人β分泌酶、抑制剂、其组合物和用途的制作方法

专利名称：人β分泌酶、抑制剂、其组合物和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及β分泌酶(β-secretase)的多种活性形式的发现，β分泌酶是一种在产生β淀粉状蛋白多肽(Aβ)所必需的两个切割位点之一上切割β淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的酶。本发明还涉及该酶的抑制剂，这些抑制剂被认为是治疗淀粉状蛋白产生性疾病(amyloidogenicdisease)如早老性痴呆的候选治疗剂。本发明的其他方面包括用于发现这类治疗性抑制剂的筛选方法、测定法和试剂盒，以及用于确定个体是否携带该酶的突变形式的诊断方法。
背景技术：
早老性痴呆的特征在于，在脑中，特别是在参与记忆和认知的脑部区域中，存在众多淀粉样蛋白斑和神经原纤维缠结(neurofrillatorytangle)。β淀粉状蛋白多肽(Aβ)是一具有39-43个氨基酸的肽，它是淀粉样蛋白斑的主要成分，通过在一种大蛋白即β淀粉状蛋白前体蛋白(APP)的N末端区域中的特定位点上切割该蛋白而产生。对APP的正常加工涉及在β-AP区域距N末端16-17位氨基酸的C端切割该蛋白、释放所分泌的一胞外结构域——α-sAPP，由此阻止β-AP的产生。通过由β分泌酶在Met671和Asp672之间切割APP及随后在APP的C末端加工，产生Aβ肽，该肽在阿耳茨海默氏病的病因学中占有重要的位置(Seubert等，早老性痴呆的药理学治疗(PharmacologicalTreatment of Alzheimer’s disease)，Wiley-liss，Inc.，345-366页，1997；Zhao，J.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)27131407-31411，1996)。
并不清楚β分泌酶在早老性痴呆患者中的水平和/或活性是否自然高于正常情况；但清楚的是，其切割产物Aβ肽在这些患者脑中存在的淀粉样蛋白斑中却异常地浓集。因此，为了有助于回答这一问题和其他关于该疾病病因学的问题，可取的是将致病性地切割APP的酶分离、纯化和表征。特别是，将经分离的酶或其活性片段用于根据抑制β分泌酶活性的能力筛选候选化合物的方法，也是人们所希望的。期望对β分泌酶活性有抑制作用的药物可用作治疗早老性痴呆和其他以含原纤维Aβ肽的沉积为特征的淀粉状蛋白产生性疾病的有效治疗剂。
美国专利5744346(Chrysler等)描述以大小(当通过凝胶排阻层析测量时，表观分子量在260-300kD的范围内)和酶活性(能在第596和597位氨基酸之间切割具有695个氨基酸的β淀粉状蛋白前体蛋白同种型)为特征的β分泌酶的初始分离和部分纯化。在β分泌酶的纯度方面，通过提供比在先公开的β分泌酶纯至少200倍的纯化的β分泌酶，本发明提供了显著的进步。这一纯化的蛋白有多种用途，包括结晶用于结构测定。本发明还提供用于产生其大小和酶分布情形与天然存在的形式相同的β分泌酶重组形式的方法。本发明进一步发现，人β分泌酶是所谓的“天冬氨酰基”(或“天冬氨酸”)蛋白酶。
发明概述本发明涉及目前已经得到纯化具有表观同质性的一β分泌酶蛋白，特别涉及一纯化的蛋白，其特征在于，在典型β分泌酶测定法——MBP-C125sw底物测定中表现出至少约0.2×105nM/h/μg蛋白、优选至少1.0×105nM/h/μg蛋白的比活性。所得的酶的特征性活性在于它能在第596和597位氨基酸之间切割具有695个氨基酸的β淀粉状蛋白前体蛋白(β-APP)同种型，与来自人293细胞(如早已表征过的那些人293细胞)的溶液化的但未富集的膜级分所表现出的活性相比，该酶的比活性高至少10000倍，优选至少20000倍，更优选多于200000倍。
在一实施方式中，纯化的酶在长度上少于450个氨基酸，包括具有氨基酸序列SEQ ID NO70[63-452]的多肽。在优选的实施方式中，纯化的蛋白以相对于如SEQ ID NO2[1-501]所示的本文称之为酶原的各种“截短的形式”存在，例如具有氨基酸序列SEQ ID NO70[63-452]、SEQ ID NO69[63-501]、SEQ ID NO67[58-501]、SEQ IDNO68[58-452]、SEQ ID NO58[46-452]、SEQ ID NO74[22-452]、SEQ ID NO58[46-452]。更一般的是，已发现，该酶特别有用的形式的特征在于，N末端在SEQ ID NO2的第46位上且C末端在SEQID NO2的第452位和第470位之间，更特别是，N末端在SEQ ID NO2的第22位上且C末端在SEQ ID NO2的第452位和第470位之间，特别是用于本文所述的结晶学研究时。这些形式被认为在跨膜“锚”域中被切割。其他特别有用的该酶的纯化形式包括SEQ ID NO43[46-501]、SEQ ID NO66[22-501]和SEQ ID NO2[1-501]。更一般的是，现在认识到的是该酶的有用形式的N末端残基对应于选自SEQID NO2的22、46、58和63位残基中的一个残基，其C末端选自位于SEQ ID NO2的452-501位之间或者位于SEQ ID NO2的452-470位之间的一个残基。本文还描述了自小鼠分离的酶的形式，如SEQ IDNO65所示。
本发明进一步涉及从纯化的β分泌酶蛋白形成的结晶蛋白组合物，例如上述多种蛋白组合物。根据一实施方式，纯化的蛋白的特征在于与β分泌酶抑制剂底物P10-P4’staD→V结合的能力，其至少等于具有氨基酸序列SEQ ID NO70[46-419]的蛋白当在同样条件下测试与所述底物的结合时所显示出的能力。根据另一实施方式，形成结晶组合物的纯化的蛋白的特征在于与β分泌酶抑制剂底物SEQ ID NO72(P10-P4’staV→V)的结合亲合性，该亲合性至少是具有氨基酸序列SEQ ID NO43[46-501]的蛋白当在同样条件下测试与所述底物的结合时所显示出的亲合性的1/100。形成结晶组合物的蛋白可以是糖基化的或脱糖基化的。
本发明还包括含有β分泌酶底物或抑制剂分子的结晶蛋白组合物，所述抑制剂的例子在本文中提供，具体的例子为由肽衍生的抑制剂，例如SEQ ID NO78、SEQ ID NO72、SEQ ID NO81及其衍生物。一般用于这方面的抑制剂具有不大于约50μM-0.5mM的Ki。
本发明的另一方面涉及一个经分离的蛋白，包括一多肽，其(i)长度少于约450个氨基酸残基，(ii)包括一个与SEQ ID NO75[63-423](包括其保守替换物)至少90％相同的氨基酸序列，和(iii)表现出β分泌酶活性，该活性由其切割底物的能力所证明，所述底物选自在596-597位氨基酸之间被切割的具有695个氨基酸的β淀粉状蛋白前体蛋白(βAPP)同种型、MBP-C125wt和MBP-C125sw。满足这些标准的肽包括(但不限于)包括序列SEQ ID NO75[63-423]的多肽，例如SEQ ID NO58[46-452]、SEQ ID NO58[46-452]、SEQ ID NO58[46-452]、SEQ ID NO74[22-452]，也可包括这些序列的保守替换物。
根据另一实施方式，本发明包括经分离的蛋白组合物，如上述的那些，其与β分泌酶底物或抑制剂分子结合，例如MBP-C125wt、MBP-C125sw、APP、APPsw和其可被β分泌酶切割的片段。在本发明的说明书中具体描述了用于这方面的附加的可被β分泌酶切割的片段。特别有用的抑制剂包括衍生自或包括SEQ ID NO78、SEQ ID NO81和SEQ ID NO72的肽。通常，这些抑制剂具有小于约1μM的Ki。这些抑制剂可被标记上一可测的报告分子。这样的标记分子是特别有用的，例如，用于配体结合测定中。
根据另一个方面，本发明包括蛋白组合物，例如上述的那些，其由异种细胞所表达。根据另一实施方式，这类细胞可共表达β分泌酶底物或抑制剂蛋白或肽。这两种被表达的分子之一或二者均可以与所述细胞来自不同的种。
在一有关的实施方式中，本发明包括与包括一多肽的β分泌酶蛋白特异性结合的抗体，所述多肽包括一个与SEQ ID NO75[63-423](包括其保守替换物)至少90％相同的氨基酸序列，但该氨基酸序列缺乏与具有选自SEQ ID NO2[1-501]和SEQ ID NO43[46-501]的序列的蛋白的显著免疫反应性。
在另一有关的实施方式中，本发明包括经分离的核酸，其包括编码β分泌酶蛋白的核苷酸序列或其互补序列，所述β分泌酶蛋白与选自SEQ ID NO66[22-501]、SEQ ID NO43[46-501]、SEQ ID NO57[1-419]、SEQ ID NO74[22-452]、SEQ ID NO58[46-452]、SEQ IDNO59[1-452]、SEQ ID NO60[1-420]、SEQ ID NO67[58-501]、SEQ ID NO68[58-452]、SEQ ID NO69[63-501]、SEQ ID NO70[63-452]、SEQ ID NO75[63-423]和SEQ ID NO71[46-419]的蛋白至少95％相同。明确被排除在该核苷酸之外的是编码具有序列SEQ IDNO2[1-501]的蛋白的核酸。
本发明还包括含有经分离的核酸的表达载体，所述核酸可操作地与具有调控序列的核酸连接，所述调控序列对于所述核酸在所选宿主细胞中的表达是有效的，以便进行异种表达。宿主细胞可以是真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或酵母细胞。这些细胞可用于例如产生重组β分泌酶的方法，其中该方法进一步包括将来自所述细胞的提取物或培养介质置于亲合基质上，例如由β分泌酶抑制剂分子或抗体形成的基质，这正如本文所述。
本发明还涉及抑制Aβ产生的化合物的筛选方法，包括使β分泌酶多肽如全长的或上述截短形式的那些多肽接触(i)测试化合物和(ii)β分泌酶底物，和如果β分泌酶多肽在测试化合物的存在下比在测试化合物的不存在下表现出较小的β分泌酶活性，则选择该测试化合物，因为其能抑制Aβ的产生。这一测定可以是基于细胞的，并使用细胞(如上述共表达细胞)所产生的酶和底物中的一种或二者均使用。用于此筛选方法的试剂盒也构成本发明的一部分。
筛选方法可进一步包括将测试化合物给药至患有早老性痴呆或早老性痴呆样病状的哺乳动物对象，并且如果在给药之后，该给药对象维持或改善认知能力或者给药对象表现出蛋白斑负荷减小，则选择该化合物作为候选治疗剂。正如本说明书中所例举的，这一给药对象优选包括针对人β淀粉状蛋白前体蛋白(β-APP)的转基因，例如是携带编码人β-APP(包括其突变型变体)的转基因的小鼠。
在一有关的实施方式中，本发明包括根据上述方法选择的β分泌酶抑制剂化合物。这些化合物可以选自例如噬菌体展示选择系统(“文库”)，例如本领域所公知的那些。根据另一方面，这样的文库可以是“偏向”于序列肽SEQ ID NO97[P10-P4’D→V]的。其他抑制剂包括或可源于本文所鉴定的肽抑制剂，例如抑制剂SEQ ID NO78、SEQ ID NO72、SEQ ID NO78和SEQ ID NO81。
剔除小鼠也构成本发明的一部分，其特征在于内源β分泌酶基因的失活或缺失，该基因例如是与序列SEQ ID NO65至少有90％序列同一性的蛋白的编码基因。所述缺失或失活可以是可诱导的，例如通过将Cre-lox表达系统插入到小鼠基因组中而诱导。
根据另一有关方面，本发明包括有效用于治疗早老性痴呆或其他以Aβ沉积为特征的脑血管淀粉样变性的药物的筛选方法。根据本发明的这一方面，向以β-APP的超量表达和/或Aβ沉积为特征的哺乳动物对象给予一测试化合物，根据该化合物抑制权利要求37所述的β分泌酶蛋白的β分泌酶活性的能力而得以选择。如果该化合物降低所述受治对象中Aβ沉积的量或者维持或改善受治对象的认知能力，则将它选作潜在的治疗性药物化合物。根据一个优选的实施方式，所述哺乳动物对象是携带编码人β-APP或其突变型的转基因的转基因小鼠。
本发明还包括一种治疗患有或易患早老性痴呆或其他脑血管淀粉样变性的患者的方法。根据这方面，通过向患者给予药学有效量的有效抑制本文所述多种酶形式中的一种或多种的化合物，阻断APP向Aβ的酶水解过程。根据另一特征，治疗性化合物是从选自SEQ ID NO72、SEQ ID NO78、SEQ ID NO81和SEQ ID NO97的肽衍生的。采用本文所述的各种噬菌体选择系统，并辅以本发明的筛选方法或其他这样的方法，可实现该衍生过程。另外，还可经合理的化学方法包括药物化学领域所公知的分子模型制作来实现衍生。所述化合物优选是相当强的β分泌酶酶活性抑制剂，这一点可由在MBP-C125sw测定中KI小于约1-50μM来证实。这样的化合物还形成本发明治疗性药物组合物的基础，该组合物也可包括药学有效的赋形剂。
根据又一有关的方面，本发明包括一种诊断患者患有或易患早老性痴呆的方法。该方法包括测定来自所述患者的细胞样品中包括编码β分泌酶的核酸的基因的表达水平，并且如果所述表达水平显著大于预定的对照表达水平，则诊断患者患有或易患早老性痴呆。本文详细描述了可用于该测定的可测核酸和引物。该核酸可以不包括编码前酶原[1-501]的核酸。本发明进一步涉及诊断患者患有或易患早老性痴呆的方法，包括测量来自所述患者的细胞样品中β分泌酶的酶活性，和如果所述酶活性水平显著大于预定的对照活性水平，则诊断患者患有或易患早老性痴呆。该诊断方法可在完整细胞的测定中和/或在源自所述患者的细胞样品的核酸上进行。
本发明还包括纯化β分泌酶蛋白酶分子的方法。根据这一方面，不纯的含有β分泌酶活性的样品用亲合基质进行纯化，该基质包括β分泌酶抑制剂，例如本文所述的多种抑制剂分子。
在阅读了以下对本发明的详细描述以及参阅了附图之后，本发明的这些和其他目的和特征将变得非常明显。
附图简述


图1A显示编码图2A所示的人β分泌酶翻译产物的多核苷酸序列(SEQ ID NO1)。
图1B显示包括推定的5’-和3’-非翻译区的
图1A的多核苷酸(SEQID NO44)。
图2A显示
图1A和1B所示多核苷酸序列的读码框的预测翻译产物的氨基酸序列(SEQ ID NO2)[1-501]。
图2B显示人β分泌酶的活性片段的氨基酸序列(SEQ ID NO43)[46-501]。
图3A显示在C末端包括FLAG-表位标记(用下划线标出；SEQ IDNO45)的编码人β分泌酶活性片段在第452位终止的翻译产物(SEQID NO2的1-452位氨基酸；SEQ ID NO59)。
图3B显示在C末端包括FLAG-表位标记(用下划线标出；SEQ IDNO45)的人β分泌酶片段的氨基酸序列(SEQ ID NO2的46-452位氨基酸；SEQ ID NO58)。
图4显示从凝胶过滤柱洗脱的重组β分泌酶的洗脱分布图。
图5显示β分泌酶全长氨基酸序列1-501(SEQ ID NO2)，包括编码其的ORF(SEQ ID NO1)，该图将某些特征标示了出来，例如指示天冬氨酸催化位点的“活性-D”位点、开始于453位的跨膜区域以及前导(“信号”)序列(1-22位残基；SEQ ID NO46)和推定的酶原(pro)区域(23-45位残基；SEQ ID NO47)，其中与46-501位氨基酸(SEQ ID NO43)(核苷酸135-1503)对应的酶原区域相对应的多核苷酸显示为SEQ ID NO44。
图6A和6B显示纯化的含β分泌酶级分在还原(6A)和非还原(6B)条件下进行电泳的银染色SDS-PAGE凝胶的图象。
图7显示从表达重组酶的异种293T细胞纯化的β分泌酶的银染色SDS-PAGE。
图8显示从表达重组酶的异种Cos A2细胞纯化的β分泌酶的银染色SDS-PAG。
图9是一示意图，其中将源自多核苷酸(SEQ ID NO76)的引物用于分子的PCR-克隆附加部分，例如所例举的由核酸SEQ ID NO78编码的片段SEQ ID NO79；所述多核苷酸编码纯化的天然存在的β分泌酶的N末端(SEQ ID NO77)。
图10显示人β分泌酶的氨基酸序列(“人Imapain序列”，1-501，SEQ ID NO2)与(“pBS/mImpain H#3 cons”)小鼠共有序列SEQ IDNO65的对比。
图11A显示用于制备载体pCF的插入子的核苷酸序列(SEQ IDNO80)。
图11B显示pCEK的线型简图。
图12显示用于用β分泌酶转染哺乳动物细胞的pCEK克隆27的简图。
图13(A-E)显示pCEK克隆27的核苷酸序列(SEQ ID NO48)，其具有氨基酸序列SEQ ID NO2所示的OFR。
图14A显示插入到亲代载体pCDNA3中的核苷酸序列。
图14B显示在来自COS细胞的溶胞产物中β分泌酶活性的曲线图，所述COS细胞被源于编码β分泌酶的克隆的载体转染。
图15A显示用平行三份的溶胞产物样品负载的SDS-PAGE凝胶的图象，所述溶胞产物制备于用突变型APP(751wt)和作为对照的β半乳糖苷酶(泳道d)转染的异种细胞、用突变型APP(751wt)和β分泌酶(泳道f)转染的细胞，其中泳道a、b和c显示来自未经处理的细胞、单独用β半乳糖苷酶转染的细胞和单独用β分泌酶转染的细胞的溶胞产物。
图15B显示用平行三份的溶胞产物样品负载的SDS-PAGE凝胶的图象，所述溶胞产物制备于用突变型APP(Swedish突变)和作为对照的β半乳糖苷酶(泳道c)转染的异种细胞、用突变型APP(Swedish突变)和β分泌酶(泳道e)转染的细胞，其中泳道a和b显示来自单独用β半乳糖苷酶转染的细胞和单独用β分泌酶转染的细胞的溶胞产物，泳道d指示标记物。
图16A和16B显示针对可溶APP(sAPP)的存在或增加而测试的细胞上清液的Western印迹。
图17A和17B显示在共表达细胞中经α切割的APP底物的Western印迹。
图18显示在用APP和β分泌酶共转染的293T细胞中Aβ(x-40)的产生。
图19A显示APP底物片段及其与抗体SW192和8E-192联合用于所述测定的示意图。
图19B显示野生型和Swedish APP序列中的β分泌酶切割位点。
图20显示源自APP 638的第二APP底物片段及其与抗体SW192和8E-192联合用于所述测定的示意图。
图21显示pohCK751载体的简图。
序列简述此部分简要地鉴定本文所述的序列标识号。方括号中所示的和整个说明书中的数字范围是参照SEQ ID NO2而言，并使用常规N→C末端的顺序。
SEQ ID NO1是包括本文例举的活性片段的编码人β分泌酶的核酸序列。
SEQ ID NO2是SEQ ID NO1[1-501]的预计翻译产物。
SEQ ID NO3-21是实施例1中所述的从SEQ ID NO2的区域设计的简并寡核苷酸引物(表4)。
SEQ ID NO22-41是用于本文所述PCR克隆方法的附加寡核苷酸引物，参见表5。
SEQ ID NO42是编码SEQ ID NO43所示活性β分泌酶的多核苷酸序列。
SEQ ID NO43是人β分泌酶的活性酶部分的序列[46-501]，其N末端对应于从天然源中分离的蛋白的主导形式的N末端。
SEQ ID NO44是包括5’和3’非翻译区的编码SEQ ID NO2的多核苷酸。
SEQ ID NO45是与某些寡核苷酸联合使用的FLAG序列。
SEQ ID NO46是推定的β分泌酶前导区域[1-22]。
SEQ ID NO47是推定的β分泌酶前原(pre-pro)区域[23-45]。
SEQ ID NO48是克隆pCEK C1.27的序列(
图13A-E)。
SEQ ID NO49是人β分泌酶编码基因的一个片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO50是SEQ ID NO49的预计的翻译产物。
SEQ ID NO51是人β分泌酶一部分的预计的内部氨基酸序列。
SEQ ID NO52和53是适用于本发明所使用的β分泌酶测定法的肽底物。
SEQ ID NO54是由人β分泌酶识别的肽序列切割位点。
SEQ ID NO55是SEQ ID NO2的46-69位氨基酸。
SEQ ID NO56是以N末端连接β分泌酶跨膜域的一个内部肽。
SEQ ID NO57是β分泌酶[1-419]。
SEQ ID NO58是β分泌酶[46-452]。
SEQ ID NO59是β分泌酶[1-452]。
SEQ ID NO60是β分泌酶[1-420]。
SEQ ID NO61是EVM[羟基亚乙基]AEF。
SEQ ID NO62是如图5所示的β分泌酶的跨膜域的氨基酸序列。
SEQ ID NO63是APPwt的P26-P4’。
SEQ ID NO64是APPwt的P26-P1’。
SEQ ID NO65是小鼠β分泌酶(
图10，下面的序列)。
SEQ ID NO66是β分泌酶[22-501]。
SEQ ID NO67是β分泌酶[58-501]。
SEQ ID NO68是β分泌酶[58-452]。
SEQ ID NO69是β分泌酶[63-501]。
SEQ ID NO70是β分泌酶[63-452]。
SEQ ID NO71是β分泌酶[46-419]。
SEQ ID NO72是P10-P4’staD→V。
SEQ ID NO73是P4-P4’staD→V(KTEEISEVN[sta]VAEF)。
SEQ ID NO74是β分泌酶[22-452]。
SEQ ID NO75是β分泌酶[63-423]。
SEQ ID NO76是编码天然存在的β分泌酶N末端的核酸。
SEQ ID N077是天然存在的β分泌酶N末端的一个肽片段。
SEQ ID NO78是P3-P4’XD→V(VMXVAEF，其中X是羟基亚乙基或抑胃酶氨酸(statine))。
SEQ ID NO79是天然存在的β分泌酶的一个肽片段。
SEQ ID NO80是插入到本发明所用的载体pCF中的核苷酸。
SEQ ID NO81是P4-P4’XD→V(EVMXVAEF，其中X是羟基亚乙基或抑胃酶氨酸)。
SEQ ID NO82是APP片段SEVKMDAEF(P5-P4’wt)。
SEQ ID NO83是APP片段SEVNLDAEF(P5-P4’sw)。
SEQ ID NO84是APP片段SEVKLDAEF。
SEQ ID NO85是APP片段SEVKFDAEF。
SEQ ID NO86是APP片段SEVNFDAEF。
SEQ ID NO87是APP片段SEVKMAAEF。
SEQ ID NO88是APP片段SEVNLAAEF。
SEQ ID NO89是APP片段SEVKLAAEF。
SEQ ID NO90是APP片段SEVKMLAEF。
SEQ ID NO91是APP片段SEVNLLAEF。
SEQ ID NO92是APP片段SEVKLLAEF。
SEQ ID NO93是APP片段SEVKFAAEF。
SEQ ID NO94是APP片段SEVNFAAEF。
SEQ ID NO95是APP片段SEVKFLAEF。
SEQ ID NO96是APP片段SEVNFLAEF。
SEQ ID NO97是由APP衍生的片段P10-P4’(D→V)KTEEISEVNLVAEF。发明详述除非另外指明，本文使用的所有术语的意义与本发明领域的技术人员所公知的意义相同。实施者可具体参阅Sambrook等的(1989)分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)(第二版)，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N.Y.和Ausubel，F.M.等(1998)现代分子生物学规程(Current Protocols in MolecularBiology)，John Wiley & Sons，New York，NY，来了解定义、技术术语和分子生物学领域公知的标准方法，特别是当这些文献涉及本发明所述的克隆规程。应理解，本发明并不限于特定的方法、规程和所述试剂，因为它们可在产生相同结果的情况下变化。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，指具有一承载能与典型寡核苷酸通过氢键结合的碱基的骨架的聚合分子，其中聚合物骨架上的碱基以某种方式允许在聚合分子和典型多核苷酸(如单链DNA)间以序列特异性的方式通过氢键结合。这样的碱基一般是肌苷、腺苷、鸟苷、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷。聚合分子包括双链和单链的RNA和DNA及其骨架修饰物，例如甲基膦酸酯键。
术语“载体”指一多核苷酸，其核苷酸序列能同化新的核酸并在适宜的宿主中繁殖这些新序列。载体包括但不限于重组的质粒和病毒。包括本发明核酸的载体(例如质粒或重组的病毒)可以位于一载体中，例如与蛋白复合的质粒、与类脂基核酸转导系统复合的质粒或者其他非病毒载体系统。
本文使用的术语“多肽”指由通过肽键连接的氨基酸残基单链构成的化合物。术语“蛋白”可与术语“多肽”同义，也可指两个或多个多肽的复合物。
当用于本发明的多肽时，术语“经修饰的”指一多肽，其或者通过天然过程而得以修饰，例如加工或其他翻译后修饰，或者通过本领域熟知的化学修饰技术而得以修饰。在众多已知的修饰中，可使用的修饰包括但不限于乙酰化、酰化、酰胺化、ADP-核糖基化、糖基化、形成GPI锚、共价连接类脂或类脂衍生物、甲基化、肉豆蔻酰化、聚乙二醇化(pegylation)、异戊二烯化、磷酸化、遍在蛋白化或任何相似的方法。
在本文的第三部分定义了术语“β分泌酶”。
与术语β分泌酶一同使用的术语“生物学活性”指具有β分泌酶酶活性，例如切割β淀粉状蛋白前体蛋白(APP)产生β淀粉状蛋白肽(Aβ)的能力。
当用于描述本发明的β分泌酶时，术语“片段”指一个多肽，其氨基酸序列与全长β分泌酶多肽的氨基酸序列的部分相同，但并不是全长的β分泌酶。在对本发明的叙述中，全长β分泌酶通常被确定为SEQID NO2，即全长核苷酸的ORF；但是，根据本发明的发现，天然存在的活性形式可能是一种或多种N末端截短的形式，例如氨基酸46-501、22-501、58-501或63-501；其他活性形式是在约450和452位氨基酸之间终止的C末端截短的形式。全文使用的编号系统是基于序列SEQ ID NO2的编号。
“活性片段”是保留β分泌酶的至少一个功能或活性的β分泌酶片段，所述功能或活性包括但不限于上述β分泌酶酶活性和/或与本文所述的抑制剂底物如P10-P4’staD→V结合的能力。本发明使用的片段包括但不限于那些保留切割β淀粉状蛋白前体蛋白产生β淀粉状蛋白肽的能力的β分泌酶片段。正如本文所述，这类片段优选包括β分泌酶的至少350个连续氨基酸或其保守替换物，更优选包括β分泌酶的至少400个连续氨基酸或其保守替换物。该片段更优选包括活性天冬氨酸残基，其结构位置由如SEQ ID NO2所示的一级多肽结构所确定和限定，在本文中其也称作“活性-D”。
“保守替换物”指一类氨基酸被同一类的氨基酸所替换，其中所述同一类别由氨基酸侧链的普通物理化学性质和在自然界发现的同源蛋白中的高替换频率(如利用例如标准Dayhoff频率交换矩阵(matrix)或BLOSUM矩阵所确定的)所限定。按上述分类的氨基酸侧链的六个普通类别包括I类(Cys)；II类(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；III类(Asn、Asp、Gln、Glu)；IV类(His、Arg、Lys)；V类(Ile、Leu、Val、Met)；和VI类(Phe、Tyr、Trp)。例如，用Asp替换III类的另一个残基如Asn、Gln或Glu，被认为是一保守替换。
“最佳对比”被限定为给出最高％同一性得分的序列对比。这样的序列对比可使用多种可商购的序列分析程序来进行，例如局部对比程序LALIGN，其中ktup为1、使用默认参数和默认PAM。优选的对比是在MacVector中使用CLUSTAL-W程序进行成对对比，其中在默认参数下操作，包括开放间隙惩罚为10.0、扩展的间隙惩罚为0.1以及BLOSUM30相似性矩阵。
两个氨基酸或多核苷酸序列的“％序列同一性”指当两个序列最佳对比时在这两个序列中相同残基的百分数。因此80％氨基酸序列同一性指在两个或多个最佳对比的多肽序列中有80％的氨基酸是相同的。如果需要将缺口插入到第一序列中以将之与第二序列最佳对比，则只使用与相应的氨基酸残基配对的残基计算％同一性(即，该计算不考虑位于第一序列的“缺口”中的第二序列残基)。
当含第一多肽区或第二多肽区域的序列如上所述使用序列对比程序进行对比时，如果这些区域基本上是共延伸的，则称第一多肽区域“对应”于第二多肽区域。对应的多肽区域一般含有相似(如果不相同时)数目的残基。但应理解，对应区域的一方可含有相对于另一方的插入或缺失残基，以及它们序列中可存在一些差异。
当含第一多核苷酸区或第二多核苷酸区域的序列如上所述使用序列对比程序进行对比时，如果这些区域基本上是共延伸的，则称第一多核苷酸区域“对应”于第二多核苷酸区域。对应的多核苷酸区域一般含有相似(如果不相同时)数目的残基。但应理解，对应区域的一方可含有相对于另一方的碱基插入或缺失，以及它们序列中可存在一些差异。
术语“序列同一性”指在如上述进行对比的两个或多个对比序列中的核酸或氨基酸序列的同一性。
两个多肽之间的“序列相似性”通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸替代物与第二多肽比较而得以确定。因此，80％的蛋白序列相似性指两个或多个对比的蛋白序列中80％的氨基酸残基是保守氨基酸残基，即它们是保守替换。
“杂交”包括任何将一核酸链与互补的核酸链经碱基配对而连接的过程。因此，严格地说，该术语是指目标序列的互补链结合到测试序列上(反之亦然)的能力。
“杂交条件”部分基于与复合物或探针结合的核酸的熔点(Tm)，一般用测量杂交时所使用的条件的“严格”程度进行分类。限定各种严格程度(即，高、中、低)的特定条件依赖于希望进行杂交的多核苷酸的性质，特别是其GC百分含量，并可根据本领域共知的方法经验性地确定。最严格的条件在功能上可用于识别与杂交探针有严格同一性或近似严格同一性的核酸序列；而高度严格的条件用于识别与探针有约80％或更大同一性的核酸序列。
本文使用的术语“基因”指参与产生多肽链的DNA节段；它可包括编码区域之前和之后的区域，例如5’非翻译区(5’UTR)或“前导”序列、3’UTR或“尾随”序列以及在各个编码节段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
术语“经分离的”指将物质从原始环境(例如，如果该物质是天然存在的，则指天然环境)中取出。例如，活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽是未经分离的，而与自然体系中的一些或全部共存物质分开的多核苷酸或多肽则是经分离的。该经分离的多核苷酸可以是载体的一部分，和/或该多核苷酸或多肽可以是组合物如经重组产生的表达所述多肽的细胞(异种细胞)的一部分，并且当所述载体或组合物不是其自然环境的一部分时其也是经分离的。
“经分离的具有编码β分泌酶的序列的多核苷酸”是一多核苷酸，其含有β分泌酶或其活性片段的编码序列，该编码序列(i)以单独形式存在、(ii)以与附加编码序列如融合蛋白或信号肽结合的形式存在(其中β分泌酶编码序列是占主导的编码序列)、(iii)以与可用于在合适宿主中表达所述编码序列的非编码序列如内含子和调控元件(如启动子和终止子元件或5’和/或3’非翻译区)结合的形式存在和/或(iv)位于在其中β分泌酶编码序列为异源基因的载体或宿主环境中。
术语“异源DNA”、“异源RNA”、“异源核酸”、“异源基因”和“异源多核苷酸”指的是核苷酸对于其所存在的细胞或部分基因组是非内源性的；通常，该核苷酸通过转染、显微注射或电穿孔等加入细胞。所述核苷酸通常包括至少一个编码序列，但这一编码序列不必表达。
术语“异种细胞”指经重组产生的含有至少一种异源DNA分子的细胞。
“重组蛋白”是因在异种细胞中表达而得以分离、纯化或识别的蛋白，所述细胞是用遗传工程改造过的重组表达载体瞬时或稳定地转导或转染的，以驱动所述蛋白在宿主细胞中的表达。
术语“表达”指由细胞产生的蛋白，通常是由于用异源核酸转染细胞而导致的结果。
“共表达”是一过程，两类或更多的目标蛋白或RNA借助这一过程在单个细胞中表达。两种或更多蛋白的共表达一般通过用一种或多种携带所述蛋白编码序列的重组表达载体转染细胞而实现。例如，在对本发明叙述中，如果两种蛋白中的一种或两种对于细胞而言是异源的，则称该细胞“共表达”这两种蛋白。
术语“表达载体”指的是能在外源细胞中插入和表达异源DNA片段的载体。许多原核细胞和真核细胞表达载体是可商购的。对适宜的表达载体的选择是在本领域技术人员的知识范围内的。
术语“纯化的”或“基本上纯化的”指的是经分离的脱离其天然环境的分子，其为多核苷酸或多肽，且至少90％、更优选至少95-99％不含与其天然共存的其他成分。尽管如此，撰稿人不排除剪接变体或其他蛋白变体(糖基化变体)在同一样品中存在的可能，也同样不能排除其在均一样品中存在的可能。
通常，如果含有蛋白或多肽的样品在银染色的聚丙烯酰胺电泳凝胶上显示出一单蛋白带，则认为该蛋白或多肽“已纯化至具有明显的同质性”。
术语“结晶蛋白”指以纯的晶体从溶液中共沉淀出的蛋白，其只由晶体组成，但可能包括其他与该蛋白紧密结合的成分。
“变体”或“变异的”多核苷酸序列可编码与参考多肽序列相比有一个或多个氨基酸发生变化的“变异的”氨基酸序列。变异的多核苷酸序列可编码变异的氨基酸序列，其包含“保守”替换，其中被替换的氨基酸在结构或化学性质上与替换它的氨基酸相似。另外，变异的多核苷酸序列可编码变异的氨基酸序列，其含有“非保守”替换，其中被替换的氨基酸在结构或化学性质上与替换它的氨基酸不相似。变异的多核苷酸也可编码变异的含有氨基酸插入或缺失或二者的氨基酸序列。此外，变异的多核苷酸也可编码与参考多核苷酸序列所编码的相同的多肽，但由于遗传密码的简并，其多核苷酸序列与参考多核苷酸序列相比有一个或多个碱基发生变化。
“等位基因变体”是多核苷酸序列的其它形式，其可具有基本不改变所编码的多肽的功能的一个或多个核苷酸的替换、缺失或添加。
“可变剪接”是一过程，多种多肽同工型借助该过程由单一基因生成，它在基因的一部分(而不是全部)转录物的加工过程中参与对非连续的内含子的一同剪接。由此，一特定的内含子可连接到若干交替外显子的任何一个上以形成信使RNA。可变剪接的mRNA产生多肽(剪接变体)，其中一些部分是共同的，而另一些部分是不同的。
当用于对mRNA转录物的叙述时，β分泌酶的“剪接变体”是指通过可变剪接来自β分泌酶基因的编码区域(即外显子)而产生的mRNA。
当用于对蛋白自身的叙述时，β分泌酶的“剪接变体”是指经可变剪接的β分泌酶mRNA的转录物编码的β分泌酶翻译产物。
“突变的”或“突变型”氨基酸或多核苷酸序列是变异的氨基酸序列或变异的多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码具有与天然存在的蛋白相比显著改变的生物学活性或功能的变异的氨基酸序列。
“替换”是指一个或多个核苷酸或氨基酸分别被不同的核苷酸或氨基酸所置换。
本文使用的术语“调节”指本发明多肽的活性的变化。调节可涉及所述分子的生物学活性、结合特性或者任何其他生物学、功能或免疫学性质的增加或减少。
术语“拮抗剂”和“抑制剂”在本文中可互换使用，它们指一种分子，当该分子结合到本发明的多肽上时，其通过阻断、减低或缩短生物学活性的持续时间来调节所述酶活性。本文使用的拮抗剂也可称作“β分泌酶抑制剂”或“β分泌酶阻断剂”。拮抗剂本身可以是多肽、核酸、烃类、类脂、小分子(通常小于1000kD)或其衍生物，或者是任何其他与酶结合并调节酶活性的配体。β分泌酶组合物本发明提供一种任选地以纯化形式存在的、经分离的、活性人β分泌酶，其进一步表征为天冬氨酰基(天冬氨酸)蛋白酶。正如下面所详细限定的，β分泌酶表现出蛋白水解活性，该活性参与由β淀粉状蛋白前体蛋白(APP)生成淀粉状蛋白多肽(Aβ)的过程，例如在引入本文作为参考的美国专利5744346中所述。另外，β分泌酶的特征在于其以适度高的亲和力结合本文所述抑制剂底物如P10-P4’staD→V(SEQ ID NO72)的能力。根据本发明的一个重要特征，人β分泌酶已经得以分离，其天然存在形式已被表征、纯化和测序。
根据本发明的另一方面，编码所述酶的核苷酸序列已得到鉴定。此外，该酶已得到进一步修饰，从而以已改变形式如截短形式进行表达，其具有与天然存在或全长重组的酶相似的蛋白酶活性。使用本文提供的信息，实施者可以从可得的资源中分离编码蛋白的多种活性形式的DNA，并可在方便的表达系统中重组性地表达所述蛋白。另外，实施者可从天然或重组源中纯化出所述酶，并使用其纯化形式，以进一步表征其结构和功能。根据本发明的另一特征，本发明的多核苷酸和蛋白特别可用于各种筛选测定方法中，包括针对抑制所述酶的药物的细胞基筛选方法。在下面的第四部分中，提供了这些测定的用途的例子以及组合物的其他应用。
β分泌酶特别受到关注是因为其活性和参与生成原纤维肽成分，这些成分是中枢神经系统(CNS)中的淀粉样蛋白斑的主要成分，例如在早老性痴呆、唐氏综合征和其他CNS紊乱中所见到的那些成分。因此，本发明的有用特征包括可用于例如筛选抑制性物质的该酶的经分离的形式，这些抑制性物质是用于治疗所述病症的候选治疗剂。A.编码人β分泌酶的多核苷酸的分离通过实施例1-3和以下所述的PCR克隆和杂交技术，获得编码人β分泌酶的多核苷酸。
图1A显示编码人β分泌酶的一种形式(SEQ IDNO2[1-501])的多核苷酸序列(SEQ ID NO1)。编码人β分泌酶的多核苷酸方便地分离自许多人组织中的任一种，优选神经元来源的组织，包括但不限于神经元细胞系，例如可商购的可从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA；ATTC CCL 127)获得的人纤维母细胞瘤细胞系IMR-32，和人胎脑，例如可从OriGene Technologies，Inc.(Rockville，MD)获得的人胎脑cDNA文库。
简言之，使用由SEQ ID NO1所示编码序列衍生的杂交探针，利用本领域熟知的方法，分离人β分泌酶编码区域。可设计并利用本领域熟知的方法制备这样的探针。在实施例1中描述了探针的例子，包括简并探针。也可使用例如本文实施例2所述的引物和条件通过PCR筛选cDNA文库。在下面的B部分更详细讨论了这些方法。
也可根据本领域熟知的方法(White，B.A.编辑的PCR克隆规程(PCR Cloning Protocols)；Humana Press，Totowa，NJ，1997；其程序见图9)使用3’-RACE(cDNA末端的快速扩增)方法筛选cDNA文库。此处，将源自SEQ ID NO1的5’部分的引物加入到部分cDNA底物克隆中，该克隆通过筛选上述胎脑cDNA文库而发现。用于确定较长序列的典型3’-RACE反应具体述于实施例3中并更详细地述于下面的B部分中。
可通过使用根据SEQ ID NO2所示多肽序列的任何部分设计的随机简并引物，识别人β分泌酶以及本文所述的神经元天冬氨酰基蛋白酶家族的其他成员。例如，在支持本发明的实验中，如在本文实施例1中所述，基于选自SEQ ID NO2的一独特的具有22个氨基酸的肽区域，设计了八个简并引物库，每个均8倍简并。该技术可用于进一步识别与其他种类和/或代表该蛋白酶家族其他成员的相似序列。多核苷酸的制备如上所述，本文所述多核苷酸可通过使用寡核苷酸探针筛选cDNA文库而获得，所述探针可杂交到和/或PCR-扩增编码人β分泌酶的多核苷酸。从各种组织制备的cDNA文库是可商购的，筛选和分离cDNA克隆的方法为本领域技术人员所熟知。可同样筛选基因组文库以获得包括调控区域和内含子的基因组序列。这些技术述于例如Sambrook等的(1989)分子克隆实验室手册(Molecular CloningA LaboratoryManual)(第二版)，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N.Y.和Ausubel，F.M.等(1998)现代分子生物学规程(Current Protocols in MolecularBiology)，John Wiley & Sons，New York，NY。
可延伸寡核苷酸，以获得上游和下游序列，例如启动子、调控元件以及5’和3’非翻译区(UTR)。可得的转录物序列的延伸可利用本领域技术人员公知的众多方法如PCR或引物延伸(Sambrook等，同上)进行，或使用例如MARATHON RACE试剂盒(编号#K1802-1；Clontech，Palo Alto，CA)利用RACE方法进行。
此外，“限制位点”PCR(Gobinda等(1993)PCR方法的应用(PCR Methods Applic.)2318-22)技术也可用于产生附加的编码区，该技术使用通用的引物以回收邻近已知位点的侧翼序列。首先，在针对接头序列的引物和一个对已知区域特异的引物的存在下，扩增基因组DNA。使用相同的接头引物和处于第一个特异性引物内部的另一特异性引物，使已扩增的序列进行第二轮PCR。用适宜的RNA聚合酶转录每一轮PCR的产物，并用逆转录酶测序。
使用基于已知区域的背驰引物，反向PCR可用于扩增或延伸序列(Triglia T等(1998)核酸研究(Nucleic Acid Res.)168186)。可使用OLIGO(R)4.06引物分析软件(1992；National Biosciences Inc，Plymouth，Minn.)或另一适宜的程序设计引物，使之具有22-30个核苷酸的长度、50％或更多的GC含量、在约68-72℃的温度下与目标序列退火。该方法使用若干限制酶，以生成位于基因的已知区域内的合适片段。接着，该片段通过分子内连接而环化，并用作PCR模板，捕获PCR(Lagerstrom M等(1991)PCR方法的应用(PCR MethodsApplic)1111-19)是一种PCR扩增人和酵母人工染色体中与已知序列相邻的DNA片段的方法。捕获PCR也要求多种限制酶的消化和连接，以在PCR之前将所设计的双链序列置于DNA分子的侧翼部分中。
可用于回收侧翼序列的另一方法是Parker JD等的方法(1991；核酸研究(Nucleic Acid Res.)193055-60)。此外，可使用PCR、嵌套引物和PromoterFinder(TM)文库以“步入”基因组DNA(Clontech，Palo Alto，CA)。该过程无需筛选文库，可用于发现内含子/外显子接界处。优选的用于筛选全长cDNA的文库是那些经大小选择以包括较大cDNA的文库。此外，随机引发的文库优选含有更多包含基因的5’和上游区域的序列。如果寡d(T)文库不产生全长cDNA，则随机引发的文库可能是特别有用的。基因组文库可用于延伸到5’非翻译调控区。
根据已知的合成方法，可通过固相法制备本发明的多核苷酸或寡核苷酸。一般，多至约100个碱基的片段可分别合成，然后相连以形成多至数百碱基的连续序列。B.β分泌酶的分离全长人β分泌酶翻译产物的氨基酸序列如图2A中的SEQ ID NO2所示。根据本发明的发现，该序列代表酶的前原(“pre pro”)形式，其是由前一部分所述核苷酸序列信息按下述方法推导出的。如下面第4部分所述，比较该序列和从天然源中纯化的酶的生物学活性形式所确定的序列，指示它可能是酶的活性和主导形式，如图2B中的序列(SEQ ID NO43)所示，其中由读码框推导的序列的前45个氨基酸被移走。这意味着酶可能是通过蛋白水解活性在翻译后被修饰的，它实际上可以是自动催化的。进一步的分析通过本文图5所示简图得以说明，它指示酶在其C末端附近含有疏水性的、推定的跨膜区。如下所述，本发明的进一步发现是，所述酶可在该跨膜区之前被截短，并仍保留β分泌酶的活性。1.从天然和重组源中纯化β分泌酶根据本发明的一个重要特性，现已从从天然和重组源中纯化出β分泌酶。引入本文作为参考的美国专利5744346描述了利用凝胶排阻层析分离β分泌酶，其呈一单峰，表观分子量为260-300,000(道尔顿)。本发明的一个发现是，通过亲合柱层析可将天然酶纯化至具有明显的均质性。本文揭示的方法用于从脑组织以及从293T和重组细胞进行制备的制备物；因此，相信这些方法通常可用于多种组织源。实施者将理解，某些制备步骤，特别是初始步骤，或许需要进行改变以适应特殊的组织源，实施者将根据本领域公知的方法调整这些步骤。从人脑和从细胞中纯化β分泌酶的方法详细述于实施例5中。简言之，脑组织的细胞膜是均质化的、分级分离的，并进行多种类型的柱层析，包括麦胚凝集素-琼脂糖(WGA)层析、阴离子交换层析和尺寸排阻层析。各级分的活性可使用针对β分泌酶活性的测定法来测量，例如实施例4中详细描述的对MBP-C125切割测定。含β分泌酶活性的级分从该柱中洗脱出，洗脱峰体积对应于约260-300kD的大小。
产生近1500倍纯化的前述纯化方案与引入本文作为参考的美国专利5744346中详细描述的方案相似。根据本发明，可通过将阳离子交换流通材料施加到亲合柱上来实现进一步的纯化，所述流通材料用作亲合基质，一种β分泌酶的特异性抑制剂，即“P10-P4’staD→V”(NH2-KTEEISEVN[sta]VAET-CO2H；SEQ ID NO72)。该抑制剂和制备其琼脂糖凝胶亲合柱的方法述于实施例7中。在洗柱后，用pH9.5的硼酸盐缓冲剂洗脱β分泌酶和有限数量的污染蛋白。然后，使用Mini-Q柱，通过阴离子交换HPLC分级分离洗脱物。合并具有活性的级分峰，以给出最终的β分泌酶制品。使用该纯化方案的过柱示例的结果简要地列于表1中。图6A显示在还原条件下的银染色SDS PAGE凝胶电泳的图，其中β分泌酶为70kD带。同样的级分在非还原条件下电泳(图6B)，证明存在以二硫键交联的寡聚物。当合并的阴离子交换级分18-21(见图6B)用二硫苏糖醇(DTT)进行处理并在Mini Q柱上再次层析，然后在非还原条件下进行SDS-PAGE，观察到走出一约70kD的单一带。令人惊奇的是，该制品的纯度比在美国专利5744346中公开的经纯化的材料纯至少200倍。考虑到底物MBP-C26sw的分子量为45kD，通过比较，确定此处所述最纯的级分表现出约253nM/h/μg蛋白的比活性。由此，该方法提供了一个比上述制品纯至少约1000倍(亲合洗脱物)、高达约6000倍的制品，而这一制品比来自人293细胞的溶液化的但未富集的膜级分中存在的酶纯至少5-100倍。
表1来自人脑的β分泌酶的制备
aMBP-C125sw测定中的活性
实施例5也描述了用于从用β分泌酶编码序列转染的异种细胞中纯化出重组材料的纯化方案。纯化的结果列于图7和8中。支持本发明的进一步实验显示，当通过凝胶排阻层析进行测量时，该重组材料具有在260000-300000道尔顿范围内的表观分子量。图4显示的是，根据美国专利5744346所述方法走凝胶排阻层析柱如Superdex 200(26/60)柱的这一制品的活性分布，所述专利引入本文作为参考。1.对β分泌酶蛋白测序在图9中为一示意图，概要地显示出了测定编码来自纯化的β分泌酶的N末端肽序列的cDNA序列的方法和结果。对纯化的分离自天然源的β分泌酶蛋白进行N末端测序，产生一个上述具有21个残基的肽序列，即SEQ ID NO77。该肽序列及其被反向翻译的完全简并的核苷酸序列SEQ ID NO76示于图4的上方。在图4中，还列出了用于RT-PCR扩增编码该肽的cDNA片段的两组部分简并的引物。在表3中显示了由DNA核苷酸引物#3427-3434组成的第一组引物(实施例3)。如表3中所述，矩阵RT-PCR利用引物#3428-3433产生预计的54bp的cDNA产物，所述矩阵RT-PCR使用来自该组的引物，并以来自原代人神经元培养物的cDNA的逆转录形式为模板。
在支持本发明的进一步实验中发现，来自第1和第2引物组的寡核苷酸也可用于扩增来自小鼠脑mRNA的具有预定大小的cDNA片段。DNA序列证明，利用标准RACE-PCR技术，这些引物也可用于克隆人β分泌酶的鼠类同源物和其他种属同源物，和/或本文所述的天冬氨酰基蛋白酶家族的其他成员。鼠类同源物的序列列于
图10中(下方的序列；“pBS/MuImPain H#3 cons”)；SEQ ID NO65。鼠类多肽序列与人多肽序列有约95％相同。2.针对附加序列的5’和3’RACE-PCR、克隆和mRNA分析来自扩增片段的非多义的内部核苷酸序列所提供的信息，有助于设计与上链(编码链)配对的内部引物用于3’RACE，以及与下链(非编码链)配对的内部引物用于5’RACE(Frohman，M.A.，M.K.Dush和G.R.Martin(1998)“Rapid production of full-length cDNAs from raretranscriptsamplification using a single gene specific oligo-nucleotideprimer.”美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)85(23)8998-9002)。在图9中以图解说明了用于该实验的DNA引物(#3459和#3460)，在实施例3的表4中列出了这些引物的准确序列。
引物#3459和#3476(表5)用于下游序列的初始3’RACE，所述下游序列来自位于载体pLPCXlox中的IMR-32 cDNA文库。该文库事前细分为100个集合体，每一集合体中含5000个克隆，从每个集合体中分离质粒DNA。用上面第2部分所述的引物筛查这100个集合体，从而从文库中识别出含β分泌酶克隆的各集合体。这样的克隆可用于RACE-PCR分析。
通过对反应产物进行琼脂糖凝胶分级分离，观察到一个近1.8Kb的PCR片段。从凝胶中纯化出该PCR产物，并使用引物#3459进行DNA序列分析(表5)。测定所得的被称作23A的克隆序列。所推导的来自23A读框之一的前7个氨基酸中有6个与N末端序列(SEQ IDNO77)的后7个氨基酸相匹配，在另一支持本发明的实验中，所述N末端序列由分离自天然源的纯化的蛋白所确定。该结果提供了对所述序列的内部确认，并限定了正确的读框下游。此外，该DNA序列有助于设计用于将所述序列向下游延伸的附加引物，以通过对下游方向上的相反链测序来证实所述序列，它还有助于分离cDNA克隆。
人β分泌酶的DNA序列如SEQ ID NO42所示，其对应于包括5’非翻译区和3’非翻译区的SEQ ID NO1。该序列由一部分的cDNA克隆(9C7e.35)来测定，该克隆是从购自OriGeneTM的人胎脑cDNA文库分离的，其即为3’RACE产物23A。将另外的克隆——总共12个独立的cDNA克隆用于确定所述复合序列。通过对来自克隆或PCR片段双链的DNA的重叠序列的测序，来装配出复合序列。预计的全长翻译产物如
图1B中的SEQ ID NO2所示。4.β分泌酶和相关转录物的组织分布寡核苷酸引物#3460(SEQ ID NO39，表5)在Northern印迹上作为末端标记的探针，用于确定编码β分泌酶的转录物的尺寸和确定其在IMR-32细胞中的表达。使用Marathon RACE ready cDNA制品(Clontech，Palo Alto，CA)，将附加引物用于分离小鼠cDNA和表征小鼠组织。表2列出了实验结果，在该实验中，利用PCR或Northern印迹法测试多种人和鼠类组织中β分泌酶编码性转录物的存在。
例如，寡核苷酸探针3460(SEQ ID NO39)杂交到IMR-32细胞中的2kb转录物上，指示出在该组织中编码β分泌酶的mRNA的尺寸为2Kb。使用寡核苷酸探针3460，对分离自人T细胞系Jurket和入骨髓单核细胞系Thp1的总RNA进行Northern印迹分析，结果也显示在这些细胞中存在2kb的转录物。
寡核苷酸探针#3460还杂交到Northern印迹中的～2kb转录物上，所述印迹含有来自所有受测的人类器官的RNA，这些人类器官来自成人和胎儿的组织。受测的器官包括心、脑、肝、胰、胎盘、肺、肌肉、子宫、膀胱、肾、脾、皮肤和小肠。此外，某些组织如胰、肝、脑、肌肉、子宫、膀胱、肾、脾和肺显示出～4.5kb、5kb和6.5kb的较大转录物的表达，这些转录物与寡核苷酸探针#3460杂交。
在支持本发明的其他实验中，通过使用源自SEQ ID NO1的包括核苷酸#155-1014的核糖探针(riboprobe)，用寡核苷酸探针#3460得到Northern印迹的结果。所述克隆提供一个860kb的核糖探针用于高度严格的杂交，该探针包括β分泌酶的催化域编码部分。它高度特异地与正确的在受测样品表达的配对mRNA杂交。用该核糖探针进行探测的分离自IMR-32和1°HNC的mRNA的Northern印迹揭示，存在先前用寡核苷酸#3460检测到的2kb转录物和一新的具有较大分子量的～5kb转录物。来自成人和胎儿人组织的RNA与该860核苷酸的核糖探针的杂交，证实了用寡核苷酸探针#3460获得的结果。编码β分泌酶的mRNA在所有受测组织中表达，其主要为～5kb的转录物。在成人中，其表达在脑、胎盘和肺中最低，在心、肝、胰、肌肉、肾、脾和肺中最高，在子宫和膀胱中则界于中间。在胎儿组织中，所述信使在所有受测组织中一律表达。
表2人和鼠类β分泌酶转录物的组织分布所发现的信使尺寸(Kb)Clontech人脑区域组织/器官 人 小鼠 组织/器官 人心 2a3.5，3.8，5&7 小脑 2Kb，4Kb，6Kb脑 2，3，4和7 3.5，3.8，5&7 大脑皮层 2Kb，4Kb，6Kb肝 2，3，4和7 3.5，3.8，5&7 骨髓 2Kb，4Kb，6Kb胰 2，3，4和7 ndd脊髓 2Kb，4Kb，6Kb胎盘2a，4和7bnd 枕极 2Kb，4Kb，6Kb肺 2a，4和7b3.5，3.8，5&7 额叶 2Kb，4Kb，6Kb肌肉2a和7b3.5，3.8，5&7 扁桃体2Kb，4Kb，6Kb子宫2a，4和7 nd 尾状核2Kb，4Kb，6Kb膀胱2a，3，4和7 nd 胼胝体2Kb，4Kb，6Kb肾 2a，3，4和7 3.5，3.8，5&7 海马 2Kb，4Kb，6Kb脾 2a，3，4和7 nd睾丸nd 4.5kb，2kb 黑质 2Kb，4Kb，6Kb胃 nd 5a丘脑 2Kb，4Kb，6Kb小肠nd 3.5，3.8，5&7f脑c2a，3，4和7 ndf肝 2a，3，4和7 ndf肺 2a，3，4和7 ndf肌肉 2a，3，4和7 ndf心 2a，3，4和7 ndf肾 2a，3，4和7 ndf皮肤 2a，3，4和7 ndf小肠 2a，3，4和7 nd细胞系 人 小鼠IMR32 2a，5和7U9372aTHP12aJurkat 2aHL60无A2935&7NALM6 5&7A5495&7Hela2，4，5&7PC12 2&5J774 5Kb，2KbP388D1 cc146 5Kb(极少)，2KbP195Kb，2KbRBL5Kb，2KbEL45Kb，2Kba仅使用寡核苷酸探针3460cf＝胎b模糊dnd＝未测定5.β分泌酶的活性形式a.N末端人β分泌酶的全长读码框(ORF)如上所述，其序列示于图2A中，为SEQ ID NO2。但是，如上所述，本发明的进一步研究表明，所述活性的、天然存在的分子的主导形式在N末端被截短约45个氨基酸。按照本领域公知的方法(Argo Bioanalytica，Morris Plains，NJ)对从天然源中纯化的蛋白进行了N末端测序。该N末端生成以下序列ETDEEPEEPGRRGSFVEMVDNLRG...(SEQ ID NO55)。这对应于由ORF衍生的推定序列的46-69位氨基酸。基于此结果和其他下述结果，所述酶的活性的、天然存在的主导人脑形式的N末端是SEQ IDNO2的第46位氨基酸。对纯化的蛋白进行进一步加工，提供内部肽的序列ISFAVSACHVHDEFR(SEQ ID NO56)，其是针对推定跨膜域的N末端，如ORF所限定。这些肽用于证实和提供针对在本申请中所述的经分离的克隆的读框信息。
在支持本发明的附加研究中，对分离自其他细胞类型的β分泌酶进行的N末端测序，揭示N末端可以是图2A所示ORF序列的46、22、58或63位氨基酸，这取决于从其中分离蛋白的组织，在受测组织中占主导的是N末端为第46位氨基酸的形式。在支持本发明的实验中，使用实施例6中所述的Fugene技术，将全长β分泌酶构建体(即，编码SEQ ID NO2)转染到293T细胞和COS A2细胞中。通过如实施例5中所述从细胞沉淀制备粗颗粒部分，而从细胞中分离出β分泌酶，然后用含0.2％Triton X-100的缓冲剂提取。主要根据实施例5A中所述的方法，将该提取物用pH 5.0的缓冲剂稀释，并走SP琼脂糖凝胶柱。此步骤除去大部分污染蛋白。在将pH调至4.5后，在P10-P4’staD→V琼脂糖凝胶上进一步纯化并浓缩β分泌酶。根据本领域公知的标准方法，分析级分的N末端序列。结果列于下表3中。
由293T细胞衍生的蛋白的一级N末端序列与得自脑的蛋白相同。此外，还可观察到小量的蛋白，其起点(Thr-22)紧接在信号序列后并位于天冬氨酰基蛋白酶同源物结构域(Met-63)的起点处。在Cos A2细胞中发现另一主要形式，其来自一Gly-58处的切割。
表3各种细胞类型中的β分泌酶形式的N端序列和量
b.C末端支持本发明的进一步实验揭示，SEQ ID NO2所示全长氨基酸序列的C末端也可是截短的，同时仍保留该分子的β分泌酶活性。更具体而言，如下D部分所详细描述的，酶的C末端截短形式的终点紧接在推定的跨膜区之前，即位于SEQ ID NO2第452位氨基酸的C末端的约10个氨基酸处，其表现出β分泌酶活性，这由它能在适宜的切割位点上切割APP和/或能结合SEQ ID NO72的能力所证实。
因此，使用SEQ ID NO2提供的参考氨基酸位置，β分泌酶的一个形式从第46位延伸到第501位(β分泌酶46-501；SEQ ID NO43)。另一个形式从第46位延伸到包括和超过第452位的任何位置上(β分泌酶4-452+)，优选形式是β分泌酶46-452(SEQ ID NO58)。更一般地，另一优选形式从第1位延伸到包括和超过第452位但不包括第501位的任何位置上。β分泌酶蛋白的其他活性形式起始于第22、58或63位氨基酸，并可延伸到包括和超过第420位半胱氨酸、更优选包括和超过第452位的任何位置上(即β分泌酶22-452+；β分泌酶58-452+；β分泌酶63-452+)，同时仍保留酶活性。如以下D部分所述，在结晶研究中特别有用的是在约第452位的C端位置上或之前、或甚至其后若干氨基酸处截短的形式，这是因为它们缺乏跨膜区的全部或一重要部分，而这些部分可干扰蛋白结晶。从第1位延伸到第452位的重组蛋白使用本文所述方法进行亲合纯化。
C.β分泌酶的结晶根据另一方面，本发明还包括以结晶形式存在的纯化的β分泌酶，同时不存在或存在结合底物，例如肽、经修饰的肽或小分子抑制剂。本部分描述方法和这些组合物的应用。
1.蛋白的结晶上述纯化的β分泌酶可作为起始原料用于确定晶体结构和针对所述酶的坐标(coordinate)。在限定底物结合位点的构象和尺寸时，该结构测定是特别有用的。此信息可用于设计和塑造酶的底物抑制剂。如本文所述，这些抑制剂是用于治疗早老性痴呆和以Aβ肽的淀粉样沉积为特征的其他淀粉样疾病的治疗剂的候选分子。
β分泌酶晶体结构的确定首先要使经纯化的蛋白结晶。使蛋白、特别是蛋白酶结晶的方法现已是本领域熟知的。实施者可参阅Principles of Protein X-ray Crystallography(J.Drenth，Springer Verlag，NY，1999)中的晶体学一般原理。此外，用于制备蛋白晶体的试剂盒通常可从供应商如Hampton Research(Laguna Niguel，CA)处获得。额外的指导可来自有关蛋白酶抑制剂的晶体学领域的众多研究论文，所述蛋白酶抑制剂尤其是针对HIV-1和HIV-2蛋白酶，它们均为天冬氨酸蛋白酶。
尽管本文所述的β分泌酶的不同形式中的任何一种都可用于结晶研究，但特别优选的是缺乏如SEQ ID NO2所示全长序列的前45个氨基酸的形式，因为它是天然存在于人脑中的主导形式。据信翻译后修饰的一些形式(可能为自动催化)用于以相当快的方式除去前45位氨基酸，因为迄今为止还没有分离出具有全部前45位氨基酸的完整的天然存在的酶。此外，优选在结晶前从分子中除去推定的跨膜区，因为，该区域不是催化所必需的，且它可潜在地使分子更难于结晶。
因此，好的结晶候选物是β分泌酶46-452(SEQ ID NO58)，因为酶的这一形式(a)提供主导的天然存在的N末端，和(b)缺乏“粘性”跨膜区，同时(c)保留β分泌酶活性。此外，还可使用具有延伸区的酶的形式，其延伸了一部分(近10-15个氨基酸)到跨膜区中。通常，为了确定配体结合位点的X射线晶体坐标，可使用酶的任何形式，条件是它们(i)表现出β分泌酶活性，和/或(ii)与已知的抑制剂如抑制剂配体P10-P4’staD→V结合，结合亲和力至少为β分泌酶[46-501](SEQ ID NO43)与P10-P4’staD→V结合的亲和力的1/100。因此，在这些研究中可使用其他的许多酶截短形式。任何特定形式的适用性可通过使其接触上述P10-P4’staD→V亲合基质来进行评价。结合到基质上的酶截短形式适合用于这些进一步的分析。因此，除了上述46-452外，支持本发明的实验揭示，终点为419位残基的一截短形式，最可能为46-419，也可结合到亲合基质上，因此它是另一候选蛋白组合物用于对β分泌酶进行X射线晶体学分析。更一般而言，在这方面，终点在跨膜区之前的任何酶形式是适用的，特别是终点在约419位残基和452位残基之间的形式。
在上述N末端上，前45位氨基酸通常在细胞加工过程中除去。其他合适的天然存在形式或经表达的形式列于上表3中。这些包括，例如起点为第22位残基的蛋白、起点为第58位残基的蛋白和起点为第63位残基的蛋白。但是，对起点在第1位残基上的全酶进行分析，还可提供有关于该酶的信息。在这点上，也可使用其他形式，例如1-420(SEQ ID NO60)至1-452(SEQ ID NO59)，包括中间形式如1-440。通常，获得在活性酶的任何亚结构域上的结构也是有用的。
纯化蛋白(包括活性形式)的方法如上所述。此外，由于所述蛋白在其天然存在(和由哺乳动物表达的重组体)形式中是明显糖基化了的，因此，希望在细菌中表达它并从细菌来源中纯化出该蛋白，所述细菌不糖基化哺乳动物蛋白，或者在例如昆虫细胞等来源中表达所述蛋白，提供统一的糖基化模式，以获得一均质组合物。适用于实现该过程的载体和密码子最佳化方法是本领域公知的。
在表达和纯化后，将蛋白的浓度调至约1-20mg/ml。根据用于其他结晶蛋白的方法，将初始蛋白溶液中的缓冲剂和盐浓度降低到尽可能低的水平。这可通过使用本领域公知的微量透析技术将样品对起始缓冲剂透析来实现。缓冲剂和结晶条件随蛋白的不同而不同，并可能随活性β分泌酶形式的片段的不同而不同，但可通过使用用于确定最佳结晶条件的距阵方法得以经验性地确定。(Drentz，J.，同上；Ducruix，A.等编辑，核酸和蛋白的结晶实用方法(Crystallization of Nucleic Acidand ProteinsA Practical Approach)，Oxford University，New York，1992)。
在透析后，调至蛋白结晶的最佳条件。通常，进行最优化的方法可包括制备一个1μl蛋白液滴的“栅格”，其混有1μl孔溶液，即改变pH和离子强度的缓冲剂。这些液滴可置于各自密封的一般为“悬滴”外型的孔中，例如置于可商购的容器(Hampton Research，LagunaNiguel，CA)中。沉淀/结晶一般在2天和2周内发生。检查孔中的沉淀或结晶情况，并将条件最优化以形成晶体。最佳晶体并不是由尺寸或形状来判断的，而是由晶体的衍射性来判断，最佳晶体的衍射性具有好于3_的分离度。典型的沉淀剂包括硫酸铵((NH4)2SO4)、聚乙二醇(PEG)和甲基戊二醇(MPD)。所使用的所有化学品应是尽可能高的品级(例如ACS)，也可在临用前利用本领域公知的标准方法进行二次纯化。
典型的形成经验栅格以确定结晶条件的缓冲剂和沉淀剂是可商购的。例如，“晶体筛选”试剂盒(Hampton Research)提供一试验条件的稀疏矩阵方法，其偏向于并且选自已知的大分子结晶条件。这提供一个“栅格”，用于利用很小量的大分子样品(50-100ml)快速测试宽的pH范围、盐和沉淀剂。在这样的研究中，将1μl缓冲剂/沉淀剂溶液加入等量的透析了的蛋白溶液，将混合物放置至少2天至2周，并仔细观察结晶情况。化学品可从普通供应商处获得；但优选使用适用于结晶研究的纯度品级，例如由Hampton Research(Laguna Niguel，CA)提供的。普通的缓冲剂包括柠檬酸盐、TEA、CHES、乙酸盐、ADA等(以提供最佳的pH范围)，一般其浓度为约100mM。一般的沉淀剂包括(NH4)2SO4、MgSO4、NaCl、MPD、乙醇、各种尺寸的聚乙二醇、异丙醇、KCl等(Ducruix)。
多种添加剂可用于帮助改善晶体的性质，如下面的第2部分所述，包括底物类似物、配体或抑制剂以及某些添加剂，它们包括但不限于5％Jeffamine5％聚丙二醇P4005％聚乙二醇4005％乙二醇5％2-甲基-2，4-戊二醇5％甘油5％二氧六环5％二甲基亚砜5％正辛醇100mM(NH4)2SO4100mM CsCl100mM CoSO4100mM MnCl2100mM KCl
100mM ZnSO4100mM LiCl2100mM MgCl2100mM 葡萄糖100mM 1，6-己二醇 100mM硫酸葡聚糖100mM 6-氨基己酸100mM 1，6-己二胺100mM 1，8-辛二胺100mM 精脒100mM 精胺0.17mM 正十二烷基-β-D-麦芽糖苷NP 4020mM 正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷根据本发明的一个发现，全长β分泌酶至少含有一个跨膜域，使用去垢剂(Triton X-100)有助于其纯化。膜蛋白可完整地结晶，但可能需要特殊的条件，例如添加非离子型去垢剂，例如C8G(8-烷基-β-葡萄糖苷)或正烷基-麦芽糖苷(CnG)。对该去垢剂的选择在一定程度上是经验性的，但某些去垢剂是普遍使用的。通过将高浓度的盐加入混合物，已成功地“盐析”出许多膜蛋白。还使用PEG成功地沉淀出许多膜蛋白(Ducruix等，同上)。此外，如上所述，与抑制剂结合但缺乏跨膜域的蛋白C末端截短形式例如β分泌酶46-452也结晶。
在确定结晶条件之后，可使用本领域共知的方法如蒸汽扩散或平衡透析来获得大量蛋白的结晶。在蒸汽扩散中，使一滴蛋白溶液对一较大量含沉淀剂或另一脱水剂的混合溶液平衡。在密封后，使该溶液平衡，以获得过饱和的蛋白浓缩物，并由此在该液滴中诱发结晶。
平衡透析可用于在低离子强度下使蛋白结晶。在这些条件下，发生“盐溶”现象，借此所述蛋白分子通过与其他蛋白分子相互作用而达到静电荷平衡。当蛋白在较低的离子强度下溶解度低时，该方法特别有用。使用了多种装置和方法，包括微量扩散细胞，其中将透析膜附在其下部可弯曲的毛细管的底部。通过慢慢地改变外部溶液的组成来获得最终的结晶条件。对这些方法的一个改进是利用了一个浓度梯度平衡透析装置。微量扩散细胞可从供应商如Hampton Researsh(Laguna Niguel，CA)处获得。
一旦获得结晶，就用纯度(例如SDS-PAGE)和生物学活性来表征晶体。优选较大的晶体(＞0.2mm)，以增加X射线衍射的分离度，其优选在10-1.5埃的级别上。对所选的晶体进行X射线衍射，并使用强的单色X射线源，例如同步加速源或旋转阳极发生器。使用本领域共知的方法分析得到的X射线衍射图案。
在一种应用中，在计算机可读媒体中记录β分泌酶氨基酸序列和/或X射线衍射数据，计算机可读媒体指任何可由计算机读取和直接接入的任何媒体。这些数据可用于构建酶、其亚结构域或其配体的模型。可用于此应用的计算机算法是可商购的。
2.蛋白与抑制剂的结晶如上所述，在结合配体如抑制剂的存在下使蛋白共结晶是有利的。通常，在蛋白结晶的最优化过程之后，在沉淀阶段中加入大于1mM浓度的抑制剂配体。也将这些晶体与在配体存在下形成的晶体相比较，从而可测量配体结合位点。也可在一“浸润”过程中将1-2μl的0.1-25mM抑制剂配体加入含晶体的液滴中，该晶体是在抑制剂不存在的条件下长成的。基于结合位点的坐标，实现进一步的抑制剂最优化。这些方法有利地用于发现HIV蛋白酶的更强的新抑制剂(参见Viswanadhan，V.N.等，药物化学杂志(J.Med.Chem.)39705-712，1996；Muegge，I.等，药物化学杂志(J.Med.Chem.)42791-804，1999)。
用于这些共结晶和浸润实验中的一种抑制剂配体是P10-P4’staD→V(SEQ ID NO72)，其为一上述的抑制素肽抑制剂。制备该分子的方法如本文所述。将该抑制剂与β分泌酶混合，使混合物进行同样的上述最优化实验，并集中精力研究那些为酶本身而设计的条件。根据本领域熟知的方法，确定坐标并在游离和配体结合型酶之间进行比较。可通过将酶的抑制浓度与这些坐标相比较，进行进一步的比较，例如Viswanadhan等(同上)所述。对这些比较进行分析，从而指导使用该方法对其他抑制剂进行设计。
D.β分泌酶的生物学活性1.天然存在的β分泌酶在支持本发明的研究中，使用一种或多种天然的或合成的底物，测试经分离的、纯化形式的β分泌酶的酶活性。例如，如上所述，当利用实施例5A所述的方法从人脑制备β分泌酶并纯化至具有均质性时，在还原(+β-巯基乙醇)条件下在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上使来自阴离子交换层析(上一步骤)的样品级分进行电泳后，通过银染法观察到单一的条带。如上表1所列，该级分具有近1.5×109nM/h/mg蛋白的比活，其中通过水解MBP-125SW来测量活性。
1.经分离的重组β分泌酶从转染细胞中产生并纯化出酶的各种重组形式。由于这些细胞用于酶的过量产生，因此已发现，可缩短针对酶的天然存在形式所述的纯化方案(例如实施例5A)，并得到阳性结果。例如，如实施例6所述，293T细胞用pCEK克隆27转染(
图12和
图13A-E)，Cos A2细胞用pCFβA2利用“FUGENE”6转染试剂(Roche MolecularBiochemicals Research，Indianapolis，IN)转染。通过在HindIII和EcoRI位点之间插入SEQ ID NO80，由从Invitrogen购买的亲本载体pCDNA3构建载体pCF(
图11A)。此序列包括腺病毒主要晚期启动子三联前导序列和一杂合剪接位点，该杂合剪接位点从腺病毒主要晚期区第一外显子和内含子与一人工合成的IgG可变区剪接受体生成。
pCDNA3用限制性内切酶HindIII和EcoRI切开，然后用DNA聚合酶I的Klenow片段补平末端。经切割和末端补平的载体经凝胶纯化，并与经分离的来自pED.GI的片段连接。通过用PvuII和SmaI消化来制备pED片段，然后凝胶纯化所产生的419个碱基对的片段，该片段进一步根据其方向来进行筛选，并通过测序来证实。
为了制备pCEK表达载体，将来自pCF的表达盒转染到EBV表达载体pCEP4(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。用BglII和XbaI切割pCEP 4，补平，将含pBR、潮霉素和EBV序列的9.15kb大片段连接到含表达盒(CMV、TPL/MLP/Igg剪接位点、Sp6、SVpolyA、M13侧翼区)的pCF的1.9kb的NruI至XmnI片段上。pCFβA2(克隆A2)在载体pCF中含有全长β分泌酶。pCF载体在COS和293T细胞中复制。在所有情况下，细胞被制成沉淀团粒，从该团粒制备粗颗粒部分。该部分用含0.2％Tritin X-100的缓冲剂提取。Tritin提取物用pH 5.0的缓冲剂稀释，走SP琼脂糖凝胶柱。在pH调至4.5之后，浓缩含β分泌酶活性的级分，如针对脑中的酶所述，有些还在P10-P4D→V琼脂糖凝胶上进行进一步纯化。对级分进行银染色，在凝胶上显示出经共纯化的条带。对对应于这些带的级分进行N末端氨基酸测定。这些实验的结果显示，在级分中存在着β分泌酶种类的一些异质性。这些种类代表酶的不同形式；例如，来自293T细胞的酶的一级N末端与脑中的相同，而在后者中(相对SEQ ID NO2)第46位氨基酸是N末端。还可观察到小量的蛋白，其起点紧挨在信号序列后(第23位残基)并位于天冬氨酰基蛋白酶同源结构域的起点处(Met-63)。在Cos A2细胞中发现另一主要形式，其来自在Gly-58处的切割。这些结果列于上表3中。
2.比较经分离的、天然存在的β分泌酶和重组体β分泌酶如上所述，源自人脑的天然存在的β分泌酶以及该酶的重组形式在切割APP时表现出活性，其证据特别为在MBP-C125测定中表现出活性。而且，来自酶的天然存在形式的关键肽序列与推导出的由克隆所述酶产生的序列的部分匹配。在另外的实验中，可进一步证实这两种酶作用相同，在所述另外的实验中，发现不同的抑制剂对每一种酶具有非常相似的亲合性，这通过在相似的测定条件下比较针对各酶所测量的IC50值来估测。这些抑制剂的发现与如下所述的本发明的另一方面一致。重要的是，当在同一实验中比较时，在由脑衍生的和重组的酶制品中，这些抑制剂产生几乎相等的IC50值和效力等级。
在进一步的研究中，在具有C末端flag序列“FLp501”的全长重组酶(SEQ ID NO2，+SEQ ID NO45)和在第452位上截短的重组酶“452Stop”(SEQ ID NO58或SEQ ID NO59)之间进行比较。如上所述，两种酶在切割β分泌酶底物如MBP-C125中表现出活性。酶的C末端截短形式具有切割MBP-C125sw底物以及P26-P4’底物的活性，对于所测的不同抑制剂药物，其效力等级相似。此外，对于用相同的抑制剂测试的两种酶，绝对IC50是可比的。所有IC50均小于10μM。
1.细胞β分泌酶支持本发明的进一步实验揭示，本文所述的经分离的β分泌酶多核苷酸序列编码β分泌酶或在细胞中有活性的β分泌酶片段。本部分描述支持本发明的实验。细胞用编码β分泌酶的DNA单独转染，或者，如实施例8所述，用编码β分泌酶的DNA和编码野生型APP的DNA共转染。
a.使用β分泌酶转染在支持本发明的实验中，将含表达全长多肽(SEQ ID NO2)的基因的克隆转染到COS细胞中(Fugene和Effectene的方法)。根据本领域公知的标准方法或如本文实施例4所述，制备全细胞溶胞产物并测试不同量的溶胞产物中的β分泌酶活性。
图14B显示了这些实验的结果。正如该图所示，从转染的细胞制备的溶胞产物在MPB-C125sw测定中表现出相当的酶活性，表示β分泌酶被这些细胞“超量表达”，而从模拟的或对照细胞中制备的溶胞产物则不表现酶活性。
b.使用β分泌酶和APP共转染细胞在进一步的实验中，如实施例8所述，293T细胞用含全长β分泌酶分子(1-501；SEQ ID NO2)的pCEK克隆27(
图12和13)或poCK载体、以及含野生型或Swedish APP构建体pohCK751的质粒共转染。利用ELISA和Western分析法分析β特异性切割，以证明在正确的切割位点发生了切割。
简言之，根据标准方法，用等量的编码βAPPsw或wt和β分泌酶或对照β半乳糖苷酶(β-gal)cDNA的质粒共转染293T细胞。βAPP和β分泌酶cDNA经载体pohCK或pCEK传递，这此载体不在293T细胞中复制(pCEK-克隆27，
图12和13；表达βAPP751的pohCK751，图21)。在转染后48小时，收集条件培养基和细胞溶胞产物。用条件培养基和细胞溶胞产物进行Western测定。在条件培养基上进行用于检测Aβ肽的ELISA，以分析不同的APP切割产物。Western印迹结果已知，β分泌酶特异性地在APPwt中的Met-Asp处和APPsw中的Leu-Asp处切割，以产生产生Aβ肽，起始于第1位并释放可溶的APP(sAPPβ)。如引入本文作为参考的美国专利5721130所述，已经开发出一类免疫试剂——具体为抗体92和92sw(或192sw)，特异性地检测在APPwt和APPsw底物中的所述位置上发生的切割。Western印迹分析在凝胶上进行，在该凝胶上将细胞溶胞产物进行分离。使用本领域熟知的方法进行这些测定，其中使用一级抗体试剂Ab92或Ab92S，它们分别对源自APPwt和APPsw的APP的N末端片段的C末端具有特异性。此外，使用对所述C末端片段的N末端氨基酸特异的抗体进行ELISA测定。
单克隆抗体13G8(对APP的C末端，即APP695的675-695位上的表位是特异的)用于Western印迹实验，以确定转染的细胞是否表达APP。
图15A显示，得到了可再现的转染，并且APP的表达水平大大过量于内源水平(在
图15A中以1、2、3表示平行的三个孔)。可在用APPwt和APPsw转染的细胞中观察到APP的三种形式——成熟的、未成熟的和内源形式。当β分泌酶用APP共转染时，较小的C末端片段出现在三个平行孔的泳道中，其来自共转染细胞(Western印迹，
图15A，最右边一组泳道)。在平行实验中，细胞用β分泌酶和APPsw底物共转染，所有成熟的APP都被切割(
图15B，最右边的标有“1，2，3”的一组泳道)。这说明β分泌酶对溶胞产物中的成熟APP(上方的条带)普遍进行了切割，由于在β分泌酶位点处切割，产生了具有预期大小的C末端片段。与Swedish底物共转染还导致增加两种不同尺寸的CTF片段(用星号表示)。连同下述附加的Western和ELISA结果，这些结果均与在β分泌酶位点上进行了初次切割之后在APPsw底物上发生的第二次切割一致。
分析来自细胞的条件培养基，分析其与对β-s-APPsw特异的192sw抗体的反应性。使用该抗体进行的分析显示，由β分泌酶切割的可溶性APP显著增加。通过比较存在于“APPsw βsec”样品中的黑带和存在于“APPsw βgal”样品中的条带，在
图16B所示的凝胶上观察到这一结果。如
图16A中所示，对β-s-APPsw特异的抗体也指示出，被β分泌酶切割的材料有所增加。
由于在这些实验中使用的抗体对β分泌酶切割位点是特异性的，所以前述结果显示，p501 β分泌酶在该位点上切割APP，该重组克隆的超量表达导致β分泌酶在正确的β分泌酶位点上的加工在整个细胞中显著增强。该加工过程对野生型APP底物有作用，在Swedish APP底物上实质上有所增强。由于293T细胞中的分泌型APP中近20％是β-sAPP，且对于APPsw，所观察到数量有所增加，因此，可能几乎所有的sAPP均为β-sAPP。通过用独立Western测定法测量α-sAPP和总sAPP，进一步证实了这一结论。
单克隆抗体1736对暴露的由α分泌酶切割的β-APP是特异的(Selkoe等)。当使用该抗体作为一级抗体进行Western印迹分析时，观察到由α分泌酶切割的APPwt略微但可再现地减少(
图17A)，也观察到由α分泌酶切割的APPsw材料显著减少(在标有“APPwt βsec”的泳道中几乎不存在反应性，
图17B)。这些结果说明，超量表达的重组p501 β分泌酶如此有效或普遍地切割APPsw，以致没有或几乎没有留下底物供α分泌酶切割。这进一步表明，在APPwt βsec样品中的所有sAPP(如
图16B中所示)均为β-sAPP。AβELISA结果收集来自重组细胞的条件培养基，按需要稀释，在微量滴定板上通过ELISA测试其中Aβ肽的产量，所述微量滴定板用特异性识别Aβ(1-40)C末端的单克隆抗体2G3包被，检测试剂为生物素化mAb3D6，其检测Aβ(x-40)(即，Aβ肽的所有N末端截短形式)。用APPwt超量表达β分泌酶，导致Aβ(x-40)的产量增加近8倍，其中1-40占小部分。Aβ1-40的产量也有实质上的增加(
图18)。采用APPsw，Aβ(x-40)增加近2倍。与β-sec/APPwt细胞相比，Aβ(x-40)β-sec/APPsw细胞的增加较不显著，据认为这一现象被部分归因于一个事实，即APPsw底物的加工比APPwt底物的加工更为有效，但并不受这一特定理论的束缚。大量APPsw是由内源β分泌酶加工的，由此在β分泌酶转染后进一步的增加受到限制。这些数据说明，重组β分泌酶的表达增加了Aβ的产生，且β分泌酶是细胞中Aβ产生的限速因素。这意味者β分泌酶的酶活性是细胞中Aβ产生的限速因素，由此提供好的治疗靶。
IV.应用A.表达β分泌酶的表达载体和细胞本发明进一步包括上述天冬氨酰基蛋白酶家族成员的克隆和表达，例如，通过根据下述标准方法将编码所述蛋白的多核苷酸插入到标准表达载体中并转染适宜的宿主细胞而进行。该表达载体和表达例如本文所述人β分泌酶的细胞可用于，例如，产生用于下面的B部分所描述的筛选实验中的成分(纯化的酶或转染的细胞)。该纯化的酶也可用于为如上面的第III部分所述的酶结晶提供起始原料。具体地讲，据认为酶的截短形式如1-452(SEQ ID NO59)和46-452(SEQ IDNO58)以及本文所述的酶的脱糖基化形式可用于这一方面，被截短到跨膜区之中的其它形式如1-460或46-458也是如此。
β分泌酶、其剪接变体、该蛋白的片段、融合蛋白或其功能等价物在本文统称为“β分泌酶”。根据本发明，编码人“β分泌酶”的多核苷酸序列可用于重组的DNA分子，它们在适宜的宿主细胞中指导β分泌酶的表达。由于遗传密码的内在简并性，可使用编码基本上相同或功能等价的氨基酸序列的其他核酸序列去克隆和表达β分泌酶。这些变化对于本领域的技术人员而言是很容易确定的。
可遗传改造本发明的多核苷酸序列，以便因各种原因而改变β分泌酶的编码序列，所述改变包括但不限于改进基因产物的克隆化、加工和/或表达。例如，所述改变可使用本领域熟知的技术如定点诱变引入，以插入新的限制位点、改变糖基化模式、改变密码子的优选性、产生剪接变体等。例如，有利的是，产生具有非天然存在密码子的β分泌酶编码性核苷酸序列。可选择由特定原核生物或真核生物宿主偏爱的密码子(Murray，E.等(1989)核酸研究(Nuc.Acids Res.)17477-508)，例如，以增加β分泌酶多肽的表达率或产生重组的RNA转录物，该转录物具有所希望的特性，例如与从天然存在的序列产生的转录物相比具有更长的半衰期。这特别适用于在非哺乳动物细胞如细菌、酵母或昆虫细胞中产生重组酶。本发明还包括重组的构建体，其包括广泛的上述序列中的一种或多种。构建体包括载体，例如质粒或病毒载体，其中以正向或反向插入有本发明的序列。在该实施方式的一个优选方面，构建体进一步包括调控序列，包括如启动子，其可操作地连接到该序列上。大量的合适载体和启动子是本领域的技术人员公知的，并且是可商购的。适用于与原核生物或真核生物宿主一起使用的克隆和表达载体也请参见Sambrook等(同上)。
本发明还涉及用本发明载体遗传改造的宿主细胞，和用重组技术产生本发明的蛋白和多肽的方法。宿主细胞是用本发明的载体遗传改造的(即，转导、转化或转染)，载体可以是例如克隆载体或表达载体。载体可以是例如质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。所制造的宿主细胞可在经改良的常规营养培养基中培养，因其适用于激活启动子、选择转化体或扩增β分泌酶基因。培养条件如温度和pH等是与先前被选择用于表达的宿主细胞所使用的那些条件，其对于本领域的技术人员而言是明显的。在本文实施例6中提供了转染各细胞类型的典型方法。
如上所述，根据本发明的一优选实施方式，宿主细胞可用酶底物共转染，例如用APP(如野生型或Swedish突变型)共转染，以测量细胞环境中的活性。这些宿主细胞特别适用于本发明的筛选实验，特别适用于筛选可穿过细胞膜的治疗剂。
本发明的多核苷酸可包括在多种适于表达多肽的表达载体中的任何一种之中。这些载体包括染色体、非染色体和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；从质粒和噬菌体DNA、病毒DNA如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒和假性狂犬病病毒的组合衍生的载体。但是，可使用任何其他的载体，只要它在宿主中可复制并可存活。适宜的DNA序列可通过多种方法插入到载体中。通常，通过本领域公知的方法，将DNA序列插入到适宜的限制性内切酶位点中。这些方法和相关的亚克隆方法是在本领域技术人员知识范围之内的。
表达载体中的DNA序列可操作地与适宜的转录调控序列(启动子)连接，以指导mRNA的合成。这些启动子的例子包括CMV、LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体λPL启动子和其他已知用于调控原核生物或真核生物细胞或其病毒中基因表达的启动子。表达载体还含有用于启始翻译的核糖体结合位点和一转录终止子。载体也可包括适宜的序列，用于增强表达。此外，表达载体优选包含一种或多种可选的标记基因，以便为选择已转化的宿主细胞提供表型特征，例如为真核生物细胞培养物提供二氢叶酸还原酶或新霉素抗药性，或例如为大肠杆菌提供四环素或氨苄青霉素抗药性。
含上述适宜的DNA序列和适宜的启动子或调控序列的载体可用于转化适宜的宿主，以使该宿主表达蛋白。适宜的表达宿主的例子包括细菌细胞，例如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，例如酵母；昆虫细胞，例如果蝇和草地夜蛾Sf9；哺乳动物细胞，例如CHO、COS、BHK、HEK 293或Bowes黑色素瘤；腺病毒；植物细胞等。可理解的是，并非所有细胞或细胞系均可产生有完全功能的β分泌酶；例如，人β分泌酶在天然形式中可能是高度糖基化了的，且该糖基化可能是活性所必需的。在此情况下，可优选真核宿主细胞。基于本文的描述，选择适宜的宿主应是在本领域技术人员的知识范围内的。本发明不受所使用的宿主的限制。
在细菌系统中，可根据针对β分泌酶的用途而选择出一些表达载体。例如当需要大量的β分泌酶或其片段去诱导抗体时，指导易于纯化的融合蛋白高水平表达的载体可能是合乎需要的。这些载体包括但不限于多功能的大肠杆菌克隆和表达载体如Bluescript(R)(Stratagene，La Jolla，CA)，其中β分泌酶的编码序列可连接到载体中，该编码序列与β半乳糖苷酶氨基末端Met和随后7个残基的序列的读码框相符，从而产生一杂交蛋白；pIN载体(Van Heeke和Schuster(1989)生物化学杂志(J Biol Chem)2645503-5509)；pET载体(Novagen，MadisonWI)等。
在发面酵母中，可使用一些含组成型或可诱导型启动子如α因子、醇氧化酶和PGH的载体。综述参见Ausubel等(同上)和Grant等(1987；酶学方法(Methods In Enzymology)153516-544)。
在使用植物表达载体的情况中，β分泌酶的编码序列的表达可由许多启动子中的任何一个驱动。例如，病毒启动子如CaMV的35S和19S启动子(Brisson等(1984)自然(Nature)310511-514)可单独使用或与来自TMV的Ω前导序列结合使用(Takamatsu等(1987)EMBO J 6307-311)。此外，也可使用植物启动子如RUBISCO的小亚基(Coruzzi等(1984)EMBO J 31671-1680；Broglie等(1984)科学(Science)224838-843)；或热休克启动子(Winter J和SinibaldiRM(1991)或然性细胞分化结果(Results.Probl.Cell Differ.)1785-105)。这些构建体可通过直接DNA转化或病原体介导的转染而导入植物细胞中。有关这些技术的综述，参见Hobbs S或Murry LE(1992)McGraw Hill科学技术年鉴(McGraw Hill Yearbook Of ScienceAnd Technology)，McGraw Hill，New York，N.Y.，pp 191-196；或Weissbach和Weissbach(1988)植物分子生物学方法(Methods For PlantMolecular Biology)，Academic Press，New York，N.Y.，pp 421-463。
β分泌酶也可在昆虫系统中表达。在一个这样的系统中，苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcNPV)被用作载体，在草地夜蛾Sf9细胞或在银纹夜蛾幼虫中表达外源基因。β分泌酶编码序列被克隆到病毒的非必要区如多角体蛋白基因中，并置于多角体蛋白启动子的调控下。成功插入Kv-SL编码序列将使多角体蛋白基因失活并产生缺乏外壳蛋白外壳的重组病毒。然后，将重组病毒用于感染草地夜蛾细胞或银纹夜蛾幼虫，在其中β分泌酶得以表达(Smith等(1983)病毒学杂志(J Virol)46584；Engelhard EK等(1994)国家科学院进展(ProcNat Acad Sci)913224-3227)。
在哺乳动物宿主细胞中，可使用许多病毒基表达体系。当将腺病毒用作表达载体时，β分泌酶编码序列可连接到腺病毒转录/翻译复合体中，该复合体由晚期启动子和三联前导序列组成。在病毒基因组的非必要E1或E3区的插入，将导致产生能够在被感染的宿主细胞中表达所述酶的能存活的病毒(Logan和Shenk(1984)国家科学院进展(Proc Nat Acad Sci)813655-3659)。此外，转录增强子如劳氏肉瘤病毒(RSV)增强子可用于提高在哺乳动物宿主细胞中的表达。
对于有效地翻译β分泌酶编码序列，特定的起始信号也是需要的。这些信号包括ATG起始密码子和邻近的序列。当将β分泌酶编码序列、其起始密码子和上游序列插入适宜的表达载体中时，可以不需要其它的翻译调控信号。而当只插入编码序列或其一部分时，必须提供包括ATG起始密码子的外源调控信号。而且，起始密码子必须位于正确的读框中，以确保转录整个插入片段。外源转录元件和起始密码子可以是不同来源的，包括天然和合成的。通过将适宜的增强子引入到所用的细胞系统中，可增强表达的有效性(Scharf D等(1994)或然性细胞分化结果(Results.Probl.Cell Differ.)20125-62；Bittner等(1987)酶学方法(Methods In Enzymology)153516-544)。
在另一实施方式中，本发明涉及含上述构建体的宿主细胞。该宿主细胞可以是较高级的真核细胞如哺乳动物细胞，或较低级的真核细胞如酵母细胞，或该宿主细胞也可是较低级的原核细胞如细菌细胞。向宿主细胞中引入构建体，可由磷酸钙转染、由DEAE-右旋糖苷介导的转染或电穿孔(Davis，L.，Dibner，M.和Battey，I.(1986)分子生物学基本方法(Basic Methods In Molecular Biology))来实现，或通过更新的方法包括用“FUGENE”(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)或“EFFECTENE”(Quiagen，Valencia，CA)的类脂转染或其他DNA载体分子来实现。利用由本发明的DNA构建体衍生的RNA，可将无细胞翻译系统用于产生多肽。
可根据其以所期望的方式调节插入序列的表达或加工所表达的蛋白的能力，来选择宿主细胞株。对蛋白的这些修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酰化、类脂化和酰化。对于正确插入、折叠和/或发挥功能而言，切割一蛋白的“prepro”形式的翻译后加工也是很重要的。例如，在β分泌酶的情况中，SEQ ID NO2的N末端可能是截短了的，从而所述蛋白起始于SEQ ID NO2的第22、46或57-58位氨基酸。针对所述的翻译后活性，不同的宿主细胞如CHO、HeLa、BHK、MDCK、293、WI38等具有特定的细胞机构和特征性的机理，可对它们进行挑选，以确保对所引入的外源蛋白进行正确的修饰和加工。
对于长期、高效地产生重组蛋白，可优选稳定的表达。例如，可使用含病毒复制起点或内源表达元件和一可选的标记基因的表达载体，转化稳定表达β分泌酶的细胞系。在引入载体之后，可使细胞在滋养培养基中生长1-2天，然后将它们换到选择性培养基中。使用可选标记的目的是赋予选择抗性，该抗性的存在使成功表达所引入的序列的细胞能够生长和得以回收。具有抗性的稳定转化细胞群可使用适合于该细胞类型的组织培养技术来进行繁殖。例如，在支持本发明的实验中，实现了酶的“452终止”形式的超量表达。
用β分泌酶编码核酸转化的宿主细胞可以在适用于从细胞培养物中表达和回收所编码的蛋白的条件下培养。由重组细胞产生的蛋白或其片段可以是分泌型、膜结合型或包含于细胞中的，这取决于使用的序列和/或载体。正如本领域技术人员可理解的，可用信号序列设计含有编码β分泌酶的多核苷酸的表达载体，所述信号序列指导β分泌酶多肽穿过原核或真核细胞的细胞膜。
β分泌酶也可作为重组蛋白得以表达，其中加入了一个或多个附加的多肽结构域，以有助于蛋白的纯化。该助纯化结构域包括但不限于金属螯合肽如组氨酸-色氨酸模块，其允许在固定化金属上进行纯化；蛋白A结构域，其允许在固定化免疫球蛋白上进行纯化；和用于FLAGS延伸/亲合纯化系统的结构域(Immunex Corp，Seattle，Wash.)。将可被蛋白酶切割的多肽接头序列加入到上述纯化结构域和β分泌酶之间，可用于帮助纯化。提供了这样的一个表达载体，用于表达包括β分泌酶(例如可溶性β分泌酶片段)的融合蛋白，该β分泌酶融合到由肠激酶切割位点分开的一多组氨酸区上。组氨酸残基促进在IMIAC(固定化金属离子亲合层析，参见Porath等(1992)蛋白表达和纯化(Protein Expression and Purification)3263-281)上纯化，同时肠激酶切割位点提供一种从融合蛋白中分离β分泌酶的手段。pGEX载体(Promega，Madison，Wis.)也可用于表达外源多肽为包含谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这样的融合蛋白是可溶性的，可通过吸附到配体-琼脂糖珠(例如，在GST-融合情况中为谷胱甘肽-琼脂糖)上及随后在游离配体的存在下洗脱，而易于从溶解了的细胞中纯化出来。
转化合适的宿主株，使该宿主株生长到适宜的细胞密度，然后利用适宜的方法(例如改变温度或化学诱导)诱导所选的启动子，并再将细胞培养一段时间。细胞一般通过离心来收集、通过物理或化学方法来破裂，并保留所产生的粗提取物以进一步纯化。可利用任何常规方法来破裂用于表达蛋白的微生物细胞，包括冷冻-解冻循环、超声波破碎法、机械破裂、溶胞剂的使用或其他方法，它们为本领域技术人员所熟知。
β分泌酶可通过本领域熟知的许多方法中的任何一种从重组细胞培养物中回收并纯化，或者优选通过本文所述的纯化方案来获得。当必要时，可将蛋白重折叠步骤用于完成成熟蛋白构象的形成。纯化β分泌酶的天然存在形式的方法和经纯化的形式详述于实施例中。
B.选择β分泌酶抑制剂的方法本发明还包括识别分子如合成药物、抗体、肽或其他分子的方法，这些分子对本文所述β分泌酶的活性有抑制作用，通常，它们被称作该酶的抑制剂、拮抗剂或阻断剂。这一实验包括提供人β分泌酶的步骤，所述人β分泌酶例如是包括SEQ ID NO2、SEQ ID NO43的β分泌酶，对于本发明，其特别是指一长约450个氨基酸残基的经分离的蛋白，其包括与SEQ ID NO75[63-423](如本文所述，包括其具有β分泌酶活性的保守替换物)至少90％相同的氨基酸序列。如下所述，使β分泌酶与测试化合物接触，以确定其是否具有调节所述酶活性的作用，并从测试化合物中选出能调节β分泌酶活性的化合物。抑制性化合物(拮抗剂)特别可用于治疗伴随有淀粉状蛋白沉积的病状，特别是早老性痴呆。本领域技术人员可理解，该实验可方便地转化为试剂盒。
特别有用的筛选实验使用同时表达β分泌酶和APP的细胞。可以如上文第III部分所述通过用编码该蛋白的多核苷酸共转染细胞而重组性地制备这些细胞，或者，也可通过用这两种蛋白之一转染天然含有第二种蛋白的细胞而进行制备。在一特别的实施方式中，所述细胞可在多孔培养板中生长，接触测试化合物的不同浓度达预定长的时间，该时间长度可凭经验确定。测定全细胞溶胞产物、培养基或细胞膜的β分泌酶活性。与对照相比，具有显著抑制活性(如下所述)的测试化合物被认为是候选治疗剂。
经分离的β分泌酶、其配体结合性、催化性或免疫原性片段或其寡肽可用于在多种药物筛选技术中的任一种中筛选治疗性化合物。用于这种实验的蛋白可以是与膜结合的、在溶液中游离的、附于固相载体上的、在细胞表面产生的或位于细胞内的。可测量β分泌酶与所测物质的结合复合体的形成。在这一实验中，可测定抑制β分泌酶与其底物如APP或APP片段结合的化合物。优选检测酶活性，并基于抑制该活性的能力选择候选化合物。更具体而言，如果在测试化合物存在下所测得的β分泌酶活性显著低于其不存在时所测得的β分泌酶活性，则认为该化合物是β分泌酶的抑制剂。在本文的叙述中，术语“显著低于”是指，当与测试化合物不存在时所测得的酶活性相比时，所述酶在测试化合物存在下表现出可测的较低的酶活性，该活性在该测定法的置信范围内。可通过Km和/或Vmax的变化、单一测定终点分析或本领域的任何其他标准技术，评价这类测量值。测定β分泌酶的典型方法述于本文的实施例中。
例如，在支持本发明的研究中，基于化合物抑制β分泌酶在MBP-C125测定中的活性的能力，对这些化合物进行选择。选择在低于约50μM的浓度下抑制酶活性的化合物，进行进一步筛选。
最可能具有抑制活性的化合物组包括本发明的另一方面。基于支持本发明的研究，已确定本文所述的肽化合物P10-P4’staD→V(SEQ IDNO72)是所述酶的相当强的抑制剂。对基于此序列和其部分的肽模拟物的进一步研究揭示出许多小分子抑制剂。
也可筛选肽或其他化合物的随机文库，以筛选出适合作为β分泌酶抑制剂的化合物。可产生针对许多化合物类型的组合文库，所述化合物可以以逐步的方式合成。这样的化合物包括多肽、β转角模拟物、多糖、磷脂、激素、前列腺素、类固醇、芳香族化合物、杂环化合物、苯并二氮杂_、寡聚N取代的甘氨酸和寡聚氨基甲酸酯。化合物的大组合文库可通过编码合成文库(encoded synthetic libraries，ESL)方法来构建，所述方法请参见Affymax，WO 95/12608；Affymax，WO93/06121；Columbia University，WO 94/08051；Pharmacopeia，WO95/35503和Scripps，WO 95/30642(它们均引入本文作为参考)。
测试化合物的一优选用于筛选治疗剂或治疗性先导化合物(leads)的来源是噬菌体展示文库。参见，例如Devlin，WO 91/18980；Key，B.K.等编辑的“肽和蛋白的噬菌体展示，实验室手册”(PhageDisplay of Peptides and Proteins，A Laboratory Manual)，AcademicPress，San Diego，CA，1996。噬菌体展示是一种有力的技术，其允许利用噬菌体遗传学从含108-109种不同序列的文库中选择并扩增具有目标特性的肽或蛋白。可针对在目标位置上氨基酸序列的选择多样性来设计文库，允许文库向目标特征偏移。对文库的设计应使被表达的肽与在噬菌体表面上展示的蛋白融合。选择展示具有目标特性的肽的噬菌体，使之继续生长扩增。由于肽通过噬菌体的繁殖而扩增，因此可容易地对来自所选噬菌体的DNA测序，以有助于快速分析所选的肽。
可通过选择特异性结合β分泌酶蛋白的噬菌体，来选择编码肽抑制剂的噬菌体。所生成的文库与在噬菌体表面上表达的蛋白例如基因II融合。文库可由各种长度、线性的或因包括两个Cys氨基酸而受约束的、融合到噬菌体蛋白上或也可融合到其他作为支架的蛋白上的肽组成。人们可以以由随机氨基酸组成的文库开始，或以偏向围绕β分泌酶切割位点的βAPP底物中的序列、或优选偏向于SEQ ID NO72中所示的D→V替换位点的文库开始。也可设计偏向于本文所述肽的抑制剂和底物、或偏向于从所选的结合型噬菌体获得的肽序列的文库，所述结合型噬菌体来自提供附加测试抑制剂化合物的初始文库。
将β分泌酶固定化，将噬菌体特异性地结合到所选的β分泌酶上。用限定因素来进一步指导噬菌体选择活化位点特异性化合物，例如要求噬菌体在已知的β分泌酶的活性位点抑制剂存在下不发生结合(例如本文所述的抑制剂)。差别选择形式可导致其复杂化。可使用标准技术(参考有关噬菌体的书籍)，将高度纯化的源自脑或优选源自重组细胞的β分泌酶固定到96孔塑料板上。也可使用重组的β分泌酶，其被设计用于与肽融合，所述肽(例如抗生物素蛋白链菌素或适宜的抗体)可与固定到塑料培养皿上的另一蛋白(例如抗生物素蛋白链菌素结合基元、His、FLAG或myc标志)结合。将噬菌体与已结合的β分泌酶一起温育，通过洗涤除去未结合的β分泌酶。洗脱噬菌体，重复该选择直到回收到一群与β分泌酶结合的噬菌体。使用标准技术进行结合和洗脱。
也可通过在生长于培养皿上的Cos或其他哺乳动物细胞中表达β分泌酶而使其“结合”。在这种情况下，人们应选择结合到β分泌酶表达性细胞上的噬菌体，不选择结合到对照细胞上的噬菌体，这些对照细胞不表达β分泌酶。
也可使用噬菌体展示技术来选择β分泌酶的优选底物，并将由噬菌体展示获得的优选底物肽的明确特性引入抑制剂中。
在β分泌酶的情况中，对在APP切割位点周围的氨基酸序列和APPsw切割位点的认识提供了用于建立噬菌体展示筛选文库的信息，以识别β分泌酶的优选底物。如上所述，对本文所述的特别好的肽抑制剂P10-P4staD→V的序列的认识提供了用于建立“偏向”于该序列的文库的信息。
例如，将含108种不同序列的肽底物文库融合到在噬菌体表面表达的蛋白(例如，基因III蛋白)和可用于结合抗生物素蛋白链菌素的序列上，或融合到另一蛋白如His标志和His抗体上。用蛋白酶消化噬菌体，通过与适宜的固定化结合蛋白如抗生物素蛋白链菌素结合，除去未消化的噬菌体。重复该选择，直至回收到一群编码底物肽序列的噬菌体。对噬菌体中的DNA测序，以得到底物序列。然后，将这些底物用于进一步开发肽模拟物，特别是具有抑制性的肽模拟物。
在最初，通过测定与β分泌酶结合或优选在本文所述实验或其他本领域已知的实验中抑制β分泌酶活性的能力，针对适用性来筛选组合文库和其他化合物。接着，进一步针对在这些实验中的效力来分析由该筛选识别的化合物。然后，可测试抑制剂化合物在被诱发淀粉状蛋白产生性疾病的转基因动物中的预防和治疗效果，所述动物例如为携有人含APP的转基因的各种啮齿类动物，例如携有APP的717突变的小鼠，如Games等(自然(Nature)373523-527，1995)和Wadsworth等(US 5811633、US 5604131、US 5720936)所述，和携有APP的Swedish突变的小鼠，例如，参见McConlogue等(US 5612486)和Hsiao等(US 5877399)；Staufenbiel等，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94，13287-13292(1997)；Sturchler-Peirrat等，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94，13287-13292，(1997)；Borchelt等，神经元(Neuron)19，939-945(1997)，所有这些文献均引入本文作为参考。
被发现在这些动物模型中有效并安全的化合物或药物在标准毒理学实验中接受进一步测试。将显示出适宜的毒理学和药物动力学分布的化合物移至针对早老性痴呆和相关疾病的治疗的人临床试验中。可将同样的筛选方法用于其他的潜在药物，例如，上述肽模拟物。
通常，在基于前述实验选择治疗性化合物时，有用的是，确定测试化合物是否具有可接受的毒性分布，例如在各种活体外细胞和动物模型中的毒性分布。在现有的化合物数据库中搜索所测试并识别的化合物也是有用的，其用于确定该化合物或其类似物是否在先前曾用于药学目的，和当曾用于药学目的时确定其最佳给药途径和剂量范围。另外，可使用本领域熟知的方法(参见例如Benet，L.Z.等，药物动力学(Pharmacokinetics)，“Goodman和Gilman治疗剂的药理学基础”(Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis Of Therapeutics)第九版，Hardman，J.D.等编辑，McGraw-Hill，New York，1966)，凭经验确定给药途径和剂量范围，所述方法被用于标准的动物模型，例如转基因的PDAPP动物模型(例如Games，D.等，自然(Nature)373523-527，1995；Johnson-Wood，K.等，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94，1550-1555，1997)。为了最优化化合物活性和/或特异性，可能可取的是构建一近邻(near-neighbor)类似物文库，以搜索具有更高特异性和/或活性的类似物。合成近邻和/或靶向化合物文库的方法在组合文库领域是熟知得。
C.抑制剂和治疗剂上面的B部分描述了筛选具有β分泌酶抑制剂活性的化合物。简言之，为筛选β分泌酶的强的和选择性的抑制剂的具体方法提供了指导。重要的是，实施者被引向一特定的肽底物/抑制剂序列和其它来源，所述肽底物/抑制剂序列例如为P10-P4’staD→V，基于其进行药物设计，所述其它来源例如为偏向性的噬菌体展示文库，其应提供附加的先导化合物。
还给实施者提供了充分的指导，以便对酶结合位点的进一步精修，例如，通过根据本文提供的方法使经纯化的酶结晶进行。这一成功对于HIV蛋白酶抑制剂开发领域是一种促进，因此认为这些努力将导致进一步使本文所述的测试化合物最优化。借助己最优化的化合物，有可能限定化合物药效团，并进一步搜索现有的药效团数据库，例如，由Tripos提供的数据库，以识别与原先发现的化合物可能在二维结构中有所不同但药效团结构和活性相同的其他化合物。在开发的不同阶段，在本文所述的任一抑制剂实验中分析测试化合物。因此，本发明包括β分泌酶抑制剂，其由本文所述的任一方法发现，特别是由抑制剂实验和结晶/最优化方案发现。这些抑制剂是用于治疗早老性痴呆及以Aβ肽沉积为特征的其他淀粉样变性病的治疗性候选物。对于这些治疗性候选物，关于在上面的B部分讨论的治疗指数(毒性)、生物利用度和剂量的考虑也是很重要的。
D.诊断方法本发明还提供了诊断带有增强β分泌酶活性的突变的个体的方法。例如，存在多种家族性早老性痴呆病，其中根本的遗传紊乱仍有待识别。可监测具有该遗传素质的家族的成员，监测其编码β分泌酶的核苷酸序列和/或启动子区域的变化，这是鉴于本文的描述，超量表达所述的酶或具有该酶的更有效催化形式的个体显然可能会产生相对较多的Aβ肽。本文报道了，β分泌酶的量是Aβ在细胞中产生的限速因素，这支持了上述推论。
更具体而言，对被怀疑易患或已患所述疾病的人们以及普通人群中的数人进行筛选，其中，获得其细胞样品如血细胞或成纤维细胞，并测试样品中是否存在β分泌酶基因的遗传突变(例如，与本文描述的SEQ ID NO1相比)。另外，可测试这些个体的细胞的β分泌酶活性。根据此实施方式，可测试一特定的酶制品，对照普通人群中测得的值的正常范围，测定该酶制品对β分泌酶底物的亲合性和/或Vmax是否增加，所述β分泌酶底物例如为本文所述的MBP-C125。其β分泌酶活性比正常值高的个体可能正患早老性痴呆或涉及Aβ肽沉积的其他淀粉状蛋白产生性疾病。
E.治疗动物模型本发明的另一应用是制备某些转基因和/或剔除动物，它们也可用于本发明的筛选实验。特别有用的是超量表达β分泌酶的转基因动物，其例如通过添加小鼠酶的附加拷贝或添加人类酶而形成。该动物可根据本领域熟知的方法(例如，Cordell，US专利5387742；Wadsworth等，US 5811633，US 5604131，US 5720936；McConlogue等，US5612486；Hsiao等，US 5877399；和“处理小鼠胚胎，实验室手册”(Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual)B.Hogan，F.Costantini和E.Lacy，Cold Spring Harbor Press，1986)进行制备，其中用一种或多种在本文中针对β分泌酶所述的构建体取代前述文献中所述的APP构建体，所有这些文献均引入本文作为参考。
与表达内源性β分泌酶的小鼠相比，超量表达β分泌酶的转基因小鼠将从APP底物中制造出更高水平的Aβ和sβAPP。这将有助于分析APP加工过程和候选治疗剂对该加工过程的抑制。在针对β分泌酶转基因的小鼠中，Aβ肽的产生增加，这将使在APP转基因小鼠中观察到的AD样病状恶化。通过将β分泌酶表达性小鼠与显示AD样病状的小鼠(例如PDAPP或Hsiao小鼠)杂交，或通过产生既表达β分泌酶又表达APP转基因的转基因小鼠，可获得上述结果。
将这些转基因动物用于筛选β分泌酶抑制剂，其优点是它们测试这些抑制剂进入脑和在活体内实现抑制的能力。
本发明所构想的另一动物模型是所谓的“剔除小鼠”，其中内源酶或者是永久性缺失的(如美国专利5464764、5627059和5631153所述，它们均以全文引入作为参考)或者是可诱导地缺失的(如US专利4959317所述，其以全文引入作为参考)，或者如下面详细所述，该酶是失活的。该小鼠用作β分泌酶活性的对照，和/或可与APP突变型小鼠杂交以证明发生病态后遗症。该小鼠也可用于筛选其他药物靶，例如特异性针对Aβ沉积病症的药物。
β分泌酶剔除小鼠可作为一个β分泌酶抑制剂的活体内潜在作用模型。对β分泌酶测试抑制剂在活体内的作用和β分泌酶剔除小鼠的表型进行比较，其可有助于指导药物的开发。例如，表型可包括或不包括在对β分泌酶抑制剂进行药物测试过程中观察到的病状。如果所述剔除没有显示出在经药物治疗的小鼠中观察到的病状，则认为该药物非特异性地与除β分泌酶靶以外的其他靶作用。来自所述剔除小鼠的组织可用于建立药物结合实验，或用于进行表达和克隆，以寻找导致这些毒性效应的靶。该信息可用于设计不与这些非目标靶作用的其他药物。剔除小鼠有助于分析β分泌酶抑制剂所固有的潜在毒性。对潜在毒性的认识可帮助指导对药物或药物传递系统的设计，以降低所述毒性。在标准剔除中，可诱导型剔除小鼠特别适用于区别在成年动物中的毒性和在胚胎中的影响。如果该剔除产生胎儿致死作用，则可诱导型剔除将是有利的。
制备剔除小鼠的方法和技术已很成熟，许多商业企业可基于合约制备该小鼠(例如，Lexicon Genetics，Woodland TX；Cell & MolecularTechnologies，Lavallette，NJ；Crysalis，DNX Transgenic Sciences，Princeton，NJ)。方法也是在本领域内可得的(参见Galli-Taliadoros，L.A.等，免疫方法学杂志(J.Immunol.Meth)1811-15，1995)。简言之，需要目标酶的基因组克隆。当如本发明所述已限定了编码蛋白区域的外显子时，有可能在缺乏关于控制转录的调控序列的信息的情况下使基因失活。具体而言，根据本领域熟知的方法(Ausubel；Sambrook)，使用本文提供的序列信息，通过杂交或PCR，可筛选小鼠品系129基因组文库。然后，对如上选择的基因组克隆进行限制酶作图及部分外显子测序，以证实小鼠的同源物，并用该基因组克隆获得信息以构建剔除载体。然后，将适宜的区域亚克隆到带有可选标记的“剔除”载体中，例如一带有neor盒的载体，其使细胞耐受氨基糖苷类抗生素如庆大霉素。进一步建造构建体，以破坏目标基因，例如通过插入一序列置换载体进行，其中可选标记被插入到基因的一个外显子中，在其中它用作诱变剂，干扰基因的协同转录。然后，对载体进行遗传改造，以用于转染到胚胎干(ES)细胞中，并分离适宜的群落。将阳性ES细胞克隆显微注射到经分离的宿主胚泡中，以产生嵌合动物，然后饲养这些动物并筛选出带有突变型等位基因的种系。
根据另一优选的实施方式，可制造β分泌酶剔除小鼠，从而使突变是可诱导的，例如通过将位于β分泌酶基因区域侧翼的lox区插入到该剔除小鼠中进行诱导。然后，将该小鼠与携有位于可诱导启动子下的“Cre”基因的小鼠杂交，至少产生一些同时携有“Cre”和lox构建体的子代。当诱导“Cre”表达时，它用于干扰在lox构建体侧翼的基因。当预期剔除突变可致死时，这一“Cre-lox”小鼠特别有用。此外，它提供了将所选组织如脑中的基因剔除掉的可能性。生成Cre-lox构建体的方法由引入本文作为参考的美国专利4959317提供，由Lexicon Genetics，Woodlands，TX基于合约进行制备。
以下实施例是用于说明而非限制本发明。实施例1人β分泌酶编码序列的分离A.PCR克隆使用Perkin-Elmer试剂盒，反向转录来自IMR人神经母细胞瘤细胞的多聚A+RNA。设计八个简并引物集合体，每个均8倍简并，编码来自经纯化的蛋白的氨基酸序列的N和C末端部分(示于表4；寡核苷酸3407-3422)。PCR反应由来自10ng RNA的cDNA、1.5mM的MgCl2、0.125μl的AmpliTaq_Gold、160μM每种dNTP(加上来自反转录酶反应的额外20μM)、Perkin-Elmer TAQ缓冲剂(来自AmpliTaq_Gold试剂盒，Perkin-Elmer，Foster City，CA)组成，反应体积为25μl。将寡核苷酸引物3407-3414中的每一个与寡核苷酸3415-3422中的每一个结合使用，总计64个反应。在Perkin-Elmer 7700序列检测仪上于下述条件下进行反应95℃时10分钟，以45℃退火15秒、72℃延伸45秒和95℃变性15秒进行4次循环，随后在相同条件但退火温度升高至55℃再进行35次循环。(前述条件在本文称为“反应1的条件”)。在4％的琼脂糖凝胶上肉眼可观察到PCR产物(Northern印迹)，特别是，在使用引物3515-3518的反应中可见明显的预期尺寸(68bp)的带。对该68bp带测序，其内部区域编码预期的氨基酸序列。这给出了针对该片断22bp的内部区域的精确DNA序列。
从各序列的不同引物集合体在产生该PCR产物中的效率可以推导出其它序列。引物集合体3419-3422给出了非常少的产物或者没有产物，而集合体3415-3418给出了强烈的信号。这些集合体之间的差别在于集合体3’最端部的CTC(3415-3418)相对TTC(3419-3422)的不同。由于CTC引发反应的效率更高，所以我们可以认定与其反向互补的GAG为正确的密码子。由于Met的编码是独一无二的，所以可以认定其后的密码子为ATG。因此所获得的精确DNA序列为CCC.GGC.CGG.AGG.GGC.AGC.TTT.GTG.GAG.ATG.GT(SEQ IDNO49)，编码氨基酸序列P G R R G S F V E M V(SEQ ID NO50)。可以用该序列设计用于在cDNA或文库上进行3和5’RACE PCR的精确寡核苷酸，或者设计用于筛选文库的特异性杂交探针。
由于发现简并PCR产物十分稳定，所以该反应还可用作诊断包含此序列的克隆是否存在的方法。可以用该PCR产物指示集合体中克隆的存在来对文库集合体进行筛选。可以将集合体拆开以识别单个克隆。对已知复杂程度和/或尺寸的集合体的筛选，可以提供关于某文库或来源中该克隆丰度的信息，并且可以近似估计出全长克隆或信使的尺寸。
至于探针的产生，可以用寡核苷酸3458和3469或者3458(SEQ IDNO19)和3468(SEQ ID NO20)(表4)进行PCR反应，其中，使用23 RACE产物、克隆9C7E.35(30ng，从origene文库分离出克隆9C7E.35，见实施例2)或产生自大脑的cDNA，采用标准PCR条件(Perkin-Elmer，rtPCR和AmpliTaq_Gold试剂盒)和以下条件25μl反应体积，1.5mM的MgCl2、0.125μl的AmpliTaq_Gold(Perkin-Elmer)，最初在95℃下10分钟以激活AmpliTaq_Gold，以65℃下15秒、72℃下45秒、95℃下15秒进行共36次循环，继以72℃下3分钟。产物在Quiagen PCR纯化试剂盒上进行纯化，并作为底物用于随机引发以产生放射性同位素标记的探针(Sambrook等人，如上；Amersham RediPrime_试剂盒)。该探针用于分离全长克隆pCEK克隆27，如
图12和13(A-E)所示。全长克隆pCEK克隆27的衍生用选定尺寸的cDNA产生哺乳动物表达载体pCEK2载体中的人初级神经元细胞文库，由不同尺寸的插入子产生克隆集合体。以从初级人神经元细胞分离出的多聚(A)+RNA制备用于β分泌酶筛选的cDNA文库。其克隆载体为pCEK2(
图12)。
pCEK2用来自Stratagene的cDNA合成试剂盒并加以某些改变来合成双链cDNA插入子。然后根据其尺寸将插入子分级分离。将总计5个级分单独地与双切割(NotI和XhoI)的pCEK2连接，继而转化到大肠杆菌菌株XL-10 Gold中，其被设计用于接受非常大的质粒。
将已转化的大肠杆菌级分涂覆在含有氨苄青霉素的Terrific Broth琼脂板上并生长18个小时。每个级分产生大约200,000个群落，总计有一百万个群落。然后将这些群落从琼脂板上刮下，并从中分离出质粒，获得大约70,000个克隆/集合体。用诊断PCR反应(上述简并引物3411和3417)对来自文库中每一集合体的70,000个克隆进行筛选，以确定存在推定β分泌酶基因的克隆。
用克隆9C7E.35产生的390bp PCR产物所产生的放射性同位素标记的探针对来自1.5kb集合体的克隆进行筛选。为产生探针，用3458和3468作为引物以及克隆9C7E.35(30ng)作为底物产生PCR产物。
用PCR产物作为底物用于随机引发，以产生放射性同位素标记的探针。通过与PCR探针杂交对来自1.5kb集合体(在此集合体中有70,000初始克隆)的180,000克隆进行筛选，识别出9个阳性克隆。这些克隆中有四个被分离出来，通过限制性酶作图，看起来它们对4-5kb(克隆27)和6-7kb(克隆53)长度的两个独立克隆进行编码。对克隆27的测序表明它含有一个1.5kb的编码区域。
图13(A-E)显示了pCEK克隆27的序列(克隆27)。
表4
实施例2人胎脑cDNA文库的筛选将Origenc人胎脑Rapid-ScreenTMcDNA文库集作成96-孔格式的阵列，每个孔包括来自人胎脑文库的5000个克隆(质粒DNA)。可获得针对每个孔的亚板，由每孔含大肠杆菌中的50个克隆的96个孔组成。这是一个由寡聚-dT引发的文库，其经尺寸选择并单向插入载体pCMV-XL3。
用PCR对来自主板的94孔进行筛选。遵从上面实施例1中所述的反应1的条件，仅采用引物3407和3416与来自各孔的30ng质粒DNA。两个集合体表现出阳性70bp条带。用同样的引物和条件筛选来自亚板之一的各孔的1μl大肠杆菌。然后将来自单一阳性孔的大肠杆菌铺板到LB/amp板上，并且用同样的PCR条件对单个菌落进行筛选。尺寸大约为1Kb的阳性克隆用9C7E.35标记。它含有初始肽序列以及包括有蛋氨酸的5’序列。3’序列不含有终止密码子，表明这不是一个全长克隆，这与Northern印迹数据一致。实施例3PCR克隆方法将3’RACE用在支持本发明所进行的实验中以阐明编码人β分泌酶的多核苷酸。可在下列文献中找到适用于重复此处所述实验和/或确定编码本文所述天冬氨酰基蛋白酶新家族其他成员的多核苷酸序列的方法和条件例如White，B.A.编辑的PCR克隆方案(PCR CloningProtocols，Humana Press，Totowa，NJ，1997)中；或者Ausubel(同上)，这两篇文献在此引入作为参考。
RT-PCR对于反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，将两个部分简并引物组用于对编码该肽的cDNA片断进行RT-PCR扩增。引物组1包括DNA引物#3427-3434，其序列表示在下面表5中。基质RT-PCR使用来自该组的引物，并将由原代人神经元培养物反转录的cDNA作为模板，用引物#3428+3433产生出了预计的54bp cDNA产物。所有RT-PCR反应在每次反应中均采用10-50ng输入多聚-A+RNA等价物，并且采用95℃变性1分钟、50℃退火30秒和72℃延伸30秒的循环条件进行35次循环。
引物#3428+3433的简并被进一步破坏，生成引物组2，包括DNA引物#3448-3455(表5)。用引物组2重复基质RT-PCR，并且将从来自IMR-32人成神经细胞瘤细胞(American Type Culture Collection，Manassas，VA)和原代人神经元培养物的多聚-A+RNA反向转录的cDNA作为模板用于扩增。来自引物组2的引物#3450和3454对预计尺寸(72bp)的cDNA片断进行最有效率的扩增，尽管引物3450+3453，和3450+3455也扩增同样的产物，但其效率较低。通过用引物3450和3454扩增来自IMR-32细胞和原代人神经元培养物的cDNA，获得了72bp的PCR产物。
5’和 3’RACE-PCR根据本领域公知的方法(例如，Frohman，M.A.、M.K.Dush和G.R.Martin(1988)，“Rapid production of full-length cDNAs from raretranscriptsamplification using a single gene specific oligo-nucleotideprimer.”美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)85(23)8998-9002.)，设计并制备与用于5’末端3’快速扩增(RACE)PCR的上链(编码链)以及用于5’RACE PCR的下链(非编码链)相匹配的内部引物。用于该实验的DNA引物(#3459和#3460)列在表4中。这些引物可以用在标准RACE-PCR方法中，其中使用可商购的模板(例如Marathon Ready cDNA_，Clontech Labs)，或者如Frohman等人所述(同上)由目标RNA制备的定制cDNA模板。
在支持本发明的实验中，用多种RACE来研究在逆转录病毒表达载体pLPCXlox中克隆的IMR-32 cDNA文库。由于载体接头提供邻接该文库中cDNA插入子的独特锚定序列，所以它们在RACE方法中可以用作5’和3’锚定引物。用于扩增来自文库的β分泌酶cDNA克隆的特异性5’和3’锚定引物，引物#3475和#3476，其序列可以由ClontechLabs，Inc.所提供的载体的DNA序列导出，并显示在表3中。
用引物#3459和#3476对来自载体pLPCXlox中的IMR-32 cDNA文库的下游序列进行3’RACE扩增。该文库已经预先细分成100个集合体，每个集合体5,000个克隆，并且从每个集合体中分离出质粒DNA。根据上面实施例1中所述的方法，将用于诊断β分泌酶克隆是否存在的引物用于对100个集合体进行检测，其提供文库的单个集合体，用于RACE-PCR。用来自集合体23的100ng模板质粒以引物3459+3476进行PCR扩增。使用Ampli-Taq Gold_在下述条件下进行40次循环的扩增，每个循环95℃变性1分钟、65℃退火45秒和72℃延伸2分钟。根据本领域公知方法(Ausubel；Sambrook)，通过琼脂糖凝胶层析对反应产物进行分级分离。
通过对反应产物进行琼脂糖凝胶层析，揭示了近似1.8Kb的PCR片断。从凝胶中纯化出PCR产物，用引物#3459对其进行DNA序列分析。生成的序列，定名为23A，以及由DNA序列推导出的预计氨基酸序列，表示在图5中。来自23A的读框之一的前七个推定氨基酸中的六个，与由纯化蛋白所确定的N末端序列的后七个氨基酸完全匹配，所述蛋白来自天然来源并在支持本发明的进一步实验中得到纯化并测序。
表5
实施例4β分泌酶抑制剂测定用于测量β分泌酶活性的测定法在本领域内是熟知的。特别有用的实验简述如下，在已授权的美国专利5744346中有详细的说明，该专利引入本文作为参考。
A.制备MBP-C125sw1.制备细胞用1菌落/瓶的大肠杆菌pMAL-C125SW cl.2(表达MBP-C125sw融合蛋白的大肠杆菌)接种到两个250ml细胞培养瓶中，其中每瓶含50ml Lbamp100。细胞在37℃下生长过夜。将等份试样(25ml)接种在2升瓶中的LBamp100(500ml/瓶)中，然后使之在30℃下生长。在600nm(OD600)下对LB培养液测量光密度；当光密度是～0.5时，加入1.5ml的100mM IPTG。在这时，取出温育前等份样，用于SDS-PAGE(“-I”)。从该等份样中取0.5ml在Beckman microfuge中离心1分钟，将生成的团粒沉淀溶解在0.5ml的1×LSB中。细胞在30℃下温育/诱导5-6小时，然后取出温育后等份样(“+I”)。然后，在4℃下，在KA9.1离心机中，使细胞在9000rpm下离心10分钟。收取团粒沉淀并储存在-20℃下。
2.提取细菌细胞团粒冷冻的细胞团粒再次悬浮于50ml的0.2M NaCl、50mM pH 7.5的Tris中，然后在莲座容器中超声处理，共5×20秒，在各次之间间隔1分钟。提取物在KA18.5离心机中在16500rpm下离心30分钟(39000xg)。使用移液器作为搅棒，使经超声处理的团粒悬浮于50ml的尿素提取缓冲剂(7.6M尿素、50mM pH 7.5的Tris、1mM EDTA、0.5％TX-100)中。总体积为约25ml/瓶。然后，悬浮液经超声处理6×20秒，在各次之间间隔1分钟。然后，使悬浮液在KA18.5离心机中在16500rpm下再次离心30分钟。将产生的上清液加入到1.5L的缓冲剂中，该缓冲剂包括0.2M NaCl、50mM pH 7.5的Tris和1％Triton X-100(0.2M NaCl-Tris-1％Tx)，在4℃下轻轻搅拌1小时，接着在4℃下在KA9.1中在9000rpm下离心30分钟。将上清液装载到经洗涤的直链淀粉柱(100ml 50％浆；New England BioLabs)。该柱用0.2MNaCl-Tris-1％TX洗涤至基线(+10倍柱体积)，随后用2倍柱体积的0.2M NaCl-Tris-1％还原的Triton X-100洗涤。然后用同一缓冲剂中的10mM麦芽糖洗脱蛋白。将等量的6M胍HCl/0.5％ TX-100加入每一级分中。合并峰值级分，并稀释到终浓度为约2mg/ml。将级分储存于-40℃下，之后稀释(20倍，在0.15％Triton X-100中稀释到0.1mg/ml)。稀释的等份试样也储存于-40℃下。
B.抗体基测定本部分所述的测定是基于某些抗体(此后称为“切割位点抗体”)对β分泌酶切割APP的区分能力，这种区分是基于独特的切割位点和随后由切割形成的特定C末端的暴露。被识别的序列是由β分泌酶切割β-APP产生的β淀粉状蛋白多肽(βAP)的紧邻氨基末端的通常约3-5个残基的序列，例如在野生型APP中的Val-Lys-Met或在APP的Swedish双突变变体形式中的Val-Asn-Leu。下述重组表达的蛋白被用作β分泌酶的底物。MBP-C125测定MBP-C125底物在大肠杆菌中表达为APP的后125位氨基酸APP融合到麦芽糖结合性蛋白(MBP)的C末端所得的融合蛋白，表达使用的载体购自New England Biolabs。因此，β切割位点是C-125区域起点下游的第26位氨基酸。该靠后的位点由单克隆抗体SW192识别。
既用野生型APP序列(MBP-C125wt)在所述切割位点上(..Val-Lys-Met-Asp-Ala..)产生重组蛋白，又用“Swedish”双突变(MBP-C125sw)(..Val-Asn-Leu-Asp-Ala..)产生重组蛋白。如
图19A以示意图表示的，对完整MBP-融合蛋白的切割导致一截短的氨基末端片段的产生，其C末端有一新的SW-192 Ab阳性表位。该氨基末端片段可用同一抗体在Western印迹上进行识别，或如
图19A所示利用抗MBP捕获-生物素化SW-192报告体夹心形式进行定量识别。抗MBP的多克隆抗体是用经纯化的重组表达的MBP(New England Biolabs)免疫兔(Josman Labs，Berkeley)而制备的。抗血清在固定化MBP的柱上亲合纯化。MBP-C125 SW和WT底物在大肠杆菌中表达，然后按上述进行纯化。
96孔微量滴定板用纯化的抗MBP抗体(以5-10μg/ml的浓度)包被，然后用在1g/L磷酸氢二钠、10.8g/L磷酸二氢钠、25g/L蔗糖、0.5g/L叠氮化钠(pH 7.4)中的2.5g/L人血清蛋白封闭。在96孔微量滴定板的各孔中，在终浓度为20mM pH 4.8乙酸盐缓冲剂、0.06％Triton X-100的50μl反应混合物中，使适当稀释的β分泌酶(5μl)与2.5μl的2.2μM MBP-C125sw底物原液混合，并在37℃温育1小时。然后，样品用Speciman稀释剂(0.2g/L磷酸氢二钠、2.15g/L磷酸二氢钠、0.5g/L叠氮化钠、8.5g/L氯化钠、0.05％Triton X-405、6g/LBSA)稀释5倍，在抗MBP抗体包被的板上进一步用Speciman稀释剂稀释5-10倍，在室温下温育2小时。在与样品或抗体温育后，板用TTBS(0.15M NaCl、50mM Tris、ph&.5、0.05％Tween-20)洗涤至少4次。将生物素化的SW192抗体用作报告体。按照制造商的说明，用NHS-生物素(Pierce)使SW 192多克隆抗体生物素化。通常，使用约240ng/ml的生物素化抗体，确切的浓度随所使用的抗体批次的不同而不同。在用报告体与板温育之后，使用抗生物素蛋白链菌素标记的碱性磷酸酶(Boering-Mannheim)进行ELISA，并以4-甲基-umbelliferyl磷酸酯为荧光底物。在Cytofluor 2350荧光测量系统中对板进行读数。使用重组产生的MBP-26SW(产物类似物)作为标准品制作标准曲线，其允许将荧光单位转化成所生成的产物的量。
使用装配到96孔微量滴定板的化合物“文库”，将该测定方案用于筛选出抑制剂结构。将在2％DMSO中终浓度为20μg/ml的化合物加入到上述测定中，将所得产物和对照(仅2％DMSO)与β分泌酶温育并进行比较，以计算“％抑制”。“符合物”被限定为在测试浓度下对酶活性产生＞35％抑制的化合物。通过在一个范围内改变测试化合物的浓度，由剂量-效应曲线计算50％抑制酶活性所需的浓度，还将该测定用于提供抑制剂的IC50值。
通常，当在该测定中与对照活性相比较时，如果其产生的活性比在样品范围内测定的平均活性值低至少1个标准偏差、优选低2个标准偏差，则认为抑制是显著的。此外，活性的降低大于对照活性约25％、优选大于约35％时，也认为其是显著的。
使用前述测定系统，从所测试的头6336个化合物中识别出24个“符合物”(在50μM浓度下达＞30％抑制)(0.4％符合率)。包括下述P26-P4’sw测定中进行的再次筛选在内，24个“符合物”中有12个化合物具有低于50μM的IC50。
P26-P4’sw测定P26-P4’sw底物是一与生物素连接的肽，序列为(生物素)CGGADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVNLDAEF(SEQ IDNO63)。P26-P1标准品是序列(生物素)CGGADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVNL(SEQ ID NO64)，其中N末端的“CGG”在所述的两种情况中均用作生物素与底物之间的接头。肽由Anaspec，Inc.(San Jose，CA)用叔丁氧羰基氨基酸通过固相合成而制备。生物素由Anaspec，Inc.在合成肽之后用EZ键碘乙酰基-LC-生物素(Pierce)连接到末端的半胱氨酸巯基上。肽保存为在5mM Tris中的0.8-1.0mM储存液，并用NaOH将pH调至约中性(pH 6.5-7.5)。
对于酶测定，底物浓度可在0-200μM之间变化。测试化合物的抑制活性时，底物的特定浓度为1.0μM。将待测化合物加入到DMSO中，终DMSO浓度为5％；在该实验中，对照也使用5％DMSO。改变酶的浓度，以使产物浓度在ELISA实验的线性范围内(125-200pM，稀释后)。使这些化合物在20mM pH 4.5乙酸钠、0.06％Triton X-100中在37℃下温育1-3小时。样品用样品稀释剂(145.4mM NaCl、9.51mM磷酸钠、7.7mM叠氮化钠、0.05％Triton X-405、6gm/L牛血清白蛋白，pH 7.4)稀释5倍以淬灭反应，然后按需要稀释用于ELISA。对于ELISA，Coster高结合96孔测定板(Corning，Inc.，Corning，NY)用SW 192单克隆抗体包被，该抗体来自克隆16A7或具有相似亲合性的克隆。生物素-P26-P4’标准品用样品稀释剂稀释到终浓度为0-2nM。稀释的样品和标准品(100μl)在SW192板上在4℃温育24小时。板用TTBS缓冲剂(150mM NaCl、25mM Tris、0.05％Tween 20，pH为7.5)洗涤4次，然后与用样品稀释剂稀释3000倍的抗生物素蛋白链菌素-碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemical，Indianapolis，IN)(0.1ml/孔)一起温育。在室温下温育1小时之后，板如前部分所述用TTBS洗涤4次，并与荧光底物溶液A(31.2gm/L 2-氨基-2甲基-1-丙醇，30mg/L，用HCl调至pH 9.5)一起温育。在30分钟后读取荧光值。
C.使用合成的寡肽底物进行测定该测定特别适用于测量部分纯化的β分泌酶底物制品。所制备的合成寡肽包括已知的β分泌酶切割位点和任选的可检测标志，例如荧光或生色部分。在已授权的美国专利5942400中描述了这些肽及其制备和检测方法的例子，该专利引入本文作为参考。可根据本领域熟知的方法，使用适合待测肽的高效液相色谱或者荧光或生色测定方法，对切割产物进行检测。例如，一个这样的肽的序列为SEVNL DAEF(SEQ ID NO52)，且切割位点在第5和6位残基之间。另一优选的底物的序列为ADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVNLDAEF(SEQ IDNO53)，且切割位点在第26和27位残基之间。
D.对细胞或组织提取物的β分泌酶测定用提取缓冲剂(20mM pH 7.5 HEPES、2mM EDTA、0.2％TritonX-100、1mM PMSF、20μg/ml抑肽素、10μg/ml E-64)提取细胞或组织。提取缓冲剂的体积随样品改变，但应至少为200μl/106细胞。可通过用微量移液器研磨，使细胞悬浮，同时可要求将组织均质化。在冰上使悬浮的样品保温30分钟。如果必须移液，则通过在4℃下在16000xg(在Beckman微量离心机中在14000rpm下)离心30分钟除去未溶液化的物质。通过将上清液稀释到终测定溶液中，对上清液进行测定。提取物的稀释度将是变化的，但应足以使所述测定中的蛋白浓度不大于60μg/ml。测定反应还包括20mM pH 4.8的乙酸钠、0.06％TritonX-100(包括由提取物和底物提供的Triton)和220-100nM MBP-C125(在用于底物制备的方案中所述的0.1mg/ml储备液的1∶10或1∶20稀释液)。反应物在37℃温育1-3小时，之后通过用样品稀释剂稀释至少5倍来淬灭反应，并使用标准方案进行测定。实施例5纯化β分泌酶A.纯化天然存在的β分泌酶按照引入本文作为参考的美国专利5744346中所述获得和加工人293细胞。(293细胞获自American Type Culture Collection，Manassas，VA)。将冷冻的组织(293细胞浆或人脑)切成片，并置于5倍体积的均质化缓冲剂(20mM pH 7.5 Hepes、0.25M蔗糖、2mM EDTA)中。使用混合器使悬浮液均质化，在4℃下在16000xg下离心30分钟。弃去上清液，以原始体积将团粒沉淀悬浮在提取缓冲剂(20mM pH 6.0MES、0.5％Triton X-100、150mM NaCl、2mM EDTA、5μg/ml亮抑蛋白酶肽、5μg/ml E64、1μg/ml抑肽素、0.2mM PMSF)中。在涡旋混合之后，通过在4℃下使试管搅动1小时而完成提取。在16000xg下使混合物如上离心，合并上清液。通过加入～1％(v/v)1M Tris碱(未中和)，将提取物的pH调至7.5。
将经中和的提取物装载到麦胚凝集素-琼脂糖(WGA-琼脂糖)柱上，该柱在4℃下用10倍柱体积的20mM pH 7.5 Tris、0.5％TritonX-100、150mM NaCl、2mM EDTA预平衡。每1g原始组织使用1ml琼脂糖树脂。WGA柱用1倍柱体积的平衡缓冲剂洗涤，然后用10倍柱体积的20mM pH 7.5 Tris、100mM NaCl、2mM NaCl、2mM EDTA、0.2％Triton X-100洗涤，然后如下洗脱。使在20mM pH 7.5 Tris、0.5％、150mM NaCl、0.5％Triton X-100、2mM EDTA中的10％壳多糖水解产物(3/4柱体积)流过该柱，之后使流动终止15分钟。然后，用另一5倍柱体积的10％壳多糖水解产物溶液洗脱该柱。将所有上述洗脱物合并(合并的WGA-洗脱物)。
合并的WGA-洗脱物用20mM pH 5.0 NaOAc、0.5％Triton X-100、2mM EDTA稀释4倍。通过加入数滴冰乙酸并同时检测pH，将稀释了的溶液的pH调至5.0。在4℃下，使该“SP装载物”以4ml/分钟流过5ml的Pharmacia HiTrap SP-柱，该柱已用20mM pH 5.0 NaOAc、0.5％Triton X-100、2mM EDTA平衡过。
前述方法提供峰活性，其在MBP-C125-SW测定中具有大于253nM产物/ml/h/μg蛋白的比活，其中比活如下所述进行测定，蛋白纯化约1500倍。纯化的β分泌酶的比活如下测量。在20mM pH 4.8 NaOAc、0.06％Triton X-100中，使MBP C125-SW底物在约200nM下结合。如下所述，利用β分泌酶测定来测量生成的产物量。然后，如下计算比活 由此，将比活表示为皮摩尔产物/μg β分泌酶/h。根据下述一般方法，通过将SP流通级分装载到P10-P4’staD→V亲合柱上，实现对人脑酶的进一步纯化。该纯化步骤的结果列于上表1中。
B.纯化来自重组细胞的β分泌酶由本文所述方法产生的重组细胞，其通常被制成能够超量表达所述酶；即，与由细胞或大多数组织内源性产生的酶相比，它们产生显著较多的酶/细胞。已发现，在这些情况下，可从纯化酶的制备过程中省去上述步骤中的一些，结果产生甚至更高水平的纯化。
将用β分泌酶基因构建体(参见实施例6)转染的CosA2或293 T细胞制成团粒沉淀物、冷冻并保存在-80℃下直至使用。通过使用手持均质机均质化30秒，使细胞团粒再次悬浮(在提取缓冲剂中达0.5ml/近106细胞的团粒，所述提取缓冲剂包括20mM pH 7.5 TRIS缓冲剂、2mM EDTA、0.2％ Triton X-100和蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂为5μg/ml E-64、10μg/ml抑肽素、1mMPMSF)，在微量离心机中以最高速离心(在4℃下离心40分钟)。使团粒沉淀物悬浮于原始体积的提取缓冲剂中，之后通过旋转在4℃下搅拌1小时，在微量离心机中以最高速在4℃下再次离心40分钟。将产生的上清液作为“提取物”保存。然后，提取物用20mM pH 5.0乙酸钠、2mM EDTA和0.2％Triton X-100(SP缓冲剂A)，加入5M NaCl使达60mM NaCl的终浓度。然后，用在水中稀释10倍的冰乙酸将溶液的pH调至5.0。保存等份试样(“SP装载物”)。使SP装载物流过1ml SP HiTrap柱，该柱用5ml SP缓冲剂A、5ml SP缓冲剂B(SP缓冲剂A加1M NaCl)和10ml SP缓冲剂A预洗涤过。使另2ml 5％SP缓冲剂B流过柱，以从柱中除去任何剩余的样品。用10倍稀释的乙酸将SP流通液的pH调至pH 4.5。然后，将该流通液如下述施加到P10-P4’staD→V-琼脂糖凝胶亲合柱上。该柱(250μl柱床尺寸)用至少20倍柱体积的平衡缓冲剂(25mM NaCl、0.2％Triton X-100、0.1mM EDTA、25mM pH 4.5乙酸钠)预平衡，然后用稀释的上清液装载。在装载后，在室温下进行后续步骤。用洗涤缓冲剂(125mM NaCl、0.2％Triton X-100、25mMpH 4.5乙酸钠)洗柱，之后加入0.6柱床体积的硼酸盐洗脱缓冲剂(200mM NaCl、0.2％还原的Triton X-100、40mM pH 9.5硼酸钠)。然后给柱加盖，加入另0.2ml洗脱缓冲剂。将柱放置30分钟。加入两倍柱床体积的洗脱缓冲剂，收集柱级分(250μl)。蛋白峰在两个级分中洗脱出。向收集的每毫升级分中加入0.5ml 10mg/ml抑肽素。
使用抗体264A(针对SEQ ID NO2所示β分泌酶的46-67位氨基酸的多克隆抗体)，通过Western印迹分析，检测从用全长克隆27(SEQ ID NO2；1-501)、419终止(SEQ ID NO57)和452终止(SEQ ID NO59)转染的细胞制得的细胞提取物。实施例6表达重组型β分泌酶的异种细胞的制备用本领域公知的Fugene和Effectene方法将两个单独的克隆(pCEK克隆27和pCEK克隆53)转染进入293T或COS(A2)细胞。293T细胞从Edge Biosystems(Gaithersburg，MD)获得。它们是用SV40大抗原转染的KEK293细胞。COSA2是COS1的亚克隆；其在软琼脂中进行亚克隆。
FuGENE方法将293T细胞接种在6孔培养板上，每个孔为2×105个细胞。在过夜生长之后，细胞有大约40-50％的汇合率。在转染之前数小时更换培养基(2ml/孔)。对于每个样品，将3μl的FuGENE 6转染试剂(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)稀释进0.1ml的无血清培养基(DME加10mM Hepes)中，并且在室温下温育5分钟。将每个样品1微克DNA(0.5-2mg/ml)加入一个单独的试管。将经稀释的FuGENE试剂逐滴加入浓缩的DNA。在轻敲混合之后，使该混合物在室温下温育15分钟。将该混合物逐滴加在细胞上，并轻微摇动混合。然后使细胞在37℃、7.5％CO2的气氛下进行温育。条件培养基和细胞在48小时后采集。收集、离心并从团粒沉淀物中分离出条件培养基。在冷冻之前加入蛋白酶抑制剂(5μg/ml E64，2μg/ml抑肽素、0.2mM PMSF)。用PBS将细胞单层漂洗一次，然后加入0.5ml的溶胞缓冲剂(1mM pH 7.5 HIPIS、1mM EDTA、0.5％Triton X-100、1mM PMSF、10μg/ml E64)。对溶胞产物冷冻和解冻，涡流混合，然后离心，并将上清液冷冻直至测定。
Effective方法根据制造商的指示，利用标准转染方案将DNA(0.6μg)和“EFFECTENE”试剂(Qiagen，Valencia，CA)加入6孔培养板。在转染后3天采集细胞，并将细胞团粒沉淀物急速冷冻。制备全细胞溶胞产物，并用MBP-C125sw底物测试不同量的溶胞产物的β分泌酶活性。
图14B表示这些实验的结果，其中相对于以微克为单位的加入反应中的COS溶胞产物，作出了以皮摩尔为单位的生成产物曲线。图例的说明描述了酶的来源，其中采用Effective方法用来自pCEK克隆27和pCEK克隆53(克隆27和克隆53)的DNA转染的细胞的活性分别以实心菱形和实心方形表示，采用FuGENE方法用来自克隆27的DNA转染的细胞的活性以空心三角形表示，模拟转染组和对照组没有活性(以实心三角形和“X”标记)。大于700pM产物的值超出了测定的线性范围。实施例7P10-P4’sta(D→V)琼脂糖凝胶亲合基质的制备A. P10-P4’sta(D→V)抑制剂肽的制备P10-P4’sta(D→V)具有NH2-KTEEISEVN[sta]VAEF-COOH(SEQID NO72)的序列，其中“sta”表示抑胃酶氨酸部分。在肽合成仪中合成肽，用叔丁氧羰基保护的氨基酸进行链装配。所有的化学品、试剂，以及叔丁氧羰基氨基酸都可以从Applied Biosystems(ABI；Foster City，CA)购得，但是二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺来自Burdickand Jackson。起始树脂，即叔丁氧羰基-Phe-OCH2-Pam树脂，也是从ABI购得的。在二甲基甲酰胺中，用1.0当量的1-羟基苯并三唑(HOBT)和1.0当量的N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，将所有氨基酸在预活化之后偶联至对应的HOBT酯上。在各偶联步骤之后并且在氟化氢切割之前，用在二氯甲烷中的50％三氟乙酸去除氨基酸α-胺上的叔丁氧羰基保护基团。
氨基酸侧链保护如下Glu(Bzl)，Lys(Cl-CBZ)，Ser(OBzl)，Thr(OBzl)。所有其它使用的氨基酸都没有进一步的侧链保护，包括叔丁氧羰基-抑胃酶氨酸。通过与无水氟化氢(HF)在0℃反应一个小时，使侧链被保护的肽脱保护并从树脂上切离。这产生了作为C末端羧酸的完全脱保护的粗制肽。
在HF处理之后，用乙酸从所述树脂提取出肽并冷冻干燥。然后用制备性反相HPLC在2.2cm内径×25cm长度的Vydac C4(330_、10μm)柱上对粗制肽进行纯化。该柱使用的溶剂体系为0.1％TFA/H2O([A]缓冲剂)，0.1％TFA/CH3CN([B]缓冲剂)作为流动相。一般，在2％[B]中以8-10ml/分钟将肽装载至所述柱上，并且用2％[B]至60％[B]的线性梯度洗脱174分钟。
对经纯化的肽进行质谱测定和分析性反相HPLC，以证实其组成和纯度。
B.引入亲合基质中所有操作都在室温下进行。将12.5ml的80％NHS-琼脂糖凝胶浆(即10ml包装体积；Pharmacia，Piscataway，NJ)注入Bio-RadEconoColumn(BioRad，Richmond，CA)，并且用165ml的冰冷1.0mMHCl洗涤。当柱床完全排干时，将柱的底部关闭，并加入5.0ml的7.0mg/ml P10-P4’sta(D→V)肽(溶解在0.1M的HEPES中，pH 8.0)。对柱加盖，旋转温育24小时。在温育之后，使柱排干，然后用8ml的pH 8.2的1.0M乙醇胺洗涤。加入另外10ml的乙醇胺溶液，再次对柱加盖，并旋转温育过夜。柱床用20ml的1.5M氯化钠、0.5M pH 7.5Tris洗涤，然后用一系列含有0.1mM EDTA、0.2％Triton X-100以及下列成分的缓冲剂洗涤，所述成分为20mM pH 4.5乙酸钠(100ml)；20mM pH 4.5乙酸钠，1.0M氯化钠(100ml)；20mM pH 9.5硼酸钠，1.0M氯化钠(200ml)；20mM pH 9.5硼酸钠(100ml)。最后，用15ml的2mM Tris、0.01％叠氮化钠(没有Triton或EDTA)对柱床进行洗涤，并在4℃下在该缓冲剂中保存。实施例8用β分泌酶和APP对细胞共转染如上面实施例4中所述采用FuGene 6试剂，用等量的编码APPsw或wt的质粒以及β分泌酶或对照β-半乳糖苷(β-gal)cDNA共转染293T细胞。用pCEK克隆27或含有全长β分泌酶的pohCJ表达β分泌酶。在这些转染中用于表达APP的质粒构建体pohCK751，如Dugan等，JBC，270(18)10982-10989(1995)所述那样进行衍生，并简要表示在图21中。加入β-gal对照质粒，使被转染的质粒的总量在每次条件下都相同。表达β-gal的pCEK和pohCK载体在293T或COS细胞中不发生复制。在收集条件培养基和细胞之前，根据上述标准方法用质粒转染平行三份的细胞孔，然后温育48小时。制备全细胞溶胞产物，并测试β分泌酶活性。由被转染的293T细胞所表达的β分泌酶活性程度相当于或者高于由用于单一转染研究的CosA2细胞所表达的β分泌酶活性程度。用抗体13G8在条件培养基和溶胞产物上进行Western印迹测定，并且在条件培养基上进行AβELISA，以分析各APP切割产物。
虽然本发明是结合具体的方法和实施例加以说明的，但是应当理解，可以在不偏离本发明的情况下作出多种变型和改变。本文所引用的所有专利和参考文献都在此引入作为参考。
权利要求
1.β分泌酶蛋白，该蛋白己被纯化至具有明显均质性。
2.权利要求1的经纯化的β分泌酶蛋白，其中所述酶经充分纯化，从而使其在第596和597位氨基酸之间切割具有695个氨基酸的β淀粉状蛋白前体蛋白(β-APP)同种型的活性比来自人293细胞的溶液化但未富集的膜级分所表现出的活性高至少1000倍。
3.权利要求1的经纯化的β分泌酶蛋白，其特征在于，在MBP-C125sw底物测定中表现出至少约0.2×105nM/h/μg蛋白的比活。
4.权利要求3的经纯化的β分泌酶蛋白，其中所述比活至少为1.0×105nM/h/μg蛋白。
5.权利要求1的经纯化的β分泌酶蛋白，其中所述蛋白的长度少于450个氨基酸，包括具有氨基酸序列SEQ ID NO70[63-452]所示的多肽。
6.权利要求1-5中任一项的经纯化的蛋白，其中所述蛋白由具有氨基酸序列SEQ ID NO70[63-452]的多肽组成。
7.权利要求1-5中任一项的经纯化的蛋白，其中所述蛋白由具有氨基酸序列SEQ ID NO69[63-501]的多肽组成。
8.权利要求1-5中任一项的经纯化的蛋白，其中所述蛋白由具有氨基酸序列SEQ ID NO67[58-501]的多肽组成。
9.权利要求1-5中任一项的经纯化的蛋白，其中所述蛋白由具有氨基酸序列SEQ ID NO68[58-452]的多肽组成。
10.权利要求1-5中任一项的经纯化的蛋白，其中所述蛋白由具有氨基酸序列SEQ ID NO58[46-452]的多肽组成。
11.权利要求10的经纯化的蛋白，其中所述蛋白由具有氨基酸序列SEQ ID NO74[22-452]的多肽组成。
12.权利要求10的经纯化的蛋白，其中所述蛋白由具有氨基酸序列SEQ ID NO58[46-452]的多肽组成。
13.权利要求10的经纯化的蛋白，其中所述蛋白的特征在于，N末端在SEQ ID NO2的第46位上且C末端在SEQ ID NO2的第452位和第470位之间。
14.权利要求10的经纯化的蛋白，其中所述蛋白的特征在于，N末端在SEQ ID NO2的第22位上且C末端在SEQ ID NO2的第452位和第470位之间。
15.权利要求1-5中任一项的经纯化的蛋白，其中所述蛋白由具有氨基酸序列SEQ ID NO.43[46-501]的多肽组成。
16.权利要求1-5中任一项的经纯化的蛋白，其中所述蛋白由具有氨基酸序列SEQ ID NO66[22-501]的多肽组成。
17.权利要求1-5中任一项的经纯化的蛋白，其中所述蛋白由具有氨基酸序列SEQ ID NO2[1-501]的多肽组成。
18.权利要求1-5中任一项的经纯化的蛋白，其中所述蛋白的N末端残基对应于选自SEQ ID NO2的第22、46、58和63位残基中的一个残基，且C末端为选自SEQ ID NO2的第452位和第501位之间的一个残基。
19.权利要求18的经纯化的蛋白，其中所述C末端位于SEQ IDNO2的第452位和第470位残基之间。
20.权利要求1的经纯化的蛋白，其中所述蛋白是从小鼠中分离的。
21.权利要求20的蛋白，其中所述多肽具有SEQ ID NO65的序列。
22.权利要求1-21中任一项的经纯化的蛋白，其中所述蛋白由异种细胞产生。
23.一种结晶蛋白组合物，其由经纯化的β分泌酶蛋白形成。
24.权利要求23的结晶蛋白组合物，其中所述经纯化的蛋白的特征在于，具有与β分泌酶抑制剂底物P10-P4’staD→V的结合亲合性，当在同样条件下测试所述蛋白与所述底物的结合时，该亲合性至少是具有氨基酸序列SEQ ID NO43[46-501]的蛋白所显示的亲合性的1/100。
25.权利要求23或24的结晶蛋白组合物，其中该组合物是从具有选自SEQ ID NO66[22-501]、SEQ ID NO43[46-501]、SEQ ID NO74[22-452]、SEQ ID NO43[46-452]和SEQ ID NO71[46-419]的序列的蛋白形成的。
26.权利要求23或24的结晶蛋白组合物，其中该组合物是从具有选自SEQ ID NO2[1-501]、SEQ ID NO59[1-452]和SEQ ID NO60[1-420]的序列的蛋白形成的。
27.权利要求23或24的结晶蛋白组合物，其中该组合物是从其N末端残基对应于选自SEQ ID NO2的第22、46、58和63位残基中的一个残基且C末端为选自SEQ ID NO2的第452位和第501位之间的一个残基的蛋白形成的。
28.权利要求27的结晶蛋白，其中所述C末端位于SEQ ID NO2的第452位和第470位残基之间。
29.权利要求23-28中任一项的结晶蛋白组合物，其中所述蛋白是糖基化的。
30.权利要求23-28中任一项的结晶蛋白组合物，其中所述蛋白是脱糖基化的。
31.权利要求23-30中任一项的结晶蛋白组合物，其中所述组合物进一步包括β分泌酶底物或抑制剂分子。
32.权利要求31的结晶蛋白组合物，其中所述β分泌酶抑制剂是具有少于约15个氨基酸并包括SEQ ID NO78(VMXVAEF；P3-P4’XD→V)这一序列的肽，包括其保守替换物。
33.权利要求31的结晶蛋白组合物，其中所述β分泌酶抑制剂具有序列SEQ ID NO72[P10-P4’staD→V]，包括其保守替换物。
34.权利要求31-35中任一项的结晶蛋白组合物，其中所述β分泌酶抑制剂具有序列SEQ ID NO81[EVMXVAEF]，其中X是羟基亚乙基或抑胃酶氨酸。
35.权利要求31的结晶蛋白组合物，其中所述β分泌酶抑制剂的特征在于，具有不大于约0.5mM的Ki。
36.权利要求31的结晶蛋白组合物，其中所述β分泌酶抑制剂的特征在于，具有不大于约50μM的Ki。
37.经分离的蛋白，包括一多肽，其(i)长度少于约450个氨基酸，(ii)包括与SEQ ID NO75[63-423]或其保守替换物至少90％相同的一个氨基酸序列，和(iii)表现出β分泌酶活性，该活性由切割底物的能力所证明，所述底物选自在596-597位氨基酸之间进行切割的具有695个氨基酸的β淀粉状蛋白前体蛋白(βAPP)同种型、MBP-C125wt和MBP-C125sw。
38.权利要求37的蛋白，其中所述多肽包括SEQ ID NO75[63-423]的氨基酸序列。
39.权利要求37的蛋白，其中所述多肽具有序列SEQ ID NO75[63-423]。
40.权利要求37的蛋白，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO58[46-452]至少95％相同。
41.权利要求40的蛋白，其中所述多肽具有序列SEQ ID NO58[46-452]。
42.权利要求37的蛋白，其中所述蛋白包括由序列SEQ ID NO58[46-452]的多肽组成。
43.权利要求37的蛋白，其中所述蛋白由具有序列SEQ ID NO74[22-452]的多肽组成。
44.权利要求37-43中任一项的蛋白，其中所述蛋白是由异种细胞表达的。
45.一种组合物，其包括权利要求37-44中任一项的蛋白和β分泌酶底物或抑制剂分子。
46.权利要求45的组合物，其中所述β分泌酶底物选自MBP-C125wt、MBP-C125sw、APP、APPsw和其可被β分泌酶切割的片段。
47.权利要求46的组合物，其中所述可被β分泌酶切割的片段选自SEVKMDAEF(P5-P4’wt)、SEVNLDAEF(sw)、SEVKLDAEF、SEVKFDAEF、SEVNFDAEF、SEVKMAAEF、SEVNLAAEF、SEVKLAAEF、SEVKMLAEF、SEVNLLAEF、SEVKLLAEF、SEVKFAAEF、SEVNFAAEF、SEVKFLAEF和SEVNFLAEF。
48.权利要求45的组合物，其中所述β分泌酶抑制剂是具有少于约15个氨基酸并包括SEQ ID NO78(VM[X]VAEF，其中X是羟基亚乙基或抑胃酶氨酸)的肽，包括其保守替换物。
49.权利要求48的组合物，其中所述β分泌酶抑制剂具有序列SEQID NO81(VM[X]VAEF，其中X是羟基亚乙基或抑胃酶氨酸)。
50.权利要求45的组合物，其中所述β分泌酶抑制剂具有序列SEQID NO72[P10-P4’staD→V]，包括其保守替换物。
51.权利要求45和48-50中任一项的组合物，其中所述β分泌酶抑制剂具有不大于约1μM的Ki。
52.权利要求45和48-50中任一项的组合物，其中所述β分泌酶抑制剂是用可测的报告分子进行标记了的。
53.一种经分离的小鼠β分泌酶蛋白酶，具有序列SEQ ID NO65。
54.与经纯化的包括一多肽的β分泌酶蛋白特异性结合的抗体，所述多肽包括一个与SEQ ID NO75[63-423]或其保守替换物至少90％相同的氨基酸序列，其中所述抗体进一步缺乏与具有选自SEQ IDNO2[1-501]和SEQ ID NO43[46-501]的序列的蛋白的显著免疫反应性。
55.权利要求54的抗体，其中所述抗体具有与选白SEQ ID NO66[22-501]、SEQ ID NO67[58-501]、SEQ ID NO69[63-501]、SEQID NO59[1-452]、SEQ ID NO74[22-452]、SEQ ID NO58[46-452]、SEQ ID NO68[58-452]和SEQ ID NO70[63-452]的蛋白的反应性。
56.一种经分离的核酸，其包括编码一β分泌酶蛋白的核苷酸序列或该核苷酸序列的互补序列，但是不包括编码具有序列SEQ IDNO2[1-501]的蛋白的核酸，所述β分泌酶蛋白与选自SEQ ID NO66[22-501]、SEQ ID NO43[46-501]、SEQ ID NO57[1-419]、SEQ IDNO74[22-452]、SEQ ID NO58[46-452]、SEQ ID NO59[1-452]、SEQ ID NO60[1-420]、SEQ ID NO67[58-501]、SEQ ID NO68[58-452]、SEQ ID NO69[63-501]、SEQ ID NO70[63-452]、SEQ IDNO75[63-423]和SEQ ID NO71[46-419]的蛋白至少95％相同。
57.权利要求56的经分离的核酸，其中所述核苷酸序列编码具有氨基酸序列SEQ ID NO58[46-452]的蛋白酶。
58.权利要求56的经分离的核酸，其中所述核苷酸序列编码具有氨基酸序列SEQ ID NO43[46-501]的蛋白酶。
59.权利要求56的经分离的核酸，其中所述核苷酸序列编码具有氨基酸序列SEQ ID NO66[22-501]的蛋白酶。
60.权利要求56的经分离的核酸，其中所述核苷酸序列编码具有氨基酸序列SEQ ID NO74[22-452]的蛋白酶。
61.一种表达载体，包括权利要求56-60中任一项的经分离的核酸，和通过可操作地与所述核酸连接的调控序列，该调控序列使所述核酸在所选宿主细胞中得以有效表达。
62.权利要求61的重组表达载体，其中所述载体适于对细菌细胞的转染。
63.用权利要求61-62中任一项的载体转染的异种细胞，其中所述细胞表达生物学活性的β分泌酶。
64.权利要求63的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
65.权利要求63的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
66.权利要求63的细胞，其中所述细胞是昆虫细胞。
67.权利要求63的细胞，其中所述细胞是酵母细胞。
68.产生重组型β分泌酶的方法，包括在促进如权利要求63-67中任一项所述细胞生长的条件下培养所述细胞，和将来自所述细胞的提取物或培养基施加到亲合基质上。
69.权利要求68的方法，其中所述亲合基质含有β分泌酶抑制剂分子。
70.权利要求69的方法，其中所述抑制剂分子是SEQ ID NO72[P10-P4’staD→V]。
71.权利要求68的方法，其中所述基质含有抗体，该抗体的特征在于具有结合β分泌酶的能力。
72.权利要求71的方法，其中所述抗体如权利要求54-55所述。
73.一种异种细胞，包括(i)编码根据权利要求37-43中任一项的活性β分泌酶蛋白的核酸分子；(ii)编码β分泌酶底物分子的核酸分子；和(iii)可操作地与(i)和(ii)连接的调控序列，该调控序列使所述核酸分子在所选细胞中得以有效的表达。
74.权利要求73的细胞，其中所述编码所述β分泌酶蛋白的核酸分子对于所述细胞而言是异源的。
75.权利要求73的细胞，其中所述编码所述β分泌酶蛋白的核酸分子和编码所述β分泌酶底物分子的核酸分子对于所述细胞而言均是异源的。
76.权利要求73的细胞，其中所述β分泌酶底物分子选自MBP-C125wt、MBP-C125sw、APPwt、APPsw和其可被β分泌酶切割的片段。
77.权利要求76的细胞，其中所述可被β分泌酶切割的片段选自SEVKMDAEF(P5-P4’wt)、SEVNLDAEF(sw)、SEVKLDAEF、SEVKFDAEF、SEVNFDAEF、SEVKMAAEF、SEVNLAAEF、SEVKLAAEF、SEVKMLAEF、SEVNLLAEF、SEVKLLAEF、SEVKFAAEF、SEVNFAAEF、SEVKFLAEF和SEVNFLAEF。
78.抑制Aβ产生的化合物的筛选方法，包括使根据权利要求37的经分离的β分泌酶多肽接触(i)测试化合物和(ii)β分泌酶底物，和如果所述β分泌酶多肽在测试化合物的存在下比在测试化合物不存在的条件下表现出较低的β分泌酶活性，则将该测试化合物作为能抑制Aβ产生的化合物而选择出来。
79.权利要求78的方法，其中所述活性β分泌酶多肽具有选自SEQID NO43[46-501]和SEQ ID NO58[46-452]的序列。
80.权利要求78的方法，其中所述β分泌酶多肽和所述底物是由根据权利要求73的细胞产生的。
81.权利要求78的方法，该方法进一步包括将所述测试化合物给药至患有早老性痴呆或早老性痴呆样病状的哺乳动物受治对象，和如果在给药之后，该受治对象维持或改善认知能力或者受治对象表现出蛋白斑负荷减小，则选择所述化合物作为候选治疗剂。
82.权利要求81的方法，其中所述对象是一种包括转基因的哺乳动物。
83.权利要求81的方法，其中所述对象是携带转基因的小鼠，所述转基因编码人β淀粉状蛋白前体蛋白(β-APP)，包括其突变变体。
84.权利要求78-83中任一项的方法，其中所述β分泌酶底物选自MBP-C125wt、MBP-C125sw、APP、APPsw和其可被β分泌酶切割的片段。
85.权利要求78的方法，其中所述可被β分泌酶切割的片段选自SEVKMDAEF(P5-P4’wt)、SEVNLDAEF(sw)、SEVKLDAEF、SEVKFDAEF、SEVNFDAEF、SEVKMAAEF、SEVNLAAEF、SEVKLAAEF、SEVKMLAEF、SEVNLLAEF、SEVKLLAEF、SEVKFAAEF、SEVNFAAEF、SEVKFLAEF和SEVNFLAEF。
86.抑制Aβ产生的化合物的筛选方法，包括在测试化合物存在下测量根据权利要求1-22或37-43中任一项的经纯化的β分泌酶多肽与β分泌酶抑制剂化合物的结合，和如果在测试化合物的存在下与抑制剂的结合少于在测试化合物不存在的条件下与抑制剂的结合，则选择所述测试化合物作为β分泌酶活性位点结合性化合物。
87.权利要求86的方法，其中所述抑制剂化合物是用可测标记物进行标记了的。
88.权利要求86的方法，其中所述β分泌酶抑制剂是具有少于约15个氨基酸并包括SEQ ID NO78(VM[X]VAEF；其中X是羟基亚乙基或抑胃酶氨酸)的肽，包括其保守替换物。
89.权利要求86的方法，其中所述β分泌酶抑制剂具有序列SEQID NO72[P10-P4’staD→V]，包括其保守替换物。
90.权利要求86的方法，其中所述β分泌酶抑制剂对于β分泌酶具有小于约50μM的Ki。
91.一种β分泌酶抑制剂化合物，其是根据权利要求78-80中任一项的方法选择的。
92.权利要求91的抑制剂，其中所述化合物选自噬菌体展示选择系统。
93.权利要求92的化合物，其中所述噬菌体展示选择系统偏向于序列SEQ ID NO72[P10-P4’D→V]。
94.一种β分泌酶抑制剂化合物，其是根据权利要求81-90中任一项的方法选择的。
95.权利要求94的抑制剂，其中所述化合物选自噬菌体展示选择系统。
96.权利要求95的化合物，其中所述噬菌体展示选择系统偏向于序列SEQ ID NO72[P10-P4’D→V]。
97.一种β分泌酶抑制剂化合物，其是根据权利要求86-90中任一项的方法选择的。
98.权利要求97的抑制剂，其中所述化合物选自噬菌体展示选择系统。
99.权利要求98的化合物，其中所述噬菌体展示选择系统偏向于序列SEQ ID NO72[P10-P4’D→V]。
100.β分泌酶抑制剂，包括含有序列SEQ ID NO78(VM[X]VAEF，其中X是羟基亚乙基或抑胃酶氨酸)的肽，包括其保守替换物。
101.权利要求100的β分泌酶抑制剂，具有序列SEQ ID NO72(P10-P4’staD→V)。
102.权利要求100的β分泌酶抑制剂，具有序列SEQ ID NO78。
103.权利要求100的β分泌酶抑制剂，具有序列SEQ ID NO81。
104.一种筛选试剂盒，包括根据权利要求1-22或37-43中任一项的经分离的β分泌酶蛋白，可切割的β分泌酶底物，和测定所述底物被β分泌酶切割的工具。
105.权利要求104的筛选试剂盒，其中所述β分泌酶蛋白存在于异种细胞中。
106.权利要求104的筛选试剂盒，其中所述β分泌酶底物选自MBP-C125wt、MBP-C125sw、APPwt、APPsw和其可被β分泌酶切割的片段。
107.权利要求106的筛选试剂盒，其中所述可被β分泌酶切割的片段选自SEVKMDAEF(P5-P4’wt)、SEVNLDAEF(sw)、SEVKLDAEF、SEVKFDAEF、SEVNFDAEF、SEVKMAAEF、SEVNLAAEF、SEVKLAAEF、SEVKMLAEF、SEVNLLAEF、SEVKLLAEF、SEVKFAAEF、SEVNFAAEF、SEVKFLAEF和SEVNFLAEF。
108.一种剔除小鼠，特征在于，其内源性β分泌酶基因是失活或缺失的。
109.权利要求108的剔除小鼠，其中所述β分泌酶基因编码与序列SEQ ID NO65有至少90％同一性的蛋白。
110.权利要求108的剔除小鼠，其中所述缺失是可诱导的。
111.权利要求110的剔除小鼠，其中所述可诱导的表达受插入到小鼠基因组中的Cre-lox表达系统影响。
112.有效用于治疗早老性痴呆或其他以Aβ沉积为特征的脑血管淀粉样变性的药物的筛选方法，包括给以β-APP的超量表达和/或Aβ沉积为特征的哺乳动物对象施用测试化合物，该化合物因其能抑制根据权利要求37-43中任一项所述的β分泌酶蛋白的β分泌酶活性而得以选择；和如果该化合物降低所述对象中Aβ沉积的量或者维持或改善所述对象的认知能力，则将它选作潜在的治疗性药物化合物。
113.权利要求112的方法，其中所述哺乳动物对象是携带编码人β-APP或其突变体的转基因的转基因小鼠。
114.治疗患有或易患早老性痴呆或其他脑血管淀粉样变性的患者的方法，包括通过向患者给予药学有效量的有效抑制权利要求37-43中任一项所述的β分泌酶蛋白的化合物，来阻断APP向Aβ的酶水解过程。
115.权利要求114的方法，其中所述化合物是从选自SEQ IDNO72、SEQ ID NO78、SEQ ID NO81和SEQ ID NO97的肽衍生的。
116.抑制组织中APP向Aβ的酶促蛋白水解过程的方法，包括使所述组织接触有效抑制权利要求37-43中任一项所述的β分泌酶蛋白的酶活性的化合物。
117.权利要求116的方法，其中所述对酶活性的抑制是由在MBP-C125sw测定中Ki小于约50μM证实的。
118.治疗早老性痴呆或其他以Aβ肽沉积为特征的脑血管淀粉样变性的治疗性药物组合物，其中所述药物中的活性化合物因其抑制根据权利要求37的β分泌酶蛋白的酶活性的能力而得以选择。
119.权利要求118的治疗性药物，其中所述对酶活性的抑制是由在MBP-C125sw测定中Ki小于约50μM证实的。
120.权利要求118的治疗性药物，其中所述药物是从选自SEQ IDNO72、SEQ ID NO78、SEQ ID NO81和SEQ ID NO97的肽衍生的。
121.诊断患者患有或易患早老性痴呆的方法，包括测量来自所述患者的细胞样品中包括编码β分泌酶的核酸的基因的表达水平，和如果所述表达水平显著大于预定的对照表达水平，则确诊患者患有或易患早老性痴呆。
122.权利要求121的方法，其中所述基因包括编码β分泌酶蛋白的核酸，所述β分泌酶蛋白与选自SEQ ID NO66[22-501]、SEQ IDNO43[46-501]、SEQ ID NO57[1-419]、SEQ ID NO74[22-452]、SEQ ID NO58[46-452]、SEQ ID NO59[1-452]、SEQ ID NO60[1-420]、SEQ ID NO67[58-501]、SEQ ID NO68[58-452]、SEQ IDNO69[63-501]、SEQ ID NO70[63-452]、SEQ ID NO75[63-423]和SEQ ID NO71[46-419]的蛋白至少95％相同；或者这些核苷酸序列中任一种的互补序列。
123.权利要求121的方法，其中所述核酸明确不包括编码具有序列SEQ ID NO2[1-501]的蛋白的核酸。
124.权利要求121的方法，其中所述核酸编码具有序列SEQ IDNO2[1-501]的蛋白。
125.权利要求121的方法，其中所述测量在全细胞测定中进行。
126.权利要求109的方法，其中所述测量在自所述患者的细胞样品得到的核酸上进行。
127.纯化β分泌酶蛋白酶分子的方法，包括使含有β分泌酶活性的不纯的样品与包括有β分泌酶抑制剂的亲合基质接触。
128.权利要求127的方法，其中所述β分泌酶抑制剂包括具有序列SEQ ID NO78(VM[X]VAEF，其中X是羟基亚乙基或抑胃酶氨酸)或其保守替换物的肽。
129.权利要求128的方法，其中所述β分泌酶抑制剂具有序列SEQID NO72(P10-P4’staD→V)。
130.权利要求128的方法，其中所述β分泌酶抑制剂具有序列SEQID NO78。
131.权利要求128的方法，其中所述β分泌酶抑制剂具有序列SEQID NO81。
全文摘要
本文公开的是以纯化和重组形式存在的活性、经分离的β分泌酶的多种形式。该酶参与淀粉样蛋白斑成分的产生,这些成分在患有早老性痴呆的个体中积聚。还公开了产生以单独形式或以与其天然底物(β－APPwt和β－APPsw)中的一些结合的形式存在的β分泌酶的重组细胞,和针对这些蛋白的抗体。这些组合物可用于对调节β分泌酶的化合物进行选择的方法。β分泌酶的抑制剂作为治疗剂参与神经变性疾病如早老性痴呆的治疗。
文档编号C12N9/64GK1390232SQ00806471
公开日2003年1月8日 申请日期2000年2月10日 优先权日1999年2月10日
发明者约翰·P·安德森, 古里巴尔·巴西, 米尼·丹·多恩, 诺曼德·弗里根, 瓦尔吉斯·约翰, 迈克尔·鲍尔, 苏坎托·辛哈, 格温·塔苏诺, 杰伊·廷格, 王淑文, 利萨·麦康恩洛格 申请人:艾兰制药公司