编码opcA基因的核苷酸序列的制作方法

专利名称：编码opcA基因的核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明提供了编码opcA基因的核苷酸序列，和具有扩增的opcA基因的棒状细菌发酵生产氨基酸特别是L-赖氨酸的方法。
现有技术氨基酸特别是L-赖氨酸用于人用药物和制药工业，特别是动物营养。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物如赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)半胱氨酸有抗性或重要的调节代谢物营养缺陷的并产生L-氨基酸如L-赖氨酸的菌株。一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于棒杆菌生产氨基酸的菌株的改良。
用于生物合成的戊糖磷酸循环的重要性是已知的。
因此，Oishi和Aida(农业和生物化学29,83-89(1965))已报道了产氨短杆菌的“己糖单磷酸逃避(shunt)”。Sugimoto和Shio(农业和生物化学51,101-108(1987))报道了黄色短杆菌中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的调节。Sugimoto和Shio(农业和生物化学51,1257-1263(1987))报道了黄色短杆菌中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的调节。
JP-A-09224661公开了黄色短杆菌MJ-223(FERM BP-1497)的称为zwf的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的核苷酸序列。JP-A-09224661描述了Zwf多肽的N-末端氨基酸序列为Met Val IlePhe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu。
但是目前还不能证实这一点。
发明目的本发明人目的在于为改良氨基酸尤其是L-赖氨酸的发酵生产而提供新措施。
发明描述氨基酸、尤其是L-赖氨酸用于人用药物及制药工业，特别是动物营养，因此提供生产氨基酸特别是L-赖氨酸的新改良方法总是令人感兴趣的。
当下文提到L-赖氨酸或赖氨酸时，不仅是指碱，也指盐，如赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明提供了一种来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包括选自如下一组的多核苷酸序列a)与编码包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的至少一个氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)编码包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)包含a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
本发明还提供了根据权利要求1的多核苷酸，其优选为能复制的DNA，包含(ⅰ)选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQID NO:9的一或多个核苷酸序列，或
(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地，(ⅳ)(ⅰ)中中性功能有义突变。
本发明还提供了权利要求4的多核苷酸，包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，权利要求6的多核苷酸，其编码包含SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10所示的至少一个氨基酸序列的多肽，含有权利要求1的多核苷酸序列的载体，以及作为宿主细胞的含有载体的棒状细菌。
本发明还提供了基本上包含一多核苷酸序列的多核苷酸，其可通过用含有相应于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9的多核苷酸或其片段的序列的探针杂交相应的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述的文库包含具有相应于SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:9的所述多核苷酸序列的完整基因。
本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码OpcA蛋白的全长cDNA，以及分离与opcA基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。
本发明的多核苷酸序列还适用作通过聚合酶链反应(PCR)制备编码OpcA蛋白的基因的DNA的引物。
作为探针或引物的这种寡核苷酸含有至少30个、优选至少20个、特别优选至少15个连续核苷酸。具有至少40或50个核苷酸的寡核苷酸也是合适的。
“分离的”是指从其天然环境中分离出来。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
“多肽”应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。
本发明的多肽包括SEQID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO8或SEQ ID NO:10的多肽，特别是具有OpcA基因产物生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的多肽至少70％相同的多肽，优选地与SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的多肽至少80％、特别是90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本发明还提供了形成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的Zwf亚基的新Zwf蛋白，这一翻译产物的氨基酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:7所示。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的可分离的Zwf亚基的N-末端氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
本发明另外还提供了用尤其已生产氨基酸的棒状细菌发酵生产氨基酸特别是L-赖氨酸的方法，在该棒状细菌中编码opcA基因的核苷酸序列任选地与zwf基因一起是扩增的，尤其是过表达的。
文中术语“扩增”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性的增加，例如通过增加一或多个基因的拷贝数，通过用强启动子或编码具有升高的活性的相应酶(蛋白质)的基因或等位基因，及任选地组合使用这些方法。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产L-氨基酸特别是L-赖氨酸。此微生物可以是棒状细菌尤其是棒杆菌属的代表菌。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
适当的棒杆菌菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌株，是例如已知的野生型菌株
谷氨酸棒杆菌ATCC13032醋谷棒杆菌ATCC15806嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539Corynebacterium melassecola ATCC 17965黄色短杆菌ATCC14067乳发酵短杆菌ATCC13869和扩展短杆菌ATCC14020和从中获得的生产L-氨基酸的突变体或菌株如谷氨酸棒杆菌FERM-P1709黄色短杆菌FERM-P1708乳发酵短杆菌FERM-P1712谷氨酸棒杆菌FERM-P6463谷氨酸棒杆菌FERM-P6464谷氨酸棒杆菌DSM5715谷氨酸棒杆菌DM58-1谷氨酸棒杆菌DSM12866和从中获得的生产L-苏氨酸的突变体或菌株如谷氨酸棒杆菌ATCC21649黄色短杆菌BB69黄色短杆菌DSM5399乳发酵短杆菌FERM-BP269乳发酵短杆菌TBB-10和从中获得的生产L-异亮氨酸的突变体或菌株如谷氨酸棒杆菌ATCC14309谷氨酸棒杆菌ATCC14310谷氨酸棒杆菌ATCC14311
谷氨酸棒杆菌ATCC15168产氨棒杆菌ATCC6871和从中获得的生产L-色氨酸的突变体或菌株如谷氨酸棒杆菌ATCC21850和谷氨酸棒杆菌KY9218(pKW9901)。
本发明人已成功地分离谷氨酸棒杆菌的编码葡萄糖-6磷酸-脱氢酶(EC2.7.1.11)的OpcA亚基的新opcA基因。
为了分离谷氨酸棒杆菌的opcA基因或其他基因，首先在大肠杆菌中建立这一微生物的基因文库。可根据通常已知的教材和手册建立基因文库。例如由Winnacker所著教材基因与克隆，基因工程入门(Verlag Chamie,Weinheim,德国，1990)，或由Sambrook等所著手册分子克隆实验手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。一非常熟知的基因文库是已由Kohara等(细胞50,495-508(1987))在λ载体中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252:255-265,1996)阐述了借助于粘粒载体SuperCos I(Wahl等，1987,Proceeding of the NationalAcademy of Sciences USA,84:2160-2164)，在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。Bormann等(分子微生物学6(3),317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。O＇Donohue(来自谷氨酸棒杆菌的4个常见芳香族氨基酸生物合成基因的克隆和分子分析，博士论文，国立爱尔兰大学，Galway,1997)描述了用Short等(核酸研究16:7583)描述的λZap表达系统克隆谷氨酸棒杆菌的基因。为在大肠杆菌中制备谷氨酸棒杆菌的基因文库，也可使用质粒如pBR322(Bolivar，生命科学25,807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19:259-268)。合适的宿主尤其是限制和重组缺陷的大肠杆菌菌株，一个例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美国科学院院报7(1990)4645-4649)所述。借助于粘粒克隆的长DNA片段随后可亚克隆并用适于测序的通用载体测序，如Sanger等(美国科学院院报74:5463-5467,1977)所述。
获得的DNA序列随后可用已知的算法或序列分析程序研究，如Staden的程序(核酸研究14,217-232(1986)),Butler的GCG程序(生物化学分析方法39,74-97(1998)),Pearson和Lipman的FASTA算法(美国科学院院报85,2444-2448(1988))或Altschul的BLAST算法(自然遗传学6,119-129(1994))，并与公共数据库中的存在的序列比较。核苷酸序列的公共数据库是例如欧洲分子生物学实验室(EMBL，德国海德堡)的数据库，或国家生物工程信息中心(NCBI,Bethesda,MD,USA)的数据库。
本发明提供了编码opcA基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4，是本发明的一部分，用前述方法从此DNA序列中也已衍生出相应蛋白质的氨基酸序列。所得OpcA基因产物的氨基酸序列以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5表示。从OpcA基因产物的氨基酸序列得到的分子量约为34.7kDa。
SEQ ID NO:1还示出了zwf基因的编码区，得到的Zwf基因产物的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。从Zwf基因产物的氨基酸序列得到的分子量约为57.5kDa。
以上述方式产生的基因文库可通过用已知序列如zwf基因(JP-A-09224661)的核苷酸探针杂交而进一步研究。在杂交反应中呈阳性的克隆的克隆的DNA随之测序以一方面给出所用探针的已知核苷酸序列，另一方面给出相邻的新DNA序列。
本发明还提供了编码opcA基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，其是本发明的组成部分，如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示。相应蛋白质的氨基酸序列已用上述方法从本发明的DNA序列衍生得到，OpcA基因产物的氨基酸序列如SEQID NO:8和SEQ IDNO:10所示。从OpcA基因的氨基酸序列得到的分子量约34.7kDa。
SEQ ID NO:6还示出zwf基因的编码区，得到的Zwf基因产物的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。从Zwf基因产物的氨基酸序列得到的分子量约为57.5kDa。
至少部分确定OpcA蛋白和Zwf蛋白的氨基酸序列的另一种方法包括经层析方法将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶蛋白纯化至均一。蛋白纯化和制备的方法和指导例如在Schleifer和Wensink的教科书分子生物学实用方法(Springer Verlag，德国柏林，1981),Harris和Angal的手册蛋白质纯化方法实用途径(IRL出版社，英国牛津，1989),Scopes的教科书蛋白质纯化原理和实践，第3版(SpringerVerlag，美国纽约，1993)及通用教科书和手册中有描述。纯化的多肽的N-末端氨基酸序列可通过如Edman(生物化学档案22,475(1949))的N-末端测序方法确定。蛋白质测序的其他方法和指导例如如Smith蛋白质测序方案分子生物学方法，第64卷和112卷(Humana出版社，Totowa，美国新泽西，1996)，以及Kamp等蛋白质结构分析制备、鉴定和微测序(Springer Verlag，美国纽约，1997)。
以这种方式可示出葡萄糖-6-脱氢酶由两个亚基组成，其分子为约30kDa和约60kDa。OpcA亚基和OpcA蛋白的N-末端氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，Zwf亚基和Zwf蛋白的N-氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
通过遗传密码的简并性由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6或SEQ ID NO:9产生的编码DNA序列也是本发明的一部分。同样，与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。另外，蛋白质中的保守氨基酸置换，如用丙氨酸置换蛋白质中甘氨酸，或用谷氨酸置换蛋白质中天冬氨酸，本领域已知是“有义突变”，其不引起蛋白质任何功能的改变，即是中性的。另外已知蛋白质N和/或C-末端的改变基本不影响其功能，或者甚至可以稳定其功能，本领域技术人员可在以下文献中发现对此的论述，参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169:751-757(1987))O’Regan等(基因77:237-251.(1989)),Sahin-Toth等(蛋白质科学3:240-247(1994))，Hochuli等(生物/技术6:1321-1325(1988))，及已知关于遗传和分子生物学的教材。以相应方式产生自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的氨基酸序列也是本发明的一部分。
最后，用产生自SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9的引物经聚合酶链反应(PCR)制备的DNA序列也是本发明的组成部分。这种寡核苷酸典型地具有至少15个核苷酸的长度。
通过杂交鉴别DNA序列的指导可参见宝灵格曼海姆有限公司的手册“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国，1993)以及Liebl等(系统细菌学国际杂志(1991)41:255-260)。用聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的指导参见Gait的手册寡核苷酸合成实用方法(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和Graham:PCR(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg，德国，1994)。
本发明人发现，在opcA基因任选地与zwf基因一起过表达后，棒状细菌以改良方式生产L-氨基酸尤其是L-赖氨酸。
为获得过表达，可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，在L-赖氨酸发酵生产期间增强表达也是可能的。通过目的在于延长mRNA寿命的措施，也可改良表达。通过防止酶蛋白的分解也可提高酶促活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的过表达。
本领域熟练技术人员从以下文献中可发现对此的详述，参见Martin等(生物/技术5,137-146(1987)),Guerrero等(基因138,35-41(1994)),Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6,428-430(1988)),Eikmanns等(基因102,93-98(1991))，欧洲专利说明书EPS0472869，美国专利4,601,893,Schwarzer和Puhter(生物/技术9,84-87(1991)),Reinscheid等(应用及环境微生物学60,126-132(1994)),LaBarre等(细菌学杂志175,1001-1007(1993))，专利申请WO96/15246,Malumbres等(基因134,15-24(1993))，日本特许公开JP-A-10-229891,Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58,191-195(1998)),Makrides(微生物学综述60:512-538(1996))及已知关于遗传及分子生物学的教材。
例如，本发明的opcA基因可借助于质粒过表达。
合适的质粒是在棒状细菌中复制的质粒。各种已知的质粒载体，如pZ1(Menkel等，应用及环境微生物学(1989)64:549-554),pEKEx1(Eikmanns等，基因102:93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因107:69-74(1991))是基于隐蔽质粒pHM1519,pBL1或pGA1。其它质粒载体如基于pCG4(US-A4,489,160)，或pNG2(Serwold-Davis等，FEMS微生物学通信66,119-124(1990))或pAG1(US-A5,158,891)的质粒载体可以同样方式使用。
图2所示大肠杆菌一谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2用作一个例子。在opcA基因和zwf基因掺入pEC-T18mob2的SphⅠ/SalⅠ裂解位点后，形成图3所示质粒pECzwfopcA。
其他合适的质粒载体是那些可通过整合进染色体而进行基因扩增的质粒载体，例如，由Reinscheid等(应用及环境微生物学60:126-132(1994))所述的用于复制或扩增hom-thrB操纵子的质粒载体。在这一方法中，将完整基因克隆进能在宿主(典型地是大肠杆菌)中复制而在谷氨酸棒杆菌中不能复制的质粒载体中。可考虑的载体例如是pSUP301(Simon等，生物/技术1,784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145,69-73(1994))，pGEM-T(Promega公司，Madison,WI,USA),pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化学杂志269:32678-84；US-A5,487,993),pCRBlunt(Invitrogen,Groningen，荷兰；Bernard等，分子生物学杂志，234:534-541(1993)),pEM1(Schrumpf等，1991，细菌学杂志173:4510-4516)或pBGS8(Spratt等，1986，基因41:337-342)。含有待扩增基因的质粒载体然后可经接合或转化转移进希望的谷氨酸棒杆菌菌株。接合方法例如如Schafer等(应用及环境微生物学60,756-759(1994))所述。转化方法例如如Thierbach等(应用微生物学及细菌学29,356-362(1988)),Dunican和Shivnan(生物/技术7,1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS微生物学通信123,343-347(1994))所述。经“交换”事件而同源重组后，得到的菌株含有至少两个拷贝的所需基因。
另外，不仅是opcA基因任选地与zwf基因，而且特定生物合成途径、糖酵解、回补代谢、柠檬酸循环或氨基酸输出的一或多种酶的扩增或过表达，对氨基酸特别是L-赖氨酸的生产可以是有益的。
因此，为生产L-赖氨酸，例如可同时过表达一或多种选自如下一组的基因·编码二氢-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，·编码抗反馈天冬氨酸激酶的lysC基因(Kalinowski等(1990)，分子和普通遗传学224:317-324)
·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174,6076-6086)，·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19831609)，·编码酮基转移酶的tkt基因(欧洲分子生物学实验室(EMBL，德国海德堡)数据库的登录号AB023377)，·编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因(JP-A-9-224662)，·编码三糖磷酸异构酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174,6076-6086)，或·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A-19548222)，·zwa1基因(DE19959328.0；DSM13115)，或·编码烯醇化酶的eno基因(DE19941478.5)，·编码转醛酶的tal基因(DSM13263)。
对于氨基酸特别是L-赖氨酸的生产，除了任选地与zwf基因一起扩增opcA基因外，还有利的是同时弱化·编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pek基因(DE19950409.1,DSM13047)和/或·编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US09/396,478,DSM12969)，或·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7；DSM13114)，或·zwa2基因(DE19959327.2；DSM13113)。
除opcA基因的过表达之外，消除非所需的副反应对氨基酸特别是L-赖氨酸的生产也是有益的(Nakayama“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl,Sikyta,Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。
根据本发明产生的微生物可连续培养或用分批方法(分批培养)，补料分批方法(补料方法)或重复补料分批方法(重复补料方法)培养以生产氨基酸特别是L-赖氨酸。已知的培养法由Chmiel所著教材(生物方法技术1．生物方法技术导论(Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991)，或由Storhas所著教材(生物反应器和外围设备(Vieweg Verlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))中提供。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求，关于各种微生物培养基的阐述见于，美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C.,USA,1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸，这些物质可单独或混合使用，可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素，此外，可将适当前体加入培养基中上述物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH,KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值，抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃～40℃，持续培养直至L-氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围达到。
L-氨基酸的分析可通过阴离子交换层析，随后经如Speckman等(分析化学，30,(1958),1190)所述茚三酮衍生化作用进行。
下述微生物已根据布达佩斯条约保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，德国不伦瑞克)谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pECzwfopcA，保藏号DSM13264。
SEQ ID NO:1还含有新的devB基因。本发明方法用于发酵制备氨基酸尤其是L-赖氨酸。
所附序列下述序列以序列表的形式附上SEQ ID NO描述1 从谷氨酸棒杆菌ATCC13032分离的DNA序列衍生自SEQ ID NO:1的Zwf蛋白的氨基酸序列3 衍生自SEQ ID NO:1的OpcA蛋白的氨基酸序列4 取自SEQ ID NO:1的ATCC13032的opcA基因的DNA序列5 衍生自SEQ ID NO:4的OpcA蛋白的氨基酸序列6 从谷氨酸棒杆菌ASO19分离的DNA序列7 衍生自SEQ ID NO:6的Zwf蛋白的氨基酸序列8 衍生自SEQ ID NO:6的OpcA蛋白的氨基酸序列9 取自SEQ ID NO:6的ASO19的opcA基因的DNA序列10 衍生自SEQ ID NO:9的OpcA蛋白的氨基酸序列11 可被分离的来自ATCC13032的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的Zwf蛋白的N-末端的氨基酸序列12 可被分离的来自ATCC13032的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的OpcA蛋白的N-末端的氨基酸序列本发明包括如下附图


图1质粒pBOB102图。
图2质粒pEC-T18mob2图。
图3质粒pECzwfopcA图。
图中所采用的缩写有如下含义
图1Neor新霉素/卡那霉素抗性ColE1 ori质粒ColE1的复制起点CMV巨细胞病毒启动子lacP:lac操纵子的启动子lacZ:β-半乳糖苷酶基因的5＇末端(lacZa基因片段)SV403＇剪接猴病毒40的3＇剪接位点SV40 polyA猴病毒40的聚腺苷酸化位点f1(-)ori丝状噬菌体f1的复制起点SV40 ori猴病毒40的复制起点图2和图3Tet四环素抗性基因oriV大肠杆菌的质粒编码的复制起点RP4mob质粒迁移的mob区rep谷氨酸棒杆菌质粒pGA1的质粒编码的复制起点per:pGA1的控制拷贝数的基因lacZ-alpha:β-半乳糖苷酶基因的lacZα基因片段(N末端)lacZalpha＇:lacZα基因片段的5’末端＇lacZ-alpha:lacZα基因片段的3’末端zwf:zwf基因opcA:opcA基因另外的缩写ApaⅠ限制酶ApaⅠ的酶切位点BamHⅠ限制酶BamHⅠ的酶切位点ClaⅠ限制酶ClaⅠ的酶切位点EcoRⅠ限制酶EcoRⅠ的酶切位点HindⅢ限制酶HindⅢ的酶切位点MstⅠ限制酶MstⅠ的酶切位点
NheⅠ限制酶NheⅠ的酶切位点NsiⅠ限制酶NsiⅠ的酶切位点SalⅠ限制酶SalⅠ的酶切位点SacⅠ限制酶SacⅠ的酶切位点SpeⅠ限制酶SpeⅠ的酶切位点SphⅠ限制酶SphⅠ的酶切位点SspⅠ限制酶SspⅠ的酶切位点XbaⅠ限制酶XbaⅠ的酶切位点实施例本发明借助于以下提供的实施例得以更详述阐述。所用分子生物学技术例如质粒DNA分离、限制酶处理、连接、大肠杆菌的标准转化等(除非另有说明)如Sambrook等(分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室，美国)所述。
实施例1构建谷氨酸棒杆菌AS019的基因文库如O＇Donohue(O＇Donohue,M.(1997)，来自谷氨酸棒杆菌的4个常见芳香族氨基酸生物合成基因的克隆和分子分析，博士论文，国立爱尔兰大学，Galway)所述，用λZap ExpressTM系统(Short等，(1988)核酸研究16:7583-7600)构建谷氨酸棒杆菌菌株ASO19的DNA文库。λZap ExpressTM系统购自Stratagene(Stratagene,11011 NorthTorrey Pines Rd.,La Jolla，加利福尼亚92037)并根据厂商指导使用。AS019-DNA用限制性内切酶Sau3A酶切并与BamHⅠ处理的并去磷酸化的λZap ExpressTM臂连接。
实施例2opcA和zwf基因的克隆和测序1、zwf探针的构建用zwf基因内部的放射性标记的寡核苷酸探测上述AS019λZapExpressTM文库。寡核苷酸用zwf基因内部的简并PCR引物产生。设计用于PCR扩增zwfDNA片段的简并核苷酸引物如下
zwf1:5＇ATY GAY CAC TAY YTS GGY AAR GA 3＇zwf2:5＇RAA WGG MAC RCC YKS CCA 3＇其中R=A+G；Y=C+T；W=A+T；M=A+C；S=G+C；K=T+G。
得到的PCR产物的估计大小约为480bp。
最佳PCR条件如下35个循环94℃1分钟60℃1分钟72℃30秒2.5-3.5mM MgCl2100-150ng AS019基因组DNA得到的PCR产物的序列分析证实产物是zwf基因的内部部分。序列分析用通用正向和反向引物和购自Pharmacia Biotech(St.Albans,Herts,UK)的T7测序试剂盒进行。2、克隆根据λZap ExpressTM系统方案(Stratagene,11011 North TorreyPines Rd.,La Jolla，加利福尼亚92037)筛选AS019λZap ExpressTM文库，然后对分离的克隆进行Southem印迹分析。DNA的Southem转移如Schleicher和Schuell方案手册所述用NytranTM作为膜(＂Nytran，修饰的Nylon-66滤膜＂(1987年3月)，Schleicher和Schuell,Dassel，德国)进行。用上述相同引物和最佳PCR条件产生的双链DNA片段用购自Amersham生命科学(Amersham Pharmacia生物技术英国有限公司，Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)的MultiprimeTMDNA标记试剂盒根据厂商指导用α-32P-dCTP进行放射标记。预杂交、杂交和洗涤条件如Schleicher和Schuell方案手册所述。放射自显影根据Sambrook等的手册所述程序用AgFa Curix RPIL胶片进行。由此鉴定了几个zwf克隆，从一个称为pBOB102(
图1)的克隆分离质粒DNA，并选择用于进一步分析。3、测序用Sanger等(美国科学院院报74,5463-5467(1977))的Sanger双脱氧链终止方法测序pBOB102的克隆的插入片段的序列。用购自Pharmacia Biotech(St.Albans,Herts,UK)的T7测序试剂盒和α-35S-dCTP应用该方法。根据Pharmacia克隆和测序指导手册(“T7测序TM试剂盒”，编号XY-010-00-19,Pharmacia Biotech,1994)，在50mA恒定电流下将样品在6％聚丙烯酰胺/尿素凝胶上于TBE缓冲液中电泳3-8小时。用得自Pharmacia Biotech的通用正向和M13反向引物进行初始序列分析通用正向引物5＇GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C3＇M13反向引物 5＇GGA AAC AGC TAT GAC CAT G3＇随后从获得的序列设计内部引物，使得完整opcA基因被推导出。内部引物的序列如下内部引物1:5＇TCA ACC CTG AGT CCA CC 3＇内部引物2:5＇CTG ACC ACG AGC GGA GG 3＇内部引物3:5＇ATG GTG ATC TGG ACG TG 3＇内部引物4:5＇CTG GCG ACT TGG CTC GA 3＇内部引物5:5＇CTT CCG GAT ACC ACC ACC 3＇获得的序列然后用DNA Strider程序(Marck(1988)，核酸研究16:1829-1836)版本1.0在苹果Macintosh计算机上分析。这一分析使得能分析如限制位点利用、开放读框分析和密码子利用的确定。获得的DNA序列和EMBL和Genbank数据库之间的检索用BLAST程序(Altschul等(1997)，核酸研究25:3389-3402)进行。用ClustalV和Clustal W程序(Higgins和Sharp,1988基因73:237-244)对比DNA和蛋白质序列。
获得的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。对该核苷酸序列的分析显示一957碱基对的开放读框，其被称为opcA基因。opcA基因编码319个氨基酸的蛋白，如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10所示。zwf基因的编码区也在SEQ ID NO:6中示出，Zwf蛋白的氨基酸序列由514个氨基酸组成，如SEQ ID NO:7所示。
实施例3从谷氨酸棒杆菌ATCC13032制备基因组粘粒基因文库来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA如Tauch等(1995，质粒33:168-179)所述分离，并用限制酶Sau3AⅠ(AmershamPharmacia,Freiburg，德国，产品描述Sau3AⅠ，编码27-0913-02)部分酶切。DNA片段用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)去磷酸化。得自Stratagene(La Jolla,USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编码251301)的粘粒载体SuperCosl(Wahl等(1987)，美国科学院院报84:2160-2164)的DNA用限制性内切酶XbaⅠ(AmershamPharmacia,Freiburg，德国，产品描述XbaⅠ，编码27-0948-02)酶切并类似地用虾碱性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性内切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述BamHⅠ，编码27-0868-04)酶切。以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC13032 DNA片段混合并用T4 DNA连接酶(AmershamPharmacia,Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编码27-0870-04)处理。连接混合物然后用GigapackⅡ XL包装提取物(Stratagene,La Jolla,USA，产品描述GigapackⅡ XL包装提取物，编码200217)包装进噬菌体中。为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)，将细胞置于10mM MgSO4并与噬菌体悬液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox,1955，病毒学，1:190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组克隆。
实施例4 ATCC 13032的opcA和zwf基因的分离和测序用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106,Qiagen,Hilden，德国)根据厂商指导分离各个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述Sau3AⅠ，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。凝胶电泳分离后，用QiaExⅡ凝胶提取试剂盒(产品号20021,Qiagen,Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA用限制性内切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述BamHⅠ，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biotech,Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994,FEMS微生物学通信，123:343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant,1990，美国科学院院报87:4645-4649)并在含有50微克/毫升zeocin的LB琼脂(Lennox,1955，病毒学，1:190)上铺板。重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品号900200,Qiagen,Hilden，德国)进行。测序用Zimmermann等(1990，核酸研究18:1067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报74:5463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司(产品号403044,Weiterstadt，德国)的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”。在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism 377”测序仪的“Rotiphoresis NF”丙烯酰胺/双丙烯酰胺凝胶(29∶1)(产品号A124.1,Roth,Karlsruhe，德国)中进行凝胶电泳分离和序列分析。
原始数据资料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14:217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden,1986，核酸研究，14:217-231)进行计算机辅助编码区分析。同源性分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25:3389-3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI，Bethesda,MD,USA)的非冗余数据库进行。
获得的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。对该核苷酸序列的分析显示一957碱基对的编码区，其被称为opcA基因。包括其终止密码子的opcA基因如SEQ ID NO:4所示，opcA基因编码319个氨基酸的蛋白质，如SEQ ID NO:3和SEQID NO:5所示。
实施例5谷氨酸棒杆菌ATCC13032的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的纯化和N-末端测序1．菌株ATCC13032的培养为纯化葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，在Labfors发酵系统(Infors AG,Bottmingen，瑞士)中在30℃将谷氨酸棒杆菌ATCC13032在基本培养基中有氧培养。在30℃培养预培养物(Bacto脑心浸液培养基，Difco实验室，底特律，美国)15小时并用于接种2.5升基本培养基。该培养基含有如下组分(每升含量)20g(NH4)2SO4,1g KH2PO4,1gK2HPO4,0.25g MgSO4·7H2O,10mg CaCl2,0.2mg生物素，30mg原儿茶酸，1mg FeSO4·7H2O,1mg MnSO4·H2O,0.1mg ZnSO4·7H2O,0.02mg CuSO4,0.002mg NiCl2·6H2O,1.2g HCl,0.2g聚乙二醇，75mgtritriplexⅡ和100g葡萄糖。发酵过程中连续加入氢氧化钠以保持pH值为7.0。在指数生长期晚期收获细胞，用Beckman(Fullerton,USA)的Avanti J-25离心机和JA10转子在4℃、6400g离心15分钟，并在含10mM MgCl2的100mM TRIS-HCl pH7.5中洗涤后，沉淀在-20℃储存备用。
2．酶纯化在破碎系统(破碎器S,BIOmatic,Rodgau-Hainhausen，德国)中进行细胞破坏。细胞先在由100mM TRIS-HCl,10mM MgCl2,0.75mM DTT和几种蛋白酶抑制剂的混合物(completeTM,Roche，德国曼海姆)组成的pH7.5缓冲液中重悬。细胞湿重与总悬浮液重量之比调整至0.3。每100毫升总悬浮液体积加入100毫升直径为0.1-0.25mm的玻璃珠(Fisher科学公司，Dusseldorf,德国)后，在5000rpm破碎细胞12分钟。通过冰冷却防止破碎过程中的升温。除去玻璃珠后用Beckman(Fullerton,USA)的L8-70M离心机和Ti45转子在4℃、235000g超离心90分钟。上清用作纯化葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的粗提物。所有纯化步骤均用Beckman(Fullerton,USA)的Biosys2000系统进行。
粗提物加至含有Fractogel EMD DEAE-650(S)材料(Merck,Darmstadt)的XK50/30柱(Pharmacia,Freiburg，德国)，总柱床体积是500毫升。柱先用含30mM MgCl2和0.75mM DTT的50mMTRIS-HCl pH7.5平衡。加入粗提物后，柱用含144mM KCl的相同缓冲液洗涤。洗脱在95分钟内用144mM-320mM的KCl线性梯度进行。合并活性组分并用Varifuge 3.0R离心机(Heraeus,Hanau，德国)在1500g和4℃在centriprep30浓缩仪(Amicon,Beverly,USA)中浓缩。用含30mM MgCl2和0.75mM DTT的50mM TRIS-HCl pH7.5稀释调整KCl的浓度为40mM。之后将部分纯化的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶加至XK26/20柱(Pharmacia,Freiburg，德国)，该柱用65mlRed-Sepharose CL6B(Pharmacia,Freiburg，德国)填充。柱用含30mMMgCl2和0.75mM DTT的50mM TRIS-HCl pH7.5平衡。洗脱在590分钟内用0-800mM的KCl线性梯度以0.87ml/min的流速进行。
合并活性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组分后，以如上所述相同方式将KCl浓度降至10mM。之后将溶液加至含20ml 2＇5＇-ADP-sepharose基质(Pharmacia,Freiburg，德国)的XK16/20柱(Pharmacia,Freiburg，德国)。该柱与Red-Sepharose CL6B柱一样用相同缓冲液平衡。洗脱通过0-2mM NADP线性梯度进行。合并活性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶组分并加至凝胶过滤柱。
使用直径1.6cm、柱床体积114ml的Superdex G200pg柱(Pharmacia,Freiburg，德国)进行凝胶过滤，洗脱经含30mM MgCl2、200mM KCl和0.75mM DTT的50mM TRIS-HCl pH7.5以1ml/min的流速进行。合并活性组分并在centriprep30浓缩仪(Amicon,Beverly,USA)中超滤。向纯化的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中加入50％(v/v)甘油后将其在-20℃储存。
在整个纯化过程中测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性和蛋白质浓度。
确定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的测定系统含有50mMTRIS-HCl pH7.5,10mM MgCl2,1mM NADP和200mM谷氨酸钾。反应通过加入4mM葡萄糖-6-磷酸起始，通过在30℃测定340nm处的吸收值的增加跟踪NADPH的形成。蛋白质浓度在考马斯亮蓝染色(Stoscheck，酶学方法182,50-68(1990))后分光光度法测定，使用牛血清白蛋白作为蛋白质标准。所有测量均用UV-160A光度计(Shimadzu,Kyoto,Japan)进行。
通过Laemmli(Laemmli,U.K.，自然227,680-685(1970))的变性不连续SDS凝胶电泳测试葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的纯度。用2＇5＇-ADP sepharose配体亲和材料进行第三个纯化步骤后，可获得分子量为ca.60kDa和30kDa的两种不同蛋白质。这两个蛋白质不能用凝胶过滤层析分离。这一制备物的比活性经测定为213U/mg蛋白质。
3．N-末端测序根据Edman(Edman and Begg，欧洲生物化学杂志)的程序用Procise蛋白质测序系统(Applied Biosystems,Foster City,USA)进行纯化的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的N-末端测序。
对于60kDa蛋白质，获得如下N-末端序列Xaa Xaa Xaa XaaXaa Pro Xaa Xaa Trp Xaa Asn Pro Leu Arg Asp，其也示于SEQ IDNO:11。
对于30kDa蛋白质，获得如下N-末端序列MetIle Phe Xaa LeuPro Asp Xaa Xaa Xaa Gln Gln Ile Ser Lys，其也示于SEQ ID NO:12。
实施例6将zwf和opcA基因克隆进pGEM-T载体用PCR扩增含有谷氨酸棒杆菌ATCC13032的完整zwf和opcA基因和两侧的上游和下游区的DNA片段。用从SEQ ID NO:1和SEQID NO:6设计的寡核苷酸引物进行PCR反应。根据Heery和Dunican(应用和环境微生物学59:791-799(1993))所述从谷氨酸棒杆菌ATCC13032分离基因组DNA并用作模板。所用引物为zwf正向引物5＇AGA ATC AGC ACG CTG CAT CAG 3＇opcA反向引物5＇AGT ATG GTG CGC GTA CTA 3＇PCR参数如下35个循环95℃3分钟94℃1分钟47℃1分钟72℃45秒2.5mM MgCl2约150-200ng DNA模板。
获得的PCR产物克隆进购自Promega公司的市售pGEM-T载体(pGEM-T Easy Vector System 1，目录号A1360,Promega UK,Southampton)，用大肠杆菌JM109(Yanisch-Perron等，基因33:103-119(1985))作为宿主。
实施例7穿梭载体pEC-T18mob2的制备根据现有技术构建大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2。
该载体含有质粒pGA1的包括复制效应子per(US-A5,175,108；Nesvera等，细菌学杂志179,1525-1532(1997))的复制区rep，质粒pAG1的赋予四环素抗性的tetA(z)基因(US-A5,158,891；国家生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD,USA)基因文库登录号AF121000)，质粒pMB1(Sutcliffe，定量生物学冷泉港研讨会43,77-90(1979))的复制起点oriV，包括lac启动子和多克隆位点(mcs)的lacZα基因片段(Norrander等，基因26,101-106(1983))，以及质粒RP4(Simon等，(1983)生物/技术1:784-791)的mob区。
将构建的载体转化进大肠杆菌菌株DH5α(Hanahan,DNA克隆实用方案，第Ⅰ卷，IRL出版社，Oxford，华盛顿特区，美国)。通过将转化混合物在补加5mg/l四环素的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)上铺板而选择携带质粒的细胞。用来自Qiagen的QIAprep SpinMiniprep试剂盒从转化子分离质粒DNA，并用限制酶EcoRⅠ和HindⅢ限制随后琼脂糖凝胶电泳(0.8％)证实。
质粒命名为pEC-T18mob2并如图2所示。其以大肠杆菌K-12菌株DH5α/pEC-T18mob2的形式保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)，保藏号DSM 13244。
实施例8葡萄糖-6-磷酸脱氢酶在谷氨酸棒杆菌中的表达随后以SphⅠ/SalⅠ片段从含zwf和opcA基因的pGEM T-载体(见实施例6)中分离完整的zwf和opcA基因，并克隆进大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2(见实施例7和图2)的lacZαSphⅠ/SalⅠ位点。这-穿梭载体含有两个SphⅠ位点，第-个位于lacZα的多克隆位点内，第二个位于赋予四环素抗性的基因内。因此用四环素(Sigma-Aldrich,PO Box 2424,Wimbome,Dorset BH217YR,UK)作为选择压力，因为仅有那些含完整四环素抗性基因的克隆能生长。这一新的构建体命名为pECzwfopcA(图3)。用SacⅠ(宝灵格曼海姆有限公司，德国)限制酶分析揭示zwf和opcA基因在pEC-T18mob2的lacZα基因中的正确方向，即在lac启动子的下游。用这一构建体转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032(美国典型培养物保藏中心，Manasa,VA,USA)，在补加1mM异丙基硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),0.02％5-溴-4-氯-3-吲哚吡喃半乳糖苷(XGAL)和5mg/l四环素的Luria琼脂上选择电转化子。琼脂平板在30℃保温48小时。如O＇Gara和Dunican所述(应用和环境微生物学61:4477-4479(1995))快速制备质粒，SacⅠ限制证实所需克隆的存在。其中一个克隆命名为ATCC13032/pECzwfopcA。
实施例9制备具有扩增的opcA基因的氨基酸生产菌L-赖氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌DSM5715的描述见EP-B-0435132,L-苏氨酸生产菌株黄色短杆菌DSM5399的描述见EP-B-0385940。两个菌株均根据布达佩斯条约在德意志微生物保藏中心保藏。
根据Liebl等(FEMS微生物学通信53:299-303(1989))所述电穿孔方法，用质粒pECzwfopcA(实施例8)转化菌株DSM5715和DSM5399。在补加5mg/l四环素的LBHIS琼脂上进行转化子的选择，LBHIS琼脂包含18.5g/l脑心浸液，0.5M山梨糖醇，5g/l Bacto-胰胨，2.5g/l Bacto-酵母膏，5g/l NaCl和18g/l Bacto-琼脂。在33℃保温2天。
以此方式获得的菌株称为DSM5715/pECzwfopcA和DSM5399/pECzwfopcA。
实施例10生产L-苏氨酸实施例9中制备的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5399/pECzwfopcA在适于生产苏氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中的苏氨酸含量。
为此，首先在33℃在具有合适抗生素的琼脂板(具有四环素(5mg/l)的脑心琼脂)上培养菌株24小时。从这些琼脂板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgⅢ。
培养基CgⅢNaCl2.5g/lBacto-肽胨 10g/lBacto-酵母膏10g/l葡萄糖(单独高压灭菌)2％(w/v)pH调至pH7.4。
向培养基中加入四环素(5mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。从此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(测量波长660nm)是0.1。培养基MM用作主培养物。培养基MMCSL(玉米浆) 5g/lMOPS(吗啉代丙磺酸)20g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O1.0g/lCaCl2·2H2O10mg/lFeSO4·7H2O10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(过滤灭菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(过滤灭菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(过滤灭菌)0.1g/lCaCO325g/l用氨水将CSL,MOPS和盐溶液调至pH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养，加入四环素(5mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
24小时后，用Biomek(Beckman仪器有限公司，慕尼黑)确定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的苏氨酸量。
所得结果示于表1。
表1
实施例11生产L-赖氨酸实施例9中制备的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715/pECzwfopcA在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中的赖氨酸含量。
为此，首先在33℃在具有合适抗生素的琼脂板(具有四环素(5mg/l)的脑心琼脂)上培养菌株24小时。从这些琼脂板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgⅢ。
培养基CgⅢNaCl 2.5g/lBacto-肽胨10g/l
Bacto-酵母膏10g/l葡萄糖(单独高压灭菌)2％(w/v)pH调至pH7.4。
向培养基中加入四环素(5mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。从此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(测量波长660nm)是0.1。培养基MM用作主培养物。培养基MMCSL(玉米浆)5g/lMOPS(吗啉代丙磺酸) 20g/l葡萄糖(单独高压灭菌) 50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(过滤灭菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(过滤灭菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(过滤灭菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水将CSL,MOPS和盐溶液调至pH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养，加入四环素(5mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek(Beckman仪器有限公司，慕尼黑)确定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的赖氨酸量。
所得结果示于表2。
表2
原始表格(为递交)-2000年7月3日02:19:24PM打印
序列表<110>国立爱尔兰大学，戈尔韦德古萨-于尔斯股份公司于利希研究中心有限公司<120>编码opcA基因的核苷酸序列<130>990213 BT<140><141><160>12<170>PatentIn ver.2.1<210>1<211>6995<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌ATCC13032<220><221>CDS<222>(3658)..(5202)<223>zwf<220><221>CDS<222>(5217)..(6173)<223>opcA<400>1cacacttgaa ccacagttgg ttataaaatg ggttcaacat cactatggtt agaggtgttg 60acgggtcaga ttaagcaaag actactttcg gggtagatca cctttgccaa atttgaacca 120attaacctaa gtcgtagatc tgatcatcgg atctaacgaa aacgaaccaa aactttggtc 180ccggtttaac ccaggaagga ttgaccacct tgacgctgtc acctgaactt caggcgctca 240ctgtacgcaa ttacccctct gattggtccg atgtggacac caaggctgta gacactgttc 300gtgtcctcgc tgcagacgct gtagaaaact gtggctccgg ccacccaggc accgcaatga 360gcctggctcc ccttgcatac accttgtacc agcgggttat gaacgtagat ccacaggaca 420ccaactgggc aggccgtgac cgcttcgttc tttcttgtgg ccactcctct ttgacccagt 480acatccagct ttacttgggt ggattcggcc ttgagatgga tgacctgaag gctctgcgca 540cctgggattc cttgacccca ggacaccctg agtaccgcca caccaagggc gttgagatca 600ccactggccc tcttggccag ggtcttgcat ctgcagttgg tatggccatg gctgctcgtc 660gtgagcgtgg cctattcgac ccaaccgctg ctgagggcga atccccattc gaccaccaca 720tctacgtcat tgcttctgat ggtgacctgc aggaaggtgt cacctctgag gcatcctcca 780tcgctggcac ccagcagctg ggcaacctca tcgtgttctg ggatgacaac cgcatctcca 840tcgaagacaa cactgagatc gctttcaacg aggacgttgt tgctcgttac aaggcttacg 900gctggcagac cattgaggtt gaggctggcg aggacgttgc agcaatcgaa gctgcagtgg 960ctgaggctaa gaaggacacc aagcgaccta ccttcatccg cgttcgcacc atcatcggct 1020tcccagctcc aactatgatg aacaccggtg ctgtgcacgg tgctgctctt ggcgcagctg 1080aggttgcagc aaccaagact gagcttggat tcgatcctga ggctcacttc gcgatcgacg 1140atgaggttat cgctcacacc cgctccctcg cagagcgcgc tgcacagaag aaggctgcat 1200ggcaggtcaa gttcgatgag tgggcagctg ccaaccctga gaacaaggct ctgttcgatc 1260gcctgaactc ccgtgagctt ccagcgggct acgctgacga gctcccaaca tgggatgcag 1320atgagaaggg cgtcgcaact cgtaaggctt ccgaggctgc acttcaggca ctgggcaaga 1380cccttcctga gctgtggggc ggttccgctg acctcgcagg ttccaacaac accgtgatca 1440agggctcccc ttccttcggc cctgagtcca tctccaccga gacctggtct gctgagcctt 1500acggccgtaa cctgcacttc ggtatccgtg agcacgctat gggatccatc ctcaacggca 1560tttccctcca cggtggcacc cgcccatacg gcggaacctt cctcatcttc tccgactaca 1620tgcgtcctgc agttcgtctt gcagctctca tggagaccga cgcttactac gtctggaccc 1680acgactccat cggtctgggc gaagatggcc caacccacca gcctgttgaa accttggctg 1740cactgcgcgc catcccaggt ctgtccgtcc tgcgtcctgc agatgcgaac gagaccgccc 1800aggcttgggc tgcagcactt gagtacaagg aaggccctaa gggtcttgca ctgacccgcc 1860agaacgttcc tgttctggaa ggcaccaagg agaaggctgc tgaaggcgtt cgccgcggtg 1920gctacgtcct ggttgagggt tccaaggaaa ccccagatgt gatcctcatg ggctccggct 1980ccgaggttca gcttgcagtt aacgctgcga aggctctgga agctgagggc gttgcagctc 2040gcgttgtttc cgttccttgc atggattggt tccaggagca ggacgcagag tacatcgagt 2100ccgttctgcc tgcagctgtg accgctcgtg tgtctgttga agctggcatc gcaatgcctt 2160ggtaccgctt cttgggcacc cagggccgtg ctgtctccct tgagcacttc ggtgcttctg 2220cggattacca gaccctgttt gagaagttcg gcatcaccac cgatgcagtc gtggcagcgg 2280ccaaggactc cattaacggt taattgccct gctgttttta gcttcaaccc ggggcaatat 2340gattctccgg aattttattg ccccgggttg ttgttgttaa tcggtacaaa gggtcttaag 2400cacatccctt acttgcctgc tctccttgag cacagttcaa gaacaattct tttaaggaaa 2460atttagtttc atgtctcaca ttgatgatct tgcacagctc ggcacttcca cttggctcga 2520cgacctctcc cgcgagcgca ttacttccgg caatctcagc caggttattg aggaaaagtc 2580tgtagtcggt gtcaccacca acccagctat tttcgcagca gcaatgtcca agggcgattc 2640ctacgacgct cagatcgcag agctcaaggc cgctggcgca tctgttgacc aggctgttta 2700cgccatgagc atcgacgacg ttcgcaatgc ttgtgatctg ttcaccggca tcttcgagtc 2760ctccaacggc tacgacggcc gcgtgtccat cgaggttgac ccacgtatct ctgctgaccg 2820cgacgcaacc ctggctcagg ccaaggagct gtgggcaaag gttgatcgtc caaacgtcat 2880gatcaagatc cctgcaaccc caggttcttt gccagcaatc accgacgctt tggctgaggg 2940catcagcgtt aacgtcacct tgatcttctc cgttgctcgc taccgcgagg tcatcgctgc 3000gttcatcgag ggcatcaagc aggctgctgc aaacggccac gacgtctcca agatccactc 3060tgtggcttcc ttcttcgtct cccgcgtcga cgttgagatc gacaagcgcc tcgaggcaat 3120cggatccgat gaggctttgg ctctgcgcgg caaggcaggc gttgccaacg ctcagcgcgc 3180ttacgctgtg tacaaggagc ttttcgacgc cgccgagctg cctgaaggtg ccaacactca 3240gcgcccactg tgggcatcca ccggcgtgaa gaaccctgcg tacgctgcaa ctctttacgt 3300ttccgagctg gctggtccaa acaccgtcaa caccatgcca gaaggcacca tcgacgcggt 3360tctggagcag ggcaacctgc acggtgacac cctgtccaac tccgcggcag aagctgacgc 3420tgtgttctcc cagcttgagg ctctgggcgt tgacttggca gatgtcttcc aggtcctgga 3480gaccgagggt gtggacaagt tcgttgcttc ttggagcgaa ctgcttgagt ccatggaagc 3540tcgcctgaag tagaatcagc acgctgcatc agtaacggcg acatgaaatc gaattagttc 3600gatcttatgt ggccgttaca catctttcat taaagaaagg atcgtgacac taccatc3657gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac 3705Val Set Thr Asn Thr Thr Pro Set Set Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg 3753Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc 3801Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg 3849Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac 3897Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Set Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat3945Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt3993Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc4041Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att 4089Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc 4137Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag 4185Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc 4233Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg 4281Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag 4329Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc 4377Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240acc atg gct gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac 4425Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc 4473Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag 4521Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln275 280 285ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac 4569Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag 4617Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct 4665Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro325 330 335gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct 4713Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt 4761Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac 4809Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc 4857Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Ash Ala Ile385 390 395 400gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc 4905Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc 4953Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc 5001Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac 5049Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Set Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca 5097Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt 5145Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc sac ggt cac acc tgg cgc 5193Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510agg cca taa tttaggggca aaaa atg atc ttt gaa ctt ccg gat acc acc 5243Arg Pro Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr515 520acc cag caa att tcc aag acc cta act cga ctg cgt gaa tcg ggc acc 5291Thr Gln Gln Ile Ser Lys Thr Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr525 530 535 540cag gtc acc acc ggc cga gtg ctc acc ctc atc gtg gtc act gac tcc 5339Gln Val Thr Thr Gly Arg Val Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser545 550 555gaa agc gat gtc gct gca gtt acc gag tcc acc aat gaa gcc tcg cgc 5387Glu Ser Asp Val Ala Ala Val Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg560 565 570gag cac cca tct cgc gtg atc att ttg gtg gtt ggc gat aaa act gca 5435Glu His Pro Ser Arg Val Ile Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala575 580 585gaa aac aaa gtt gac gca gaa gtc cgt atc ggt ggc gac gct ggt gct 5483Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala590 595 600tcc gag atg atc atc atg cat ctc aac gga cct gtc gct gac aag ctc 5531Ser Glu Met Ile Ile Met His Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu605 610 615 620cag tat gtc gtc aca cca ctg ttg ctt cct gac acc ccc atc gtt gct 5579Gln Tyr Val Val Thr Pro Leu Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala625 630 635tgg tgg cca ggt gaa tca cca aag aat cct tcc cag gac cca att gga 5627Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly640 645 650cgc atc gca caa cga cgc atc act gat gct ttg tac gac cgt gat gac 5675Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp655 660 665gca cta gaa gat cgt gtt gag aac tat cac cca ggt gat acc gac atg 5723Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met670 675 680acg tgg gcg cgc ctt acc cag tgg cgg gga ctt gtt gcc tcc tca ttg 5771Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu685 690 695 700gat cac cca cca cac agc gaa atc act tcc gtg agg ctg acc ggt gca 5819Asp His Pro Pro His Ser Glu Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala705 710 715agc ggc agt acc tcg gtg gat ttg gct gca ggc tgg ttg gcg cgg agg 5867Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg720 725 730ctg aaa gtg cct gtg atc cgc gag gtg aca gat gct ccc acc gtg cca 5915Leu Lys Val Pro Val Ile Arg Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro735 740 745acc gat gag ttt ggt act cca ctg ctg gct atc cag cgc ctg gag atc 5963Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile750 755 760gtt cgc acc acc ggc tcg atc atc atc acc atc tat gac gct cat acc 6011Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr765 770 775 780ctt cag gta gag atg ccg gaa tcc ggc aat gcc cca tcg ctg gtg gct 6059Leu Gln Val Glu Met Pro Glu Ser Gly Asn Ala Pro Set Leu Val Ala785 790 795att ggt cgt cga agt gag tcc gac tgc ttg tct gag gag ctt cgc cac 6107Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His800 805 810atg gat cca gat ttg ggc tac cag cac gca cta tcc ggc ttg tcc agc 6155Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr Gln His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser815 820 825gtc aag ctg gaa acc gtc taaggagaaa tacaacacta tggttgatgt 6203Val Lys Leu Glu Thr Val830agtacgcgca cgcgatactg aagatttggt tgcacaggct gcctccaaat tcattgaggt 6263tgttgaagca gcaactgcca ataatggcac cgcacaggta gtgctcaccg gtggtggcgc 6323cggcatcaag ttgctggaaa agctcagcgt tgatgcggct gaccttgcct gggatcgcat 6383tcatgtgttc ttcggcgatg agcgcaatgt ccctgtcagt gattctgagt ccaatgaggg 6443ccaggctcgt gaggcactgt tgtccaaggt ttctatccct gaagccaaca ttcacggata 6503tggtctcggc gacgtagatc ttgcagaggc agcccgcgct tacgaagctg tgttggatga 6563attcgcacca aacggctttg atcttcacct gctcggcatg ggtggcgaag gccatatcaa 6623ctccctgttc cctcacaccg atgcagtcaa ggaatcctcc gcaaaggtca tcgcggtgtt 6683tgattcccct aagcctcctt cagagcgtgc aactctaacc cttcctgcgg ttcactccgc 6743aaagcgcgtg tggttgctgg tttctggtgc ggagaaggct gaggcagctg cggcgatcgt 6803caacggtgag cctgctgttg agtggcctgc tgctggagct accggatctg aggaaacggt 6863attgttcttg gctgatgatg ctgcaggaaa tctctaagca gcgccagctc taacaagaag 6923ctttaacaag aagctctaac gaaaagcact aacaaactaa tccgggtgcg aaccttcatc 6983tgaatcgatg ga 6995<210>2<211>514<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌ATCC13032<400>2Val Ser Thr Asn 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Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510Arg Pro<210>3<211>319<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌ATCC13032<400>3Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gln Gln Ile Ser Lys Thr1 5 10 15Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr Gln Val Thr Thr Gly Arg Val20 25 30Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val35 40 45Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val Ile50 55 60Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu65 70 75 80Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met Ile Ile Met His85 90 95Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln Tyr Val Val Thr Pro Leu100 105 110Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro115 120 125Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile130 135 140Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu145 150 155 160Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln165 170 175Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu180 185 190Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp195 200 205Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg210 215 220Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro225 230 235 240Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile245 250 255Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met Pro Glu260 265 270Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser275 280 285Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr290 295 300Gln His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val305 310 315<210>4<211>960<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌ATCCl3D32<220><221>CDS<222>(1)..(957)<223>opcA<400>4atg atc ttt gaa ctt ccg gat 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720Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro225 230 235 240ctg ctg gct atc cag cgc ctg gag atc gtt cgc acc acc ggc tcg atc 768Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile245 250 255atc atc acc atc tat gac gct cat acc ctt cag gta gag atg ccg gaa 816Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met Pro Glu260 265 270tcc ggc aat gcc cca tcg ctg gtg gct att ggt cgt cga agt gag tcc 864Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser275 280 285gac tgc ttg tct gag gag ctt cgc cac atg gat cca gat ttg ggc tac 912Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr290 295 300cag cac gca cta tcc ggc ttg tcc agc gtc aag ctg gaa acc gtc taa 960Gln Mis Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val305 310 315<210>5<21l>319<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌ATCC13032<400>5Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gln Gln Ile Ser Lys Thrl 5 10 15Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr Gln Val Thr Thr Gly Arg Val20 25 30Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val35 40 45Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val Ile50 55 60Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu65 70 75 80Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met Ile Ile Met His85 90 95Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln Tyr Val Val Thr Pro Leu100 105 110Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro115 120 125Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile130 135 140Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu145 150 155 160Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln165 170 175Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu180 185 190Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp195 200 205Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg210 215 220Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro225 230 235 240Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile245 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gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg gta 309Tyr Asp Leu Als Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu Val50 55 60 65ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac gta 357Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr Val70 75 80cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat gtt 405Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn Val85 90 95tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt gat 453Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe Asp100 105 110gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc gac 501Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile Asp115 120 125aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att cca 549Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile Pro130 135 140 145cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag crg gag cgt tcc ggc atg 597Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly Met150 155 160gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag cct 645Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys Pro165 170 175ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc aac 693Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val Asn180 185 190gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg ggc 741Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu Gly195 200 205aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag ctg 789Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln Leu210 215 220 225ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag arc acc 837Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile Thr230 235 240atg gct gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac ggc 885Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp Gly245 250 255atc ggc gca ccg cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc ttg 933Ile Gly Ala Pro Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu Leu260 265 270gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg gca cgg 981Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Ala Arg275 280 285cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac cca 1029Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr Pro290 295 300 305ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag ggc 1077Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln Gly310 315 320tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct gag 1125Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro Glu325 330 335tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct cgt 1173Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser Arg340 345 350cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt ggt 1221Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu Gly355 360 365cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac cag 1269Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His Gln370 375 380 385cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa 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1992Met Ile Ile Met His Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln Tyr610 615 620gtc gtc aca cca ctg ttg ctt cct gac acc ccc atc gtt gct tgg tgg 2040Val Val Thr Pro Leu Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp625 630 635cca ggt gaa tca cca aag aat cct tcc cag gac cca att gga cgc atc 2088Pro Gly Glu Ser Pro Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile640 645 650gca caa cga cgc atc act gat gct ttg tac gac cgt gat gac gca cta 2136Ala Gln Arg Arg Ile Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu655 660 665 670gaa gat cgt gtt gag aac tat cac cca ggt gat acc gac atg acg tgg 2184Glu Asp Arg Val Glu Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp675 680 685gcg cgc ctt acc cag tgg cgg gga ctt gtt gcc tcc tca ttg gat cac 2232Ala Arg Leu Thr Gln Trp Arg Gly Leu Val Ala Set Set Leu Asp His690 695 700cca cca cac agc gaa atc act tcc gtg agg ctg acc ggt gca agc ggc 2280Pro Pro His Ser Glu Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly705 710 715agt acc tcg gtg gat ttg gct gca ggc tgg ttg gcg cgg agg ctg aaa 2328Ser Thr Ser Val Asp Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys720 725 730gtg cct gtg atc cgc gag gtg aca gat gct ccc acc gtg cca acc gat 2376Val Pro Val Ile Arg Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp735 740 745 750gag ttt ggt act cca ctg ctg gct atc cag cgc ctg gag atc gtt cgc 2424Glu Phe Gly Thr Pro Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg755 760 765acc acc ggc tcg atc atc atc acc atc tat gac gct cat acc ctt cag 2472Thr Thr Gly Ser Ile Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gln770 775 780gta gag atg ccg gaa tcc ggc aat gcc cca tcg ctg gtg gct att ggt 2520Val Glu Met Pro Glu Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly785 790 795cgt cga agt gag tcc gac tgc ttg tct gag gag ctt cgc cac atg gat 2568Arg Arg Ser Glu Ser Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp800 805 810cca gat ttg ggc tac cag cac gca cta tcc ggc ttg tcc agc gtc aag 2616Pro Asp Leu Gly Tyr Gln His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys815 820 825 830ctg gaa acc gtc taaggagaaa tacaacacta tggttgatgt agtacgcgca 2668Leu Glu Thr Valcgcatactga agatttggtt gcacaggctg cctccaaatt cattgaggtt gttgaagcag 2728caactgccaa taatggcacc gcacaggtag tgctcaccgg tggtggcgcc ggcatcaagt 2788tgctggaaaa gctcagcgtt gatgcggctg accttgcctg ggatcgcatt catgtgttct 2848tcggcgatga gcgcaatgtc cctgtcagtg attctgagtc caatgagggc caggctcgtg 2908aggcactgtt gtccaaggtt tctatccctg aagccaacat tcacggatat ggtctcggcg 2968acgtagatct tgcagaggca gcccgcgctt acgaagctgt gttggatgaa ttcgcaccaa 3028acggctttga3038<210>7<211>514<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌AS019<400>7Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val20 25 30Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala35 40 45lle Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu50 55 60Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr65 70 75 80Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn85 90 95Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe100 105 110Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile115 120 125Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile130 135 140Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly145 150 155 160Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys165 170 175Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val180 185 190Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu195 200 205Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln210 215 220Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile225 230 235 240Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp245 250 255Gly Ile Gly Ala Pro Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu260 265 270Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Ala275 280 285Arg Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr290 295 300Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln305 310 315 320Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro
325 330 335Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser340 345 350Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu355 360 365Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His370 375 380Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile385 390 395 400Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser405 410 415Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe420 425 430Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg435 440 445Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn450 455 460Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala465 470 475 480Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly485 490 495Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg500 505 510Arg Pro<210>8<211>319<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌AS019<400>8Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gln Gln Ile Ser Lys Thrl 5 10 15Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr Gln Val Thr Thr Gly Arg Val20 25 30Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val35 40 45Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val Ile50 55 60Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu65 70 75 80Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala Ser Glu Met Ile Ile Met His85 90 95Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln Tyr Val Val Thr Pro Leu100 105 110Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro115 120 125Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile130 135 140Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu145 150 155 160Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln165 170 175Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu180 185 190Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp195 200 205Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg210 215 220Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro225 230 235 240Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile245 250 255Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met Pro Glu260 265 270Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser275 280 285Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr290 295 300Gln His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val305 310 315<210>9<211>960<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌AS019<220>atc act tcc gtg agg ctg acc ggt gca agc ggc agt acc tcg gtg gat624Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp195 200 205ttg gct gca ggc tgg ttg gcg cgg agg ctg aaa gtg cct gtg atc cgc672Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg210 215 220gag gtg aca gat gct ccc acc gtg cca acc gat gag ttt ggt act cca720Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro225 230 235 240ctg ctg gct atc cag cgc ctg gag atc gtt cgc acc acc ggc tcg atc768Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile245 250 255atc atc acc atc tat gac gct cat acc ctt cag gta gag atg ccg gaa816Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met Pro Glu260 265 270tcc ggc aat gcc cca tcg ctg gtg gct att ggt cgt cga agt gag tcc864Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser275 280 285gac tgc trg tct gag gag ctt cgc cac atg gat cca gat ttg ggc tac912Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr290 295 300cag cac gca cta tcc ggc ttg tcc agc gtc aag ctg gaa acc gtc taa960Gln His Ala Leu Ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val305 310 315<210>10<211>319<212>PRT<213>谷氨酸捧杆菌AS019<400>10Met Ile Phe Glu Leu Pro Asp Thr Thr Thr Gln Gln Ile Ser Lys Thr1 5 10 15Leu Thr Arg Leu Arg Glu Ser Gly Thr Gln Val Thr Thr Gly Arg Val20 25 30Leu Thr Leu Ile Val Val Thr Asp Ser Glu Ser Asp Val Ala Ala Val35 40 45Thr Glu Ser Thr Asn Glu Ala Ser Arg Glu His Pro Ser Arg Val Ile50 55 60Ile Leu Val Val Gly Asp Lys Thr Ala Glu Asn Lys Val Asp Ala Glu65 70 75 80Val Arg Ile Gly Gly Asp Ala Gly Ala Sar Glu Met Ile Ile Met His85 90 95Leu Asn Gly Pro Val Ala Asp Lys Leu Gln Tyr Val Val Thr Pro Leu100 105 110Leu Leu Pro Asp Thr Pro Ile Val Ala Trp Trp Pro Gly Glu Ser Pro115 120 125Lys Asn Pro Ser Gln Asp Pro Ile Gly Arg Ile Ala Gln Arg Arg Ile130 135 140Thr Asp Ala Leu Tyr Asp Arg Asp Asp Ala Leu Glu Asp Arg Val Glu145 150 155 160Asn Tyr His Pro Gly Asp Thr Asp Met Thr Trp Ala Arg Leu Thr Gln165 170 175Trp Arg Gly Leu Val Ala Ser Ser Leu Asp His Pro Pro His Ser Glu180 185 190Ile Thr Ser Val Arg Leu Thr Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ser Val Asp195 200 205Leu Ala Ala Gly Trp Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Pro Val Ile Arg210 215 220Glu Val Thr Asp Ala Pro Thr Val Pro Thr Asp Glu Phe Gly Thr Pro225 230 235 240Leu Leu Ala Ile Gln Arg Leu Glu Ile Val Arg Thr Thr Gly Ser Ile245 250 255Ile Ile Thr Ile Tyr Asp Ala His Thr Leu Gln Val Glu Met Pro Glu260 265 270Ser Gly Asn Ala Pro Ser Leu Val Ala Ile Gly Arg Arg Ser Glu Ser275 280 285Asp Cys Leu Ser Glu Glu Leu Arg His Met Asp Pro Asp Leu Gly Tyr290 295 300Gln His Ala Leu ser Gly Leu Ser Ser Val Lys Leu Glu Thr Val305 310 315<210>11<211>15<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌ATCC13032<400>11Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Trp Xaa Asn Pro Leu Arg Asp1 5 10 15<210>12<211>15<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌ATCC13032<400>12Met Ile Phe Xaa Leu Pro Asp Xaa Xaa Xaa Gln Gln Ile Ser Lys1 5 10 1权利要求
1.来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包含选自如下一组的至少一个多核苷酸序列a)与编码包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的至少一个氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，b)编码包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)包含a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
2.权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是能在棒状细菌中复制的优选地是重组的DNA，并额外含有编码基因tal,tkt,zwf和devB的至少一个核苷酸序列。
3.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。
4.权利要求1的多核苷酸，包含如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
5.权利要求2的可复制的DNA，包含(ⅰ)如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9所示的一或多个核苷酸序列，或(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于的(ⅰ)序列的至少一个序列，或(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地(ⅳ)(ⅰ)中中性功能的有义突变。
6.权利要求1的多核苷酸序列，其编码包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10所示的至少一个氨基酸序列的多肽。
7.经导入权利要求1或5的能复制的DNA而转化的棒状微生物，特别是棒杆菌属。
8.制备L-氨基酸的方法，其特征在于进行以下步骤(a)发酵产生所需的L-氨基酸的细菌，该细菌中除了opcA基因是扩增的之外，优选地至少zwf基因和任选地基因tkt基因或devB基因的一或多个基因也是扩增的，(b)在培养基或细菌细胞和浓缩细菌细胞中积累所需产物，及(c)分离所需的L-氨基酸。
9.权利要求8的方法，特征在于除了所述基因之外，戊糖磷酸循环的一或多个基因是额外扩增的，特别是过表达的。
10.权利要求8或9的方法，其特征在于为实现扩增，通过用携带这些基因或核苷酸序列的质粒转化所述微生物而增加基因或核苷酸序列的拷贝数。
11.权利要求8的方法，其特征在于发酵这样的细菌制备氨基酸特别是赖氨酸，所述细菌中除了opcA基因之外，选自如下一组的一或多个基因同时扩增，特别是过表达11.1编码二氢-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，11.2编码抗反馈天冬氨酸激酶的lysC基因，11.3编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，11.4编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，11.5编码酮基转移酶的tkt基因，11.6编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因，11.7编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因，11.8zwa1基因，11.9编码烯醇化酶的eno基因，11.10编码转醛酶的tal基因，11.11特别是zwf基因。
12.权利要求8的方法，其特征在于发酵这样的细菌制备氨基酸特别是赖氨酸，所述细菌中选自如下一组的一或多个基因同时弱化12.1编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因，12.2编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因，12.3编码丙酮酸氧化酶的poxB基因，或12.4zwa2基因。
13.权利要求1的多核苷酸序列作为经聚合酶链反应制备具有相应于opcA基因的作用DNA的引物的应用。
14.权利要求1的多核苷酸序列作为杂交探针的应用。
全文摘要
本发明涉及来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包含选自如下一组的至少一个多核苷酸序列a)与编码包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的至少一个氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸，b)编码包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)包含a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。本发明还涉及发酵制备L－氨基酸的方法，其包括在特别是已产生L－氨基酸的棒状微生物中，a)除了扩增特别是过表达opcA基因之外，扩增特别是过表达编码tal基因，tkt基因，zwf基因或devB基因的至少一个核苷酸序列，b)在培养基或细菌细胞中浓缩所需L－氨基酸，及c)分离所需的L－氨基酸。
文档编号C12Q1/68GK1317049SQ00801334
公开日2001年10月10日 申请日期2000年7月5日 优先权日1999年7月9日
发明者L·K·杜尼肯, 阿什令·麦科麦克, 克里奥娜·斯特普尔顿, 凯文·伯克, 贝恩德·莫里茨, 洛塔尔·埃格林, 赫尔曼·扎姆, 贝蒂娜·默克尔, 安克·韦森伯恩 申请人:德古萨股份公司, 于利希研究中心有限公司, 国立爱尔兰大学