专利名称：自切割rna序列及其在控制蛋白质合成中的应用的制作方法
背景技术：
本发明涉及通过向基因非翻译区(UTR)中插入一种使转录的RNA能条件性自切割的序列，控制(激活或抑制)由mRNA序列合成蛋白质。
体内蛋白质的合成在几个水平上控制。第一个水平是基因转录，产生前mRNA(pre-mRNA)。转录起始的速率以及转录物延伸受基础转录机制的严格生理控制。另一个水平是前mRNA剪接为成熟mRNA。另外的剪接事件能以组织特异的方式或在激素控制下发生，因而活性蛋白质在有限的组织或生理环境中合成。其它的控制水平是mRNA转换和mRNA翻译为蛋白质的能力。因此，蛋白质合成的药物控制在理论上能定位在上述每一个水平上。
一种药物能通过改变RNA合成速率控制基因组内靶基因的表达。这能用能以高亲和力和序列特异性结合DNA，因而与靶基因转录所必需的转录因子竞争的药物来实现。这些药物可以是形成三股螺旋的寡核苷酸(C.Helene等人，Ciba Found Symp.(1997)20994-106)、肽核酸(Pooga，M.等人，Nat Biotechnol.(1998)16(9)857-61)或吡咯-咪唑聚酰胺(Dickinson，L.A.等人，Proc Natl Acad Sci USA.(1998)，95(22)12890-5)。这也能用可与基因启动区特异结合并且在结合诱导分子后激活的异源转录因子实现(Allgood，V.E.等人，AnnualReports in Medicinal Chemistry(1997)32231-239)。可激活异源转录因子的药物有抗生素、雌激素类似物或免疫抑制剂。
提高mRNA的转换能实现蛋白质产量的降低。反义寡核苷酸与靶RNA退火，能诱导RNAaseH的对它的切割，或防止它的翻译，或通过干扰RNA的二级结构诱导更快速的降解(Kumar，M.等人，Microbiol Mol Biol Rev.(1998)62(4)1415-34)。相反，核酶与靶RNA退火，并切割它(Forster，A.C.和Altman，S.，Science(1990)249783-6)。核酶一般是具有通常与核酸序列的切割、剪接或连接有关的酶样催化活性的RNA分子。催化活性核酶的典型底物是RNA分子，尽管核酶也能催化DNA分子作为底物的反应。自然存在的胞内活性核酶顺式作用，只催化单转换反应，通常在反应过程中自我修饰(Cech，T.R.，BiosciRep.1990；10(3)239-61)。然而，也能改造核酶，使之以真正的催化方式反式作用，转换超过1次，并且没有自我修饰。在核酶中能鉴别两个不同的区通过与特异核酸序列杂交给予核酶特异性的结合区，和给予核酶切割、连接或剪接活性的催化区。
由基因组内特异靶基因产生蛋白质的药物控制能通过控制mRNA翻译为蛋白质来解决。利用特异配体结合RNA(aptamer)及其同源配体的相互作用控制基因表达已经发表(Werstuck，G.和Green，M.R.，Science(1998)282，296-298)。mRNA的翻译可被在mRNA 5’帽子结构附近结合的药物抑制。在这种情况下，药物的胞内存在抑制蛋白质产生。
基因表达和蛋白质产生的控制在基因治疗和DNA疫苗领域是有利的。旨在防止不利副作用的发生，和调整有效治疗窗口内的表达水平。但是，在基因治疗中使用上述系统控制基因表达面临主要的障碍。DNA结合药物，以及反义和核酶寡核苷酸有极低的生物可用性，易于被组织或体液内的核酸酶和蛋白酶降解。外源转录因子可引起细胞毒性免疫应答，这将破坏表达转基因的细胞，从而破坏治疗或接种(S.K.Tripathy等人，Nature Medicine(1996)2，545-550)。而且，可激活外源转录因子的药物有抗生素、雌激素类似物或免疫抑制剂。它们本身不是用于基因治疗的治疗剂，可能具有不希望的副作用。因此，为了所用的治疗选择一种至少是无害的诱导药物是有利的。另一个缺点是为了适应控制序列和编码转录因子的基因，载体中需要大克隆间隙。因此i)避免使用外源蛋白质控制基因表达，和ii)根据治疗目的选择诱导药物是非常有利的。
基因表达和蛋白质产生的控制在功能基因组学、转基因植物和转基因动物领域是有利的。基因向细胞培养物或整个植物或动物中的条件表达，和有和无基因表达的表型的比较使人们能破译该基因的功能。基于外源转录因子的基因开关的缺点有两层i)靶基因的表达和mRNA的翻译不再受内源生理刺激物的控制，和ii)诱导药物对细胞生理学的作用。因此，i)将转基因置于内源转录启动子控制下，以及在mRNA上保留相同的翻译控制序列，和ii)选择一种不改变细胞生理学的诱导药物是非常有利的。
下文描述的本发明的特点在于上述有利特征。
基因的非翻译区(UTR)将被转录为RNA但不翻译为蛋白质的基因的DNA序列。UTR可位于编码区5’末端之前(5’-UTR)、编码区3’-末端之后(3’-UTR)，或者可以是插入编码区内的内含子。
前mRNA的非翻译区不被翻译为蛋白质的前mRNA的序列。UTR可位于编码区5’末端之前(5’-UTR)、编码区3’-末端之后(3’-UTR)，或者可以是插入编码区内的内含子。
配体配体可以是一种核酸分子、蛋白质、多糖或糖，或有机或无机分子，它可与自切割RNA序列相互作用并抑制或刺激自切割。
该方法在用一种基因转染培养的细胞或活动物，并且需要控制该基因表达的情况中有用。细胞中合成的蛋白质的量与其mRNA的量成正比，并且依赖于mRNA向蛋白质的有效翻译。mRNA的两个特点对于有效翻译为蛋白质(Gallie，R.，Gene & Dev.(1991)52108-2116)及其稳定性(Beelman，C.A.和Parker，R.，Cell(1995)81179-183)是必需的5’帽子结构和3’-polyA尾。图2A显示，从mRNA上除去3’-polyA或5’-帽子能控制萤光素酶基因的表达。在报道基因的5’-UTR或3’-UTR中插入本发明的活性核酸序列需要切割转录RNA，因而需要分别去除5’-帽子和3’-polyA。任一位置的活性核酸序列降低萤光素酶蛋白质的产生，而相同位置的无活性核酸序列不影响基因表达。
本发明能用来控制体外、来自体内的或体内的基本上所有类型的细胞中基本上所有类型的蛋白质的产生。
更具体而言，本发明的第一个目的在于编码一种蛋白质、多肽或肽的修饰基因，其中该修饰基因含有(在其非翻译区(UTR)中插入)一种核酸序列，该序列使由该基因转录的RNA分子可配体依赖性自切割。
如上所述，修饰基因可以是基因组DNA、cDNA或合成DNA。修饰基因含有至少一个UTR，它能自然存在于该基因中或人工插入其中。例如，当基因是一种gDNA分子时，该基因含有自然存在的UTR，如5’-UTR、内含子和3’-UTR。当基因是一种cDNA或合成(或半合成)分子时，可以加入UTR区，如内含子。此外，甚至在基因中存在自然UTR时，除了自然UTR之外，也能插入其它UTR，或用它们代替自然UTR。修饰基因可进一步含有一个转录启动子，以指导编码区转录为前mRNA。另外，该基因还可包含于载体中，如质粒、病毒、粘粒、噬菌体、人工染色体等。修饰基因可编码任何类型的蛋白质、多肽或肽，包括人、其它哺乳动物、植物、病毒或细菌来源的蛋白质、多肽或肽，或其衍生物。编码的生物产物可显示治疗或预防活性，例如，也可代表一种标记分子。
如上所述，本发明的修饰基因包含至少一种插入该基因UTR中的特殊核酸序列。UTR可以是5’-UTR、3’-UTR或内含子。尽管在本发明的基因中插入单拷贝核酸序列足以引起对蛋白质产生的控制，但在特殊实施方案中，修饰基因可含有插入不同UTR中或UTR的不同位置中的几个拷贝的这种核酸序列，或插入不同UTR或UTR的不同位置中的不同核酸序列。
在一个实施方案中，插入前mRNA的UTR中的RNA序列的自切割可被配体抑制。因此，在没有配体时前mRNA或mRNA被切割，蛋白质产量降低；在配体存在下前mRNA或mRNA不被切割，蛋白质的产生恢复。
因此，本发明的一种特别的修饰基因包含一种核酸序列，它使由该基因转录的RNA能配体抑制性自切割。
在另一个实施方案中，插入前mRNA的UTR中的RNA序列的自切割可被配体激活。因此，在配体存在下前mRNA或mRNA被切割，蛋白质产生抑制；在没有配体时前mRNA或mRNA不被切割，蛋白质的产生恢复。
因此，本发明的另一种特别的修饰基因包含一种核酸序列，它使由该基因转录的RNA能配体激活性自切割。
本发明也涉及一种修饰基因的方法，包括在该基因的至少一个非翻译区内插入一种核酸序列，该序列使由该基因转录的RNA能配体依赖性自切割。
核酸能插入UTR序列内的不同位点。当涉及5’-UTR或3’-UTR时，能在基本不影响DNA转录为前mRNA的不同位点进行插入。通过分析UTR的序列，使用可获得的或人工产生的限制位点，可确定这些位点。也可通过重组、诱变等实现插入。当涉及内含子时，插入能在不影响转录的任何区域进行。由于UTR内核酸序列的自切割可能依依赖于周围的核苷酸序列，优选地使用可预测最稳定构象的计算机程序，如RNAfold(Zuker，M.，Methods Mol Biol(1994)25267-94)，评估当核酸序列插入UTR内的特定位置时是否以生产性的构象折叠。实际上，周围序列可为核酸序列提供另外的折叠途径，产生失活的或不依赖配体的构象(Stage-Zimmermann，T.K.RNA(1998)4875-889)。核酸序列在UTR内的不同插入位点能根据以上方法学选择。
在本发明中用来引起生产控制的特殊核酸序列可以是编码配体依赖性自切割RNA的任何核酸序列。该核酸序列的大小因其性质和/或来源而不同。核酸序列一般含有10-500个碱基对，优选地少于300个碱基对。这些核酸序列一般包含20-200bp。
核酸可以是不同来源的。特别是，核酸可来自天然存在的自切割RNA序列。在这点上，人们能选择其RNA转录物具有自切割活性的DNA序列，该活性公知可被多种配体影响，如锤头状核酶、丁型肝炎病毒核酶、链孢霉VS核酶、发夹核酶、I组内含子、II组内含子和Rnase P(Clouet-d’Orval，B.等人，Biochemistry(1995)3411186-90；Olive，J.E.等人，EMBO J.(1995)143247-51；Rogers，J.等人，J.Mol.Biol.(1996)259916-25)。这些序列可以人工制备并根据本发明使用。特别是，编码这些RNA的DNA(或其功能衍生物)可通过常规技术制备，并用来按照本发明修饰基因。
此外，也可选择其RNA转录物具有自切割活性的任何DNA序列，并可从化合物文库中鉴定自切割抑制剂。
然而，在一个优选实施方案中，首先选择一种有利的配体，并在体外产生其RNA转录物具有配体依赖性自切割特征的DNA序列。在这点上，本发明也描述了一种特殊方法，能用来产生人工、非天然存在的配体依赖性自切割RNA，和编码它们的DNA。所述人工、非自然存在的配体依赖性自切割RNA被称为aptazyme，代表本发明的另一个目的。
因此，在本发明的一个特别实施方案中，核酸序列是一种编码aptazyme的人工DNA。所述aptazyme能通过体外进化和所述方法获得，如下所述。
Aptazyme的产生在本发明公开的方法中，可首先选择配体，然后产生相应的激活或抑制的aptazyme。
配体的选择配体可以是一种核酸分子、蛋白质、多糖或糖或有机或无机分子。配体的性质能选择为外源的，如至少容易进入转基因转染的细胞的某些无毒分子或药物。此外，也能设计一种完全内源的系统，其中控制配体是靶细胞内存在的一种分子(例如，某些小代谢物或大分子)。在这点上，配体可以是靶细胞群体内存在而在其它群体中基本不存在(或以较低浓度存在)的分子，从而提供表达的组织选择性。更具体而言，配体可以是靶细胞群体内存在的一种分子，它与将要纠正的病理学或条件直接或间接相关，并且在未受该病理学影响的细胞或组织中基本不存在。配体依赖性自切割核酸的活性取决于它与代谢物或大分子的结合。如果配体依赖性自切割核酸被代谢物或大分子(例如病原蛋白质)灭活(即，在其存在下不被切割)，该基因的表达基本上限于表达足量代谢物或大分子的细胞，即疾病细胞群体(这些配体的例子包括突变p53分子、激活的癌基因等)。配体的其他例子包括抗生素(例如，强力霉素、培氟沙星等)、用于人体的分子(如药物、佐剂、替代物等)和对人体无害的任何分子。该方法需要在aptazyme与配体之间的分子识别中有极高的特异性。这种特异性原则上能用核酸aptamer实现(Famulok，M.，Curr.Opin.Struct.Biol.(1999)；9324-329)。
Aptazyme的选择能通过体外进化和选择方法制备并分离经历配体依赖性自切割的aptazyme。该方法与SELEX技术(美国专利5270163，在此引用作为参考)有关，SELEX是一种针对特定特征可同时筛查不同RNA或DNA(单链或双链DNA)分子的十分不同的组合文库的技术。这些特征可以是i)核酸的催化活性，ii)核酸以高亲和性和选择性特异复合希望的靶分子的能力。
本方法不同于以前描述的选择变构核酶的方法(WO94/13791；WO98/08974)。更具体而言，本发明的一种生产方法(如图3A和图3B所示)包括1.制备不同双链脱氧核糖核酸(DNA)分子的库，该库的分子的至少部分序列是随机或部分随机的序列，使得该部分在该库的不同分子中有不同序列。例如，通常可用核酸合成仪制备随机序列。
2.在不会发生自切割的条件下在用于选择配体抑制性自切割核酸序列的配体存在下，或在不存在用于选择配体激活性自切割核酸序列的配体时，将DNA分子库转录为核糖核酸(RNA)分子库，3.在不会发生自切割的条件下(存在或不存在配体时)，将该RNA库的所有成员固定于固体支持物上，4.在不会发生自切割的条件下(存在或不存在配体时)，在该配体存在或不存在下，温育该RNA库，5.分离与固体支持物结合的RNA分子，和自切割产生的液相中存在的RNA分子。变性并洗涤与固体支持物结合的RNA分子，6.重复步骤3-5多次循环，例如约1-50次循环，以除去由于多种非生产性构象状态在非许可条件下能自切割(虽然效率较低)的RNA序列，7.向该库中添加或除去所述配体，并在允许自切割的条件下温育，和8.分离特征为自切割(液相中存在)和特征不是自切割(与固体支持物结合)的该库的RNA分子，以获得特征为配体依赖性自切割的第一次选择的RNA分子库。
在一个优选实施方案中，本发明的方法进一步包括9.将所述第一次选择的RNA分子库反转录为单链互补DNA(cDNA)分子库，并扩增(例如通过PCR)该单链cDNA库为双链DNA库，和10.重复步骤2-9多次循环，例如约10-100次循环，获得aptazyme。
也能用该方法选择aptamer，即配体结合的RNA序列。
在一个实施方案中，库中的分子包含除两个短铡翼序列外完全随机的序列，这两个序列包含RNA聚合酶启动子和扩增引物附着位点。
在本发明的另一个实施方案中，根据已知的核酶序列构建库中的分子。例如，该分子可以由与随机或半随机序列附着的恒定、核酶衍生的序列组成。
没有固定数量的随机核苷酸。但是，随机序列一般含有10-300个核苷酸，优选地20-200个，更优选地20-180个核苷酸。尽管此处称为“随机”序列，但应当理解，该序列只在最初用于选择方法中时是随机的，选择方法的产物不是随机的，而是一组显示配体依赖性自切割活性的特异序列。
起始库可包含不同数量的DNA分子。特别是，起始库可包含高达1020个分子或更多。典型的库含有104-1016个分子。
应当理解，上述生产方法可用于不同DNA库，例如包括基因组、cDNA或RNA文库。
在选择步骤中，使用模拟细胞环境的条件是希望的，其中最终要使用aptazyme。例如，当aptazyme旨在控制哺乳动物细胞中的蛋白质产生时，将相应设置选择培养基的离子成分，并将温度设置为37℃。
逐渐提高每一轮选择和扩增的选择阈值是有用的。例如，当体外进化步骤继续时，可使用较低浓度的配体，导致筛选出与希望的配体具有逐渐提高的亲和性的物种。步骤3-5中的温育次数和时间(非许可条件)可逐渐延长，从而提高配体对自切割核酸序列的控制。在允许自切割的条件下，步骤7中的温育时间可逐渐缩短，从而筛选出具有较快切割率的物种。
另外，可通过在诱变条件下进行扩增(例如PCR)，在步骤9获得的选择DNA库中加入突变。该诱变步骤扩大了将要选择的库的序列多样性。
配体控制的基因表达盒的选择aptazyme的体外选择通常产生一组几个序列，它们显示希望的配体依赖性自切割性质。因此克隆选择的aptazyme并确定它们的真实序列是可能的。实现方法包括，将编码aptazyme的双链DNA库与适当线性化的质粒载体连接，用产生的环形质粒载体转化细菌(Sambrook等人(1989)，《分子克隆实验室手册》第二版，N.Ford编，Cold SpringHarborCold Spring Harbor Laboratory Press)。含有aptazyme的克隆质粒能用Applied Biosystems试剂盒按照使用说明书通过Sanger等人的方法(Proe.Natl.Acad.Sci.USA，74(1977)5463-5467)测序。通常测序10-100个克隆，其中能鉴定显示希望的性质的不同家族的亚组。
因此选择能使报道基因在靶细胞中配体依赖性表达的aptazyme是希望的。报道基因表达盒和携带它们的载体能通过标准分子生物学技术构建(Sambrook等人(1989)，《分子克隆实验室手册》第二版，N.Ford编，Cold Spring HarborCold Spring Harbor LaboratoryPress)。靶细胞用两种报道基因转染报道基因(1)在至少一种UTR中含有体外选择的aptazyme序列，报道基因(2)不含任何aptazyme。两组细胞在配体存在或不存在情况下培养。在配体存在和不存在时估计报道基因(1)表达与报道基因(2)表达的比值。选择当蛋白质产生将被抑制时具有最低比值、当蛋白质产生将被诱导时具有最高比值的aptazyme克隆。
能用本发明控制不同细胞型中体外、体内或来自体内的蛋白质产生。
在这点上，本发明也在于一种控制由基因产生蛋白质、多肽或肽的方法，包括在基因的至少一个非翻译区中插入一种核酸序列，该序列使由该基因转录的RNA能配体依赖性自切割。
在一个特别实施方案中，本发明提供一种以配体依赖性方式从其表达将被控制的基因的前mRNA或mRNA中除去5’-帽子结构和/或3’-polyA尾的方法。这可通过在该基因的至少一个UTR中插入一种序列来实现，这需要转录的RNA可配体依赖性自切割。
本发明也涉及一种从基因转录的前mRNA或mRNA中除去5’-帽子结构和/或3’-polyA尾的方法，包括在该基因的至少一个非翻译区中插入一种核酸序列，该序列使该基因转录的RNA能配体依赖性自切割。
在一个特别实施方案中，该方法用于从基因转录的前mRNA或mRNA中除去5’-帽子结构，并在该基因的至少一个5’-非翻译区内插入核酸序列。
在另一个特别实施方案中，该方法用于从基因转录的前mRNA或mRNA中除去3’-polyA结构，并在该基因的至少一个3’-非翻译区内插入核酸序列。
本发明也涉及一种控制细胞内蛋白质、多肽或肽产生的方法，包括(i)向细胞中导入一种编码蛋白质、多肽或肽的修饰基因，其中该修饰基因含有(在其非翻译区(UTR)中插入)一种核酸序列，该序列使该基因转录的RNA分子能配体依赖性自切割，和(ii)在配体存在或不存在下接触细胞。
在一个特别实施方案中，该修饰基因含有(在其非翻译区(UTR)中插入)一种核酸序列，该序列使该基因转录的RNA分子能配体激活的自切割，细胞与配体接触可抑制其产生，而除去(或终止接触或无)配体可恢复(或提高)其产生。
在另一个特别实施方案中，该修饰基因含有(在其非翻译区(UTR)中插入)一种核酸序列，该序列使该基因转录的RNA分子能配体抑制性自切割，细胞与配体接触可提高其产生，而除去(或终止接触或无)配体可抑制其产生。
在上述方法中，配体能对于细胞是外源的，或是细胞的一种内源成分，如上所述。在这点上，配体可以是一种在研究蛋白质、多肽或肽产生的细胞中优势存在的分子(在其它细胞或组织中基本上不存在或以较低浓度表达)。
上述方法可用于在体外或来自体内的细胞(或细胞群体或培养物)中产生蛋白质、多肽或肽。
上述方法也可用于在体内细胞、组织或器官中产生蛋白质、多肽或肽。
上述细胞可选自例如原核细胞、真核细胞、哺乳动物细胞和植物细胞。可以是组织、器官、分离的细胞培养物、建立的细胞系或初级培养物。优选的细胞是哺乳动物细胞，特别是鼠或人细胞，更优选地是来自体内或体内的。为了体内使用，能通过对生物施用将基因导入细胞中，配体能是外源的或包含于细胞内。此外，基因也可包含于选自质粒、病毒、粘粒、人工染色体等或其组合的载体中。优选的载体包括质粒和病毒，如腺病毒、反转录病毒、AAV、HSV、HIV等。
本发明也公开并要求保护如上所述的配体与修饰基因的组合(或含有它们的载体)，用于同时、分开或顺序使用。
优选的组合包括-一种配体和一种修饰基因，其中该配体抑制所述序列转录的RNA的自切割；-一种配体和一种修饰基因，其中该配体激活所述序列转录的RNA的自切割。
优选地，配体选自核酸分子、蛋白质、多糖、糖和有机和无机分子。
本发明的其他方面和优点将在下面的实验部分中公开，应当认为它们仅仅是说明性的，并非限制本发明的范围。
图例
图1描述根据本发明的蛋白质产生的配体依赖的控制。
图2A、2B和2C证明在前mRNA的UTR中插入的自切割RNA序列(例如，核酶锤头状序列)能控制基因表达。图2A在基因的一个UTR中不含核酶序列、含无活性核酶序列或含活性核酶序列的报道蛋白质产生。图2B报道基因的前mRNA中的核酶序列插入位点(限制酶切位点)。图2C活性和无活性核酶的序列。
图3A和3B图3A对配体抑制的自切割RNA序列的选择方法概述。
图3B对配体激活的自切割RNA序列的选择方法概述。
图4用于aptazyme库克隆的质粒的描述。
图5初始库的设计。显示了用于第一个选择循环的双链DNA分子的完整序列，以及合成的不同引物的相对位置和序列。
图6两次选择的时程。显示了两次选择在每次选择循环后洗脱的RNA的百分数，用强力霉素和培氟沙星作为配体。两次循环之间的空隙显示选择压力的提高(通过改变温育时间和/或降低配体浓度)(见表1)。
图7在含量逐渐升高的强力霉素存在下，选择的RNA库的自切割动力学。左图选择循环#10后的库；右图选择循环#13后的库。
图8强力霉素敏感的aptazyme的自切割活性和aptazyme向aptamer的转化。Aptazyme RNA在50mM Tris-HCl pH7.5中37℃温育，通过加入10mM MgCl2起始自切割，并在3分钟内估测。当指出时，向切割反应中加入200nM强力霉素(Dox)或四环素(Tet)。在未加入RNA时(左图对照)，在1μM和2μM aptazyme衍生的aptamer存在下(左起第2张和第3张
图1μM aptamer，2μM aptamer)，在1μM和2μM非同源RNA存在下(左起第4张和第5张
图1μM非同源RNA，2μM非同源RNA)，进行自切割反应。
i.初始简并库的制备用Expedite核酸合成系统(Millipore)以标准DNA合成化学产生初始简并库。寡核苷酸在变性聚丙烯酰胺凝胶上纯化。合成下列引物库引物5’-CGCGTTGTGTTTACGCGTCTGATGAGT-N(40)-ACGAAACTACCTCGAGACGT(SEQ ID NO1)引物15’-CGCGTTGTGTTTACGCGTCIGATG(SEQ ID NO2)引物25’-AGCTGGTACCTAATACGACTCACTATAGGAGCTCGGTAGTCACGCGTTGTGTTTACGCGTCTGATG(SEQ ID NO3)引物35’-ACGTCTCGAGGTAGTTTCGT(SEQ ID NO4)纯化后，获得6nmol库引物(4.1015分子)。如前所述(Bartel D.P.和Szostak J.W.，Science(1993)2611411-1418)用引物1和引物3 PCR扩增总DNA。使用6nmol预扩增双链产物作为模板，引物2和引物3，在相同条件下进行另一个扩增步骤。终DNA分子具有下列特征(从5’到3’)KpnI限制位点、T7RNA聚合酶启动子、SacI限制位点、在螺旋II结构域中含有40个随机核苷酸的锤头状核酶序列、XhoI限制位点(见图5)。
在初始体外选择循环中，该DNA文库作为T7RNA聚合酶的模板。
ii.总选择方案图3A和图3B概述了所用的选择方案。在选择过程中对选择方案进行几处修改，在后面(部分iii)详述。
a)转录和在柱上固定标准转录反应含有下列成分250单位T7RNA聚合酶(Stratagene)、T7缓冲液(Stratagene)、2.5mM每种dNTP、20mMGMPS、20μCiα32P GTP、RNasin(50U)、配体(1mM)。转录反应物在37℃下温育过夜。然后在8％变性聚丙烯酰胺凝胶上纯化未切割的RNA转录物。纯化后，RNA用碘-乙酰-LC-生物素(Pierce-200倍过量)在室温下处理90分钟。在与上述相同的条件下凝胶纯化引发的RNA，并在室温下与链霉亲和素琼脂糖(Pierce)温育30分钟。然后用1ml洗涤缓冲液A(WA；25mM HEPES pH7.4，1M NaCl，5mM EDTA)、洗涤缓冲液B(WB；3M尿素，5mM EDTA)和水洗涤柱材料6次。最后，用水漂洗5次。
b)负选择在配体(1mM-1μM)存在下，固定的RNA在选择缓冲液(SB；40mMTris-HCl pH8，50mM NaCl，10mM亚精胺，8mM MgCl2)中37℃温育2-4小时。温育在加入镁后开始。第5轮后，在温育的前2小时30分内中断温育10次，用1ml WB(变性条件)洗柱两次，并用水漂洗3次。然后再次充分洗涤柱材料(用1ml WA-WB-H2O洗6次；用1ml H2O洗5次)。
c)正选择在与负选择相同、不含配体的条件下进行正选择。温育时间相当短(10-1分钟)。用1ml WB洗脱切割的核酸序列。通过2次酚/氯仿抽提和乙醇沉淀纯化洗脱的RNA。
d)反转录和扩增最后用Tth DNA聚合酶(Boehringer)反转录RNA，在标准条件下用引物3和引物4 PCR扩增。该DNA作为下一轮选择的T7RNA聚合酶的模板。
iii.选择过程中选择方案的修改在选择过程中，对选择方案进行几处修改(见表1)。在第一循环中使用16nmol转录RNA以保持库的多样性。柱材料和洗涤体积因而放大。在后面的循环中，降低RNA的量。也调节配体浓度和不同温育时间，以提高严格性。在第10和第13个选择循环后，在前述条件下(Cadwell R.C.和Joyce G.F.；《PCR方法和应用》(1992)28-33)对库进行诱变PCR。诱变PCR产生具有新的多样性的与所选序列密切相关的RNA分子。
iv.选择中的富集(图6)在选择强力霉素抑制的aptazyme和培氟沙星抑制的aptazyme过程中的洗脱图极其相似，表明这种选择方案极稳定。在第4次循环中能观察到第一次富集的迹象，在第5次循环中得到证实。然而，选择库的时程实验显示在有或无配体时的切割之间没有显著差异。而且，该库的切割效率与未选择的库(数据未显示)相比严重降低。假定这一结果是由于在非许可条件下由于多种非生产性构象状态能自切割(尽管效率低)的RNA种的共选择。
为了对这些邻位点(parasite)反选择，通过在负选择(见ii-b)中加入几个变性步骤修饰该选择方案。
在第7次循环中观察到新的富集。因此，通过将配体浓度降低为100μM，将洗脱时间减为1分钟，来提高选择严格性。在3次循环后能观察到新的富集。对此阶段的选择库进行诱变PCR，通过使配体浓度降低10倍提高选择严格性。3次循环后能观察到新的富集。对选择库再次施行该方法(诱变PCR-选择严格性提高-3个选择循环)，引起该库的新的富集。在这一阶段后，以非常低的洗脱时间(10秒)进行最后一次循环，以选择最快切割的核酸序列。
v.库动力学(图7)在选择中和选择后，不同循环后获得的库在标准条件下转录(250单位T7RNA聚合酶(Stratagene)、T7缓冲液(Stratagene)、2.5mM每种dNTP、20μCiα32P GTP、50U RNasin、1mM配体)。凝胶纯化未切割的转录物，用牛小肠碱性磷酸酶(Stratagene)去磷酸化，用T4聚核苷酸激酶(Stratagene)和γ32P-ATP 5’放射标记。凝胶纯化放射标记的RNA分子，以10nM的浓度在含有不同含量配体的SB中37℃温育。反应在加入镁之后起始。在不同时间点取出等份，与等量加样缓冲液(9M尿素，5mM EDTA)在冰上混合以抑制反应。然后将样品加至12％测序凝胶中，用磷成像仪(Molecular Dynamics)定量对应于完整(103nt)或切割的(13nt)核酸序列的带。实施例2在哺乳动物细胞中强力霉素和培氟沙星诱导的表达盒的选择第10、13和16个选择循环后获得的DNA库用限制酶XhoI和KpnI酶切。质粒pNPG1和pNPG2(图4)用相同的酶酶切，并将3个DNA库与两种质粒的每一种连接。按照标准方法(Sambrook等人(1989)，《分子克隆实验室手册》第二版，N.Ford编，Cold SpringHarborCold Spring Harbor Laboratory Press)用6种连接混合物之每一种转染大肠杆菌DH5α株。每次转染分离100个菌落。从每一个菌落中提取质粒DNA并纯化。克隆到质粒中的aptazyme用AppliedBiosystems试剂盒按照使用说明书通过Sanger等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74(1977)5463-5467)测序。
用与lipofectamine(Gibco-Life Sciences，Bethesda，MD USA)复合的质粒DNA根据使用说明书(每μg DNA 6μl lipofectamine)转染培养的人细胞系HeLa和HEK293。在一组实验中，细胞与10μM强力霉素或10μM培氟沙星温育，在另一组实验中，细胞在不含配体的情况下温育。转染48小时后，裂解细胞，按照使用说明书(Promega，Madison，WI USA)记录Renilla萤光素酶和萤火虫萤光素酶的含量。对每一实验条件(即质粒、配体)计算萤火虫萤光素酶活性(aptazyme控制的)与Renilla萤光素酶活性的比值(比值R)。在配体(强力霉素或培氟沙星)存在下产生大量萤火虫萤光素酶而在不含配体情况下产生少量萤火虫萤光素酶的质粒确定有最高比值R。选择这些质粒进一步在用强力霉素或培氟沙星控制蛋白质产生的基因转移实验中使用。实施例3小鼠中强力霉素诱导的蛋白质产生将10μg含aptazyme质粒pNPG1或pNPG2(在实施例2中选择的)注射到8周龄Balb/c小鼠的胫骨前肌(后肢)中，随后对这些肢进行电穿孔，以增强基因转移(Mir，L.M.等人，P.N.A.S.USA(1999)；96(8)4262-7)。一组5只小鼠在饮水中给予强力霉素(0.2mg/ml)，另一组不给。基因转移7天后，处死动物，获得胫骨前肌。将肌肉重悬浮于1ml裂解缓冲液中(双萤光素酶报道测定系统，Promega，Madison，WI USA)，用Fast-Prep匀浆器(Bio 101，Vista，CAUSA)中的玻璃和陶瓷珠匀浆。按照Promega的说明书估测萤火虫萤光素酶和Renilla萤光素酶的量。比较每组小鼠(强力霉素处理或未处理的)合成的萤火虫萤光素酶的量。基因转移率的个体间差异能通过比较2组小鼠之间萤火虫萤光素酶与Renilla萤光素酶的比值来补偿。因而能证实强力霉素可诱导小鼠中萤光素酶的产生。实施例4可与强力霉素结合的RNA aptamer的选择(图8)按照实施例1概述的方法选择aptazyme。按照实施例2将DNA库插入pNPG2中。几个克隆用Applied Biosystems试剂盒按照使用说明书通过Sanger等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74(1977)5463-5467)测序。
进一步研究克隆6。用引物2和引物3(实施例1)PCR扩增克隆6的DNA序列。扩增的序列(上链)如下所示 双下划线T7 RNA聚合酶转录启动子下划线原始DNA库中的随机序列(实施例1)黑体酶切位点扩增的DNA序列(SEQ ID NO5)用T7 RNA聚合酶转录，产生的RNA如实施例1所述纯化。RNA序列是(下文中称为aptazyme)GGAGCUCGGUAGUCACGCGUUGUGUUUACGCGUCUGAUGAGUGGUACAGUCCAGGGUGAAGUUCCAAUUUUGAACACCUCCACGAAACUACCUCGAGACGU(SEQ ID NO6)克隆6的DNA序列也用引物4和引物3 PCR扩增。引物4和扩增的序列(上链)如下所示引物45’-AGCTGGTACCTAATACGACTCACTATAGGAGCTCGGTAGTCACGCGTTGTGTTTACGCGTCTGATG(SEQ ID NO8)扩增的序列 双下划线T7 RNA聚合酶转录启动子下划线原始DNA库中的随机序列(实施例1)黑体突变的碱基引物4引入了一个C到G的突变，它能灭活锤头状核酶的自切割活性，但对其四级结构几乎没有影响(Bidya，N和Uhlenbeck，O.C.；Biochemistry(1997)361108-1114)。
扩增的DNA序列(SEQ ID NO7)用T7 RNA聚合酶转录，产生的RNA如实施例1所述纯化。RNA序列是(下文中称为aptamer)GGAGCUCGGUAGUGACGCGUUGUGUUUACGCGUCUGAUGAGUGGUACAGUCCAGGGUGAAGUUCCAAUUUUGAACACCUCCACGAAACUACCUCGAGACGU图8描述的实验显示，1)aptazyme的特征为可被强力霉素(四环素，强力霉素的一种异构体，可抑制切割为更小的程度)特异性抑制的自切割活性，2)aptamer能够解除强力霉素对自切割的抑制，但不能解除四环素对自切割的抑制。其解释是，aptamer与aptazyme竞争结合强力霉素。这证明酶切位点5’的核苷酸C突变为核苷酸G使aptazyme转化为可特异结合强力霉素的RNA配体。
表1
序列表<110>AVENTIS PHARMA S.A.<120>自切割RNA序列及其在控制蛋白质合成中的应用<130>Ribo<140>99402552.6<141>2000-10-13<150>99402552.6<151>1999-10-15<160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>87<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>1cgcgttgtgt ttacgcgtct gatgagtnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60nnnnnnnacg aaactacctc gagacgt 87<210>2<211>24<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>2cgcgttgtgtttacgcgtct gatg 24<210>3<211>66<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>3agctggtacc taatacgact cactatagga gctcggtagtcacgcgttgt gtttacgcgt 60ctgatg 66<210>4<211>20<212>ADN<213>人工序列<223>人工序列描述引物<400>4acgtctcgag gtagtttcgt 20<210>5<211>128<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>5agctggtacc taatacgact cactatagga gctcggtagt cacgcgttgt gtttacgcgt 60ctgatgagtg gtacagtcca gggtgaagtt ccaattttga acacctccac gaaactacct 120cgagacgt 128<210>6<211>101<212>ARN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>6ggagcucggu agucacgcgu uguguuuacg cgucugauga gugguacagu ccagggugaa 60guuccaauuu ugaacaccuc cacgaaacua ccucgagacg u 101<210>7<211>128<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>7agctggtacc taatacgact cactatagga gctcggtagt cacgcgttgt gtttacgcgt 60ctgatgagtg gtacagtcca gggtgaagtt ccaattttga acacctccac gaaactacct 120cgagacgt 128<210>8<211>66<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>8agctggtacc taatacgact cactatagga gctcggtagt cacgcgttgt gtttacgcgt 60ctgatg 66<210>9<211>101<212>ARN<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>9ggagcucggu agugacgcgu uguguuuacg cgucugauga gugguacagu ccagggugaa 60guuccaauuu ugaacaccuc cacgaaacua ccucgagacg u 10权利要求
1.一种编码RNA、蛋白质、多肽或肽的修饰基因，其中该修饰基因含有在其非翻译区(UTR)中插入的一种核酸序列，该核酸序列使该基因转录的RNA分子能配体依赖性自切割。
2.权利要求1的修饰基因，其中该基因是一种基因组DNA。
3.权利要求1的修饰基因，其中该基因是一种cDNA。
4.权利要求1的修饰基因，其中该基因是一种包含至少一种非翻译区的合成DNA。
5.权利要求1的修饰基因，其中所述非翻译区选自5’-UTR、3’-UTR和内含子。
6.权利要求1的修饰基因，其中所述非翻译区在基因中天然存在或被导入该基因中。
7.权利要求1的修饰基因，其中所述核酸序列使该基因转录的RNA分子能配体激活性自切割。
8.权利要求1的修饰基因，其中所述核酸序列使该基因转录的RNA分子能配体抑制性自切割。
9.权利要求1的修饰基因，其中所述核酸序列来自锤头状核酶、丁型肝炎病毒核酸、链孢霉VS RNA、发夹核酶、I组内含子、II组内含子和Rnase P。
10.权利要求1的修饰基因，其中所述核酸序列是一种编码aptazyme的人工DNA，可通过体外进化和选择获得。
11.权利要求1的修饰基因，其中所述配体选自核酸、蛋白质、多糖、糖、有机和无机分子。
12.权利要求1的修饰基因，其进一步包含一个转录启动子。
13.含有权利要求1或12的修饰基因的载体。
14.一种控制由基因产生蛋白质、多肽或肽的方法，包括在基因的至少一个非翻译区中插入一种核酸序列，该核酸序列使由该基因转录的RNA能配体依赖性自切割。
15.一种修饰基因的方法，包括在基因的至少一个非翻译区中插入一种核酸序列，该序列使由该基因转录的RNA能配体依赖性自切割。
16.一种从基因转录的前信使RNA或mRNA中除去5’-帽子结构和/或3’-polyA尾的方法，包括在基因的至少一个非翻译区中插入一种核酸序列，该序列使由该基因转录的RNA能配体依赖性自切割。
17.权利要求16的方法，用来从基因转录的前mRNA或mRNA中除去5’-帽子结构，包括在基因的至少5’-非翻译区中插入一种核酸序列，该序列使由该基因转录的RNA能配体依赖性自切割。
18.权利要求16的方法，用来从基因转录的前mRNA或mRNA中除去3’-polyA尾结构，包括在基因的至少3’-非翻译区中插入一种核酸序列，该序列使由该基因转录的RNA能配体依赖性自切割。
19.一种控制细胞内蛋白质、多肽或肽产生的方法，包括(i)向细胞中导入一种编码蛋白质、多肽或肽的修饰基因，其中该修饰基因含有在其非翻译区(UTR)中插入的一种核酸序列，该序列使该基因转录的RNA分子能配体依赖性自切割，和(ii)在配体存在或不存在下接触细胞。
20.一种控制细胞内蛋白质、多肽或肽产生的方法，包括(i)向细胞中导入一种编码蛋白质、多肽或肽的修饰基因，其中该修饰基因含有在其非翻译区(UTR)中插入的一种核酸序列，该序列使该基因转录的RNA分子能配体激活性自切割，和(ii)用配体接触细胞以抑制产生或在不存在配体的情况下增加产生。
21.一种控制细胞内蛋白质、多肽或肽产生的方法，包括(i)向细胞中导入一种编码蛋白质、多肽或肽的修饰基因，其中该修饰基因含有在其非翻译区(UTR)中插入的一种核酸序列，该序列使该基因转录的RNA分子能配体抑制性自切割，和(ii)用配体接触细胞以增加产生或在不存在配体的情况下减少产生。
22.权利要求19、20或21的方法，其中所述配体对于细胞是外源的。
23.权利要求19、20或21的方法，其中所述配体是细胞的一种内源成分，是致病或非致病的。
24.权利要求23的方法，其中所述配体是一种在研究蛋白质、多肽或肽产生的细胞中优势存在的分子。
25.权利要求24的方法，其中所述配体是一种在研究蛋白质、多肽或肽产生的靶细胞中优势存在、而在其它细胞中基本不存在或以较低水平存在的分子。
26.权利要求19、20或21的方法，用于在体外或来自体内的细胞中产生蛋白质、多肽或肽。
27.权利要求19、20或21的方法，用于在体内细胞、组织或器官中产生蛋白质、多肽或肽。
28.权利要求19、20或21的方法，其中的细胞选自原核细胞、真核细胞、哺乳动物细胞和植物细胞。
29.权利要求19、20或21的方法，其中基因包含于选自质粒、病毒或其组合的载体中。
30.配体与权利要求1的修饰基因的组合，用于同时、分开或顺序使用。
31.根据权利要求30的配体和修饰基因的组合，其中该序列转录的RNA的自切割被该配体抑制。
32.根据权利要求30的配体和修饰基因的组合，其中该基因转录的RNA的自切割被该配体激活。
33.根据权利要求30、31或32的组合，其中配体选自核酸分子、蛋白质、多糖、糖和有机和无机分子。
34.一种体外进化和选择方法，用于产生配体依赖性自切割RNA序列，该方法包括a)制备不同双链脱氧核糖核酸(DNA)分子的库，该库的分子中至少部分序列是随机或部分随机的序列，使得该部分在该库的不同分子中有不同序列，b)在不会发生自切割的条件下在用于选择配体抑制性自切割核酸序列的配体存在下，或在不存在用于选择配体激活性自切割核酸序列的配体时，将DNA分子库转录为核糖核酸(RNA)分子库，c)在不会发生自切割的条件下(存在或不存在配体时)，将该RNA库的所有成员固定于固体支持物上，d)在不会发生自切割的条件下，在存在或不存在配体时，温育该RNA库，e)分离与固体支持物结合的RNA分子，和自切割产生的液相中存在的RNA分子，变性并洗涤与固体支持物结合的RNA分子，f)重复步骤d)-e)多次循环，例如约1-50次循环，以除去由于多种非生产性构象状态在非许可条件下能自切割，虽然效率较低，的RNA序列，g)向该库中添加或除去所述配体，并在允许自切割的条件下温育，和h)分离特征为自切割(液相中存在)和特征不是自切割(与固体支持物结合)的该库的RNA分子，以获得这种特征的第一次选择的RNA分子库。
35.权利要求34的方法，其进一步包括i)将步骤h)的第一次选择的RNA分子库反转录为单链互补DNA(cDNA)分子库，并将该单链cDNA库扩增为双链DNA库，j)重复步骤b)-i)多次循环，例如约10-100次循环，获得编码配体依赖性自切割RNA分子的双链DNA分子。
36.权利要求34或35的方法，其中步骤a)中DNA分子库的分子具有一种序列，该序列来自一部分核苷酸被10-100个随机核苷酸替代的已知自切割RNA序列。
37.权利要求34或35的方法，其中步骤a)中DNA分子库的分子具有一种序列，该序列来自一部分核苷酸被已知RNA配体(aptamer)的序列替代的已知自切割RNA序列。
38.权利要求34或35的方法，其中步骤a)中DNA分子库的分子具有一种序列，该序列由除了两个短侧翼序列外完全随机的序列组成，这两个序列包含RNA聚合酶启动子和扩增引物附着位点。
39.一种合成的、非天然存在的DNA分子，其编码一种配体依赖性自切割RNA序列。
40.权利要求39的DNA，其中所述配体是一种核酸分子、蛋白质、多糖或糖，或有机或无机分子。
41.权利要求39的DNA，其中所述配体是细胞的一种内源成分。
42.一种合成的、非天然存在的配体依赖性自切割RNA分子。
43.一种体外进化和选择方法，用于产生配体结合的RNA序列，该方法包括a)制备不同双链脱氧核糖核酸(DNA)分子的库，该库的分子的至少部分序列是随机或部分随机的序列，使得该部分在该库的不同分子中有不同序列，b)在不会发生自切割的条件下在用于选择配体抑制性自切割核酸序列的配体存在下，或在不存在用于选择配体激活性自切割核酸序列的配体时，将DNA分子库转录为核糖核酸(RNA)分子库，c)在不会发生自切割的条件下(存在或不存在配体时)，将该RNA库的所有成员固定于固体支持物上，d)在不会发生自切割的条件下，在存在或不存在配体时，温育该RNA库，e)分离与固体支持物结合的RNA分子，和自切割产生的液相中存在的RNA分子，变性并洗涤与固体支持物结合的RNA分子，f)重复步骤d)-e)多次循环，例如约1-50次循环，以除去由于多种非生产性构象状态在非许可条件下能自切割，虽然效率较低，的RNA序列，g)向该库中添加或除去所述配体，并在允许自切割的条件下温育，和h)分离特征为自切割(液相中存在)和特征不是自切割(与固体支持物结合)的该库的RNA分子，获得这种特征的第一次选择的RNA分子库。i)将aptazyme酶切位点5’的核苷酸C突变为核苷酸G，以消除自切割活性。
全文摘要
本发明涉及通过向基因非翻译区(UTR)中插入一种使转录的RNA能条件自切割的序列,控制(激活或抑制)由mRNA序列合成蛋白质。
文档编号C12N5/10GK1377414SQ00813861
公开日2002年10月30日 申请日期2000年10月13日 优先权日1999年10月15日
发明者N·皮格尼奥, M·法姆洛克, V·特威利尔 申请人:阿文蒂斯药物股份有限公司