专利名称：基于PCR检测和定量Tapesia yallundae和Tapesia acuformis的制作方法
技术领域：
本发明涉及引物和探针在用于检测Tapesia yallundae(syn.Pseudocercosporella herpotrichoides W型)和Tapesia acuformis(syn.Pseudocercosporella herpotrichoides R型)的TaqManTM定量PCR测定中的应用。应用这些测定可以在植物群体中对特定真菌病原体进行检测和定量。本发明还涉及引物和探针在检测宿主小麦DNA用作内源性反应对照的TaqManTM定量PCR测定中的应用。
疾病破坏作用的严重性取决于病原体的侵袭性和宿主的反应。大多数植物育种项目的一个目的是增强宿主植物的抗病性。典型地，不同种类(race)的病原体有差别地与同一作物物种的不同品种相互作用，而且许多来源的宿主抗性仅对特定的病原体种类产生防护。而且，一些病原体种类会表现出疾病症状的早期征兆，而对作物几乎不造成破坏。Jones和Clifford(1993；谷物疾病(Cereal Diseases)，John Wiely)报道，随着宿主栽培品种中抗性的引入可以预期在病原体群体中会出现病原体的毒性形式，因此有必要对病原体群体进行监测。此外，关于抗某些杀真菌剂的真菌菌株的进化，有几个经文献证明的案例。早在1981年，Fletcher和Wolfe(1981；Proc.1981 Brit.Crop Prot.Conf.)就认为，来自春大麦的24％白粉菌群体和来自冬大麦的53％白粉菌群体在对杀真菌剂三唑醇的反应方面表现出相当大的差异，而且这些群体在各品种间的分布是不同的，最易感的品种也将给出最高发生率的较不敏感真菌类型。已有文献证明，小麦霉(也对三唑醇)、葡萄孢(Botrytis)(对苯菌灵)、核腔菌(Pyrenophora)(对有机汞)、Pseudocercosporella(对MBC型杀真菌剂)等真菌对杀真菌剂敏感性方面存在类似的差异，而Mycosphaerella fijiensis对三唑的敏感性差异亦略有提及(Jones和Clifford；谷物疾病，John Wiley，1983)。
谷物在全世界范围内种植，是世界粮食生产的一个主要部分。尽管许多病原体会造成产量的损失，但在欧洲和北美的主要谷物种植区域，引起坏死的病原体壳针孢(Septoria)和Pseudocercosporella尤其重要(Jones和Clifford；谷物疾病，John Wiley，1983)。特别是，由这些真菌的不同隔离群(isolate)和类型造成的差异症状使得难于准确地预先确定可能的疾病损失。因此，对于大田病理学家，获得可以快速和准确鉴定特定病原体的改良诊断技术将是相当有用的。
小麦的眼斑病(eyespot)是由病原体Tapesia acuformis和Tapesiayallundae引起的。这些病原体以前一直被认为是同一物种Pseudocercosporella herpotrichoides(Fron)Deighton的变种。小麦、黑麦、燕麦和其它禾本科植物均易感染此眼斑病，该疾病在冷湿气候下发生并盛行于欧洲、北美及南美、非洲和澳大利亚。小麦是最易受到感染的谷物，但在其它谷物上已鉴定到同样具有毒性的隔离群。例如，从黑麦中还分离出该真菌的R菌株(Tapesia acuformis)，该菌株比分离自小麦的W菌株(Tapesia yallundae)在小麦上生长慢。眼斑病局限在植物的茎杆基部，能够彻底杀死分蘖或植物；然而，更通常地它引起倒伏和/或导致种子大小和数量的降低。与眼斑病有关的产量损失量甚至比与小麦壳针孢(Septoria tritici)和颖枯壳针孢(Septoria nodorum)有关的产量损失还大。对眼斑病的典型控制措施包括生长调节剂处理以增强节间、和杀真菌剂处理。然而，栽培品种对不同真菌菌株的差异敏感性使得难于预测杀真菌剂处理的效力。
鉴于上述情况，确实需要开发允许在感染过程的早期鉴定病原体真菌特定种类的技术。在作物群从出现明显疾病症状之前通过鉴别特定种类的病原体，农学家可以评价在鉴定出该病原体的作物品种中该病原体进一步发展的可能结果，并可以在认为必需使用杀真菌剂时选择适合的杀真菌剂。
TaqManTM化学和ABI7700(Perkin Elmer，Applied BiosystemsDivision，Foster City，CA)为精确、可重复地定量测定DNA和RNA提供了手段。TaqManTM化学的基础是聚合酶链式反应(PCR)。在常规PCR测定中，设计与目的DNA序列的5’和3’末端互补的寡核苷酸引物。在热循环过程中，首先热变性DNA。然后样品被带到退火和延伸温度，在这些温度下引物与其特异互补序列结合并通过核苷三磷酸的加入在Taq聚合酶的作用下延伸。经过重复热循环，模板DNA的量得到扩增。
在TaqManTM化学中，设计与PCR扩增子的引物之间序列区域互补的寡核苷酸探针。该探针在其5’末端含有荧光报道染料(fluorescentreporter dye)，在其3’末端含有淬灭染料(quencher dye)。当探针完好时，其荧光释放由于荧光共振能量转移(FRET)现象而被淬灭。在热循环过程中，探针与一个引物下游的靶DNA杂交。TaqManTM化学依赖Taq聚合酶的5’外切核酸酶活性从探针上切下荧光染料。随着PCR产物的积累，荧光信号增强。通过测定该信号，即可对扩增产物定量。该方法使得可以通过靶向病原体DNA对疾病压力进行定量。在区分病原体的测定中，联合PCR引物，探针提供了另一水平的特异性。
·上文提及的寡核苷酸引物，其中所述引物选自SEQ ID NO42和43；·寡核苷酸引物对，其中至少一个所述引物是由SEQ ID NO42和43组成的寡核苷酸引物；·寡核苷酸引物对，其中所述引物对由SEQ ID NO42和43组成。
本发明还提供·检测真菌病原体，尤其是Tapesia yallundae和Tapesiaacuformis，的方法，包括(a)从病原体感染的植物叶中分离DNA；(b)采用至少一个根据本发明的引物，对所述DNA进行聚合酶链式反应扩增；和(c)通过显现所述聚合酶链式反应扩增的产物，检测所述真菌病原体。
·检测真菌病原体，尤其是Tapesia yallundae和Tapesiaacuformis，的方法，包括(a)从感染所述真菌病原体的植物组织中分离DNA；(b)采用所述DNA为模板在聚合酶链式反应中以根据权利要求3的引物对扩增所述真菌病原体的部分内部转录间隔区(InternalTranscribed Spacer)序列；和(c)通过显现该扩增的部分内部转录间隔区序列，检测所述真菌病原体。
本发明还提供用于检测真菌病原体的诊断试剂盒，其包含上文提及的引物。
本发明还提供检测小麦DNA的方法，包括(a)从感染病原体的小麦组织中分离DNA；(b)采用根据本发明的引物对对所述DNA进行聚合酶链式反应扩增；和(c)通过显现所述聚合酶链式反应扩增的产物，检测所述小麦DNA。
而且，本发明提供在真菌内部转录间隔区序列的基于扩增的检测中使用的寡核苷酸探针，其中所述探针含有
(a)与选自下组的序列中的至少10个连续核苷酸互补的核苷酸序列Tapesia yallundae的ITS1、Tapesia yallundae的ITS2、Tapesiaacuformis的ITS1和Tapesia acuformis的ITS2；(b)位于所述核苷酸序列5’末端的荧光报道染料；和(c)位于所述核苷酸序列3’末端的淬灭染料。
本发明还提供上文提及的寡核苷酸探针，其中所述核苷酸序列与选自下组的序列中的至少10个连续核苷酸互补SEQ ID NO37的第31-263位核苷酸、SEQ ID NO37的第420-570位核苷酸、SEQ ID NO38的第31-262位核苷酸、和SEQ ID NO38的第419-568位核苷酸，但其中所述核苷酸序列特别选自SEQ ID NO7、SEQ ID NO24、SEQ ID NO27和SEQ ID NO29。
本发明还提供在小麦DNA的基于扩增的检测中使用的寡核苷酸探针，其中所述探针含有(a)与SEQ ID NO41或SEQ ID NO44中的至少10个连续核苷酸互补的核苷酸序列；(b)位于所述核苷酸序列5’末端的荧光报道染料；和(c)位于所述核苷酸序列3’末端的淬灭染料。
本发明还提供用于定量真菌DNA的寡核苷酸引物对/探针组，其中所述引物对由根据本发明的引物对组成，而探针是SEQ ID NO24、SEQ IDNO7或SEQ ID NO44。
为了确保清晰一致地理解本说明书和权利要求，提供以下定义基因是指编码序列和相关的调节序列，其中编码序列可被转录成RNA，如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA或反义RNA。调节序列的例子是启动子序列、5’和3’非翻译序列和终止序列。可以存在的其它元件有例如内含子。
一致性序列一致性百分数采用基于动态规划算法(dynamicprogramming algorithms)的计算机程序来确定。在本发明范围中优选的计算机程序包括BLAST(基础局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool))搜索程序，该程序被设计用于探查所有可获得的序列数据库，而不论查询的是蛋白质还是DNA。此搜索工具的BLAST2.0版本(Gapped BLAST)已可在互联网(目前是http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上公开获得。它采用寻求局部而非整体比对的启发式算法(heuristic algorithm)，因此，能够检测仅共有分隔区域的序列之间的关系。BLAST搜索中给出的分数有十分明确的统计学解释。所述程序优选采用设定为默认值的任选参数运行。
植物是指任何植物，尤其是种子植物。
植物材料是指植物的叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、卵细胞、合子、胚胎、种子、插条、细胞或组织培养物、或任何其它部分或产物。
本发明涉及鉴定和定量不同植物病原性真菌物种的方法。本发明提供在TaqManTM定量PCR测定中有用的引物和探针DNA序列。这些DNA序列在本发明方法中是有用的，因为它们可以用于聚合酶链式反应(PCR)和基于TaqManTM的诊断测定中。在DNA模板由特定真菌病原体提供的PCR反应中，这些引物产生唯一的片段。与采用TaqManTM探针进行的杂交相结合，它们可以用于在疾病症状出现以前检测和定量宿主植物材料中的特定病原体。
在一个优选实施方案中，本发明提供用于检测Tapesia yallundae(syn.Pseudocercosporella Herpotrichoides W型)和Tapesiaacuformis(syn.Pseudocercosporella Herpotrichoides R型)的ITS衍生的诊断引物和TaqManTM探针。
本发明为评价特定作物品种-病原体株关系中的潜在破坏性提供了可能性，并使得可以明智地利用多样的可获得的杀真菌剂武器库。而且，本发明可以用于提供有关特定病原体种类在大范围地理区域中的发展和散布的详细信息。本发明提供用于在指定作物上定量疾病压力的方法。
本发明还提供用于实施本发明的试剂盒。该试剂盒对于鉴定和定量真菌病原体Tapesia yallundae和Tapesia acuformis尤其有用。序列表中序列的简述SEQ ID NOs1-34是在真菌病原体Tapesia yallundae和Tapesiaacuformis的基于PCR的检测中有用的如下寡核苷酸探针和引物
SEQ ID NO35是正向测序引物。
SEQ ID NO36是反向测序引物。
SEQ ID NO37是Tapesia acuformis(syn.P.Herpotrichoides R型)的内部转录间隔区DNA序列，NRRL保藏号为B-21234，按5’至3’方向含有小亚基rRNA基因的3’末端(第1-30位核苷酸)、内部转录间隔区1(第31-263位核苷酸)、5.8S rRNA基因(第264-419位核苷酸)、内部转录间隔区2(第420-570位核苷酸)、和大亚基rRNA基因的5’末端(第571-627位核苷酸)。
SEQ ID NO38是Tapesia yallundae(syn.P.Herpotrichoides W型)的内部转录间隔区DNA序列，NRRL保藏号为B-21231，按5’至3’方向含有小亚基rRNA基因的3’末端(第1-30位核苷酸)、内部转录间隔区1(第31-262位核苷酸)、5.8S rRNA基因(第263-418位核苷酸)、内部转录间隔区2(第419-569位核苷酸)、和大亚基rRNA基因的5’末端(第570-626位核苷酸)。
SEQ ID NO39是从来自三个不同地域(Barton、Elmdon、Teversham)、感染了Tapesia acuformis的小麦提取物中PCR扩增产生的部分ITS区的共有DNA序列，按5’至3’方向含有部分内部转录间隔区1序列、5.8S rRNA基因、和部分内部转录间隔区2序列。
SEQ ID NO40是从来自三个不同地域(Barton、Elmdon、Teversham)、感染了Tapesia yallundae的小麦提取物中PCR扩增产生的部分ITS区的共有DNA序列，按5’至3’方向含有部分内部转录间隔区1序列、5.8S rRNA基因、和部分内部转录间隔区2序列。
SEQ ID NO41是小麦叶绿体DNA中编码细胞色素b-559的基因的核苷酸序列(Hird等，Mol.Gen.Genet.20395-100(1986))。
SEQ ID NO42-44是在小麦叶绿体DNA的基于PCR的检测中有用的如下寡核苷酸引物和探针
本发明提供在鉴定和定量植物病原性真菌的不同致病型中使用的独特DNA序列。具体地，这些DNA序列可以在鉴定真菌致病型的基于TaqManTMPCR的分析中用作引物。本发明DNA序列包括来源于特定真菌病原体核糖体RNA基因区域中的内部转录间隔区(ITS)序列的引物和探针，它们能够鉴别此特定病原体。来自病原体种或属中不同致病型的ITS DNA序列在这些种或属的不同成员之间是不同的，它们可以被用于鉴别这些特定成员。
生物医学研究者采用基于PCR的技术检测感染动物组织中的病原体已有一段时间，并获得了一定的成功。然而，仅在最近，该技术才被应用于检测植物病原体。通过对Gaumannomyces graminis线粒体基因组具有特异性的序列进行PCR，已经在感染的小麦中检测到该病原体的存在(Schlesser等，1991；Applied and Environ.Microbiol.57553-556)；而且随机扩增多态性DNA(即RAPD)标记能够区分Gremmeniella abietina的许多种类，Gremmeniella abietina是导致松柏类植物中出现scleroderris canker的原因。美国专利5,585,238(完整地并入本文作为参考)描述了来源于壳针孢属(Septoria)、Pseudocercosporella和球腔菌属(Mycosphaerella)菌株核糖体RNA基因区域中ITS序列的引物，以及它们在采用基于PCR的技术鉴定这些真菌隔离群中的用途。此外，WO 95/29260(完整地并入本文作为参考)描述了来源于镰孢属(Fusarium)菌株核糖体RNA基因区域中ITS序列的引物，以及它们在采用基于PCR的技术鉴定这些真菌隔离群中的用途。而且，美国专利5,800,997(完整地并入本文作为参考)描述了来源于尾孢属(Cercospora)、长蠕孢属(Helminthosporium)、球梗孢属(Kabatiella)和柄锈菌属(Puccinia)菌株核糖体RNA基因区域中ITS序列的引物，以及它们在采用基于PCR的技术鉴定这些真菌隔离群中的用途。
由于具有高拷贝数，核糖体基因适合用作分子探针的靶标。尽管成熟rRNA序列之间具有高度保守性，但非转录和转录间隔区序列通常保守性差，因此适合作为靶序列用于检测新近的进化歧异。真菌的rRNA基因按单元组织，每个单元编码三个成熟亚基18S(小亚基)、5.8S和28S(大亚基)。这些亚基之间由两个大约300bp的内部转录间隔区，ITS1和ITS2，分隔开(White等，1990；见《PCR实验指南》(PCR Protocols)；编者Innes等；第315-322页)。此外，这些转录单元由非转录间隔区序列(NTS)分隔开。ITS和NTS序列对于检测不同真菌病原体的具体致病型尤其适合。本发明DNA序列来自特定植物病原体核糖体RNA基因区域中的内部转录间隔区序列。来自病原体种或属中不同致病型的ITS DNA序列在这些种或属的这些成员之间是不同的。一旦确定了一个病原体的ITS序列，即可将这些序列与其它ITS序列作比对。以此方式，可以从这些ITS序列得到引物。也就是说，可以根据这些ITS序列中的如下区域设计引物，所述区域在真菌致病型间具有最大的序列差异。可以将这些序列和基于这些序列的引物用于鉴定具体病原体。
来源于ITS序列的代表性寡核苷酸引物的序列公开于SEQ ID NO1-34中。这些序列可以在基于TaqManTM定量PCR对目的病原体进行的鉴定中使用。
在PCR分析中使用本发明引物序列的方法是本领域熟知的。例如，见美国专利4,683,195和4,683,202，以及Schlesser等(1991)Appliedand Environ.Microbiol.57553-556。还参见Nazar等(1991；Physiol.and Molec.Plant Pathol.391-11)，他们采用PCR扩增探索黄萎轮枝孢(Verticillium albo-atrum)和大丽花轮枝孢(Verticilliumdahliae)的ITS区的差异，并由此区分了这两个物种；还参见Johanson和Jeger(1993；Mycol.Res.97670-674)，他们采用类似技术区分香蕉病原体Mycosphaerella fijiensis和Mycosphaerella musicola。
近来TaqManTM方法学在医学研究中被用于定量检测临床样品中的单纯疱疹病毒(HSV)DNA(J.Clin.Microbiol.37(6)1941-7(1999年6月))、在兽医学中被用于检测宿主动物体内的寄生微生物(J.Clin.Microbiol.37(5)1329-31(1999年5月))，并且该方法学已表现出可用于甄别牛肉末中的细菌病原体(Appl.Envir.Micro.62(4)1347-1353(1996年4月))。仅在最近TaqManTM方法才被用于鉴定和/或定量作物中的真菌病原体(植物病理学(Phytopathology)，89(9)796-804(1999))。
本发明ITS DNA序列可以通过本领域已知的方法从真菌病原体克隆。一般地，从真菌隔离群中分离DNA的方法是已知的。见，Raeder和Broda(1985)应用微生物学通讯(Letters in Applied Microbiology)217-20；Lee等(1990)真菌遗传学时事通讯(Fungal Genetics Newsletter)3523-24；及Lee和Taylor(1990)《PCR实验指南方法和应用指导》(PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications)，Innes等(编)；第282-287页。
将每个病原体组中的这些ITS序列进行比较，以定位可以在TaqManTMPCR测定中用于区分不同种和/或株的序列趋异差别。在鉴定了序列趋异后，为每个探针合成多个引物，并在TaqManTM测定中对这些引物进行测试。在TaqManTM测定中使用的模板首先是纯化的病原体DNA，其次是从感染的宿主植物组织中分离到的DNA。由此，可以鉴定出具有鉴别性(即识别出一个特定的病原体种或株而不是相同病原体的其它种或株)的探针-引物组合。
优选的引物-探针组合能够在感染的宿主组织(即先已感染了特定病原体种或株的宿主组织)中区分不同的种或株。本发明提供许多符合此标准用于Tapesia yallundae和Tapesia acuformis的引物-探针组合。本发明的引物和探针是以真菌ITS区域间的序列差异为基础设计的。序列间的最小一个碱基对差异就能够允许设计出具有辨别能力的引物或探针。设计针对于特定真菌病原体的ITS区域的引物-探针组合可以联合用于检测种特异性PCR片段扩增的针对核糖体基因编码区中保守序列区域的引物或探针一起使用。一般地，引物应具有59℃左右的理论解链温度(Tm)以便获得良好的灵敏度，而且应缺少显著的二级结构并在引物组合间缺少3’重叠区。引物对的Tm典型地彼此相差2℃以内。引物一般与ITS1或ITS12的至少约5-10个连续核苷酸具有序列一致性。在优选实施方案中，引物长度大致是约5至30个核苷酸碱基。探针的Tm一般设计为高于引物Tm10℃。所有的小麦提取物均含有宿主小麦DNA和存在的任何真菌病原体DNA。因此，可以对提取物进行靶向小麦DNA的内源性对照测定，以说明提取物样品间的任何差异。本发明描述了靶向细胞色素b-559基因的对照测定。在小麦品种间细胞色素b-559基因是一个保守基因，是宿主植物生存所必需的。这些对照测定提供了对假阴性的控制。即，可能由于PCR反应抑制造成的阴性真菌DNA结果可以通过内源性对照测定来验证。这些对照测定还提供了一个靶标，针对此靶标可以对真菌DNA的量进行标化以便实现样品与样品的比较。本发明描述了这些对照测定在独立于真菌病原体测定的反应中和在多重反应中的应用。本发明本身容易地引出了含有实施本发明方法所必需要素的“试剂盒”的制备。该试剂盒可以含有带分隔的托架，以便在其中密集放置一或多个容器，如管或小瓶。其中一个容器可以含有未标记的或可检测标记的DNA引物。这些标记DNA引物可以按需要以冻干形式存在或处于适合的缓冲液中。一或多个容器可以含有在TaqManTMPCR反应中使用的一或多种酶或试剂。这些酶可以单独或混合地，以冻干形式存在或处于适当缓冲液中。最后，该试剂盒可以含有实施本发明技术所必需的所有其它成分，例如缓冲液、抽提试剂、酶、吸管、平板、核酸、核苷三磷酸、滤纸、和类似的其它消耗品。
以下实施例给出了典型的实验操作方法，这些操作方法可以用于选择适合的引物和探针序列、测试引物和探针的选择和鉴别效力、和应用这些引物和探针检测和定量疾病和真菌隔离群。提供这些实施例旨在作为举例说明而非进行限制。
(2)将茎样品置于Bioreba(Reinach，瑞士)重负荷塑料袋中(cat#490100)。给此植物组织称重，即装有样品的塑料袋的重量减去包装重量(塑料袋的重量)。
(3)每份重量(g)的小麦组织中加入等体积(mL)Muller提取缓冲液(0.1％w/v Tween-80；0.040M Tris碱；0.15M氯化钠；0.1％w/v牛血清白蛋白(Pentex Fraction V)；0.01％ w/v叠氮化钠；0.20M EDTA；pH7.7，储存在4℃)。采用设置在70的Bioreba Homex 6匀浆器浸解组织。研磨组织直到形成纤维状。
(4)于冰上将提取汁液等分装在Eppendorf管中。
(a)煮沸提取物5分钟。
(b)将煮沸的提取物置于冰上。用小型离心机12,000×G离心(microfuge)此煮沸提取物。
(c)将来自该离心提取物的上清液按1∶20稀释在dH2O中。
(d)将稀释的提取物一直储存在冰上直到临用前。表2用于开发引物和探针的小麦样品的产地
表3用于开发测定方法的小麦样品的产地
实施例3从Tapesia yallundae和Tapesia acuformis感染的小麦样品中分离内部转录间隔区(ITS)DNA并测序从表2中显示的感染了Tapesia yallundae的小麦提取物，采用Tapesia yallundae特异性引物JB537(SEQ ID NO31)和JB541(SEQ IDNO32)，PCR扩增大约420bp的截短ITS区片段。类似地，从Tapesiaacuformis感染的小麦提取物，采用Tapesia acuformis特异性引物JB540(SEQ ID NO33)和JB542(SEQ ID NO34)，PCR扩增Tapesia acuformis的截短ITS片段。聚合酶链式反应采用Perkin-Elmer的GeneAmp试剂盒(Foster City，CA；part no.N808-0009)进行，在50μl终体积中含有50mM KCl、2.5mM MgCl2、10mM Tris-HCl(pH8.3)，dTTP、dATP、dCTP和dGTP各200μM、引物各50pmol、2.5单位Taq聚合酶和1μl 1∶10稀释的小麦提取物。反应在Perkin-Elmer 9700型热循环仪中按94℃15s和75℃1min，运行35循环。
采用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA；part no.K4550-40)，根据厂家说明书，将PCR产物克隆至pCR2.1-TOPO TA克隆载体中。采用此TA克隆载体的正向引物(5’-gtaaaacgacggccagt-3’；SEQID NO35)和反向引物(5’-caggaaacagctatgac-3’；SEQ ID NO36)，对含有ITS片段插入的克隆测序。测序在ABI PRISM 377TMDNA测序仪(PerkinElmer Applied Biosystems，Foster City，Caiifornia)上进行。实施例4寡核苷酸的合成和纯化通过例如Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)或Midland Certified Reagent公司(Midland，Texas)合成和纯化寡核苷酸和TaqManTM探针(引物和探针)。实施例5种特异性引物和探针的选择对实施例3中描述的从感染小麦组织获得的Tapesia yallundae(SEQID NO40)和Tapesia acuformis(SEQ ID NO39)的ITS区共有序列进行多序列比对。包括在该比对中的还有美国专利5,585,238引用的Tapesiayallundae和Tapesia acuformis真菌DNA的ITS区序列(分别是SEQ IDNO37和SEQ ID NO38)。针对在真菌种之间含有最大序列差异的区域设计PCR引物和TaqManTM探针。这就产生了对Tapesia acuformis或Tapesia yallundae具有特异性的设计引物和探针。根据实施例4合成显示在下表3和4中的寡核苷酸引物和探针。并合成前述(美国专利5,585,238)Tapesia yallundae特异性引物JB537(SEQ ID NO31)和JB541(SEQ ID NO32)、以及Tapesia acuformis特异性引物JB540(SEQID NO33)和JB542(SEQ ID NO34)。此外，还合成White等(1990；《PCR实验指南》；编者Innes等，第315-322页)公开的核糖体基因特异性引物ITS1(SEQ ID NO1)和ITS4(SEQ ID NO2)，用于联合这些ITS区特异性引物进行测试。表4用于TaqManTM扩增Tapesia acuformis DNA的引物和探针
表5用于TaqManTM扩增Tapesia yallundae DNA的引物和探针
实施例6对引物-探针文库的最初筛选在最初TaqManTM筛选中测试实施例5中设计的种特异性引物文库。测试引物和探针组合从靶病原体DNA进行扩增的能力。所有其它反应条件均保持恒定(1×TaqManTM通用母混合物(Perkin Elmer，Norwalk，CT；part no.N430-4447)，引物各200nM，100nM探针，0.04ng/μL真菌靶基因组DNA，热循环50℃2分钟，95℃10分钟，以及95℃15秒、60℃60秒循环40周)。通过鉴定最佳扩增该靶DNA的那些引物和探针，确定病原体特异性引物和探针。实施例7TaqManTM引物优化一旦确定了对靶病原体DNA特异的引物对后，在单次TaqManTM试验中优化引物浓度。试验不同浓度正向引物对不同浓度反向引物的矩阵，而所有其它反应条件保持恒定(1×TaqManTM通用母混合物(Perkin Elmer)，100nM探针，0.4ng/μL真菌靶基因组DNA，热循环50℃2分钟，95℃10分钟，以及95℃15秒、60℃60秒循环40周)。实施例8TaqManTM探针优化一旦按实施例7确定了最佳引物浓度后，即优化探针浓度。在引物处于最佳浓度时，在一个典型的TaqManTM试验中运行不同的探针浓度。选择在报道PCR扩增方面给出最佳信号的探针浓度。记录用于定量Tapesia acuformis和Tapesia yallundae的最佳引物和探针以及它们的最佳反应浓度(分别列于表5和6)。采用60℃的退火温度、35个循环建立对Tapesia acuformis和Tapesia yallundae的分析测定。表6Tapesia acuformis特异的引物和探针组合
表7Tapesia yallundae特异的引物和探针组合
实施例9确定TaqManTM测定对真菌基因组DNA的特异性用一组来自其它谷类植物病原体的DNA，验证该TaqManTM测定的交叉反应性(表1)。采用实施例7和8中测定的最佳引物和探针浓度进行TaqManTM反应，对按实施例1制备的谷类植物病原体基因组DNA(0.2ng/μL)进行测试。根据结果，改变热循环参数以使该测定更严紧。这些改变包括改变反应中的退化/延伸温度或循环数。成功的TaqManTM测定对皮克级以下量的靶DNA敏感，并与该组谷类植物病原体或植物DNA无任何交叉反应。表8中显示了实施例8所确定的Tapesia acuformis(R型)和Tapesia yallundae(W型)测定方法的结果。CT值用于显示在所选隔离群中的扩增。当采用这些测定方法时，CT值为35的那些隔离群不产生扩增。表8真菌基因组DNA样品的Tapesia acuformis TaqManTM测定结果
注CT值或循环阈值，是指PCR循环，在此循环首先可检测到高于基线信号的报道荧光增加。序列检测(Sequence Detection)软件就所有标准品产生CT对(LogN)起始拷贝数的标准曲线，然后通过内插法(interpolation)确定未知样品的起始拷贝数。实施例10确定TaqManTM测定对感染小麦中病原体的特异性在采用实施例3所述测定进行分析的基础上，将小麦样品确定为感染Tapesia acuformis和/或Tapesia yallundae的样品。此外采用表6所列引物组合和实施例8的PCR条件测试小麦样品。采用序列检测系统(Sequence Detection Systems)软件(Perkin Elmer-AppliedBiosciences)，根据真菌靶标基因组DNA的标准曲线(表9)定量从小麦样品扩增的病原体DNA。关于Tapesia acuformis特异性测定的结果显示在表10中。在所有感染样品中均检测到来自Tapesia acuformis的DNA，并对之进行了定量。关于Tapesia yallundae特异性测定的结果显示在表11中。在所有感染样品中均检测到来自Tapesia yallundae的DNA，并对之进行了定量。对于任一个测定，在未感染小麦组织中均没有观察到交叉反应。表9Tapesia acuformis和T.yallundae基因组DNA分别在R型和W型测定中重复两次实验的标准曲线
表10小麦提取物的Tapesia acuformis TaqManTM测定结果。样品进行两次重复实验并被常规PCR测定实验的结果证明
表11小麦提取物的Tapesia yallundae TaqManTM测定结果。样品进行两次重复实验并被常规PCR测定实验的结果证明
实施例11与真菌病原体TaqManTM测定一起使用的内源性对照所有小麦提取物均含有宿主小麦DNA和存在的任何真菌病原体DNA。因此，为了说明样品提取物间的任何差异，对提取物进行靶向小麦DNA的内源性对照测定。这些测定提供对假阴性的控制。即，可能由于PCR反应抑制导致的阴性真菌DNA结果可以通过此内源性对照测定得到验证。这些测定还提供了一个靶标，通过该靶标可以对真菌DNA的量进行标化以便样品和样品间的比较。实施例12内源性对照引物和探针的选择用于扩增和检测小麦叶绿体DNA的引物和探针涉及细胞色素b-599基因的编码序列(SEQ ID NO41)。引物和探针序列的选择采用ABI PrimeExpress程序(PE Applies Biosystems，Foster City，CA，USA)根据厂家说明来实现。该程序选择在解链温度、二级结构、碱基组成和扩增子长度方面得到优化的TaqManTM引物和探针组。从该软件选择的这些引物和探针组，通过手工寻找在3’末端具有最少数目的热动力学稳定碱基的引物，由此筛选出最佳的组。选择用于扩增小麦DNA作为内源性对照的引物/探针组显示在表12中。它们均按实施例4的方法合成。表12靶向小麦(Triticum aestivum)叶绿体DNA的内源性对照反应所用的引物和探针组合
实施例13采用TaqManTM测定在小麦提取物中定量小麦DNA按实施例2所述制备小麦组织的提取物。按如下对这些组织进行实施例11所述的测定在薄壁光学级PCR管(PE Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)中制备反应物。通过在1×TaqMan通用母混合物溶液(PE Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)中将正向和反向引物浓度调节至900nM并将探针浓度调节至250nM，制备反应混合物。加入1微升1∶20稀释的小麦提取物。此外，通过加入1μL 5ng/μL真菌DNA制备物，测试与真菌DNA的交叉反应性。反应在ABI 7700仪(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA)中进行，热循环是50℃2分钟，90℃10分钟，以及95℃15秒、60℃60秒的40个循环。ABI 7700软件确定每个反应的荧光达到0.4阈值时的CT值。该数据列于表13中。给出的此CT值与每个样品中存在的小麦靶DNA量负相关。产生40 CT值的样品为无扩增。表13显示，此内源性对照测定在多个小麦品种中均检测到细胞色素b-599基因。对小麦叶绿体DNA的TaqManTM测定还显示出每个样品中存在不同量的宿主DNA。采用靶DNA的稀释物，可以按实施例10所述产生标准曲线，根据此曲线可以对小麦DNA进行定量。表13在小麦和真菌DNA提取物中靶向小麦叶绿体DNA的TaqManTM测定所报道的CT值
实施例14用于真菌病原体的TaqManTM测定和用于宿主DNA的对照测定的合并将实施例13中给出的反应和用于定量真菌DNA的反应合并在一起，以便在同一反应管中进行两个测试。列于表6中的针对Tapesiaacuformis的探针和引物按其最佳浓度加至实施例13所述的反应中。按所述对感染的小麦组织运行这些反应。此处给出的数据显示，TaqManTM真菌病原体测定可以和针对小麦组织的内源性对照反应在同一反应管中进行。表14在小麦DNA提取物中靶向小麦叶绿体DNA的TaqManTM测定所报告的CT值
尽管本发明通过参考其具体实施方案进行了描述，但应当理解，可以有许多变化、修饰和其它实施方案，因此所有这些变化、修饰和实施方案都应被认为属于本发明的范围之内。
序列表<110>Novartis AG<120>基于PCR检测和定量Tapesia yallundae和Tapesia acuformis<130>PB/5-31084A<140><141><150>US09/371,749<151>1999-08-10<150>US60/168,326<151>1999-12-01<160>44<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述ITS1<400>1tccgtaggtg aacc tgcgg 19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述ITS2<400>2tcctccgctt attgatatgc 20<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述J103W<400>3ggctacccta cttggtag18<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述J104W<400>4cctgggggct accctacttg 20<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述J105W<400>5gggggctacc ctacttggta g21<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述J106W<400>6tgggggctac cctacttggt ag 22<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述J107W<400>7tttagagtcg tcaggcctct cggagaagc 29<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述J108W<400>8atttattcaa gggtggaggt cctga25<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述J109W<400>9aagggtggag gtctgaacca g21<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述J110W<400>10aagggtggag 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1.寡核苷酸引物，其选自SEQ ID NOs3-6、8-23、25-26、28、30、42和43。
2.根据权利要求1的寡核苷酸引物，其中所述引物选自SEQ ID NOs3-6、8-23、25-26、28和30。
3.寡核苷酸引物对，其中至少一个所述引物是权利要求2的寡核苷酸引物。
4.根据权利要求3的寡核苷酸引物对，其中所述引物对由SEQ ID NO14和SEQ ID NO18组成。
5.根据权利要求3的寡核苷酸引物对，其中所述引物对由SEQ ID NO3和SEQ ID NO8组成。
6.根据权利要求1的寡核苷酸引物，其中所述引物选自SEQ ID NO42和SEQ ID NO43。
7.寡核苷酸引物对，其中至少一个所述引物是权利要求6的寡核苷酸引物。
8.根据权利要求7的寡核苷酸引物对，其中所述引物对由SEQ ID NO42和SEQ ID NO43组成。
9.检测真菌病原体的方法，包括(a)从感染病原体的植物叶中分离DNA；(b)采用至少一个根据权利要求2的引物对所述DNA进行聚合酶链式反应扩增；和(c)通过显现所述聚合酶链式反应扩增的产物，检测所述真菌病原体。
10.权利要求9的方法，其中所述真菌病原体选自Tapesia yallundae和Tapesia acuformis。
11.检测真菌病原体的方法，包括(a)从感染所述真菌病原体的植物组织中分离DNA；(b)采用所述DNA作为模板在聚合酶链式反应中以根据权利要求3的引物对扩增所述真菌病原体的部分内部转录间隔区序列；和(c)通过显现该扩增的部分内部转录间隔区序列，检测所述真菌病原体。
12.权利要求11的方法，其中所述真菌病原体选自Tapesia yallundae和Tapesia acuformis。
13.用于检测真菌病原体的诊断试剂盒，其含有权利要求2的引物。
14.用于检测真菌病原体的诊断试剂盒，其含有权利要求3的引物对。
15.检测小麦DNA的方法，包括(a)从感染病原体的小麦组织中分离DNA；(b)采用根据权利要求7的引物对，对所述DNA进行聚合酶链式反应扩增；和(c)通过显现所述聚合酶链式反应扩增的产物，检测所述小麦DNA。
16.在真菌内部转录间隔区序列的基于扩增的检测中使用的寡核苷酸探针，其中所述探针含有(a)与选自下组的序列中的至少10个连续核苷酸互补的核苷酸序列Tapesia yallundae的ITS1、Tapesia yallundae的ITS2、Tapesiaacuformis的ITS1和Tapesia acuformis的ITS2；(b)位于所述核苷酸序列5’末端的荧光报道染料；和(c)位于所述核苷酸序列3’末端的淬灭染料。
17.根据权利要求16的寡核苷酸探针，其中所述核苷酸序列与选自下组的序列中的至少10个连续核苷酸互补SEQ ID NO37的第31-263位核苷酸、SEQ ID NO37的第420-570位核苷酸、SEQ ID NO38的第31-262位核苷酸、和SEQ ID NO38的第419-568位核苷酸。
18.根据权利要求17的寡核苷酸探针，其中所述核苷酸序列选自SEQID NO7、SEQ ID NO24、SEQ ID NO27和SEQ ID NO29。
19.在小麦DNA的基于扩增的检测中使用的寡核苷酸探针，其中所述探针含有(a)与SEQ ID NO41的至少10个连续核苷酸互补的核苷酸序列；(b)位于所述核苷酸序列5’末端的荧光报道染料；和(c)位于所述核苷酸序列3’末端的淬灭染料。
20.根据权利要求19的寡核苷酸探针，其中所述核苷酸序列是SEQ IDNO44。
21.用于定量真菌DNA的寡核苷酸引物对/探针组，其中所述引物对由根据权利要求4的引物对组成，而该探针是SEQ ID NO24。
22.用于定量真菌DNA的寡核苷酸引物对/探针组，其中所述引物对由根据权利要求5的引物对组成，而该探针是SEQ ID NO7。
23.用于定量小麦DNA的寡核苷酸引物对/探针组，其中所述引物对由根据权利要求8的引物对组成，而该探针是SEQ ID NO44。
全文摘要
本发明提供在检测Tapesia yallundae(syn.Pseudocercosporellaherpotrichoides W型)和Tapesia acuformis(syn.Pseudocercosporellaherpotrichoides R型)的TaqMan
文档编号C12Q1/68GK1369017SQ00811440
公开日2002年9月11日 申请日期2000年8月8日 优先权日1999年8月10日
发明者J·J·贝克, C·J·巴内特 申请人:辛根塔参与股份公司