专利名称：来自棉花的纤维特异性肌动蛋白启动子的分离和鉴定的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物分子学领域，尤其涉及转基因植物和用于产生转基因植物的启动子，特别是纤维特异性启动子。
背景技术：
棉花是纺织工业最广泛使用的天然纤维，全世界棉花年产量为1亿包，总值450亿美元。在过去的几十年间虽然已通过经典育种明显改进了纤维的品质和产量，但是通过经典育种进一步改善纤维性质的潜力已被限制，因为需要物种相容性和可利用的性状。基因工程提供了进一步改良棉花的新途径，其是通过导入基因以产生具有高度所需特征的新种质而进行。
棉花纤维(种毛)是经历快速同步延伸的单细胞毛状体。皮层(cortical)微管提供了规范和调控细胞延伸的纤维素微原纤维排列所需的空间信息(Giddings和Staehelin，1991；Cyr和Palevitz，1995；Fisher和Cyr，1995)。纤维发育由4个重叠阶段组成(即起始、初级细胞壁形成、次生细胞壁形成和成熟)(Basra和Malik，1984)。微管蛋白和肌动蛋白可能在发育纤维细胞中起重要功能作用。成熟纤维是纤维素、水、少量蛋白质、果胶、半纤维素、矿物质、蜡、少量有机酸、糖和色素的生物学组合物，其提供优异的穿着性能和审美性能(Arthur，1990；Basra和Malik，1984；Ryser，1985)。纤维分化和发育需要许多基因，这些基因在纤维发育的不同阶段差异表达，目前仅鉴别了参与大量纤维特异性结构蛋白、酶、多糖、蜡或木质素的生物合成的一些基因(John和Crow，1992；John，1996a；Song和Allen，1997；Ma等，1997；Kawai等，1998；Whittaker和Triplett，1999)。这些分离的基因由于其纤维特异性表达可被认为具有改良棉花纤维的潜在应用。例如，John已使用纤维特异性基因启动子产生基因工程棉花以收获改变的纤维(John，1996b，1997a，1997b)。
启动子是确定植物和动物发育过程中基因表达的时空特异性的DNA片段。在过去十年间已从各种植物和动物中鉴别和分离了许多组织特异性基因及其启动子，包括一些棉花组织特异性基因和启动子(Loguerico等，1999；Kawai等，1998；Song和Allen，1997；Ma等，1997；John，1996a；Rinehart等，1996；Hasenfratz等，1995；John和Peterson，1994；John和Crow，1992)。有几种启动子以显示在棉花中以纤维特异性方式控制基因表达(Rinehart等，1996；John，1996a；John和Crow，1992)。一些植物组织特异性启动子可被用于在特异组织中以发育调控模式表达外源蛋白质(John，1996b，1997a，1997b)。
发明概述从棉花中分离了一种编码肌动蛋白的纤维特异性基因(称为CFACT1)。分离的完整CFACT1基因长度为3.040kb，包括一个0.816kb的启动子。将CFACT1启动子片段(0.8kb)与GUS基因融合，构建基因表达载体以分析启动子的功能。用CFACT1启动子/GUS融合基因转基因的棉花和烟草植物，通过Southern印迹杂交方法鉴别。在所有研究的转基因棉花植物中，GUS活性仅在新生纤维中检测到，而在花器官如花药，花瓣和萼片，或叶和根中未检测到。此结果结合Northern印迹分析结果表明，CFACT1启动子在棉花中是纤维特异性的。此启动子在转录水平控制特异性基因在棉花纤维中的表达。分离的启动子可用于改良棉花纤维，通过操纵基因产生具有高纤维品质和产量的新棉花变种。
附图简述
图1示出棉花CFACT1基因cDNA的核苷酸序列(686bp；SEQID NO1)。
图2示出棉花CFACT1基因的核苷酸序列(3040bp；SEQ IDNO2)。
图3示出分离的CFACT1基因的结构图。
图4示出在表达载体中的与GUS基因融合的CFACT1启动子的构建体。
发明详述CFACT1启动子是一种在棉花中有活性的纤维特异性启动子。对取自各种棉花组织的cDNA进行的Northern印迹分析结果示出，一个包含CFACT1基因的cDNA克隆在开花后(DPA)8和14天的新生纤维中强烈表达，也在开花后4，8和14天的幼胚珠中表达，但在其它组织中很少或根本不表达。对此cDNA克隆进行测序表明其长度为686bp(
图1)。发现分离自基因组DNA文库的全长序列长度为3040bp，包括一个0.8kb的启动子片段，其1-818位碱基代表启动子(图2)。将棉花CFACT1的核苷酸序列和推定的多肽序列与数据库中序列相对比，表明此基因在氨基酸水平和核苷酸水平均与来自一些植物，如Malva pusilla(AF112538)，大豆(U60499)，和Brassica napus(AF11812)等的已知肌动蛋白基因呈现高度同源。CFACT1基因与已知棉花肌动蛋白基因(AF059484)在氨基酸水平只呈现71-93％同源性，在核苷酸水平呈现80-82％相同性。另外，其启动子不同于已知棉花和非棉花肌动蛋白基因的启动子，因此它是分离自棉花的一种新肌动蛋白基因。分析CFACT1基因序列表明，在其开放读框中含有4个外显子和3个内含子(图3)。此基因结构在分析的所有完整肌动蛋白基因中是典型的〔Shah等，1983；Baird和Meagher，1987；Nairn等，1988；Stranathan等，1989；McElroy等，1990；Cox等，1995；An等，1996〕。
CFACT1基因的转录物在开花后8天的棉花新生纤维中呈最高累积(通过Northern印迹分析表明的)，然后随着纤维的进一步发育基因产物(mRNA)的累积明显降低。对比不同发育阶段的棉花胚珠中的基因表达，也示出基因转录物在开花后8天比在开花后4天和14天累积多，从开花后8天至28天的纤维发育中，基因产物的累积逐渐及明显降低至不可检测的水平。这提示此基因是在棉花纤维和胚珠发育期间在转录水平被严格调节而特异表达的，与其它棉花纤维特异性基因一样〔Whittaker和Triplett，1999；Shin和Brown，1999，Kawai等，1998；John，1996a；Song和Allen，1997；Ma等，1997；Rinehart等，1996；John和Crow，1992〕。
CFACT1基因的启动子长度为0.8kb，是有活性的纤维特异性启动子。通过农杆菌介导的基因转移，将CFACT1启动子/GUS融合基因构建体用于转化烟草和棉花，使用含有CaMV35s启动子/GUS融合体的pBI121载体作阳性对照。与Northern印迹分析结果相一致，在研究的所有转基因棉花植物中，由CFACT1启动子驱动的GUS基因在新生纤维中特异表达，但在其它组织中不表达，而在阳性对照棉花植物(35SGUS)的所有组织中均检测到GUS活性。获得共230株转化的棉花植物，移植入土壤中生长至成熟。相似地，发现在CFACT1启动子驱动下的所研究的20多株转基因烟草植物中，GUS基因活性只在种子和果肉中检测到，这提示CFACT1启动子活性在烟草中也是组织特异性的(棉花纤维是种皮的延伸毛，发现其与烟草种皮组织学相应)。此结果结合Northern印迹分析表明，CFACT1启动子在转录水平控制基因在棉花纤维中的特异表达。
因此，本发明的一个实施方案是一种棉花纤维特异性启动子，得自棉花纤维肌动蛋白基因CFACT1。
本发明的另一个实施方案是一种棉花纤维特异性启动子，其包含棉花纤维CFACT1基因的0.8kb启动子片段，具有SEQ ID NO2的1-816位核苷酸的序列。
本发明的另一实施方案是一种棉花纤维特异性启动子，其包含CFACT1启动子(SEQ ID NO2的1-816位核苷酸)的一个活性片段。活性片段是序列长度比SEQ ID NO2的1-816位核酸序列短但仍保留在棉花中与纤维特异性启动子同样的活性的序列。片段可包含SEQ ID NO2的1-816位核苷酸序列的切除，缺失，截短或取代，或这些变化的组合。
CFACT1在棉花纤维中强烈表达，表明其在纤维形成和发育中的起直接作用。已经熟知肌动蛋白在许多植物中参与细胞骨架形成和细胞扩展。这是基于这样一种概念，即我们在目前研究工作中探求与细胞骨架形成和细胞扩展相关的基因。在测序后，由于其是一种肌动蛋白基因而将其命名为CFACT1。尽管还没有进行任何通过过表达或低表达证明CFACT1在转基因棉花中的功能的研究工作，但可以推测CFACT1参与棉花纤维发育，因为其具有一个纤维特异性强启动子〔Delmer等，1995〕。
本发明的启动子用于产生纤维特性改变的转基因棉花。使用本发明的纤维特异性强启动子使转基因在棉花纤维中选择性表达，使应用的转基因的类型范围更大。选择性表达避免了如系统表达转基因强加于转基因植物的代谢负担，或转基因在非纤维组织中表达的不利影响。在棉花纤维中表达而在棉花植物的其它部分中不表达的所需基因例如包括(1)染色棉花的花色素苷基因，(2)来自蚕或蜘蛛的丝蛋白基因，提高棉花纤维的强度，(3)棉花纤维中聚羟基丁酸酯的生物合成，以改良导热性能和绝缘性能〔John等，1996〕。在本领域有许多增强纤维的基因可与本发明的启动子便利地连接，并用于通过熟知方法转化棉花〔见例如Umbeck，1992〕，以达到转基因在转基因棉花纤维中表达。见例如John，1996b，1997a，1997b；John等，1996。实施例1分离编码CFACT1序列的纤维特异性cDNA将棉花种子表面用70％乙醇消毒30-60秒，及用10％H2O2消毒30-60分钟，随后用无菌水冲洗。将种子在1/2 MS培养基上在培养室中在28℃光照萌发，并将从无菌幼苗切下的子叶和下胚轴用作转化外植体。将棉花植物在罐中生长以提取DNA和RNA。
用硫氰酸胍方法或SV总RNA分离系统(Promega)，从棉花的新生纤维，胚珠，花药，花瓣，萼片，叶和根中提取总RNA。聚(A)+RNA是通过用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia Biotech)中的寡(dT)纤维素旋转层析柱纯化的。棉花cDNA用cDNA合成试剂盒(Pharmacia Biotech)合成。棉花cDNA文库通过将cDNA片段插入ZAP表达载体(Stratagene)中构建。
将分别来自开花后大约8和14天的新生棉花纤维的聚(A)+RNAs转为cDNA，将其用于构建棉花cDNA文库。从此纤维cDNA文库中，随机挑取大约200个cDNA克隆，及随后进行测序。根据序列数据选择具有参与细胞扩展潜力的一些克隆。
为发现转录物在棉花纤维中特异表达的cDNA克隆，分析所选择的cDNA克隆的表达模式，通过用分离自棉花纤维，胚珠，花药，花瓣，萼片，叶和根的总RNAs，使用来自克隆的探针进行Northern印迹杂交进行分析。将来自不同棉花组织的RNA样品在琼脂糖—甲醛凝胶上分离，并通过毛细印迹移至Hybond-N尼龙膜上。将RNANorthern印迹在ExpressHyb溶液(Clontech)中，在68℃与通过随机标记(Promega Prime-a-Gene标记系统)制备的32P cDNA探针杂交。在杂交后，将印迹在68℃在0.1×SSC，0.5％SDS中冲洗30-60分钟。实验结果示出一个cDNA克隆在开花后8和14天的新生纤维中强烈表达，并也在开花后4，8和14天的幼胚珠中表达，但在其它组织中较低表达或不表达。
将PCR片段和cDNA片段亚克隆入载体中，并将用Qiagen质粒试剂盒制备的质粒DNA在PCR反应中用作模板。通过自动测序仪对PCR产物进行测序。发现一个克隆是编码肌动蛋白多肽一部分的一个686bp CFACT1 cDNA片段(
图1)。Northern印迹杂交证明CFACT1 cDNA转录物在开花后8和14天的新生纤维中大量积累，并也在开花后4，8，14和21天的幼胚珠中或多或较少积累。但这些转录物在来自开花后28天的胚珠的RNA中检测不到，在来自花药，花瓣，萼片，叶片和根的RNA中也检测不到(图4)。此结果提示CFACT1 cDNA表达在棉花中是纤维特异性的。将CFACT1cDNA序列与来自数据库的已知棉花肌动蛋白cDNA(D88414)相对比，所述已知肌动蛋白cDNA长度只有1.079kb且不是一个完整肌动蛋白cDNA，对比结果示出这两个cDNA呈现高水平的同源性(在氨基酸水平呈97％相同性，在核酸水平呈96％相同性)。
将来自棉花不同组织的总RNA用于逆转录第一链cDNA，其在差别展示PCR反应中用作模板。通过使用差别展示试剂盒(Clontech)进行差别展示分析。第一链cDNA是用2pg总RNA作为逆转录的起始物，寡(dT)作引物，在42℃反应1小时合成的。差别展示PCR是开始进行一次94℃ 5分钟，40℃ 5分钟和68℃ 5分钟循环，随后进行94℃ 2分钟和40℃ 5分钟及68℃ 5分钟的两次循环，然后进行94℃ 1分钟，60℃ 1分钟和68℃ 2分钟的25次循环，最后在68℃延伸7分钟。切除目标差别展示条带并再扩增以进一步分析。取可重复的纤维特异性差别展示产物进行进一步分析。收集在每个目标条带中的cDNA，并通过PCR扩增再生。随后将分离的cDNA亚克隆入载体中并测序。
Northern印迹分析示出CFACT1基因的转录物在开花后8天新生棉花纤维中呈现最高积累，然后随着纤维的进一步发育，基因产物(mRNA)的积累明显降低。对比棉花胚珠的不同发育阶段中的基因表达也示出，基因转录物在开花后8天的胚珠中比在开花后4和14天的胚珠中积累的多，随着纤维从开花后8天至28天的发育，基因产物的累积逐渐及明显降低至不可检测水平。这提示基因在棉花纤维和胚珠发育期间是在转录水平被严格调节而特异表达的，如其它棉花纤维特异性基因一样〔Whittaker和Triplett，1999；Shin和Brown，1999；Kawai等，1998；John，1996a；Song和Allen，1997；Ma等，1997；Rinehart等，1996；John和Crow，1992〕。实施例2CFACT1基因的分离和结构分析使用以下方法从棉花植物中提取并纯化总DNA。将液氮加入4g叶组织中，并将叶彻底均质。将20ml冰冻的提取缓冲液(63g/L葡萄糖，0.1M Tris.HCl(pH8.0)，5mM EDTA，20g/L PVP-40，1g/lDIECA，1g/L抗坏血酸，2ml/L β-巯基乙醇)加入在50ml试管中的均质组织中，并在2500rpm离心15分钟。在除去上清后，将10ml裂解缓冲液加入每个试管中。将再悬浮的沉淀在65℃温育30分钟。在每个试管中加入10ml氯仿，与样品混合并在3500rpm离心10分钟。将上清移至清洁的试管中，再进行一次氯仿提取。将上清移至清洁的试管中，在每个试管中加入0.6体积的异丙醇以沉淀DNA。在3500rpm离心30分钟后，将DNA用70％乙醇冲洗。然后将分离的基因组DNA溶解于无菌水或TE(10mM Tris.HCl，1mM EDTA)中使用。
棉花基因组DNA文库是从棉花植物的叶中构建的。将DNA用BamHI部分消化，并将DNA片段克隆入ZAP表达载体(Stratagene)的BamHI位点中。
基因组步行(Walker)文库是使用通用基因组步行试剂盒(Clontech)构建的。将来自棉花植物叶的基因组DNA分别用5种限制酶消化，然后通过酚/氯仿纯化，及通过乙醇沉淀。将消化的DNA与基因组步行衔接子连接。接连进行两次基因组步行PCR反应。在初始PCR中将1μl每个基因组步行DNA文库用作模板，在二级PCR中将初始PCR产物用作模板。PCR在95℃ 1分钟起始，随后进行35次95℃ 15秒，和68℃ 4分钟循环，最后在68℃扩展6分钟。切下目标PCR条带并通过Geneclean试剂盒纯化(Bio 101)。
覆盖全长CFACT1基因的两个重叠片段通过基因组步行方法分离，并对其进行完全测序。完整的CFACT1基因长度为3040bp，包括一个0.8kb的启动子(图2)。将棉花CFACT1基因的核苷酸序列和推定的多肽序列与数据库所示序列相对比，发现此基因在氨基酸水平和核苷酸水平均与已知肌动蛋白基因呈高度同源，所述已知肌动蛋白基因例如来自Malva pusilla(AF112538)，大豆(U60499)，Brassica napus(AF11812)等植物。CFACT1基因与已知棉花肌动蛋白基因(AF059484)在氨基酸水平只呈71％-93％同源性，在核苷酸水平呈80-82％相同性。另外，其启动子不同于已知棉花和非棉花肌动蛋白基因的启动子，因此它是分离自棉花的一种新的肌动蛋白基因。对CFACT1基因的序列进行分析表明在其开放读框中含有4个外显子和3个内含子(图3)。此基因结构在迄今为止所有分析的完整肌动蛋白基因中是典型的〔Shan等，1983；Baird和Meagher，1987；Nairn等，1988；Stranathan等，1989；McElroy等，1990；Cox等，1995；An等，1996〕。实施例3CFACT1启动子的功能分析为对CFACT1启动子的功能进行定性，将0.8kb CFACT1启动子在pBI101中与GUS基因连接，以构建基因表达载体(图4)。将棉花和烟草用含有CFACT1启动子/GUS融合基因的根瘤农杆菌转化，使用含有CaMV35S启动子/GUS融合体的pBI121载体作为阳性对照。CaMV35S启动子在棉花和其它植物的所有组织中均是活性的，并且是一种组成型启动子〔Odelldeng，1985；Ow等，1987；McCabe和Martinell，1993〕。将一个含有CFACT1启动子/GUS融合基因或CaMV35S启动子/GUS融合体对照物的二元载体，转移至根瘤农杆菌菌株LBA4404中。进行转化的棉花外植体得自实施例1中生长的棉花幼苗。烟草外植体得自烟草幼苗。将烟草种子表面用70％乙醇灭菌30-60秒，并用0.1％HgCl2灭菌15分钟，随后用无菌水冲洗。将种子在培养室中在28℃在1/2MS培养基上光照萌发，并从无菌幼苗上切下叶用作转化外植体。将棉花子叶和下胚轴外植体和烟草叶外植体通过携带载体的农杆菌转化，并将转化的植物移植入温室土壤中生长至成熟。
将烟草叶切成大约2×2cm的薄片，并浸渍在农杆菌悬浮液中5分钟。将感染的烟草外植体在MS培养基上用1mg/L 6-BA在28℃培养48小时，然后移至含有100mg/L卡那霉素和1mg/L 6-BA的MS选择培养基上20-30天，以选择转化的茎(卡那霉素抗性茎)。将转化的茎从愈伤组织中切下并在具有50-100mg/L卡那霉素的MS培养基上生根。将转化的烟草外植体移植至温室土壤中，生长至成熟。
将子叶和下胚轴用作外植体以转化棉花。将棉花种子表面用70％乙醇灭菌30秒，及用10％H2O2灭菌60分钟，随后用无菌水冲洗。将这些种子在28℃在无菌水中温育。将种子萌发过夜。取出胚并置于IM培养基上(1/2(MS(常量营养物，微量营养物，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L)+phytogel 2g/L pH＝6.4)，在28℃培养7天。将棉花的子叶和下胚轴用作转化外植体。在切成5mm2(mm)的块后，将外植体在根瘤农杆菌菌株LBA4404悬浮液(OD600＝0.2-0.4)中浸渍15分钟。然后将外植体在24℃置于CM培养基上(MS(常量营养物，微量营养物，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+葡萄糖30g/L+MgCl20.7mg/L+phytogel 2g/L pH＝6.4)中培养2天。在用液体MS培养基冲洗后，将外植体置于SM培养基上(MS(常量营养物，微量营养物，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+葡萄糖30g/L+MgCl20.7mg/L+phytogel 2g/L+卡那霉素50mg/L+Cefutoxime 200mg/L，pH＝6.4)，在28℃在培养室中光照培养以进行选择，每月进行传代培养。在SM上传代培养2-3个月后，在外植体中诱导愈伤组织。将愈伤组织移至DM培养基上(MS(常量营养物，微量营养物，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L+KNO319g/L+MgCl20.7mg/L+葡萄糖30g/L+phytogel 3g/L，pH＝6.4)，并每月进行传代培养。在大约5个月后，开始形成体细胞胚。将幼胚在DM培养基上持续培养直至它们发育成熟。将成熟胚移至在盒子中的GM培养基上(1/2(MS(常量营养物，微量营养物，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L)+NAA 0.01mg/L+葡萄糖30g/L+phytogel 3.5g/L，pH＝6.4)，发育成小植物。然后将此小植物移植至土壤中，生长植物并收集转基因种子。
将具有嵌合的CFACT1启动子/GUS基因(或35SGUS基因)的转基因烟草和棉花植物，和作为阴性对照的未转化的植物，通过DNA Southern印迹杂交和通过GUS组织学测定进行分析。将来自棉花和烟草叶的总基因组DNA用限制酶消化，在琼脂糖凝胶上分离，并通过毛细印迹移至Hybond-N尼龙膜上。将DNA Southern印迹在ExpressHyb溶液(Clontech)中，在68℃与通过随机标记(Promega Prime-a-Gene标记系统)制备的32P-DNA探针杂交。在杂交后，将印迹在68℃在0.1×SSC，0.5％SDS中冲洗30-60分钟。将32P标记的尼龙膜在-70℃曝光到X光胶片上以放射自显影。Southern印迹分析表明CFACT1启动子/GUS融合体基因整合入棉花和烟草基因组中。
对先前Jefferson等(1987)所述方法加以修改，在转基因的烟草和棉花植物中对GUS活性进行组织化学分析。将植物的新鲜组织在X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸)溶液中温育过夜，所述X-gluc溶液由0.1M磷酸钠(pH7.0)，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.5mM亚铁氰化钾，和0.1％X-gluc(Clontech Chemical)组成。然后通过相继用100％和70％乙醇漂洗洗清并固定染色的植物，并直接或在显微镜下检测样品并照像。获得属于21个转化品系的共230个转化的棉花植物，并移植至土壤中生长至成熟。在研究的所有转基因棉花植物中，只在新生纤维中检测到GUS活性，但在花器官如花药，花瓣和萼片中，或在叶和根中未检测到。对比之下，当在X-gluc溶液中在与转基因植物组织相同条件下染色时，用阳性对照pBI121(35SGUS)转化的植物在所有组织中均呈现强GUS活性，未转化的植物示出在纤维以及其它组织中无GUS活性。在研究的20多个转基因烟草植物中，通过CFACT1启动子驱动的GUS基因只在种子和果肉中表达，提示CFACT1启动子在烟草中也是组织特异性的。这些结果表明CFACT1启动子在转录水平指导基因在棉花纤维中特异表达。
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序列表<110>李学宝蔡林程宁辉刘建伟<120>来自棉花的纤维特异性肌动蛋白启动子的分离和鉴定<130>2577-139<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>685<212>DNA<213>Arabidopsis sp.<400>1ctggagctcg cgcgcctgca ggtcgacact agtggatcca aagtaattcg gcacgagggg 60tttctcacac cgtgccaatc tatgaaggat atgcccttcc acatgccatc ctccgtcttg 120accttgcagg tcgtgatcta accgatgcct tgatgaaaat tcttaccgag agaggttaca 180tgttcaccac cactgctgaa cgggaaattg tccgtgacat gaaggagaag cttgcttatg 240ttgccctgga ctatgagcag gaactggaga ctgcgaagag cagctcatct gttgagaaaa 300actatgagtt gcctgacgga caagtcatta ctattggagc tgagagattc cgttgcccgg 360aagtcctctt ccagccatct ttcatcggga tggaagctgc tggaatccat gaaactacct 420acaactctat catgaagtgt gatgtggata tcaggaagga tctctacggt aacattgtgc 480tcagtggggg ttcaaccatg ttccctggta ttgcagaccg catgagcaag gagatcactg 540cacttgctcc aagcagcatg aagattaaag tcgttgcccc accagaaaaa aaaatacagt 600gtctggattg gaaggatcta tcttggcatc actccacacc ttccaacaaa tgtggatttc 660ccagggtgaa tttgatgaat ccggc 685<210>2<211>3041<212>DNA<213>Arabidopsis sp.<400>2actatagggc acgcgtggtc gacggcccgg gctggtcctc taaagaacaa ttgtgtcaag 60tcgttcttgc cgagcaaatc cgaataggag cttagagtaa catctaacag acggactgct 120ccagcattaa ctgtttggtg aaaatgttaa tggtagtgct atgtcgaagt attttcatgg 180aaggtgttaa gaattaatgt tattgggatt actaatttct agtattaatt gtggtttgga 240agttaatata taattattca atccttgttt tttatttttt ttttataaca caattacaaa 300taatttattt aactttggtt gttttcaatt tatgacggtt aatattttag tttaataatt 360gagcattatt atatattaaa taaataaatc attgtaatat atgtaaaaat aatttaaaat 420ataaatttat taatatatat aataaactca atcaaacaat aaaaagataa taaattctta 480aatatataaa ttttttaaaa tagcttttca gtaaatctgt caaacaatag aaaatatttt 540ttgcaggttc atccaaacac cagaaaagta aatcattttc agaaaagtaa atcatttttc 600agaaattatt tttcggaaat tattttactg gcaaacaaat ggagtctaag tgtttctgtt 660tttatttttt atttttctat ttagagaaac tagaaattga tttgtcaaat gtctttaatc 720tagcttgttt agattagttg aagggcacag aacccgcgtt gtcaagtgat tttgctgtac 780tcactaccta gattcttatt ttcagtattg taaaagatgg ccgacggtga ggctattcaa 840cccctcgtct gtgataatgg aactggaatg gtgaaggtta gttatttttt agaccaaagc 900aaacctgaca cctagctttt agacttggac aaggataaaa tctgtttaag tgggcttagc 960tcaggcttct acattcaaag cctgaatgca gctcagctca tttacattat ataatttata 1020gatataatag atacatatat aatactataa tttaaacatt aattttctaa atcaatggta 1080aggcatattg cactcaagag aggagacata gatttagacc ttggaaacga cattgttggg 1140aaaggtatct ataatccatg aacaaggacc ataaacatgg acatgaagaa tacccaaaaa 1200aaatatattt taagaaatag aaaatactat tggtagattt gggtaaaata tgagatcata 1260ttatggacta agccgagctt gggcacataa gaattatgat gatatcatac acaaacctgg 1320ccggtctatg aacacttcta gacctgagtc ataatctcgg ttattgttta tttctttatg 1380aaaagtaact tatggttaag ctaattttgt ctgtaatgta ggccggtttt gctggtgatg 1440atgctccaag ggcagttttt cccagtatcg ttggtcgtcc ccggcacact ggtgttatgg 1500ttgggatggg tcagaaggat gcctatgtag gagatgaagc acaatctaaa ggaggtatcc 1560ttactttgaa atatcctatt gagcatggta ttgtgagcaa ttgggatgat atggaaaaga 1620tctggcatca tacattctac aacgaactcc gtgttgttcc tgaggagctc cctgtgctac 1680tcacggaagc acctctcaac cccaaggcca atagagaaaa gaagactcag atcatgtttg 1740agaccttcaa tgtacctgct atgtatgttg ccatccaggc cgttctctct ctgtatgcca 1800gtggtcgtac aacaggtttg ttagacttga aacttctatg agcttttctc attttaatga 1860tattttcgaa tcatgttgac actggattat ccctctattg gaacaggtat tgtgctggat 1920tccggtgatg gtgtttctca catcgtgcca atctatgaag gatatgccct tccacatgcc 1980atcctccgtc ttgaccttgc aggtcgtgat ctaaccgatg ccttgatgaa gattcttacc 2040gagagaggtt acatgttcac caccactgct gaacgggaaa ttgtccgtca catgaaagag 2100aagcttgctt atgttgccct ggactatgag caggagctgg agactgccaa gagcagctca 2160tctgttgaga agaactatga gttgcctgac ggacaagtta ttactattga agctgagaga 2220ttccgttgcc cggaagtcct cttccagcca tctttcatcg ggatggaagc tgctggaatc 2280catgaaacta cctacaactc tatcatgaag tgtgatgtgg atatcaggaa ggatctctac 2340ggtaacattg tgctcagtgg gggttcaacc catgttcccc ggtattgcag accgcatgag 2400caaggagatc actgcacttg ctccaagcag catgaagatt aaggtcgttg cgccaccaga 2460gagaaagtac agtgtctgga ttggaggatc tatcttggca tcactcagca ccttccagca 2520ggtaaatata tatttttata tttggctcta cttcttttgt ttgatggttg tccgacactg 2580acgttcttgc tttacagatg tggatttcca agggtgagta tgatgaatcc ggtccatcca 2640ttgtccacag gaagtgcttc taagttttgt aattgctttt gatggtgatc tacattttgc 2700atttagttgg ctcttttttg gcgtgccgtg tcaagtgaac tcaaaagtct ggtttatgtg 2760cgggaagtta gggatcattg taggatggtg tacctgatat tgacgtatta ttattttagc 2820ctttcaccgt atcaccacca ttaagctgat gggccctaag gagatggcgg tggacggaca 2880attggtgctt aattccttcc ctacaatcca tctttgaacc atgctgctta aaaggatgtt 2940tggagcggga gactggattg tggtgctttt atttttttat ttatttaata ttcaagggtt 3000ttgagaacat taatgttaat agctattatt gtacgagatt t 304权利要求
1.一种棉花纤维特异性启动子，包括棉花肌动蛋白基因CFACT1的启动子。
2.一种棉花纤维特异性启动子，包括具有SEQ ID NO2的1-816位核苷酸序列的棉花肌动蛋白基因CFACT1启动子的一个0.8kb片段。
3.一种棉花纤维特异性启动子，包括具有SEQ ID NO2的1一816位核苷酸序列的棉花肌动蛋白基因CFACT1启动子的一个活性片段。
全文摘要
本发明涉及棉花肌动蛋白基因CFACT1,及其纤维特异性启动子。这些启动子显示强烈的纤维特异性活性。
文档编号C12N15/82GK1377417SQ00813722
公开日2002年10月30日 申请日期2000年8月1日 优先权日2000年8月1日
发明者李学宝, 蔡林, 程宁辉, 刘建伟 申请人:分子农业生物学院