专利名称：宿主细胞中重组多肽的区室化的制作方法
技术领域：
本发明涉及在各种情况下在不同的细胞区室中优选地包含至少两种功能性重组多肽并且其中至少一种与支持体结合的宿主细胞，所述不同的细胞区室是例如细胞溶胶，细胞质膜，周质和外膜，还涉及制备所述宿主细胞的方法。本发明的细胞特别适合作为进行其中各种酶的区室作用是有利的或必需的酶促反应级联的生物反应器。
将活细胞用作制备生物物质例如多羟基脂肪酸的“酶反应器”对于生物技术工业是极其重要的。迄今为止，为了以此种方法获得携带能合成期望的产物的重组酶的宿主细胞，通常将外源基因引入宿主细胞并且表达所述基因。但是，已知方法的一个缺点是通过表达外源基因在宿主细胞中产生的酶不稳定、活性太低或者存在的量太小。当进行多阶段反应时特别困难，其中一个阶段的底物或产物对其它阶段可能有不利的影响。
本发明的一个目的是至少部分减少现有技术的问题，并且提供能提供稳定形式的功能性重组多肽、尤其是能进行多阶段酶反应的宿主细胞。
该目的是通过提供一种宿主细胞来实现的，该宿主细胞包含至少两种功能性重组多肽，其中至少一种与支持体结合。
出人意料的是，发现异源多肽在例如革兰氏阴性细菌细胞或者真核生物细胞这些细胞的不同区室中进行支持体结合的重组表达将导致功能形式(例如免疫活性和/或生物学活性，例如酶促活性)异源多肽的稳定呈递。如果宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞，则细胞区室可以优选选自细胞溶胶，细胞质膜(外和内)，周质间隙和外膜(外和内)。如果宿主细胞是真核生物细胞，则所述区室可以优选选自细胞溶胶，细胞质膜(外和内)和细胞器，例如高尔基体，溶酶体，线粒体，叶绿体，液泡或内质网。
在宿主细胞中出现的功能性重组蛋白质优选是协同的，即它们完成共同的免疫和/或生物功能，例如作为多阶段反应级联中的酶。
至少一种，优选多种功能性重组多肽与支持体结合，例如为融合多肽的形式，并且包含至少一个功能结构域和至少一个支持体结构域。支持体结合的多肽的优选形式是S-层结构(具有S-层支持体结构域的融合多肽)，膜结合的多肽(具有膜整合的支持体结构域的融合多肽)或/和重组噬菌体结构成分。如果希望将功能多肽从细胞溶胶输出到其它细胞区室，则所述多肽和合适的导向结构域一起被表达，所述导向结构域有利于输出给各种情况下期望的细胞区室。导向结构域的例子是有利于通过膜的信号肽或/和辅助序列。
在本发明的一个优选的实施方案中，支持体结合的多肽中至少一个以重组S-层结构存在。S-层是结晶细菌细胞表面蛋白，其由相同的自身组装单元组成。例如在Peyret等(分子微生物学9(1993)，97-109)中可以获得来自微生物的各种S-层基因的遗传学数据和序列信息。这些信息引作参考。
优选的S-层基因是嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)PV72基因sbsA和sbsB。例如在国际专利申请PCT/EP97/00432中可以发现这些基因的序列，该专利申请还公开了在革兰氏阴性宿主细胞的细胞质中产生重组S-层融合蛋白。接着国际专利申请PCT/EP98/04723描述了在革兰氏阴性细菌细胞或真核生物细胞的各种区室中产生重组S-蛋白质。关于重组S-层基因的构建和合适的表达构建体的产生，可以参照这两个国际专利申请。但是，其中并未指出要进行两种不同的功能性重组多肽的共表达。
出人意料地发现，例如在宿主细胞特别是革兰氏阴性细菌细胞和真核生物细胞的各种区室中，在适合时可以与其它异源蛋白质一起同时或/和顺序共表达多种重组S-层蛋白质。
SEQ ID No.1的91-3684位显示编码成熟SbsA蛋白质的基因的核苷酸序列。SEQID No.2中给出了相应的氨基酸序列。SEQ ID No.3的94-2763位显示编码成熟SbsB蛋白质的基因的核苷酸序列。SEQ ID No.4中给出了相应的氨基酸序列。
在第一个优选的实施方案中(sbsA)，编码功能肽的支持体结构域的核酸选自(i)包括SEQ ID No.1中所示的91-3684位核苷酸序列的核酸，(ii)包括遗传密码子简并性的构架中相应于(i)的核酸的核苷酸序列的核酸，和(iii)包括在严格条件下与(i)或/和(ii)的核酸杂交的核苷酸序列的核酸。
在第二个优选的实施方案中(sbsB)，编码功能肽的支持体结构域的核酸选自
(i)包括SEQ ID No.3中所示的94-2763位的核苷酸序列的核酸，(ii)包括遗传密码子简并性的构架中相应于(i)中的核酸的核苷酸序列的核酸，和(iii)包括在严格条件下与(i)中或/和(ii)中的核酸杂交的核苷酸序列的核酸。
根据本发明的“严格杂交”指即使在55℃，优选60℃在低盐缓冲水溶液(例如0.2xSSC)中洗涤后仍然发生杂交(也参见Sambrook等(1989)，分子克隆，实验手册)。
将肽或多肽编码序列插入到sbsA基因中的优选的位点是SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的200-3600位之间的区。特别优选的插入位点是585位的NruI裂解位点，881位的PvuII裂解位点，920位的SnaBI裂解位点，2507位的PvuII裂解位点和2652位的PvuII裂解位点(PCT/EP97/00432)。进一步优选的插入位点是562，1087，1813，1947，2295，2652，3046，3484和3594位。在上面的各种情况下指出的位置指插入的第一个核苷酸的位置。
插入到sbsB基因中的优选位点是SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的200-2600位之间的区。特别优选的插入位点是410位(密码子136)，484位(密码子161/162)和1583位(密码子528/529)(PCT/EP97/00432)。进一步优选的插入位点是598，1012，1435，1808和2301位。各种情况下指出的位置指插入的第一个核苷酸。
可替代地或者另外地也可以产生不同形式的支持体-结合的多肽，例如作为重组噬菌体结构，例如ΦX174或ΦCH1的成分。
产生支持体-结合的多肽的另一种可能是作为与膜整合结构域的融合多肽进行合成，使得功能多肽定位于各种情况下期望的位置(各种情况下选择的膜的外侧或内侧)。
用于整合到原核生物革兰氏阴性宿主细胞的外膜中的支持体序列可以是来自奈瑟氏球菌属或嗜血杆菌属的IgA蛋白酶的C-末端结构域(Klauser等，分子生物学杂志(J.Mol.Bio.)234(1993)，579-593)。其它合适的支持体结构域序列是OmpA或LamB序列或者它们的部分(…)。
为了整合到革兰氏阴性原核生物宿主细胞的细胞质膜中，优选使用的是具有α-螺旋结构的疏水性非裂解性膜-整合蛋白质结构域。编码这种膜整合蛋白质结构域的DNA序列的例子描述于欧洲专利0516655中。
为了分泌到革兰氏阴性原核生物细胞的周质中，有可能使用例如malE信号肽序列。引起分泌到周质中的其它序列例如描述于Blondel和Bedouelle(欧洲生物化学杂志193(1990)，325-330；Adip-Conquy等(蛋白质工程8(1995)，859-863)；Weller等欧洲生物化学杂志236(1996)，34-39和Dubreuil等(FEMSImmunol.Med.Microbiol.)13(1996)，317-323。
已知用于在真核细胞的细胞质膜或细胞器中表达的信号肽是用于转运到叶绿体中的质体蓝素的N-末端转运肽(Weisbeek等，细胞科学杂志(J.Cell.Sci)增刊11(1989)，199-223)，用于转运到线粒体中的线粒体信号肽(Skerjanc，生物化学细胞生物学68(1990)，9-16)，用于转运到液泡中的引导肽(Vitale和Chrispeels，生物测定(Bioessays)14(1992)，151-160)，用于细胞膜，胞质和高尔基体器的引导肽(Stanley，Mol.分子膜生物学.13(1996)，19-27)，用于内质网的保留信号(Lencer等，细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)131(1995)，951-962)和用于高尔基器或质膜的转移序列(Rambourg等，Anat.Rec，245(1996)，447-458).
编码外源多肽的DNA序列除了编码信号肽的区段之外，还可以包含一个或多个编码另外的蛋白质结构域的区段。这样的区段优选地可以位于编码信号肽的区段和编码外源多肽的区段之间。该区段优选编码来自革兰氏阴性细菌或真核生物有机体的分泌多肽或者其部分。这样的核酸区段的一个优选的例子是编码麦芽糖结合蛋白的malE基因。
所述外源多肽优选选自DNA-结合表位，抗原性，变应原性或免疫原性表位，金属-结合表位，链霉抗生物素，酶，细胞因子或抗体-结合蛋白。
优选的例子是链霉抗生物素，其对于停靠生物素化试剂是合适的，例如在整合到外膜中之后。另一个优选的实施例是抗原性，变应原性或免疫原性表位，例如来自病原体微生物例如细菌，真菌，寄生虫等和病毒的表位，或者来自植物的表位或者抗内源物质例如细胞因子还有抗毒素特别是内毒素的表位。免疫原性表位特别优选的实施例是来自病毒的表位，例如来自疱疹病毒，例如疱疹病毒1，例如Δ糖蛋白，疱疹病毒6或者假狂犬病病毒(Lomniczi等，病毒学杂志(J.Virol.)49(1984)，970-979)，特别是来自gB，gC或/和gD基因的表位，来自足口病病毒(FMDV)的表位，特别是来自编码VP1，VP2或/和VP3的基因区段的表位，来自黄病毒的表位或者来自线状病毒例如Ebola病毒，马尔堡病毒或拉沙病毒的表位。可以选择免疫原性表位使得它们促进抗体介导的免疫反应的发生或/和促进细胞免疫反应的发生，例如通过刺激T细胞。合适的变应原性表位的例子是桦花粉变应原，例如Bet v I(Ebner等，免疫杂志(J.Jmmunol.)150(1993)1047-1054)。此外，特别优选的是能结合并且过滤出内源或外源物质例如来自血清或者其它体液的细胞因子或毒素的抗原表位。该类型的表位可以包括细胞因子或毒素受体的成分或者抗细胞因子或毒素的抗体的成分。
修饰的外源多肽，例如S-层蛋白质；其具有携带糖基化位点的免疫原性或/和抗原性表位，该蛋白质优选在其中糖基化作用是可能的之真核宿主细胞中产生。因此也有可能将天然的S-层序列糖基化。S-层基因sbsA中潜在的N-糖基化位点的例子是26，285，343，384，387，388，418，421，483，653，675，902，924，1048，1058，1118，1154和1161位氨基酸的位置。在155，184，213，302，303，400，463，606，755和915位可能发生sbsB基因中的潜在的N-糖基化作用。sbsA基因中其它可能的修饰作用包括酰胺化作用，酪蛋白激酶II的磷酸化作用，N-豆蔻酰化作用和蛋白质激酶C的磷酸化作用。sbsB基因中其它可能的修饰包括cAMP和cGMP依赖性蛋白质激酶的磷酸化，酪蛋白激酶II的磷酸化，N-豆蔻酰化，蛋白质激酶C的磷酸化和与附着于纤连蛋白受体(通过序列RGD)。
同样优选的外源多肽是细胞因子，例如白细胞介素，干扰素或肿瘤坏死因子。这些分子可以例如与免疫原性表位结合使用，用于生产疫苗。另外，抗体结合蛋白，例如蛋白质A或蛋白质G，或者DNA-或/和金属结合表位，例如亮氨酸拉链，锌指等也是优选的。
重组多肽特别优选是酶，特别是催化多阶段酶促反应的酶。具体例子是用于合成多羟基链烷酸酯的酶，例如多羟基丁酸合酶(Lubitz和Resch，DE4417169A1；Slater，S.C.，Voige W.H.，Dennis，A.E.细菌学杂志(J.Bacteriol.)(1998)，1704431)。
本发明还进一步涉及可从本发明的革兰氏阴性宿主细胞获得的重组细菌菌蜕，其具有至少两种与支持体结合的功能性重组多肽。
在例如国际专利申请PCT/EP91/00967中描述了合适的“细菌菌蜕”的制备，该专利文献在此引作参考。所述专利申请公开了通过用来自噬菌体的裂解性膜蛋白的基因，裂解释放性蛋白质的基因或者包含编码裂解性蛋白质的其部分序列的基因转化革兰氏阴性细菌，培养该细菌，表达该裂解基因，并且从培养基中分离得到的细菌菌蜕。
如欧洲专利0516655所述，这些细菌的膜可能已经结合了在这些革兰氏阴性细菌中表达重细DNA获得的重组蛋白质。该重组DNA包括第一个DNA序列，其编码具有α-螺旋结构并且由14-20个氨基酸组成的疏水性非裂解性膜整合蛋白质结构域，所述蛋白质结构域N-和C-末端侧翼可以各自连接2-30个任何类型的氨基酸。该第一个DNA序列与编码期望的重组蛋白质的第二个DNA序列可操作连接。此外，所述革兰氏阴性细菌包含第三个DNA序列，其分别受第一个和第二个DNA序列的控制并且编码来自噬菌体的裂解性膜蛋白质或者裂解性毒素释放蛋白质或者其裂解部分。该类型重组革兰氏阴性细菌的表达和溶菌作用产生所谓“细菌菌蜕”，其包含具有与表面结合的免疫原性表位的完整表面结构。
优选通过下面一种方法进行本发明的宿主细胞的制备，其中(a)提供用编码重组多肽的至少两种核酸转化的宿主细胞，为了有利于以支持体结合形式表达重组多肽，其中至少一种核酸与编码支持体结构域的序列连接，(b)在导致核酸的表达和由其编码的功能形式多肽的产生的条件下培养该宿主细胞。
此外，优选地编码重组多肽的核酸与在各种情况下将重组多肽定位在宿主细胞的不同区室中的序列可操作连接。
当作为修饰的S-层以支持体结合形式表达重组蛋白时，另外有可能在细胞中表达编码未修饰的S-层蛋白质的基因。在这种情况下，修饰的S-层蛋白质可能形成与未修饰的S-层蛋白质相容的S-层结构。本发明该方法的一个实施例是用四个S-层基因转化的大肠杆菌细胞，其中四个基因中的两个是天然sbsA或sbsB基因，另外两个是重组sbsA或sbsB基因。
编码重组多肽的核酸优选位于包含该核酸的至少一个拷贝的重组载体上。使用的载体可以是常规的原核生物或真核生物染色体或染色体外载体。这样的载体的例子描述于前面的Samhrook等的文献中。这些载体含有编码重组多肽的核酸，该核酸与在特定宿主细胞中有活性的表达调控序列可操作连接。所述表达调控序列特别优选包括一个可调控启动子。合适的原核生物启动子的例子是tac，lac，trp和λ启动子。合适的真核生物启动子的例子是SV40，CMV和金属硫蛋白启动子。编码异源多肽的至少两种核酸特别优选通过使用两个不同的可调控启动子来表达，例如已经描述过的两个不同的温度敏感λ启动子。
重组宿主细胞(活宿主细胞或菌蜕)适合多种应用。作为疫苗或佐剂的应用是优选的，并且在这种情况下，使用的重组多肽具有病原体和/或内源免疫刺激多肽例如细胞因子的免疫原性表位。
使用本发明的宿主细胞或/和细菌菌蜕作为酶反应器是特别优选。
通过下面的实施例和附图进一步详细说明本发明，其中SEQ ID NO.1给出了嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)S-层基因sbsA的编码区段的完整核苷酸序列；SEQ ID NO.2给出了由此衍生的氨基酸序列；SEQ ID NO.3给出了嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)S-层基因sbsB的编码区段的完整核苷酸序列；SEQ ID NO.4给出了由此衍生的氨基酸序列。
图1给出了将异源多肽于革兰氏阴性细菌细胞的不同区室中的可能性的示意图。
(a)革兰氏阴性细菌细胞由胞质(cy)，内膜(im，周质(pp)和外膜(cm)组成。
(b)异源多肽可以通过与合适的引导肽(pe)连接而输出给周质。
(c)异源多肽可以在内膜(mae)内侧上固着。
(d)在周质中，异源多肽可以以重组S-层形式(sie)被固定。
(e)在周质中，不只是一种而是多种重组异源多肽可以被固定成S层形式。
图2是不同区室中，包含不同异源多肽(例如酶)的本发明的重组细菌细胞的示意图。
实施例1.细菌菌株，培养基和质粒在58℃下在SVIII培养基(Bacillus stearothermophilus)PV72革兰氏阴性细菌菌株(Bartelmus和Perschak，Z.Zucherind.7(1957)，276-281)中培养嗜热脂肪芽孢杆菌。在LB培养基(Sambrook等，(1989)，上文)中培养大肠杆菌。为了筛选转化体，以100微克/毫升的终浓度向培养基加入氨苄青霉素。将质粒pPlcAT10(λpL，bla，colE1)(Stanssens等，基因36(1985)，211-223)用作克隆载体。
2.DNA片段的操作根据上文Sambrook等(1989)中所述标准方法进行DNA限制性酶切分析，琼脂糖凝胶电泳和DNA片段的克隆。
根据生产商的说明书，使用Bio-Rad Gene Pulser(Bio-Rad实验室Richmond，加里弗尼亚，美国)通过电穿孔来转化感受态细胞。
根据Birnboim和Doly的方法(核酸研究(Nucleic AcidsRes.)7(1979)，1513-1523)分离质粒DNA。根据Ausubel等描述的方法(分子生物学通用方法(Current Protocols in Molecular Biology)(1987)，纽约，John Wiley)分离染色体DNA。
从Boehringer Mannheim，New England Biolabs或Stratagene获得限制性内切酶和其它的酶，并且根据生产商的说明来使用。
3.DNA测序根据Sanger等的双脱氧链中止方法进行DNA分子的测序分析。在已经公开的sbsA序列的基础上构建用于对sbsA基因测序的引物(Kuen等，Gene145(1994)，115-120)。
4.sbsA的PCR扩增根据PCR/EP98/04723的实施例4进行sbsA基因的PCR扩增。
将PCR-扩增的产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分级，并且使用Gene Clean系统(BI0101 La Jolla，加里弗尼亚，美国)纯化用于克隆。
5.sbsA基因的克隆5.1细胞质表达载体将通过PCR获得的长度3.79kb的sbsA基因纯化，并且用限制性内切酶XbaI和BamHI酶切。将得到的XbaI-BamHI片段克隆到载体pPLcAT10的相应的限制性酶切位点中，使得sbsA基因处于位于上游的pL启动子的转录调控之下。通过克隆程序再构建sbsA列的ATG起始密码子。克隆的sbsA序列包含N-末端sbsA信号序列，在转录终止子之后20个核苷酸处结束。得到的载体命名为pBK4。
5.2周质表达载体将没有信号序列并且在3’末端有一个终止密码子的sbsA基因克隆到可商购的质粒pMAL-P2(New England Biolabs)的多接头中。得到的pMAL-A质粒包含tac启动子调控的融合基因，该基因包括含有其信号序列的malE基因，还有没有其信号序列的sbsA基因。Xa因子酶切位点位于两个结构域之间。
6.大肠杆菌的胞质和周质中sbsA基因的重组共表达在28℃下培养用pBK4和pMAL-A共转化的大肠杆菌K12细胞，直到达到0.3OD600的光密度。然后通过将培养温度从28℃增到42℃来诱导sbsA的胞质表达。通过加入1mM的lac诱导物IPTG来诱导sbsA的周质表达.在sbsA表达的诱导之前和之后1，2，3和5小时取出1.5毫升等份。将大肠杆菌pop2135/pPLcAT10(在相同条件下培养)和嗜热脂肪芽孢杆菌PV72用作对照。
通过SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹对来自所有样品的培养上清液和细胞抽提物研究S-层蛋白质的表达。
对于蛋白质印迹，将蛋白质转移到硝基纤维素膜上并且与来自兔的多克隆抗SbsA抗血清一起孵育。Egelseer等人在细菌学杂志(177(1995)，1444-1451)中描述了该抗血清的制备。使用山羊抗兔IgG和碱性磷酸酶的结合物检测结合SbsA的特异性抗体。
在共转化的大肠杆菌细胞的胞质抽提物中发现了另外一条强的蛋白质泳带，其具有与野生型sbsA蛋白质相同的分子量。
对用pMAL-转化的大肠杆菌DH5α细胞(Hanahan(1983)上文)的粗抽提物的分析表明，在细胞抽提物的周质级分中表达了具有大约170kDa分子量的MalE-SbsA融合多肽，所述周质级分通过冷渗透震扰方法(Neu和Heppel，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)240(1965)；3685-3692)产生。
7.在胞质和周质中SbsB蛋白质的共表达如实施例5和6所述，将sbsB基因克隆到质粒pMAL-P2和pPLcAT10中，产生质粒pMAL-B和pBK6。
在用质粒pMAL-B和pBK6转化的大肠杆菌细胞的胞质和周质中能检测到sbsB蛋白质的存在。
8.大肠杆菌的胞质膜中固定的PHB合成酶多羟基链烷酸酯(PHA)是细菌贮存物质，它是当磷，硫或氧不足但是碳源充分存在时在天然生产者中形成的。它们由羟基脂肪酸的酯化单体组成，并且形成水不溶性聚合物，这些聚合物根据羟基的位置和侧链的长度加以区分。最主要的PHA是多(R)-3-羟基丁酸酯(P(3-HB))，一种没有支化的(R)-3-羟基丁酸P(3-HB)均聚物。
在革兰氏阴性兼性化能无机营养氧氢菌Ralstonia eutropha中，负责PHB合成的基因phbA，phbB和phbC组织在一个操纵子(phbCAB)中(Schubert等，细菌学杂志(1998)，1705837)。已经公开过所述基因的开放读框的核苷酸序列和翻译区的核苷酸序列(Steinbuchel，A.多羟基链烷酸，于生物材料(1991)，123-213)。
在PHB合成酶的结构/功能关系的研究中，制备了各种插入突变体和缺失突变体还有融合蛋白，并且测定了酶活性的变化(Kalousek，S.PhD thesis，维也纳大学(1993))。从这项工作开始，产生了质粒pPHB-L，它具有编码融合蛋白的基因，其中所述融合蛋白由P(3-HB)合酶(590个氨基酸中的588个)和来自噬菌体MS2的裂解蛋白质的C-末端序列的膜固着点组成。当表达pPHB-L时，在固体培养基+1％葡萄糖上生长的细胞蓄积高达60％(w/w)P(3-HB)颗粒因此，膜固着PHB合酶在酶学方面是完全有功能的。
9.来自质粒的(2，5-二酮-D-葡糖酸)还原酶在细菌中的重组表达；以及其在细菌S-层的固定化重组质粒在细菌菌株中的表达应该可以使得所述菌株在一个步骤(一步发酵)中从D-葡萄糖直接产生2-KLG。为了该目的，将还原为2-KLG需要的酶(来自棒状杆菌ATTC31090的2，5-DKG还原酶)克隆到产生2，5-二酮-D-葡糖酸(2，5-DKG)的菌株中。
使用编码表面层基因(sbsA)的载体pSL提高了2，5-DKG还原酶的稳定性。与此相关，S-层蛋白(sbsA)作为2，5-DKG还原酶的基质。通过在sbsA基因中4个不同的位点插入2，5-DKG还原酶，发现了具有形成自身组装产物能力的重组蛋白。
为此，制备了sbsA-2，5DKG还原酶融合基因，其在sbsA基因的4个不同的位点(581，881，916和2649位)携带2，5DKG基因。大肠杆菌pop2135作为宿主细胞。通过插入的基因和相邻区的序列分析检查了正确克隆。也可以通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析来证明融合蛋白的稳定表达。在大肠杆菌中成功表达之后，将质粒转化到Pectobacterium cypripedii HaPO1中。
同样可以利用SDS-PAGE和蛋白质印迹来检测P.cypripedii HaPO1中SbsA-2，5DKG还原酶融合蛋白的稳定表达。
10. 与S-层固定的其它酶为了以这种方式分别产生光和荧光，也可将萤光素酶(luxA和luxB基因)和绿荧光蛋白(gfp)与sbsA基因融合。
权利要求
1.至少包含两种功能性重组多肽并且其中至少一种与支持体结合的宿主细胞。
2.根据权利要求1的细胞，特征在于，所述多肽各自位于其不同的区室。
3.根据权利要求1或2的细胞，特征在于，所述细胞是革兰氏阴性细菌细胞。
4.根据权利要求2或3的细胞，特征在于，所述区室选自细胞溶胶，细胞质膜的外侧和内侧，周质间隙和外膜外侧和内侧。
5.根据权利要求1或2的细胞，特征在于，所述细胞是真核生物细胞。
6.根据权利要求2或5的细胞，特征在于，所述区室选自细胞溶胶，细胞质膜的外侧和内侧和细胞器。
7.根据权利要求1-6之任一项的细胞，特征在于，多种重组多肽与支持体结合。
8.根据权利要求1-7之任一项的细胞，特征在于，结合支持体的多肽以具有支持体结构域的融合多肽的形式存在。
9.根据权利要求1-8之任一项的细胞，特征在于，结合支持体的多肽以S-层结构，结合膜的多肽或/和作为重组噬菌体结构的成分的形式存在。
10.根据权利要求1-9之任一项的宿主细胞，特征在于，重组多肽选自酶，细胞因子，抗体结合蛋白，DNA结合表位，抗原性、变应原性和免疫原性表位和链霉抗生物素。
11.根据权利要求1-10之任一项的细胞，特征在于，重组多肽是酶。
12.根据权利要求11的宿主细胞，特征在于，所述酶催化一个多阶段酶促反应。
13.根据权利要求11或12的宿主细胞，特征在于，所述酶催化多羟基链烷酸酯的合成。
14.从根据权利要求1-13之任一项的革兰氏阴性细胞获得的重组细菌菌蜕，其具有至少两种与支持体结合的功能性重组多肽。
15.根据前面权利要求之任一项的宿主细胞的制备方法，特征在于(a)该方法提供用编码重组多肽的至少两种核酸转化的宿主细胞，其中至少一种核酸与编码支持体结构域的序列连接，以促进以支持体结合形式表达重组多肽，(b)在导致核酸表达和功能形式的其编码多肽产生的条件下培养该宿主细胞。
16.根据权利要求1-13之任一项的细胞或者根据权利要求14的菌蜕作为疫苗或佐剂的用途。
17.根据权利要求1-13之任一项的宿主细胞或者根据权利要求14的菌蜕作为酶反应器的用途。
全文摘要
本发明涉及优选地在各种情况下在不同的细胞区室中包含至少两种功能性重组多肽并且其中至少一种与支持体结合的宿主细胞,所述不同的细胞区室是例如细胞溶胶,细胞质膜,周质和外膜,还涉及制备所述宿主细胞的方法。本发明的细胞特别适合作为进行各种酶的区室化比较有利或必需的酶促反应级联的生物反应器。
文档编号C12N1/15GK1345370SQ00802985
公开日2002年4月17日 申请日期2000年1月28日 优先权日1999年1月28日
发明者沃纳·卢比茨 申请人:沃纳·卢比茨