唯有DNA测序能从根本上对不同的种或品种作出鉴定(曹晖等，1998；王义权等，1997；王康正等，1997；舒艳群等，1999)。目前，应用DNA测序技术已对中药海马、龟板、鳖甲、人参与西洋参及其伪品、野山参与载培参、蛇床、鸡内金类、紫河车、鹿鞭及伪品等进行了鉴定(吴平等，1998；Ngan etal.，1999；马小军等，2000；蔡金娜等，2000；王建云等，1996)。
本发明针对上述传统质量控制方法的局限，应用DNA分子标记技术，采用DNA直接测序方法，测定了3种正品大黄和常用的10种伪品大黄的叶绿体trnL/trnF的序列，找到了正品大黄与伪品大黄的区别位点，并根据此位点，设计了正品大黄的特异扩增引物。通过实验，我们得到了一个最佳的特异扩增条件，在此条件下，正品大黄能扩增出一条300-400bp的清晰的条带，而伪品大黄则无。为了检验此方法的可靠性，我们对各产地采集的大黄样品进行了实验，结果表明，该方法简单易行，重现性好，准确可靠。
下面为所测定的正品大黄和伪品大黄的叶绿体基因trnL/trnF中的一段碱基序列。从中可以看出，在碱基345bp处，正品大黄的碱基为C，伪品大黄的碱基为A。此位点在trnL 5’外显子和trnL 3’外显子之间(内含子中)，并且距3’外显子221碱基处。根据此位点的变异，我们设计了正品大黄的特异扩增引物的序列。
310320 330 340 350 360* * ****R.palmatum TA-------------TATTATATAAAAAAATTAAATTAAAAAATCTTGATGACGACCCGCR.tanguticumTAACTATATATAATATATTATATAAAAAAATTAAATTAAAAAATCTTGATGACGACCCGCR.officinaleTA--------TAATATATTATATAAAAAAATTAAATTAAAAAATCTTGATGACGACCCGCR.undulatum ---------------TATTATATAAAAAAATTAAATTAAAAAATATTGATGACGACCCGCR.hotaoense -----------------TTATATAAAAAAATTAAATTAAAAAATATTGATGACGACCCGCR.wittrockii----------------ATTATATAAAAAAATTAAATTAAAAAATATTGATGACGACCCGCR.likiangense ---------------------------------AATTAAAAAATATTGATGACGACCCGCR.compactum ----------------ATTATATAAAAAAATTAAATTAAAAAATATTGATGACGACCCGCR.sublanceolatum ------------------AAAAAAATTAAA---AATTAAAAAATATTGATGACGACCCGCR.pumilum -----------------------AATTAAA---AATTAAAAAATATTGATGACGACCCGCR.nanum-----------------------------A---AATTAAATTAAAATGATGACGACCCGCR.przewalskyi ------------------TATATAAAAAAATGCAATTAAAAAATATTGATGACGACCCGCR.reticulatum ------------------TATATAAAAAAATGCAATTAAAAAATATTGATGACGACCCGC370380 390 400 410 420* * * ** *R.palmatum ATTTTTTTT-ATGACTATGAAAAAATGGAAGAATTATTGTGAAGCGATTCCAAGTTGAAGR.tanguticum ATTTTTTTT-ATGACTATGAAAAAATGGAAGAATTATTGTGAAGCGATTCCAAGTTGAAGR.officinale ATTTTTTTTTATGACTATGAAAAAATGGAAGAATTGTTGTGAAGCGATTCCAAGTTGAAGR.undulatumATTTTTTTT-ATGACTATGAAAAAATGGAAGAATTGTTGTGAAGCGATTCCAAGTTGAAGR.hotaoenseATTTTTTTT-ATGACTATGAAAAAATGGAAGAATTGTTGTGAAGCGATTCCAAGTTGAAGR.wittrockii ATTTTTTT--ATGACTATGAAAAAATGGAAGAATTGTTGTGAAGCGATTCCAAGTTGAAGR.likiangense ATTTTTTT--ATGACTATGAAAAAATGGAAGAATTGTTGTGAAGCGATTCCAAGTTGAAGR.compactumATTTTTTTT-ATGACTATGAAAAAATGGAAGAATTGTTGTGAAGCGATTCCAAGTTGAAGR.sublanceolatum ATTTTTTTT-ATGACTATGAAAAAATGGAAGAATTGTTGTGAAGCGATTCCAAGTTGAAGR.pumilum ATTTTTTTT-ATGACTATGAAAAAATGGAAGAATTGTTGTGAAGCGATTCCAAGTTGAAGR.nanumATTTTTTTT-ATGACTATGAAAAAATGTAAGAATTGTTGTGAAGCGATTCCAAGTTGAAGR.przewalskyi ATTTTTTTTTATGACTATGAAAAAATGGAAGAATTGTTGTGAAGCGATTCCAAGTTGAAGR.reticulatum ATTTTTTTT-ATGACTATGAAAAAATGGAAGAATTGTTGTGAAGCGATTCCAAGTTGAAG本发明提供了一种鉴定正品大黄的方法，包括提取大黄的DNA；测定tmL 5’外显子和tmL 3’外显子之间，距3’外显子221碱基处的碱基，如果是C，则为正品大黄，如果是A则为伪品大黄。
在本发明的上述方法中总DNA的提取和碱基的测定可通过现有技术中任何已知的方法进行。例如，通过PCR扩增，设计特定的探针进行点杂交，对扩增产物进行测序等。
作为例子，本发明使用了一种PCR方法，使用了一种引物5’CGAAAT CGG TAG ACG CTA CG3’，和5’AAT GCG GGT CGT CAT CAA G3’。对扩增产物进行电泳，正品大黄应在300-400bp处有一清晰的条带，而伪品则无。
本发明还提供了一种用于鉴定正品大黄的PCR试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，dNTPs，DNA聚合酶，其特征在于，其中的引物是5’CGAAAT CGG TAG ACG CTA CG3’，5’AAT GCG GGT CGT CAT CAA G3’。
在本发明的试剂盒中，反应体积可以为20μl，内含50mM Tris-HCI(pH8.3)，1.5mM MgCl2，250μg/mL BSA，0.5mM dNTPs，2μM正反向引物，0.75U Taq DNA聚合酶。
首先从大黄叶片中采用CTAB法提取总DNA并进行总DNA质量及浓度的检测(顾红雅，1998)；其次，采用本发明的分子鉴定试剂盒，加入已提取的总DNA，进行特异PCR扩增；最后，将扩增产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，检测扩增的条带的有无。
由于采用发明的正品大黄的鉴定试剂盒，其操作简单，重复性好，准确率高。即普通的技术人员亦可用该试剂盒进行大黄的原植物鉴定。本发明的试剂盒可以批量生产，供药品生产、流通、应用部门(如药材公司、医药进出口公司、药厂、医院等)；药品监督部门(各级药品检验机构)；从事中药研究的科研单位和高等院校；医药产品使用者使用。
2、混合物冷至室温后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻颠倒离心管使管内混合物混合均匀，抽提10分钟，0℃10000g离心10分钟。
3、吸取上层水相，加入1/10体积CTAB-0.7MNaCl，轻轻混匀，再加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提，重复步骤(2)。
4、吸取上层水相，加入2/3体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动，置-20℃放置30分钟，0℃8000g离心5分钟。
5、弃去液相，沉淀加75％乙醇浸泡60分钟，期间换洗2-3次，去乙醇，风干。
6、用200l 1×TE溶解DNA，加入RNA酶至终浓度为20μg，37℃保温60分钟。
7、用等体积氯仿抽提10分钟，0℃ 10000g离心10分钟。
8、吸取上层水相，加入1/10体积3MNaAc(PH5.2)和2倍体积的无水乙醇，轻轻摇动，0℃10000g离心5分钟。弃去液相，沉淀用75％的乙醇洗2-3次，去乙醇，风干。
9、用200μl 1×TE溶解DNA，4℃保存。
(2)DNA质量及浓度检测取2μl DNA样品和2μl点样缓冲液(0.25％溴酚蓝，40％蔗糖)混匀，在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳。以λDNA作对照，70V电压下电泳1小时，检测DNA片段的长度并估测DNA的浓度。
(3)特异PCR的扩增采用正品大黄原植物分子鉴定试剂盒进行特异PCR的扩增。反应体积为25μl，内含50mM Tris-HCl(PH8.3)，250μg/mL BSA，0.5mM dNTPs，2μM正反向引物，0.75U Taq DNA聚合酶，25ng总DNA。
扩增程序为94℃，3min，随后94℃，1min，68℃，1min，72℃，2min，2个循环；接着94℃，30s，68℃，30s，72℃，1min and 30s，33个循环。最后72℃保温5min。
(4)PCR扩增产物的检测配置1.5％的琼脂糖凝胶(含有0.5μg/ml EB)，将2μl扩增产物和1μl点样缓冲液混匀上样。用100 bp DNA Ladder作分子量标准，1×TBE为电泳缓冲液，70V恒压电泳3-4小时。在紫外透射分析仪下检测扩增产物，并照相记录实验结果。正品大黄应在300-400bp处有一清晰的条带，而伪品则无。
参考文献1、楼之岑.大黄研究的回顾与前瞻.北京医科大学学报(增刊)，1993，25(5)1-32、殷卫，郑俊华.大黄的药理研究近况.北京医科大学学报(增刊)，1993，25(5)141-1433、中华人民共和国药典委员会.中国药典(2000年版，一部)。北京人民卫生出版社、化学工业出版社。
4、郑俊华.生药学.北京人民卫生出版社，199964-74；199-2035、曹晖等。分子标记技术在中药品种鉴别中的应用。中国药学杂志，1998，33(5)269-2736、王义权等.DNA分子遗传标记鉴别在生药鉴定中的应用前景.中国中药杂志，1997，22(10)583-5867、王康正等.DNA分子诊断技术在药用植物研究上的应用.中国中药杂志，1997，22(12)707-7098、舒艳群等.RAPD技术在药用植物学研究中的应用.中草药，1999，30(2)147-1519、吴平等.用聚合酶链反应产物直接测序技术鉴定中药材鳖甲.中国药科大学学报，1998，29(1)28-3010、Ngan.F.et al..Molecular authentication of Panax species.Phytochemistry，1999，50787-79111、马小军等.野山参与栽培参rDNA内转录间隔区(ITS)序列比较.中国中药杂志，2000，25(4)206-20912、蔡金娜等.中国不同地区蛇床的rDNA ITS序列分析.药学学报，2000，35(1)56-5913、王建云等.DNA序列分析技术鉴定鸡内金的方法学研究.中国药科大学学报，1996，27(8)471-47514、顾红雅等.植物分子生物学——实验手册.北京高等教育出版社，19984-权利要求
1.一种鉴定正品大黄的方法，包括提取大黄的DNA；测定trnL 5’外显子和trnL 3’外显子之间，距3’外显子221碱基处的碱基，如果是C，则为正品大黄，如果是A则为伪品大黄。
2.按照权利要求1所述的方法，其中，测定tmL 5’外显子和tmL 3’外显子之间距3’外显子221碱基处的碱基是通过PCR反应进行的。
3.按照权利要求2所述的方法，其中，所述的PCR方法使用的引物是5’CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG 3’，和5’AAT GCG GGT CGTCAT CAA G3’，PCR扩增后对扩增产物进行电泳，正品大黄在300-400bp处有一条带，而伪品则无。
4.一种用于鉴定正品大黄的PCR试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液，dNTPs，DNA聚合酶和引物，其特征在于，其中的引物是5’CGA AATCGG TAG ACG CTA CG3’，5’AAT GCG GGT CGT CAT CAA G3’。
5.按照权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒反应体积是20μl，内含50mM Tris-HCI(pH8.3)，1.5mM MgCl2，250μg/mL BSA，0.5mM dNTPs，2μM正反向引物，和0.75U Taq DNA聚合酶。
全文摘要
本发明提供了一种鉴定正品大黄的方法,包括:提取大黄的DNA;测定trnL 5’外显子和trnL 3’外显子之间,距3’外显子221碱基处的碱基,如果是C,则为正品大黄,如果是A则为伪品大黄。本发明还提供了一种用于鉴定正品大黄的PCR试剂盒,其中的引物是5’CGAAAT CGG TAG ACG CTA CG3’,5’AAT GCG GGT CGT CAT CAA G3’。本发明可在分子水平上区别正品大黄和非正品大黄,保障人民的用药安全。
文档编号C12Q1/68GK1357635SQ0013413
公开日2002年7月10日 申请日期2000年12月5日 优先权日2000年12月5日
发明者杨美华, 张大明, 郑俊华, 范国强 申请人:中国科学院植物研究所, 北京大学