专利名称：采用多种dna聚合酶的dna测序方法和所用的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA核苷酸序列分析方法和所用的试剂盒，更具体地，涉及通过对DNA核苷酸序列进行一次分析而比常规方法能更准确地分析DNA全长核苷酸序列的DNA核苷酸序列分析方法和试剂盒。
背景技术：
已经知道，桑格双脱氧核苷酸介导的链终止法是用于分析DNA核苷酸序列的常规方法。在桑格法中，DNA核苷酸链通过和在戊糖的C-3位含有取代的羟基的脱氧核苷酸(dNTP)反应而延长，并通过和在戊糖的C-3位不含有取代的羟基的双脱氧核苷酸(ddNTP)反应而终止。
在桑格法中，四种dNTP如脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)和脱氧胞苷三磷酸(dCTP)用作产生与模板DNA互补的DNA片段的底物。四种ddNTP如双脱氧鸟苷三磷酸(ddGTP)、双脱氧腺苷三磷酸(ddATP)、双脱氧胸苷三磷酸(ddTTP)和双脱氧胞苷三磷酸(ddCTP)用作用于终止互补DNA片段的链延长反应的底物。与dNTP不同，ddNTP在戊糖的C-3位不含有羟基。因此，当ddNTP和延长反应中的互补DNA片段的末端反应时，互补DNA片段的链延长反应被终止。
因此，在桑格法中产生了不同长度的其末端被ddNTP终止的DNA片段。在桑格法中，产生了与模板DNA的核苷酸数目相对应的不同的互补DNA片段，进而通过电泳，按分子量的顺序将其进行分离。之后，通过测定每个互补DNA片段的末端碱基来识别模板DNA的核苷酸序列。
然而，尽管桑格法很方便，但是它的一个缺陷在于，由于互补DNA延长反应的持续合成能力是有限的，只有长度在500-700bp的DNA可以被准确测定。例如，为了准确和完整地识别平均长度为2Kb的人类cDNA，DNA测序步骤需要通过对人类cDNA的分割来重复三次以上。如上所解释的，作为长DNA的测序方法，桑格法是一种费时、费力和昂贵的方法。
同时，在所谓的鸟枪法(已知是用于基因组DNA的大规模核苷酸测序方法)中，全长DNA被分割为几个DNA片段，分别识别每个片段的碱基的序列。之后，使用计算机相互比较每个片段的序列，通过删除重叠部分来分析全长DNA序列。在上述鸟枪法中，利用可通过一次DNA序列分析识别的DNA长度的扩展来缩减全长DNA序列分析所需的时间和劳力。
通常，在常规的桑格双脱氧核苷酸介导的链终止方法中，采用单个的DNA聚合酶。因此，对应于模板DNA 20-30bp的短DNA片段和对应于模板DNA 600-700bp的长DNA片段少量生成。然而，对应于模板DNA 40-500bp的DNA片段大量生成。所以，短DNA片段和长DNA片段的含量相对较低，从而DNA两端末端部分的核苷酸序列比其中间部分难以测定。
由于上述原因，可通过对核苷酸序列的一次分析进行分析的DNA的长度实际上受到限制。因此，人们长期以来为得到一种新方法进行了多种研究，该方法应能扩展通过核苷酸序列的一次分析来识别的DNA长度，所述核苷酸序列的一次分析是借助对模板DNA两端末端部分更准确的测定进行的。
发明的公开因此，本发明的目的在于提供一种通过核苷酸序列的一次分析测定较长DNA序列的方法以及该方法所用的试剂盒。本发明的方法是对常规桑格DNA测序方法的改进，它可以用于测定比可由桑格测序方法所测定的更长的DNA。
本发明的目的可以通过提供一种DNA序列分析方法来实现，该方法采用了两种以上的DNA聚合酶，该聚合酶包括其对ddNTP的亲和力高于常规桑格法中所用的DNA聚合酶对ddNTP的亲和力的DNA聚合酶，和其对ddNTP的亲和力低于常规桑格法中所用的DNA聚合酶对ddNTP的亲和力的DNA聚合酶。
更具体地，其对ddNTP的亲和力高于桑格法中所用的DNA聚合酶对ddNTP的亲和力的DNA聚合酶大量产生相对短的DNA片段，而其对ddNTP的亲和力低于桑格法中所用的DNA聚合酶对ddNTP的亲和力的DNA聚合酶则大量生成相对长的DNA片段。因此，通过本发明的方法，同时采用对ddNTP的亲和力相互不同的多种DNA聚合酶，可以无差别地得到从10bp到大于1,000bp的不同长度的DNA片段。所以，对于那些比可通过常规桑格法分析的DNA片段还长的DNA片段，可以通过本发明的方法进行DNA序列分析。
用于本发明的术语“DNA聚合酶对dNTP或ddNTP的亲和力”是代表特定DNA聚合酶对dNTP或ddNTP与进行延长的DNA片段的一端的反应频率的贡献程度的相对值。在本发明中，由韩国BIONEERCORPORATION制造的TopTM DNA聚合酶对dNTP或ddNTP的亲和力作为DNA聚合酶对dNTP或ddNTP的亲和力的标准。
图2是DNA片段的电泳照片，该DNA片段是利用对dNTP的亲和力是对ddNTP亲和力0.5倍的DNA聚合酶生成的。
图3是DNA片段的电泳照片，该DNA片段是利用对dNTP的亲和力是对ddNTP亲和力8000倍的DNA聚合酶生成的。
图4是DNA片段的电泳照片，该DNA片段是利用同时包含对ddNTP的亲和力不同的
图1到图3中的三种DNA聚合酶的DNA聚合酶混合物而生成的。
图5是DNA片段的电泳照片，该DNA片段是利用同时包含对ddNTP的亲和力不同的图2和图3中的两种DNA聚合酶的DNA聚合酶混合物而生成的。
本发明的最佳实施模式下面将详细地描述本发明。
在常规桑格法中，使用对dNTP的亲和力是对ddNTP的亲和力3000倍的DNA聚合酶。
本发明的方法是对桑格法的改进，其特征在于，使用DNA聚合酶混合物，该混合物同时包含其对ddNTP的亲和力和对dNTP的亲和力的比率高于常规用于桑格法中的DNA聚合酶的该比率的DNA聚合酶和其对ddNTP的亲和力和对dNTP的亲和力的比率低于常规用于桑格法中的DNA聚合酶的该比率的DNA聚合酶。
用于常规桑格法中DNA测序分析的DNA聚合酶对dNTP的亲和力和对ddNTP的亲和力的比率，可以代表通过由DNA聚合酶催化的将dNTP引入到DNA片段末端的链延长反应频率和通过由DNA聚合酶催化的将ddNTP引入到DNA片段末端的链终止反应频率之间的比率。
在本发明的方法中，同时使用两类DNA聚合酶，一类是其参与dNTP引入反应的频率小于参与进行延长的DNA片段的链终止反应的ddNTP引入反应频率的3000倍，优选不超过1000倍，更优选不超过0.5倍的DNA聚合酶；另一类是其参与dNTP引入反应的频率高于参与进行延长的DNA片段的链终止反应的ddNTP引入反应频率的3000倍，优选不小于5000倍，更优选不小于8000倍的DNA聚合物。
因此，本发明的方法包括(i)核苷酸混合物的制备步骤，该混合物同时包含对dNTP的亲和力小于对ddNTP的亲和力3000倍，优选不超过1000倍，更优选不超过0.5倍的DNA聚合酶，和对dNTP的亲和力高于对ddNTP的亲和力3000倍，优选不小于5000倍，更优选不小于8000倍的DNA聚合酶；(ii)通过将模板DNA连同引物一起加入所述核苷酸混合物而生成互补DNA片段的步骤；和(iii)识别按照分子量顺序分离的所述互补DNA片段的末端碱基以测定模板DNA的核苷酸序列的步骤。
作为本发明的另一个目的，DNA测序试剂盒由四种气密性容器组成，该容器装有核苷酸混合物以及对dNTP的亲和力小于对ddNTP的亲和力3000倍，优选不超过1000倍，更优选不超过0.5倍的DNA聚合酶，和对dNTP的亲和力高于对ddNTP的亲和力3000倍，优选不小于5000倍，更优选不小于8000倍的DNA聚合酶。
更详细地，本发明的试剂盒包括(i)一气密性容器，装有ddATP、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、缓冲溶液、稳定剂、对dNTP的亲和力小于对ddNTP的亲和力3000倍，优选不超过1000倍，更优选不超过0.5倍的DNA聚合酶，和对dNTP的亲和力高于对ddNTP的亲和力3000倍，优选不小于5000倍，更优选不小于8000倍的DNA聚合酶；
(ii)一气密性容器，装有ddGTP、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、缓冲溶液、稳定剂、对dNTP的亲和力小于对ddNTP的亲和力3000倍，优选不超过1000倍，更优选不超过0.5倍的DNA聚合酶，和对dNTP的亲和力高于对ddNTP的亲和力3000倍，优选不小于5000倍，更优选不小于8000倍的DNA聚合酶；(iii)一气密性容器，装有ddCTP、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、缓冲溶液、稳定剂、对dNTP的亲和力小于对ddNTP的亲和力3000倍，优选不超过1000倍，更优选不超过0.5倍的DNA聚合酶，和对dNTP的亲和力高于对ddNTP的亲和力3000倍，优选不小于5000倍，更优选不小于8000倍的DNA聚合酶；和(vi)一气密性容器，装有ddTTP、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、缓冲溶液、稳定剂、对dNTP的亲和力小于对ddNTP的亲和力3000倍，优选不超过1000倍，更优选不超过0.5倍的DNA聚合酶，和对dNTP的亲和力高于对ddNTP的亲和力3000倍，优选不小于5000倍，更优选不小于8000倍的DNA聚合酶。
下面，参照下面的实施例更详细地描述本发明。这些实施例用于阐明本发明，并不意味着对本发明的限定。
同时，将对dNTP的亲和力是对ddNTP的亲和力的3000倍的TopTM聚合酶(由Bioneer公司制造)分别加入上述四(4)种核苷酸混合物中以制备用于生成互补DNA片段的混合物，其目的是用于与本发明的结果相比较。
1.5μg的pUC19质粒DNA作为模板DNA、M13 Universal Forward17聚体(5’-gtaaaacgacggccagt，30pmoles)作为引物和蒸馏水分别加入上述三(3)种混合物，每种制备40μg的用于生成互补DNA片段的反应混合物。之后，将互补DNA片段生成反应顺序地重复30个循环在94℃240秒，94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 60秒，最后再在72℃进行300秒处理，制成DNA片段混合物。向每一DNA片段混合物加入40μl终止(Stop)溶液(2.5％溴酚蓝，2.5％氰基二甲苯，10mMNaOH)，从而终止互补DNA片段的生成反应。将这样得到的DNA片段通过由8M尿素和6％丙烯酰胺制成的聚丙烯酰胺凝胶电泳，以其分子量顺序进行分离。每个DNA片段的末端碱基通过使用银-染色法(通过使用Bioneer公司制造的Silverstar染色试剂盒)识别。
将10X反应缓冲溶液(500mM Tris-HCl，20mM MgCl2)、5M的Betain稳定剂、5个单位的DNA聚合酶混合物(其由2.5个单位的Thermo测序酶和2.5个单位的Tfi突变DNA聚合酶组成)，和由3μM的dGTP、30μM的dATP、30μM的dTTP、30μM的dCTP和3.02μM的ddTTP组成的核苷酸混合物加入一气密性容器；和将10X反应缓冲溶液(500mM Tris-HCl，20mM MgCl2)、5M的Betain稳定剂、5个单位的DNA聚合酶混合物(其由2.5个单位的Thermo测序酶和2.5个单位的Tfi突变DNA聚合酶组成)，和由3μM的dGTP、30μM的dATP、30μM的dTTP、30μM的dCTP和1μM的ddCTP组成的核苷酸混合物加入一气密性容器，这样制成本发明的DNA测序试剂盒，其包含四种气密性容器。
向所述DNA核苷酸测序试剂盒的每个气密性容器中分别加入1.5μg作为模板DNA的pUC19质粒DNA、作为引物的M13 UniversalForward 17聚体(5’-gtaaaacgacggccagt，30pmoles)和蒸馏水，制成40μg的用于生成互补DNA片段的反应混合物。这样生成的DNA片段分别按其分子量顺序进行分离。然后，根据实施例1的方法分析DNA片段的末端碱基。
图1是利用常规DNA聚合酶(TopTMDNA聚合酶，5个单位)生成的DNA片段的电泳照片，其中所述DNA聚合酶对ddNTP的亲和力是常规的。
图2是利用DNA聚合酶(Tfi突变DNA聚合酶，5个单位)生成的DNA片段的电泳照片，其中所述DNA聚合酶对ddNTP的亲和力高于常规DNA聚合酶对ddNTP的亲和力。
图3是利用DNA聚合酶(Thermo测序酶，5个单位)生成的DNA片段的电泳照片，其中所述DNA聚合酶对ddNTP的亲和力低于常规DNA聚合酶对ddNTP的亲和力。
图4是利用由
图1到图3中的三种DNA聚合酶(分别为2个单位，2个单位，1个单位)组成的DNA聚合酶混合物生成的DNA片段的电泳照片，其中这些DNA聚合酶对ddNTP的亲和力彼此互不相同。
图5是利用由图2和图3中的两种DNA聚合酶(分别为2.5个单位，2.5个单位)组成的本发明的DNA聚合酶混合物生成的DNA片段的电泳照片，其中这些DNA聚合酶对ddNTP的亲和力不同。
工业实用性如上所述，利用本发明的方法或试剂盒可以比利用常规桑格法更准确和完整地分析10-1000bp的DNA的核苷酸序列。所以，有可能通过对核苷酸序列的一次分析而测定比桑格法可测定的更长的DNA序列。
权利要求
1.一种采用双脱氧核苷酸介导的链终止反应的DNA核苷酸序列分析方法，其特征在于，包括(i)核苷酸混合物的制备步骤，该混合物同时包含对dNTP的亲和力小于对ddNTP的亲和力3000倍的DNA聚合酶和对dNTP的亲和力高于对ddNTP的亲和力3000倍的DNA聚合酶；(ii)通过将模板DNA连同引物一起加入所述核苷酸混合物中生成DNA片段的步骤；和(iii)识别按照分子量顺序分离的所述DNA片段的末端碱基以测定模板DNA的核苷酸序列的步骤。
2.根据权利要求1的DNA核苷酸序列分析方法，其中核苷酸混合物同时包含对dNTP的亲和力不超过对ddNTP的亲和力1000倍的DNA聚合酶和对dNTP的亲和力不小于对ddNTP的亲和力5000倍的DNA聚合酶。
3.根据权利要求1的DNA核苷酸序列分析方法，其中核苷酸混合物同时包含对dNTP的亲和力不超过对ddNTP的亲和力0.5倍的DNA聚合酶和对dNTP的亲和力不小于对ddNTP的亲和力8000倍的DNA聚合酶。
4.根据权利要求1的DNA核苷酸序列分析方法，其中核苷酸混合物还包含对dNTP的亲和力是对ddNTP的亲和力3000倍的DNA聚合酶。
5.根据权利要求2的DNA核苷酸序列分析方法，其中核苷酸混合物还包含对dNTP的亲和力是对ddNTP的亲和力1000-5000倍的DNA聚合酶。
6.根据权利要求3的DNA核苷酸序列分析方法，其中核苷酸混合物还包含对dNTP的亲和力是对ddNTP的亲和力0.5-8000倍的DNA聚合酶。
7.根据权利要求1的DNA核苷酸序列分析方法，其中将DNA片段通过电泳按照其分子量顺序进行分离。
8.根据权利要求1的DNA核苷酸序列分析方法，其中每个DNA片段的末端碱基通过银染色法进行识别。
9.根据权利要求2的DNA核苷酸序列分析方法，其中将DNA片段通过电泳按照其分子量顺序进行分离。
10.根据权利要求2的DNA核苷酸序列分析方法，其中每个DNA片段的末端碱基通过银染色法进行识别。
11.根据权利要求3的DNA核苷酸序列分析方法，其中将DNA片段通过电泳按照其分子量顺序进行分离。
12.根据权利要求3的DNA核苷酸序列分析方法，其中每个DNA片段的末端碱基通过银染色法进行识别。
13.根据权利要求4的DNA核苷酸序列分析方法，其中将DNA片段通过电泳按照其分子量顺序进行分离。
14.根据权利要求4的DNA核苷酸序列分析方法，其中每个DNA片段的末端碱基通过银染色法进行识别。
15.根据权利要求5的DNA核苷酸序列分析方法，其中将DNA片段通过电泳按照其分子量顺序进行分离。
16.根据权利要求5的DNA核苷酸序列分析方法，其中每个DNA片段的末端碱基通过银染色法进行识别。
17.根据权利要求6的DNA核苷酸序列分析方法，其中将DNA片段通过电泳按照其分子量顺序分离。
18.根据权利要求6的DNA核苷酸序列分析方法，其中每个DNA片段的末端碱基通过银染色法进行识别。
19.一种DNA核苷酸测序试剂盒，包括一装有反应缓冲液、稳定剂、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、ddATP和DNA聚合酶的气密性容器，一装有反应缓冲液、稳定剂、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、ddGTP和DNA聚合酶的气密性容器，一装有反应缓冲液、稳定剂、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、ddCTP和DNA聚合酶的气密性容器，和一装有反应缓冲液、稳定剂、dATP、dGTP、dCTP、dTTP、ddTTP和DNA聚合酶的气密性容器；其特征在于，所述DNA聚合酶是对dNTP的亲和力小于对ddNTP的亲和力3000倍的DNA聚合酶和对dNTP的亲和力高于对ddNTP的亲和力3000倍的DNA聚合酶的混合物。
20.根据权利要求19的DNA核苷酸测序试剂盒，其中所述DNA聚合酶混合物由对dNTP的亲和力不超过对ddNTP的亲和力1000倍的DNA聚合酶和对dNTP的亲和力不小于对ddNTP的亲和力5000倍的DNA聚合酶组成。
21.根据权利要求19的DNA核苷酸测序试剂盒，其中所述DNA聚合酶混合物由对dNTP的亲和力不超过对ddNTP亲和力0.5倍的DNA聚合酶和对dNTP的亲和力不小于对ddNTP的亲和力8000倍的DNA聚合酶组成。
22.根据权利要求19的DNA核苷酸测序试剂盒，其中所述DNA聚合酶混合物还包含对dNTP的亲和力是对ddNTP的亲和力3000倍的DNA聚合酶。
23.根据权利要求20的DNA核苷酸测序试剂盒，其中所述DNA聚合酶混合物还包含对dNTP的亲和力是对ddNTP的亲和力1000-5000倍的DNA聚合酶。
24.根据权利要求21的DNA核苷酸测序试剂盒，其中所述DNA聚合酶混合物还包含对dNTP的亲和力是对ddNTP的亲和力0.5-8000倍的DNA聚合酶。
全文摘要
本发明涉及利用双脱氧核苷酸介导的链终止反应的DNA核苷酸序列分析方法和所用的试剂盒,更具体地,直接涉及利用多种对双脱氧核苷酸的亲和力相互不同的DNA聚合酶进行分析的DNA核苷酸序列分析方法。
文档编号C12Q1/68GK1336960SQ00802714
公开日2002年2月20日 申请日期2000年11月25日 优先权日1999年11月26日
发明者朴韩浯, 俞在亨 申请人:株式会社百尼尔