专利名称：中空纤维模拟骨髓造血装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种体外造血技术，主要是为造血干、祖细胞移植进行临床前造血细胞培养与扩增提供技术设备。
骨髓以及造血干、祖细胞移植是重建造血与免疫功能、治疗某些严重血液病及恶性肿瘤的有效途径之一，也是基因治疗可供选择的方法之一。然而，造血细胞来源非常有限，为了获取这些细胞，人们寄希望于造血干、祖细胞的体外扩增和大规模培养。
目前体外培养与扩增造血细胞尚处于实验阶段。无基质细胞的培养体系加组合细胞因子配方仍然是当今的热门研究方向。这是一种液体悬浮培养体系，主要有多孔板和方瓶培养技术、可透气袋细胞培养技术以及小型生物反应器搅拌式灌注培养技术等。这类技术的缺陷在于培养造血细胞的条件与体内造血细胞生存的内环境条件相差甚远，而且各种组合细胞因子配方仍然不能阻止原始造血细胞的迅速分化与耗竭。另一方面，采用滋养层基质细胞支持造血细胞在体外培养与扩增也是当前倍受瞩目的发展方向，主要采用骨髓基质细胞或工程细胞来支持体外造血。这类技术在克服离体造血细胞迅速分化与耗竭方面有了很大的进步。但是，用消化与分散等方法转移基质细胞，将会造成不同程度的损伤，且在操作过程中容易造成污染而导致失败。
本发明所涉及的一种人工骨髓装置，主要采用中空纤维膜和微载体技术以及密封式无菌操作技术，模拟骨髓造血功能，可以有效地克服现有技术中存在的缺陷和不足，开辟体外培养和有效扩增造血细胞的新途径。经查阅血液学期刊并经计算机联网检索，在造血(Hematopoiesis)、中空纤维/膜(Membrane/Hollow Fiber)和人工器官(Artificial organ)领域内迄今未见有关报道，同时亦未见有与本发明技术特征相似的专利申请或文章发表。
本发明的要点是，该装置系由中空纤维制成的细胞培养管、微载体支持物及密封式灌注管道系统三部分组成。
一、细胞培养管由可拆卸的部件组装而成，以便于收获培养增殖的细胞。这与现行的中空纤维生物反应器不同，后者的中空纤维细胞培养管不可拆卸，其目的是收获细胞产生的蛋白质产物。
本发明的细胞培养管由四部份组成1、中空纤维集束组成的柱状体(图1-5)，其两端采用树脂凝胶等(图1-7)封固并保留每根中空纤维管内腔管道的开口(图1-11)。空心的纤维外径一般为200至1000微米(μm)，是已知的醋酸纤维素或聚砜等膜材料。在两端树脂凝胶块间，沿中空纤维束柱状体的边缘，匀称地加了三条聚四氟乙烯制成的支持筋(图1-4)，柔软的中空纤维束在两个树脂凝胶块和三根支撑筋之间得到固定与保护。
2、套筒(图1-3)可采用医用塑料等制成的两端开口的管筒，套装在中空纤维束柱状体外面。套筒与中空纤维膜管之间，形成了中空纤维膜的外腔；每根中空纤维膜的内部管道构成了中空纤维膜的内腔。
3、下盖(图1-2)为套管下端的密封盖。盖与套筒端口之间构成了中空纤维膜内腔的共有汇集小室，并有硅橡胶O型垫圈密封(图1-10)。盖与套筒端口用法兰盘与螺栓加以连接紧固。盖的中心有支管(图1-1)接有无菌连接器，与管道系统相通，可引导管道系统的气、液流体从下盖支管汇集于小室，再进入每根中空纤维膜的内腔。
4、上盖(图1-8)为套管上端的密封盖，结构同下盖，可将进入每根中空纤维内腔的气、液流体汇集于上盖小室，再从中心支管(图1-9)经无菌连接器排出，流进属于中空纤维内腔的管道系统。
二、细胞与微载体在细胞培养管内中空纤维膜的外腔，可接种造血细胞和骨髓基质细胞，而这些基质细胞事先被粘附在其支持物-微载体表面。微载体(图1-12)为已知的葡聚糖凝胶球体，粒珠直径约200微米，表面有变性胶原涂层。骨髓基质细胞(图1-13)可按一定比例数量接种于微载体上，待基质细胞在微载体上贴附牢固后，同将要培养的造血细胞(图1-15)混合，通过套筒的下支管(图1-14)接种进入中空纤维膜外腔。此外，亦可采用明胶微载体，它易于与纤维蛋白等细胞外基质蛋白结合。这种附有胞外基质的微载体，在与某些细胞因子结合后也具有支持体外造血的部分功能。
造血细胞是将要培养的细胞，可取自骨髓、外周血或脐带血，经过分离后取出有核细胞或单个核细胞；也可通过富集纯化取出CD34+(细胞分化抗原34阳性)细胞等原始造血细胞。造血细胞与微载体-基质细胞无菌混合后即可注入中空纤维培养管外腔，加培养液后可进行培养。培养期间可通过无菌连接器和下支管补充细胞所需营养物质。废培养液可通过套管的上支管(图1-6)排出。中空纤维薄膜管可模拟血管输送营养物质，进行气体与物质交换，排除代谢废物。微载体与贴附的基质细胞可模拟骨髓造血微环境，支持体外造血，维持造血干细胞自我更新潜能，并刺激造血细胞增殖与分化。最后通过无菌操作收获扩增的造血细胞；拆卸细胞培养管，取出中空纤维柱状体与细胞悬液，冲洗，分级沉降，去掉微载体，按常规操作收获细胞。再通过已知的免疫磁珠阳性选择技术等，分离出较纯净的原始造血细胞备用。
三、密封式灌注管道系统(图2)本发明采用改良的密封式灌注系统培养造血细胞，整个系统有两个循环回路1、中空纤维外腔循环回路由火焰消毒无菌连接器(图2-2)、供液瓶/废液瓶(图2-3)、贮液瓶(图2-4)和泵(图2-5)等组成。泵驱动培养液经无菌连接器，从培养套筒下支管进入中空纤维外腔，灌注细胞后由套筒上支管排出，作为取样标本或废弃液；或用附加泵通过火焰消毒无菌连接器(图2-2)，由供液瓶(图2-3)加入新鲜培养基与试剂等，给造血细胞与基质细胞提供营养成分和添加剂，如各种细胞因子和血清等。此外，也可加入NaHCO3等调节试剂对培养参数进行直接调控。外腔循环回路安装了火焰消毒无菌连接器(图2-2)，这是一种多功能无菌接口，实现了添加新鲜培养基、取样以及排除废液等密封式无菌操作，可使批量培养细胞操作简便，也可保证操作过程无污染。
2、中空纤维内腔循环回路这是透析循环回路，透析液由贮液瓶(图2-9)流出，通过气体交换器(图2-8)、泵(图2-7)、pH电极监测小室(图2-6)和无菌连接器，从培养管下盖支管(图1-1)流进中空纤维内腔，通过中空纤维膜与外腔培养液进行小分子物质交换，为外腔中的细胞提供氧和生理浓度的CO2以及小分子营养物质如氨基酸、葡萄糖和盐类等；同时可去除外腔中积聚的小分子废物如乳酸、铵离子和多余的CO2等。透析液从上盖支管排出，流经无菌连接器和溶氧(DO)电极监测小室(图2-12)返回贮液瓶(图2-9)。当废物积聚导致pH值下降到一定指标时，可通过改良的多功能接口-火焰消毒无菌连接器(图2-11)排出废液，进入废液瓶(图2-10)再通过火焰消毒无菌连接器换上新的供液瓶。此外，也可通过该接口取样，作离线检测。
3、细胞培养环境的超滤调节由于透析液与培养液小分子物质成分基本上是相同的，因此按照常规操作可对细胞培养条件作超滤调节。当培养管内腔回路的上盖管道加夹阀时，内腔透析液在泵的压力之下，可从内腔过滤进入外腔；相反，夹阀加在外腔回路套筒上支管管道时，外腔培养液，除被截留的大分子物质外，也可透过中空纤维膜过滤进入内腔回路中，从而可以调节高密度细胞所处的环境条件。这种调节可利用已知的电子仪器和定时器等附加装置来实现。
四、消毒与保温中空纤维培养管的四个支管上安装了高压蒸汽消毒备用的硅橡胶管及火焰消毒无菌连接器。中空纤维培养管连同无菌连接器一道，先用40Gy中子射线照射消毒，再用1％H2O2灌注中空纤维培养管外腔和内腔，用消毒去离子水、10-5mol/L巯基乙醇、Hanks盐水以及培养液依次清洗后备用。或在安装火焰消毒无菌连接器后，把中空纤维培养管用塑料封装起来，送环氧乙烷消毒室进行灭菌处理。
除中空纤维培养管外，灌注系统可从无菌连接器接口处断开，分别包装进行高压蒸汽消毒(0.1Mpa,30分钟)备用。使用时，可通过酒精灯火焰消毒无菌连接器的接口，将整个灌注系统连接起来投入运行。
整个灌注系统置于37℃培养箱中保温，5％CO2-空气等通过管道与空气滤器从箱外输入。
本发明的优点与积极效果在于中空纤维膜管加微载体基质细胞可模拟骨髓造血组织中的血管与造血微环境，有利于体外造血干细胞维持自我更新潜能、抑制过度分化与耗竭；微载体的可以移动、可分割、可定量的特点，有利于基质细胞和胞外基质附着，对造血调控、细胞分离和推向临床提供了便利条件；中空纤维细胞培养管为可拆卸结构，有利于收获中空纤维之间培养扩增的造血细胞；由于该模拟造血装置采用密封式无菌操作技术，将有助于杜绝污染，为大规模培养造血细胞提供了安全保障，有助于实现体外造血的管道化和自动化。
c-kit原癌基因只在原始的造血干/祖细胞中表达。采用RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)，同内参GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)引物并行测试的方法可半定量检测c-kit表达的mRNA水平。
小鼠实验表明，在中空纤维管培养二周后，仍然保留了大量的原始造血细胞。在不加细胞因子的条件下，中空纤维组G1的c-kit表达比原骨髓有所降低，但比方瓶组G2高出一倍，而常规液体悬浮培养体系G4与G3组，在没有外加细胞因子的条件下，基本上没有c-kit基因表达。说明原始造血干/祖细胞全部分化耗竭尽了。实验表明，中空纤维模拟骨髓造血装置确实能维持部分造血干/祖细胞的自我更新潜能，可抑制造血细胞过度分化与耗竭。
实施例2脐带血细胞培养实验微载体(MC)20mg用胞外基质蛋白-纤连蛋白(FN)涂层，在无菌条件下将脐带血单个核细胞与MC·FN混合，加入富含细胞因子的条件培养液，共同注入中空纤维培养管外腔，其内腔灌注由10％CO2-空气调节的透析液。用流式细胞仪每次检测104个细胞。脐血单个核细胞在接种前其造血干/祖细胞CD34+细胞含量为1.2％；中空纤维管培养二周后，CD34+细胞百分含量为20％，常规方瓶液体悬浮培养对照为4.9％。结果显示中空纤维管灌注培养后，CD34+细胞含量比液体悬浮培养对照组高4倍。实验说明，中空纤维灌注结合微载体胞外基质在条件培养液刺激之下，较有利于原始造血细胞增长。
图1中空纤维模拟骨髓造血的细胞培养管示意图其中1-下盖支管2-下盖3-套筒4-支撑筋5-中空纤维束柱状体6-套筒上支管7-树脂凝胶块8-上盖9-上盖支管10-O型垫圈11-中空纤维管道及开口12-微载体13-骨髓基质细胞14-套筒下支管15-造血细胞图2密封式灌注管道系统示意图其中1-中空纤维细胞培养管2-火焰消毒无菌连接器3-供液瓶/废液瓶4-贮液瓶5-泵6-pH电极在线监测小室7-泵8-气体交换器9-贮液瓶10-供液瓶/废液瓶11-火焰消毒无菌连接器12-溶氧电极在线监测小室
权利要求
1.中空纤维模拟骨髓造血装置，其特征是所述的装置系由中空纤维细胞培养管、微载体支持物和密封式灌注管道三部分连接组成一个循环系统。
2.按照权利要求1所述的中空纤维摸拟骨髓造血装置，其特征是为便于收获培养增殖的细胞，所说的细胞培养管由可拆卸的相关部件组装而成(1)由醋酸纤维素或者聚砜等膜材料制造的中空纤维集束柱状体(1-5)在两端树脂凝胶块(1-7)和三根用聚四氟乙烯制成的支持筋(1-4)之间得到固定与保护；(2)选择医用塑料等制成的套筒(1-3)，两端开口，套装在中空纤维束柱状体外面，形成中空纤维膜的外腔；每根中空纤维膜的内部管道构成其内腔；(3)下盖(1-2)、与套筒端口之间构成了中空纤维膜内腔的共有汇集小室并由硅橡胶O型垫圈进行密封(1-10)，通过盖的中心支管(1-1)、无菌连接器与管道系统相连，可引导该系统的气、液流体从下盖支管汇集于小室，再进入每根中空纤维膜的内腔；(4)上盖(1-8)，结构同下盖，可将进入每项根中空纤维内腔的气、液流体汇集于上盖小室，再经中心支管(1-9)、无菌连接器排除，流进属于中空纤维内腔的管道系统。
3.按照权利要求1所述的中空纤维模拟骨髓造血装置，其特征是微载体(1-12)为葡聚糖凝胶或者明胶等制成的球体，表面敷有变性胶原涂层或者胞外基质蛋白涂层，置于细胞培养管中空纤维膜的外，作为骨髓基质细胞和培养造血细胞赖以依附的支持物。
4.按照权利要求1所述的中空纤维模拟骨髓造血装置，其特征是密封式灌注管道(2)由中空纤维外腔循环回路和中空纤维内腔循环回路两部分组成(1)中空纤维外腔循环回路包括火焰消毒无菌连接器(2-2)、供液瓶/废液瓶(2-3)、贮液瓶(2-4)和泵(2-5)等部件；(2)中空纤维内腔循环回路(透析循环)包括贮液瓶(2-9)、气体交换器(2-8)、泵(2-7)、PH电极监测小室(2-6)等。
5.按照权利要求1、2、3或4所述的中空纤维模拟骨髓造血装置，其特征是中空纤维膜管可模拟血管输送营养物质，进行气体与物质的交换，排除代谢废物；微载体与贴附的基质细胞可模拟骨髓造血微环境，支持体外造血，维持造血干细胞自我更新潜能，并刺激造血细胞增殖与分化。
全文摘要
中空纤维模拟骨髓造血装置,也称人工骨髓,属于一种体外造血细胞培养技术,该装置由中空纤维细胞培养管、微载体支持物及密封式灌注管道系统组成,其特征是中空纤维膜管可模拟血管输送营养物质,进行气体与物质交换,排除代谢废物;微载体与贴附的基质细胞可模拟骨髓造血微环境,支持体外造血,维持造血干细胞自我更新潜能,并刺激造血细胞增殖与分化。小鼠骨髓培养和脐带血细胞培养实验证明,在没有外加细胞因子条件下,中空纤维灌注培养方式明显优于常规方瓶及液体悬浮培养的效果。
文档编号C12M3/04GK1321741SQ0013418
公开日2001年11月14日 申请日期2000年12月8日 优先权日2000年12月8日
发明者张君奎, 张永富, 张海玲, 杨少光, 田征, 黄志刚, 赵钧铭 申请人:中国医学科学院血液学研究所, 中国医学科学院生医学工程研究所