Dna芯片的制作方法

专利名称：Dna芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及到一种高度敏感的DNA芯片，该芯片可用于基因分析领域。本发明还涉及到一种用于该芯片的制备的DNA溶剂以及一种用于该芯片的制备的方法。
DNA芯片被开发作为可显著地促进该功能分析计划的手段。DNA芯片工艺已经被用于对酵母的所有基因或者对被培养的细胞或器官的基因进行分析。
用于制备DNA芯片(DNA阵列)的已知方法包括，例如，一种方法，在该方法中在芯片的固相上的预先确定的位置合成了一种单链的DNA，还包括另一种方法，在该方法中在芯片的固相上的预先确定的位置上定位有一种事先制备的单链或者双链DNA。根据前一种方法制备的DNA芯片的例子为在美国专利No.5,445,934、5,744,305和5,700,637中描述的高密度寡核苷酸阵列。根据后一种方法制备的DNA芯片的例子为在美国专利No.5,807,522和WO 98/18961中描述的样点阵列(spotting array)。但是，对于上述的高密度寡核苷酸阵列，需要一种用于高密度固相合成的大型设备。进一步，合成一种该方法的长核苷酸链由于其合成产量而十分困难。对于具有被定位的双链DNA的样点阵列，一个将固定化于DNA芯片的双链DNA变性成为单链DNA的步骤是必不可少的，这复杂化了分析过程。对于具有被定位的单链DNA的样点阵列，需要在将其固定化于固相之前从双链DNA制备单链DNA，这复杂化了该芯片的制备过程。如上所述，传统的DNA芯片和制备这样的DNA芯片的传统方法存在诸多问题。
另外，提供在其上排列和固定化有一些含有开放读码框架(此后称为ORF)的DNA以在一种生物体的全基因水平上测定基因表达模式或者基因产物的功能的DNA芯片是需要的。但是，排列和固定化有不同链长度的DNA的DNA芯片存在一些问题，例如，微弱的杂交信号以及短DNA的低固定化速度。因此，提供产生高固定化速度和强杂交信号的DNA芯片是需要的。
发明目标本发明的主要目标为提供一种高敏感的DNA芯片，该芯片可用于在总基因组的水平上检测一种生物体内的基因表达。
在该第一个方面中，含有一种挥发性酸或其盐类的一种DNA溶液可优选地用于该DNA在该固定化基片表面的固定化。尽管不期望以此对本发明进行限制，在优选的情况下使用的为一种含有挥发性有机酸或其盐类的DNA溶液。更优选的情况下，该DNA溶液含有乙酸或其一种盐。本发明提供一种DNA芯片，该芯片在预定区域排列和固定化有DNA，固定化于一种固定化基片表面的DNA至少是部分单链的。只要能够用于高密度固定化DNA，在该第一个方面中使用的固定化基片没有特定的限制。在优选的情况下使用一种无孔基片。尽管不期望以此对本发明进行限制，例如，该无孔基片在优选的情况下由玻璃制成。
本发明的第二个方面涉及到一种用于制备DNA芯片的DNA溶液，该溶液含有一种挥发性酸或其一种盐。在该第二个方面中，该挥发性酸或其盐在优选的情况下为一种挥发性有机酸或其一种盐。尽管不期望以此对本发明进行限制，在优选的情况下该挥发性有机酸或其盐类为乙酸或一种乙酸盐。
本发明的第三个方面涉及到一种用于制备单链DNA芯片的方法，该方法包括使用一种DNA溶剂在一种固定化基片的预定区域上排列和固定化DNA，该DNA溶剂含有一种挥发性的酸或其一种盐。在该第三个方面中，该挥发性酸或其盐在优选的情况下为一种挥发性有机酸或其一种盐。尽管不期望以此对本发明进行限制，在优选的情况下该挥发性有机酸或其盐类为乙酸或一种乙酸盐。进一步，在该第三个方面中使用的固定化基片在优选的情况下为一种无孔基片。例如，该无孔基片由玻璃制成。
本发明者致力于研究开发一种可被用于在总基因组水平上检测一种生物体内的基因表达的基因芯片并且发现了一种新的方法，该方法实现了DNA有效地固定化。进一步，本发明者使用该方法成功地开发出一种高度敏感的DNA芯片，该芯片产生高杂交效率和低背景。这样就已经完成了本发明。发明详述如本文所使用，DNA芯片指一种芯片，该芯片在一种基片表面的预定区域在变性条件下排列和固定化有DNA，其中该固定化DNA至少是部分单链的。该DNA芯片亦称为DNA微阵列。如本文所使用，一组排列和固定化于一种固定化基片的预定区域的DNA可被称为一个阵列。如本文所使用，高密度DNA芯片指的是一种DNA芯片，该芯片在一种基片表面的预定区域以100点/cm2或更高的密度排列和固定化有DNA。
根据本发明，任何挥发性酸均可被优选地使用，只要在对DNA在一种基片表面的预定区域进行排列和固定化期间的一系列步骤内(例如，在对定位于一种基片的DNA进行干燥的步骤)该酸成分随着水的蒸发而挥发。包括无机酸和有机酸在内的任何挥发性酸均可被无限制地优选地使用。例如，乙酸是优选的。
根据本发明，挥发性酸的一种盐为该酸如上所述的一种盐。例如，归类于元素周期表的第一族和第二族的碱的盐是优选的。
如本文所使用，ORF指的是一种DNA序列，该序列编码或者可能编码一种生物体的基因组的被编码基因中的一种蛋白。
(1)本发明的基因芯片用于排列和固定化于本发明的基因芯片的一种基片表面的预定区域的DNA是没有特定限制的。通常使用50个碱基或更长的双链多聚核苷酸或其一种衍生物。例如，一种优选的DNA的制备通过使用聚合酶链反应或其类似方法进行的酶法扩增以及使该扩增产物在固定化于一种基片上时变性成为单链DNA或其衍生物而完成。例如，一种具有修饰的DNA可被用作衍生物，该修饰使其能够固定化于一种基片的表面。尽管不期望以此对本发明进行限制，这些衍生物的例子如具有在其5’末端引入了功能基团的DNA，如一个氨基基团或一个巯基基团。
用于固定化于本发明的基因芯片的一种基片的预定区域的DNA可以由来自一个DNA片段的或者来自两个或更多个DNA片段的一条有义链和一条反义链组成。
尽管不期望以此对本发明进行限制，DNA芯片的一个例子为在其预定区域固定化有双链DNA混合物的DNA芯片，该DNA具有来自某一基因的多个不同部分的核苷酸序列。
根据本发明，基片并不受到特定限制，并且该基片可由具有光滑表面的无孔材料制成。例如，在优选情况下使用一种由诸如载玻片玻璃(slide glass)这样的玻璃制成的基片。对于该基片的表面没有特定的限制，只要单链DNA可以通过共价或非共价键固定化于其上便可。例如，在优选情况下使用一种在其表面具有亲水或疏水功能基团的基片。可在优选情况下使用的基片的例子包括具有羟基基团、氨基基团、巯基基团、醛基团、羧基基团、酰基集团或其它类似基团的基片，但不限于这些。这样的一种功能基团可作为该基片自身的表面本体存在。在替代情况下，该功能基团可通过表面处理而引入。经这样的表面处理的基片的例子包括以可购得的硅烷偶联试剂如aminoalyklsilane处理过的玻璃或者以诸如聚赖氨酸或者氮丙啶这样的多聚阳离子进行处理的玻璃。经上述处理的载玻片玻璃可通过商业途径获得。
如本文所使用，固定化期间的变性指的是溶于一种适当的溶剂的用于固定的DNA被维持在可以使双链DNA解离成单链DNA的条件之下。例如，诸如热变性和碱变性这样的处理被包括在内。在这样的变性条件下被固定化于一种固定化基片之上的DNA至少部分是单链的。
在另一个实施方案中，使用用于制备DNA芯片的DNA溶液而制备的一种DNA芯片被作为例子，该溶液含有一种挥发性酸或其一种盐。在制备这样的DNA芯片时，该酸成分在点样后的干燥期间被挥发，并且其pH随后升高。其结果制备成了一个DNA芯片。在该DNA芯片中，在该溶剂中含有的双链DNA被排列和固定化，并且其至少部分是单链的。
进一步，本发明的DNA芯片可在沸水中煮沸并且在冰浴中的冰冷乙醇中冷却后使用。
(2)用于制备本发明的一种DNA芯片的DNA溶液作为用于制备本发明的DNA芯片的DNA溶液，在优选情况下使用含有挥发性酸或其一种盐的溶液。有机酸或者无机酸均可优选地用作该挥发性的酸。有机酸没有特定限制，只要其具有挥发性便可，其例子为羧酸，如甲酸和乙酸。无机酸没有特定限制，只要其具有挥发性便可，其例子为碳酸、氰酸和氢氰酸。任何挥发性的酸均可被优选地使用，只要该酸成分可在将DNA排列和固定化于一种基片表面的预定区域期间的一系列步骤内(例如，在对定位于一种基片的DNA进行干燥的步骤)随着水的蒸发而挥发。
根据本发明，上述的挥发性酸可以是一种盐。尽管不期望以此对本发明进行限制，该盐的一些例子为归类于元素周期表的第一族(锂、钠、钾等等)和第二族(铍、镁、钙等等)的金属的盐。
用于制备本发明的DNA芯片的DNA溶液不受特定的限制，其例子为一种含有乙酸钠的DNA溶液。如果在本发明中使用了一种乙酸钠溶液，则该乙酸钠的含量为50mM或更多，在优选的情况下为200mM或更多，更优选情况下为300mM或更多。乙酸钠溶液的pH值在优选的情况下为5.0到7.0，更优选的情况下为5.5到6.5。如果所制备的含有乙酸钠的DNA溶液如上文所述被用于本发明的DNA芯片的制备方法，则乙酸在点样后的干燥期间被挥发，pH因此而上升。由此而制备了一种DNA芯片。在该DNA芯片中，这样的溶剂中含有的双链DNA被排列和固定化于一种基片表面的预定区域，并且该DNA至少是部分单链的。
进一步，本发明的DNA溶剂可能含有一种表面活性剂。尽管不期望以此对本发明进行限制，例如，在优选的情况下使用诸如sucrosemonolaurate这样的非离子表面活性剂。sucrose monolaurate的浓度在优选的情况下为0.005％到0.05％，更优选的情况下为0.01％到0.03％，但并不限于这些浓度。
用于制备本发明的DNA芯片的DNA溶剂可能含有一种DNA，该DNA由来自一个DNA片段的或者来自两个或更多个DNA片段的一条有义链和一条反义链组成。尽管不期望以此对本发明进行限制，用于制备DNA芯片的DNA溶剂的一个例子为含有双链DNA混合物的一种DNA溶剂，这些DNA具有来自某一基因的多个不同部分的核苷酸序列。
用于制备本发明的DNA芯片的DNA溶剂中所含有的DNA的长度不受特定的限制。一种50个碱基或者更长的DNA是优选的。
(3)用于制备本发明的DNA芯片的方法根据用于制备本发明的DNA芯片的方法而被固定的DNA片段的长度不受特定的限制。一种50个碱基或者更长的DNA是优选的。根据本发明的制备方法，用于固定化的DNA片段可以为一种通过使用限制酶切割而从质粒中获得的DNA片段，该质粒插入有该目标DNA片段或类似物。在替代情况下，该DNA片段可以为一种使用核酸扩增方法，例如使用PCR而制备的DNA片段。
根据用于制备本发明的DNA芯片的方法，用于固定化于一种基片的预定区域的的DNA片段可以由来自一个DNA片段的或者来自两个或更多个DNA片段的一条有义链和一条反义链组成。尽管不期望以此对本发明进行限制，在一个示例性的方法中一些双链DNA混合物固定化于预定的区域，这些DNA具有来自某一基因的多个不同部分的核苷酸序列。在另一个示例性的方法中，来自多个DNA片段的有义和反义链被逐一点样于相同的预定区域。
用于制备本发明的DNA芯片的方法参考来自一种生物体的基因组的DNA而具体地阐明。
例如，一种生物体的基因组中含有的一种ORF或其片段按照以下方法进行制备。根据一种ORF的信息来进行PCR扩增反应，该信息来自于通过国际互联网发表的数据库中或者经原始测定。在该扩增反应中使用一种基因组DNA、cDNA文库或者类似物作为模板。已知当被扩增的片段长度超过1000碱基对(bp)时PCR的效率通常会降低。另一方面，已知如果被固定化的DNA片段短于300bp则紫外交联下的DNA固定化速率以及DNA芯片的检测敏感度均会降低。因此，引物通常经过设计以使被扩增用于DNA芯片制备的DNA区域的长度为300到1000bp。但是，本发明提高了低于300bp的DNA的固定化速率以及DNA的检测敏感度，并且实现了含有在总基因组水平上低于300bp的DNA片段的DNA芯片的制备和使用。因此，扩增低于300bp的DNA区域的一个引物对可被设计用于本发明的DNA芯片的制备。
引物经设计以使其可同模板适当地退火。尽管不期望以此对本发明进行限制，该引物在适当的情况下长20bp或更长。进一步，设计具有50-60％的的GC含量的引物是优选的。例如，长度低于20bp的引物或者所具有的GC含量不处于上文提及的范围的引物只要能被用于PCR扩增便可被应用而不出问题。
一种如上设计的引物可以使用DNA合成仪或类似设备合成。可根据用于基因组DNA或cDNA文库的制备方法来制备一种模板DNA。具有一种组合物的反应混合物和常用的反应循环被用于通过PCR扩增一种ORF或其一个片段。如果同时平行进行一批反应，在一个96孔板中进行PCR是优选的。事实上，用于这样的反应的设备可通过商业获得。
如果一种含有牛血清白蛋白(BSA)的反应混合物被用于PCR扩增，是该BSA的含量低于传统用量是优选的。BSA的终浓度在优选的情况下低于0.01％(w/v)，更优选的情况下为0.005％或者更低，更优选的情况下为0.001％或更低，但不限于此。
一种用于纯化DNA片段的传统方法被用于纯化通过PCR扩增出的DNA片段(一种PCR产物)。可以使用可从商业上获得的96孔板形式的纯化试剂盒，例如使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)来同时纯化一批平行样品。由于被纯化的DNA溶液的盐浓度影响样点(spot)的均一性，必须对该DNA片段进行纯化以使其充分脱盐。该DNA片段可以根据一种异丙醇沉淀方法进行纯化。如上文所述通过使用低BSA浓度的PCR而获得的DNA片段可在简单的纯化程序后被使用。下一步，使用部分该纯化DNA片段测定扩增产物的大小、纯度和产量。通过在2或3％的琼脂糖凝胶上的电泳测定该扩增产物的大小。可通过分析该凝胶的电泳模式来测定纯度，例如，使用一种影像分析仪或一种电泳凝胶分析系统以计算主带的相对强度。另外，该DNA的浓度可根据紫外吸收方法或者荧光分光光度方法进行测定。
冻干于一个96孔板中的DNA片段参照测定结果在给定的浓度下溶解于一种给定的用于固定化的溶剂中。例如，3×SSC(一种氯化钠/柠檬酸钠溶液；1×SSC为0.15M的氯化钠/0.015M柠檬酸钠)被用作固定化的溶剂。尽管不期望以此对本发明进行限制，例如，在优选的情况下根据本发明使用一种含有挥发性酸或其一种盐的DNA溶剂。诸如乙酸这样的有机酸或者诸如碳酸这样的无机酸可在优选的情况下被用作挥发性酸。可向该DNA溶剂中加入一种表面活性剂(例如，一种非离子表面活性剂)。该表面活性剂的一个例子为surcosemonolaurate。
在另一个实施方案中，可以使用一种含有吗啉、吗啉衍生物、其一种盐或一种碳酸盐的缓冲液(日本专利申请号No.10-351276)。在该情况下，用于固定化的溶剂的盐含量优选地为10至500mM，更优选地为50到200mM。DNA固定化速率的提高导致了DNA芯片的检测敏感度的提高。因此，使用这样一种缓冲液是优选的，该缓冲液产生高固定化效率，特别是对于被用于在总基因组水平上检测基因的表达的芯片。在另一方面，被固定化的DNA的量通常随着用于在基片上进行固定的DNA的浓度的提高而增加。但是，可用的DNA的量是有限的。由此，调节该浓度使其尽可能地恒定于0.1mg/ml或更多是优选的。这样，被固定化的DNA的量趋于恒定，并且可制备出一种适于基因表达分析的基因芯片。
溶解于如上所述的用于固定化的溶剂的一种DNA片段被用于热变性或者碱变性，并且随后使用可购得的阵列仪(一种用于制备DNA芯片的设备)点样于一种基片。该变性作为提高基因芯片的检测敏感度的手段是非常有用的，这是因为它提高了DNA固定化的速率。低于300bp的短DNA的固定化速率被特别地提高。因此，本发明的方法在制备一种生物体的总基因组水平上的基因芯片的情况下是有效的。这是由于这样的DNA芯片含有ORF，并且对于许多这样的ORF，用于固定化的DNA片段长约100bp。例如，热变性通过将DNA溶液在沸水中保持1到2分钟并随后迅速冷却而进行。在替代的情况下，该变性可以为碱变性，在碱变性中DNA溶液的pH被提高并随即中和该溶液。例如，向DNA溶液中加入氢氧化钠终浓度为0.2M，随后在室温下温浴该混合物5分钟并且随后通过加入乙酸钠(pH5)终浓度为0.3M，进行中和。本发明的该基因芯片被用于在上文所述的变性的条件下有效地对单链DNA进行固定化并且产生强烈的杂交信号。
进一步，根据本发明，一种挥发性酸的盐溶液被用作溶剂，例如一种挥发性有机酸同强碱形成的盐(例如，乙酸钠溶液(pH6.0))。当溶于该溶液的一种双链DNA被置于基片上时，该溶液的pH值由于溶剂的蒸发而提高，这导致了该DNA的变性。这样制备成了一种DNA芯片，其中的DNA至少部分是单链的。这样的一种DNA芯片的使用同通过放置单链DNA而制备的芯片的效率相同。一种挥发性有机酸同强碱的盐可被加入上述用于固定化的溶液。
一种可从商业购得的阵列仪可在本发明的制备方法中使用，只要该设备可被用于在短时间内可重复地制备一种均一的高密度DNA芯片。例如，可以使用Genetic MicroSystems(GMS)的417阵列仪。样点的大小通常低于1纳升。样点的空间通常为约300μm。如果一个基因组含有5000或更少的基因，使用具有这样的规格的阵列仪基因组中的所有ORF均可容易地排列于一个载玻片玻璃上。
例如，用于使用阵列仪进行点样的基片在加湿的温箱中在25到50℃的温度以及80％到100％的湿度下下温浴1小时。随后固定化可使当地通过紫外照射来完成。在天然情况下，在加湿温箱中的湿度、温度和时间根据大气温度而进行最优化，这是由于它们同大气温度紧密相关。具有被固定化的DNA的基片在含有合适的表面活性剂的水溶液中洗涤，例如含有0.2％的十二烷基磺酸钠(SDS)的溶液，随后以蒸馏水洗涤。随后对该基片表面的未参加固定化的功能基团进行封闭。
如上文所述制备的DNA芯片的质量可通过以荧光标记的基因组DNA片段进行杂交来检测。
根据本发明可以制备一种在其上固定化有DNA的DNA芯片，该DNA至少部分是单链的。这通过以用于固定化的双链DNA在变性成为单链DNA后点样于一种基片来完成。其结果提高了固定化速率。由此该芯片具有高检测灵敏度。进一步，在低于300bp的短DNA，特别是约100bp的DNA被用于固定化于一种基片时，本发明的方法作为具有高固定化速率的固定化方法特别有用。
由于一种双链DNA根据本发明在变性条件下被固定于一种固定化基片，本发明还可用于检测某种基因的有义链或者反义链的表达。
实施例以下的实施例进一步详细阐明了本发明，但不能被解释成为对本发明的限制。
实施例1排列和固定化有变性DNA的DNA芯片的制备和检测敏感度DNA芯片通过以天然或变性DNA点样而制备。随后，对杂交信号的密度进行比较。
人类癌症相关基因CA13的cDNA片段通过以下方法制备。简而言之，使用来自人类胃组织的cDNA作为模板以及具有SEQ ID NOS1和2的核苷酸序列的引物CA13-S6和CA13-A4作为引物根据WO98/37187中描述的方法来进行PCR。制备了具有SEQ ID NO10的核苷酸序列的约1.0kb的CA13 cDNA片段。通过使用Microcon-100(Amicon)并随后进行乙醇沉淀而除去引物来纯化该CA13片段。该纯化DNA的部分被溶于1×SSC、3×SSC或50mM的碳酸盐缓冲液(pH9.5)，通过检测260nm下的吸收而测定其浓度。随后，在上述溶液之一中含有0.1或0.5mg/ml的该纯化DNA的溶液被制备。如下文所述用于碱变性的样品经制备以使该处理可产生上文提及的浓度。
加入终浓度为0.2M的NaOH后该样品在室温下温育5分钟，并且通过加入终浓度为0.3M的乙酸钠(pH5.0)进行中和。这一过程在下文中称为碱变性。已变性或未变性的DNA使用GMS 417(GMS)阵列仪点样于载玻片玻璃。POLY-PREP-SLIDES(Sigma，此后称为SIG/PLL)和MAS包被的载玻片玻璃被用作为固定化基片。样点大小为150μm。样点空间为375μm。一种DNA排列三个点。
点样之后备载玻片玻璃在加湿温箱KCL1000(EYELA)中在37℃下湿度90％下温育1小时，随后使用紫外照射设备FS-1500(Funakoshi)在60mJ/cm2的能量下对其进行紫外交联。在0.2％的SDS中洗涤各载玻片玻璃一次，随后以蒸馏水洗涤2次，在约1000rpm的低速下离心以除去水并进行空气干燥。随后如下方法以琥珀酰化使其表面的氨基基团失活。首先，通过将1.5g的琥珀酐溶于89.5ml的N-甲基-吡咯烷酮并且将该溶液同9ml的1M硼酸缓冲液(pH8.0)混合而制备封闭溶液。该载玻片玻璃被立即浸入封闭溶液并在室温下处理20分钟。处理之后，该载玻片玻璃在蒸馏水中充分洗涤，低速离心以除去水分并进行空气干燥。
下一步制备了一个1.0kb的CA13片段，该片段经Cy5(AmershamPharmacia)标记。简而言之，进行了一种PCR，该PCR除使用Cy5标记的引物CA13-A4代替引物CA13-A4之外其余均以上文所述的用于制备该CA13片段的方式进行。如上文所述纯化由此获得的Cy5-标记的，并且随后将其溶于TE(含有1mM EDTA(Nacalai Tesque)的10mM三羟甲基氨基甲烷(pH 8.0，Nacalai Tesque))。
封闭之后，在沸水中煮沸一些载玻片玻璃3分钟，在冰浴中的乙醇中迅速冷却，随后以低速离心进行干燥。该程序此后被称为热变性。杂交按下文方法进行。含有1μM Cy5标记的CA13片段、4×SSC、0.2％的SDS以及100μg/ml鲑鱼精DNA的杂交溶液被滴入阵列仪中的各载玻片玻璃之上。以盖玻片覆盖该液滴以防含入空气气泡。以封口膜封缄该盖玻片的边缘并在60℃过夜温育该载玻片玻璃。杂交之后，在2×SSC中从载玻片玻璃上除去盖玻片。在室温下在含有0.2％的SDS的2×SSC中洗涤该载玻片玻璃5分钟，随后以0.05×SSC洗涤5分钟。随后以低速离心干燥该载玻片玻璃。使用GMS 418阵列仪(GMS)在635的激发波长和660的发射波长下检测该载玻片玻璃。使用一种影像分析软件ImaGene(BioDiscovery)分析杂交信号的相对强度。结果见表1。表1所示为在DNA芯片的制备时对点样的DNA进行碱变性的效果。表1中的信号的相对强度为来自三个位点的信号的平均相对强度。
表1基片热变性 DNA含量 溶剂 信号的相对强度(mg/ml)碱变性+ -MAT/MAS+ 0.5 1×SSC 9261 7553×SSC 7524 3083碳酸盐 9482 55260.1 1×SSC 2934 493×SSC 2547 327碳酸盐 2676 1114MAT/MAS- 0.5 1×SSC 8328 60423×SSC 6674 4109碳酸盐 9183 62290.1 1×SSC 3176 26713×SSC 2975 1148碳酸盐 2195 1848SIG/PLL+ 0.5 1×SSC 2196 11493×SSC 1583 787碳酸盐 2504 11730.1 1×SSC 463 4143×SSC 372 248碳酸盐 443 280SIG/PLL- 0.5 1×SSC 4076 11593×SSC 3558 993碳酸盐 5372 21250.1 1×SSC 834 6413×SSC 831 235碳酸盐 978 491如表1所示，对于每一个载玻片玻璃，当样品在碱变性条件下进行点样时，无论是否在固定化后进行热变性均观察到高相对强度的杂交信号。特别地，已经确认一种较强的杂交信号可以通过进行碱变性来获得，即使使用的是碳酸盐缓冲液。传统上已经认为碳酸盐缓冲液可产生高固定化效率。因此，当双链DNA在变性以使其至少成为部分单链后被点样时，该变性DNA可被有效地固定化与一种基片之上，这导致了强烈的杂交信号。对载玻片玻璃进行热变性的结果表明，即使在点样后对双链DNA进行变性也不能观察到以碱变性DNA进行点样时所观察到的效果。因此，以在碱变性条件下的双链DNA进行点样是特别重要的。
实施例2DNA的大小对于变性DNA的芯片上固定化的影响制备出了点样有不同长度的天然或变性双链DNA的DNA芯片，并且对杂交信号的强度进行了比较。人类转铁蛋白受体(后文称为TFR)的一种cDNA片段作为一种测试样本按下列方法进行比较。首先，根据传统方法从人类K562细胞(Dainippon Pharmaceutical)中进行mRNA抽提并且进行cDNA的合成。使用所产生的CDNA作为模板以及特异于TFR(GeneBank No.X01060)的引物S7(SEQ ID NO3)和AS7(SEQ ID NO4)作为引物来进行PCR。获得了一种编码4,738bp完整区域的PCR产物。该产物被连接于一种载体pT7Blue(Novagen)以获得一种重组质粒pT7TFR。使用pT7TFR作为模板以及下列引物对之一作为引物进行PCRS7和AS6(SEQ ID No5)；S7和AS4(SEQID No6)；S7和AS3(SEQ ID No7)；S7和AS2(SEQ ID No8)以及S7和AS1(SEQ ID No9)。由此制备了2.0、1.0、0.5、0.2和0.1kb的TFR片段并以乙醇沉淀对其进行纯化。所纯化的DNA被溶于50mM碳酸缓冲液(pH 9.5)。使用PicoGreen试剂盒(MolecularProbes)测量其含量，该试剂盒可被用于对双链DNA进行特异地定量，并且调节该含量至0.25、0.5或1.0mg/ml。被用于碱变性的样品经制备以使该处理产生上述的含量。
各样品被直接或者在碱变性条件下使用GMS 417阵列仪(GMS)点样于载玻片玻璃。使用PLL包被的载玻片玻璃(Mstdunami Glass；后文称为MAT/PLL)或者MAT/MAS作为固定化基片。样点的大小为150μm。样点的空间位375μm。对于每种DNA排列两个点。
使用在5’-末端标记有罗丹明X(后文称做ROX)的引物AS7制备的TFR片段被用作为探针。杂交按如下方法进行。含有1μm探针、4×SSC、0.2％的SDS以及100μg/ml鲑鱼精DNA的杂交溶液被滴入阵列仪中的各载玻片玻璃之上。以盖玻片覆盖该液滴以防含入空气气泡。以封口膜封缄该盖玻片的边缘并在42℃温育该载玻片玻璃5小时。杂交之后，在2×SSC中从载玻片玻璃上除去盖玻片。在室温下在含有0.2％的SDS的2×SSC中洗涤该载玻片玻璃5分钟，随后以0.2×SSC洗涤5分钟。随后以低速离心干燥该载玻片玻璃。使用GMS418阵列仪(GMS)在532的激发波长和570的发射波长下检测各载玻片玻璃。使用ImaGene分析杂交信号的相对强度。结果见表2。
表2基片 DNA含量DNA大小 信号的相对强度(bp) 碱变性(mg/ml) + -MAT/MAS 0.252000 4356 26521000 2597 2126500 2295 1937200 2939 2291100 3095 20420.502000 6927 43051000 4619 3559500 3400 3281200 6056 3240100 8821 38571.002000 8384 65351000 6427 4546500 5517 384920011252 483310012932 5053MAT/PLL 0.252000 6470 9381000 2280 1233500 2042 962200 1495 682100 1343 3250.50200010983 32571000 4419 980500 2801 831200 2624 742100 2313 14731.00200012165 53861000 7357 2397500 2944 1087200 3678 680100 3686 952如表2所示，对于每一块载玻片玻璃，在一种固定化基片上以变性条件点样有双链DNA的样本中，无论该点样DNA的大小均可观察到高相对强度的杂交信号。当使用的是高浓度的短DNA时，点样信号的相对强度特别显著地提高。因此，当一种双链DNA在变性条件下被点样于一种固定化基片上以制造至少部分单链的固定化DNA时，一种短DNA可被有效地固定化与基片之上，这样导致了强烈的杂交信号。同使用诸如MAT/PLL这样的PLL包被的载玻片玻璃所观察到的信号相比，MAT/MAS载玻片易于产生较强的信号。已经证实这种载玻片玻璃在制备具有被点样的短DNA的DNA芯片时特别地有效。
实施例3对DNA溶剂的检测(1)乙酸钠溶液对DNA进行变性的效果通过使用以各种浓度溶于含有乙酸钠缓冲液(pH 6.0)的溶剂中的天然双链DNA进行点样而制备了一种DNA芯片。随即对可杂交的DNA的量进行了比较。按以下方法制备出了一种1.5kb的TFR片段以作为测试样本。使用在实施例2中制备的pT7TFR作为模板以及具有SEQ ID NO11的核苷酸序列的引物S7和AS5作为引物进行PCR。这样制备出了一种1.5kb的TFR片段并以乙醇沉淀进行纯化。所纯化的DNA被溶于水中，并且通过测量其在260nm下的吸收测定其浓度。向含有该DNA的溶液(终浓度0.3mg/ml)加入终浓度为50、100、200、300或500mM的乙酸钠缓冲液(pH 6.0)。含有相同浓度的经过或不经过碱变性的DNA的3×SSC被用作参照。
使用GMS417阵列仪将各样本点样于MAT/MAS载玻片玻璃。如实施例1所述，排列之后对该载玻片玻璃进行固定化并对其表面的氨基基团进行封闭。该载玻片玻璃不被用于热变性。
使用Label IT Cy3标记试剂盒(Takara Shuzo)根据该试剂盒的说明指导以Cy3标记鲑鱼精DNA，该DNA已经被转化为较小的分子(200到2,500bp，Funakoshi)。Cy3标记的鲑鱼精DNA作为探针在温和的条件下同载玻片玻璃上的DNA进行杂交。测量非特异性杂交探针的荧光强度。由此测量了可杂交的点样DNA的量，即，以单链形式存在的DNA的量。具体地，使用100ng的Cy3标记的鲑鱼精DNA作为探针，对于寡DNA探针如实施例1中所述进行杂交以及洗涤。使用GMS 418阵列仪(GMS)在532的激发波长和570的发射波长下检测该载玻片玻璃。使用ImaGene分析杂交信号的相对强度。结果见表3。
表3溶剂 浓度 信号的相对强度(mM)乙酸钠 50 16147100 11640200 19070300 38700500 566363×SSC 13972碱变性 53370如表3所示，信号的相对强度随着乙酸钠的浓度的增加而增加，这证实了点样的DNA中的可杂交DNA比率提高了。
(2)添加表面活性剂的影响对向乙酸钠溶液中添加某种表面活性剂的影响进行了测试。sucrose monolaurate(Dojindo Laboratories)被用作为一种表面活性剂。该检测通过加入含量在0.005％到0.05％之间的sucrosemonolaurate来进行。如(1)中的描述制备一种DNA芯片并对信号进行分析。结果证实了sucrose monolaurate的添加使样点的信号强度均一并提高了信号强度。特别地，在0.01％到0.03％的浓度范围内观察到了显著的提高。
工业应用本发明提供了一种DNA芯片，该芯片对于短DNA产生该固定化速率并且产生高灵敏度，并且该芯片可被用于在总基因组的水平上以高灵敏度和高效检测一种生物体内的基因表达。本发明还提供了一种用于制备所述的芯片的DNA溶剂以及一种使用所述的溶剂制备DNA芯片的方法。
序列表自由文本SEQ ID NO1所设计的用于扩增人类癌症相关基因CA13的cDNA的寡核苷酸引物，该引物命名为CA13-S6。
SEQ ID NO2所设计的用于扩增人类癌症相关基因CA13的cDNA的寡核苷酸引物，该引物命名为CA13-A4。
SEQ ID NO3所设计的用于扩增人类转铁蛋白受体cDNA的寡核苷酸引物，该引物命名为S7。
SEQ ID NO4所设计的用于扩增人类转铁蛋白受体cDNA的寡核苷酸引物，该引物命名为AS7。
SEQ ID NO5所设计的用于扩增人类转铁蛋白受体cDNA的寡核苷酸引物，该引物命名为AS6。
SEQ ID NO6所设计的用于扩增人类转铁蛋白受体cDNA的寡核苷酸引物，该引物命名为AS4。
SEQ ID NO7所设计的用于扩增人类转铁蛋白受体cDNA的寡核苷酸引物，该引物命名为AS3。
SEQ ID NO8所设计的用于扩增人类转铁蛋白受体cDNA的寡核苷酸引物，该引物命名为AS2。
SEQ ID NO9所设计的用于扩增人类转铁蛋白受体cDNA的寡核苷酸引物，该引物命名为AS1。
SEQ ID NO11所设计的用于扩增人类转铁蛋白受体cDNA的寡核苷酸引物，该引物命名为AS5。
序列表<110>Takara Shuzo Co.，Ltd.<120>DNA芯片<130>662036<150>JP 11-209782<151>1999-07-23<160>11<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Designed oligonucleotide primer designated as CA13-S6 for amplifying cDNAfor human cancer-associated gene CA13.<400>1gacagagcat cagaaccaga 20<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>Designed oligonucleotide primer designated as CA13-A4 for amplifying cDNAfor human cancer-associated gene CA13.<400>2cttttcaatc catccacc 18<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Designed oligonucleotide primer designated as S7 for amplifying humantransferrin receptor cDNA.<400>3caagctagat cagcattctc 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Designed oligonucleotide primer designated as AS7 for amplifying humantransferrin receptor cDNA.<400>4tataccttta cctccaaaag 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Designed oligonucleotide primer designated as AS6 for amplifying humantransferrin receptor cDNA.<400>5acaaatctgt ctgttttctc 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Designed oligonucleotide primer designated as AS4 for amplifying humantransferrin receptor cDNA.<400>6ttgtctggac aggtatatta20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Designed oligonucleotide primer designated as AS3 for amplifying humantransferrin receptor cDNA.<400>7tcaacataca acgcaagatt20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Designed oligonucleotide primer designated as AS2 for amplifying humantransferrin receptor cDNA.<400>8gtcccatagc agatacttcc 20<210>9<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>Designed oligonucleotide primer designated as AS1 for amplifying humantransferrin receptor cDNA.<400>9ccacatgact gttatcgcca 20<210>10<211>1048<212>DNA<213>Human<400>10gacagagcat cagaaccaga ggcttggtcc cacaggccac ggaccaatgg cctgcagccg 60tgacaacact cctgtcatat tggagtccaa aacttgaatt ctgggttgaa ttttttaaaa 120atcaggtacc acttgatttc atatgggaaa ttgaagcagg aaatattgag ggcttcttga 180tcacagaaaa ctcagaagag atagtaatgc tcaggacagg agcggcagcc ccagaacagg 240ccactcattt agaattctag tgtttcaaaa cacttttgtg tgttgtatgg tcaataacat 300ttttcattac tgatggtgtc attcacccat taggtaaaca ttccctttta aatgtttgtt 360tgttttttga gacaggatct cactctgttg ccagggctgt agtgcagtgg tgtgatcata 420gctcactgca acctccacct cccaggctca agcctcccga atagctggga ctacaggcgc 480acaccaccat ccccggctaa tttttgtatt ttttgtagag acggggtttt gccatgttgc 540caaggctggt ttcaaactcc tggactcaag aaatccaccc acctcagcct cccaaagtgc 600taggattaca ggcatgagcc actgcgccca gcccttataa atttttgtat agacattcct 660ttggttggaa gaatatttat aggcaataca gtcaaagttt caaaatagca tcacacaaaa 720catgtttata aatgaacagg atgtaatgta catagatgac attaagaaaa tttgtatgaa 780ataatttagt catcatgaaa tatttagttg tcatataaaa acccactgtt tgagaatgat 840gctactctga tctaatgaat gtgaacgtgt agatgttttg tgtgtatttt tttaaatgaa 900aactcaaaat aagacaagta atttgttgat aaatattttt aaagataact cagcatgttt 960gtaaagcagg atacatttta ctaaaaggtt cattggttcc aatcacagct cataggtaga 1020gcaaagaaag ggtggatgga ttgaaaag<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Designed oligonucleotide primer designated as AS5 for amplifying humantransferrin receptor cDNA.<400>11atacaacagt gggctggcag20
权利要求
1.一种DNA芯片，该DNA芯片在一种基片的表面的预定区域排列和固定化有DNA，该芯片的制备方法包括在变性条件下将双链DNA固定化于一种固定化基片。
2.权利要求1的DNA芯片，其中使用一种DNA溶剂将这些DNA固定于该固定化基片，该DNA溶剂含有一种挥发性酸或其一种盐。
3.权利要求2的DNA芯片，其中该挥发性酸或其一种盐为一种挥发性的有机酸或其一种盐。
4.权利要求3的DNA芯片，其中该挥发性有机酸或其一种盐为乙酸或其一种盐。
5.权利要求1至4中任意一个的DNA芯片，其中该固定化基片为一种无孔基片。
6.权利要求5的DNA芯片，其中该无孔基片由玻璃制成。
7.一种含有一种挥发性酸或其一种盐的DNA溶剂，该溶剂用于制备一种DNA芯片。
8.权利要求7的DNA溶剂，其中该挥发性酸或其一种盐为一种挥发性的有机酸或其一种盐。
9.权利要求8的DNA溶剂，其中该挥发性有机酸或其一种盐为乙酸或其一种盐。
10.权利要求7至9中任意一个的DNA溶剂，该溶剂进一步含有一种表面活性剂。
11.一种方法，该方法用于制备一种DNA芯片，该DNA芯片在一种基片的预定区域表面排列和固定化有DNA，该方法包括在变性条件下将双链DNA固定化于一种固定化基片的表面。
12.权利要求11的方法，其中使用一种DNA溶剂将这些DNA固定于该固定化基片的预定区域，该DNA溶剂含有一种挥发性酸或其一种盐。
13.权利要求12的方法，其中该挥发性酸或其一种盐为一种挥发性的有机酸或其一种盐。
14.权利要求13的方法，其中该挥发性有机酸或其一种盐为乙酸或其一种盐。
15.权利要求11至14中任意一个的方法，其中该固定化基片为一种无孔基片。
16.权利要求15的方法，其中该无孔基片由玻璃制成。
全文摘要
一种DNA芯片,该DNA芯片在一种支持物的表面的预定区域排列和固定化有DNA,其特征在于双链DNA在变性条件下固定化于固定化支持物的表面。
文档编号C12Q1/68GK1362991SQ00810717
公开日2002年8月7日 申请日期2000年7月17日 优先权日1999年7月23日
发明者浅田起代蔵, 植田稔, 高山正范, 峰野纯一, 君塚房夫, 加藤郁之进 申请人:宝酒造株式会社