Mage－a12抗原肽及其应用的制作方法

专利名称：Mage－a12抗原肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明的领域本发明涉及优先表达在肿瘤(包括恶性黑素瘤，膀胱癌，肾癌，肺癌，食道癌等)中的编码核酸分子和多肽。核酸分子和编码多肽在治疗和诊断中的应用。
一般，宿主将不在正常非肿瘤细胞中表达的肿瘤相关基因识别为外源基因。这样，肿瘤相关基因的表达可以刺激宿主对肿瘤细胞的免疫应答。肿瘤相关基因也可以表达在某些组织中的正常细胞中，并且不刺激免疫应答。在这种组织中，因为免疫系统不能“看到”这些免疫学特别组织内的细胞，细胞表面上的蛋白质产品的普通免疫学可识别片段不可能刺激免疫应答。免疫学特别组织的实例包括脑和睾丸。
发现基因的肿瘤相关表达提供了识别细胞为肿瘤细胞的一种方式。诊断化合物可以以肿瘤相关基因为依据，并可用来确定肿瘤细胞的存在和位置。并且，当肿瘤相关基因与肿瘤表型方面有关时(如，非调节生长或转移)，肿瘤相关基因可用来提供治疗物，如可降低或基本上消除这种基因表达的反义核酸，从而降低或基本上消除依赖于具体肿瘤相关基因表达的表型方面。
哺乳动物免疫系统识别并与外源或外来物质反应的过程是很复杂的过程。系统的一个重要方面是T细胞应答。这种应答需要T细胞识别并与细胞表面分子和肽的复合物反应，细胞表面分子是指人类白细胞抗原(“HLA”)，或主要组织相容性复合物(“MHC”)。肽从也呈递HLA/MHC分子的细胞处理的大分子衍生。有关这个方面参看Male等人Advanced Immunology(J.P.Lipincott Company，1987)6-10章。T细胞和HLA/肽复合物之间的相互作用是限制性的，需要T细胞特异于HLA分子和肽的特别组合。如果特异肽不存在，即使其组对复合物存在也没有T细胞应答。同样地，如果特异复合物不存在但T细胞存在，也不会有应答。这个机理与免疫系统对外源物质的应答有关，与自身免疫病理学有关，与对细胞异常应答有关。很多工作集中在将蛋白质加工到HLA结合肽中的机理上。有关这个方面参看Barinaga，科学，257880，1992；Fremont等人，科学257919，1992；Matsumura等人，科学257927，1992；Latron等人，科学257964，1992。
T细胞识别细胞异常的机理也已与癌症相关。例如，在1992年5月22日提交的，1992年11月26日公开的PCT申请PCT/US92/04354(参考收入本篇)中，公开了基因家族，其中被加工到肽中，接着表达在细胞表面上，其可通过特异CTL致使肿瘤细胞裂解。这些基因据说编码“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子，从中衍生的肽称为“肿瘤排斥抗原”或“TRA”。要获得这一家族基因的更多的信息，参看Traversari等人，J.Exp.Med.1761453-1457，1992；van der Bruggen等人，科学2541643，1991；De Plaen等人，免疫遗传学40360-369，1994以及美国专利No.5,342,774。
美国专利No.5,405,940中，其公开内容参考收入本篇，其中教授了由HLA-A1分子呈递的九肽。参考文献教授在已知具体肽对具体HLA分子的特异性的情况下，应可以预计具体肽与一种HLA分子结合，而不是其他分子。这一点很重要，因为不同的个体具有不同的HLA显型。这样，当确定具体肽做为特异HLA分子的组对物具有诊断和治疗衍生物时，对于个体这仅与具体HLA显型有关。这需要在这一领域的进一步的工作，因为细胞异常不局限于一种具体HLA显型，并且目标治疗需要了解一些待治疗的异常细胞的情况。
在美国专利No.5,629,166(参考收入本篇)中，公开了MAGE-1表达产物加工到第二TRA中的事实。这种第二TRA有HLA-Cw16分子呈递，也称为HLA-C*1601。公开内容显示给定的TRAP可以产生多种TRA。
在美国专利No.5,487,974(参考收入本篇)中，酪氨酸酶被描述为肿瘤排斥抗原前体。这份参考文献公开了将由一些正常细胞(例如黑素细胞)产生的分子加工到肿瘤细胞中以产生由HLA-A2分子呈递的肿瘤排斥抗原。
在美国专利No.5,620,886(其全文参考收入本篇)中，公开了不是从酪氨酸酶衍生的第二TRA由HLA-A2分子呈递。TRA从TRAP衍生，但由已知的MAGE基因编码。这份公开内容显示，具体HLA分子可以呈递从不同来源衍生的TRA。
其他TRAP在美国专利No.5,571,711，5,610,013，5,587,289，和5,589,334，以及PCT申请WO96/10577中公开。TRAP加工成肿瘤排斥抗原，其由多种HLA分子呈递。
有很多患者会从包括其他抗原肽的治疗中受益，因为患者肿瘤没有表达预先知道的抗原肽，或者因为患者没有表达适当的HLA分子。因此，需要确定含有由MHC I类分子呈递的由CD8*淋巴细胞识别的其他肿瘤相关抗原。
依据本发明的一个方面，提供了分离的MAGE-A12 HLA I类结合肽。肽包括SEQ ID NO6氨基酸序列或结合HLA I类分子的其功能变体。功能变体包括一种或多种氨基酸添加，替换或缺失。在某些实施方案中，分离的MAGE-A12 HLA I类结合肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，其功能片段，和其功能变体。在优选实施方案中，分离的肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQ IDNO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，其功能片段，和其功能变体。分离的MAGE-A12 HLA I类结合肽优选地不是全长MAGE-A12多肽序列。
依据本发明的另一个方面，提供了分离的MAGE-A12 HLA I类结合肽，其包括结合HLA Cw*07的SEQ ID NO2氨基酸序列片段，或其功能变体。功能变体包括一种或多种氨基酸添加，替换或缺失。功能变体结合HLA Cw*07。优选实施方案包括SEQID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。
在一些实施方案中，前述分离的MAGE-A12 HLA I类结合肽是不可水解的。优选地，不可水解的肽是从下列组中选取的，包括含D-氨基酸的肽，含-psi[CH2NH]-还原酰胺肽键的肽，含-psi[COCH2]-酮亚甲基肽键的肽，含-psi[CH(CN)NH]-(氰亚甲基)氨基肽键的肽，含-psi[CH2CH(OH)]-羟基亚乙基肽键的肽，含-psi[CH2O]-肽键的肽，含-psi[CH2S]-硫代亚甲基肽键的肽。
依据本发明的一个方面提供了包括前述分离的MAGE-A12HLA I类结合肽和非-MAGE-A12肿瘤抗原的一种或多种分离的HLA I类或II类结合肽的组合物。优选地，MAGE-A12 HLA I类结合肽和非MAGE-A12 HLA结合肽结合为多表位多肽。
依据本发明的另一个方面，提供了编码前述肽的分离的核酸。核酸没有编码全长MAGE-A12。在某些实施方案中，核酸包括SEQ ID NO1核苷酸序列的片段。依据本发明表达载体也提供了。表达载体包括可操作地结合启动子的分离的前述核酸。在某些实施方案中，表达载体还包括编码HLA-Cw*07的核酸。在本发明的另一个方面中，提供了用前述核酸或表达载体转染或转化的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞也表达HLA-Cw*07分子。
依据本发明的另一个方面，提供了选择性地增加含有对MAGE-A12 HLA结合肽特异的T淋巴细胞的T淋巴细胞群的方法。方法包括将含有T淋巴细胞群的T淋巴细胞源与足以选择性地增加含有对MAGE-A12 HLA结合肽特异的T淋巴细胞的T淋巴细胞群的量的呈递MAGE-A12 HLA结合肽和HLA分子的复合物的试剂接触。在某些实施方案中，试剂是用MAGE-A12蛋白质或其HLA结合片段接触过的抗原呈递细胞。在其他实施方案中，MAGE-A12 HLA结合肽是从下列组中选取的，包括(i)包括SEQ ID NO2氨基酸序列的片段的肽；(ii)包括SEQ ID NO6氨基酸序列的肽；以及(iii)(i)和(ii)肽的功能变体。
依据本发明的另一个方面，提供了诊断特点在于表达MAGE-A12 HLA结合肽的病变的方法。方法包括将从受试体分离的生物样品与结合复合物的试剂接触，确定复合物与试剂之间的结合来确定病变。在某些实施方案中，MAGE-A12 HLA结合肽是从下列组中选取的，包括(i)包括SEQ ID NO2氨基酸序列的片段的肽；(ii)包括SEQ ID NO6氨基酸序列的肽；以及(iii)(i)和(ii)肽的功能变体。
依据本发明的另一个方面，提供了治疗患有特点在于表达MAGE-A12的病变的受试体的方法。方法包括给受试体服用足以减轻病变的量的MAGE-A12 HLA结合肽。在某些实施方案中，MAGE-A12 HLA结合肽是从下列组中选取的，包括(i)包括SEQ ID NO2氨基酸序列的片段的肽；(ii)包括SEQ ID NO6氨基酸序列的肽；以及(iii)(i)和(ii)肽的功能变体。
依据本发明的另一个方面，提供了治疗患有特点在于表达MAGE-A12的病变的受试体的方法。方法包括给受试体服用足以减轻病变的量的组合物，组合物包括分离的MAGE-A12 HLA I类结合肽和分离的非-MAGE-A12肿瘤抗原的HLA I类或II类结合肽。
依据本发明的另一个方面，提供了治疗患有特点在于表达MAGE-A12的病变的受试体的方法。方法包括给受试体服用足以减轻病变的量的选择性地增加受试体中HLA分子和MAGE-A12 HLA结合肽的复合物的存在量的试剂。在某些实施方案中，试剂包括MAGE-A12 HLA结合肽。在优选实施方案中，MAGE-A12 HLA结合肽是从下列组中选取的，包括(i)包括SEQID NO2氨基酸序列的片段的肽；(ii)包括SEQ ID NO6氨基酸序列的肽；以及(iii)(i)和(ii)肽的功能变体。
依据本发明的另一个方面，提供了治疗患有特点在于表达MAGE-A12的病变的受试体的方法。方法包括给受试体服用足以减轻病变的量自身T淋巴细胞，其中T淋巴细胞对HLA分子和MAGE-A12结合肽的复合物特异。在某些实施方案中，MAGE-A12 HLA结合肽是从下列组中选取的，包括(i)包括SEQID NO2氨基酸序列的片段的肽；(ii)包括SEQ ID NO6氨基酸序列的肽；以及(iii)(i)和(ii)肽的功能变体。
依据本发明的另一个方面，还提供了鉴别MAGE-A12 HLA结合肽的功能变体的方法。方法包括选取MAGE-A12 HLA结合肽，结合MAGE-A12 HLA I类结合肽的HLA结合分子，以及受到由HLA结合分子呈递的MAGE-A12 HLA结合肽刺激的T细胞；诱变MAGE-A12 HLA结合肽的第一氨基酸残基制备变体肽；确定变体肽与HLA结合分子的结合以及T细胞的刺激作用，其中变体肽与HLA结合分子结合以及T细胞受到由HLA结合分子呈递的变体肽刺激的表示该变体肽是功能变体。在某些实施方案中，MAGE-A12 HLA结合肽是从下列组中选取的，包括(i)包括SEQ ID NO2氨基酸序列的片段的肽；(ii)包括SEQ ID NO6氨基酸序列的肽；以及(iii)(i)和(ii)肽的功能变体。在其他实施方案中，方法包括比较MAGE-A12 HLA结合肽对T细胞的刺激作用和功能变体对T细胞的刺激作用的步骤来确定功能变体对T细胞的刺激作用的有效性。同样提供了通过方法鉴别的分离的MAGE-A12 HLA结合肽的功能变体。
依据本发明的另一个方面，提供了选择性地结合前述MAGE-A12 HLA结合肽的分离的多肽，只要分离的多肽不是HLA分子。在某些实施方案中，分离的多肽的抗体，优选地是单克隆抗体。在其他实施方案中，分离的多肽是从下列组中选取的抗体片段，包括Fab片段，F(ab)2片段或或包括对MAGE-A12 HLA结合肽具有选择性的CDR3区域的片段。
依据本发明的另一个方面，提供了选择性地结合HLA分子和MAGE-A12 HLA结合肽的复合物的分离的T淋巴细胞。在某些实施方案中，MAGE-A12 HLA结合肽是从下列组中选取的，包括(i)包括SEQ ID NO2氨基酸序列的片段的肽；(ii)包括SEQ ID NO6氨基酸序列的肽；以及(iii)(i)和(ii)肽的功能变体。
依据本发明的另一个方面，提供了包括HLA分子和MAGE-A12 HLA结合肽的复合物的分离的抗原呈递细胞。在某些实施方案中，MAGE-A12 HLA结合肽是从下列组中选取的，包括(i)包括SEQ ID NO2氨基酸序列的片段的肽；(ii)包括SEQ ID NO6氨基酸序列的肽；以及(iii)(i)和(ii)肽的功能变体。
依据本发明另一个方面，提供了鉴别MAGE-A12 HLA结合肽的侯选类似物的方法。方法包括提供结合MAGE-A12 HLA结合肽的HLA分子，将HLA分子与测试分子接触，确定测试分子与HLA分子的结合，其中结合HLA分子的测试分子是MAGE-A12 HLA结合肽的侯选类似物。在某些实施方案中，方法包括制成HLA分子和侯选类似物的复合物，将复合物与结合HLA分子和MAGE-A12 HLA结合肽的复合物的T细胞接触，测试T细胞的活化作用。在其中的某些方法中，T细胞的活化作用通过从下列组中选取的性质来指示，包括T细胞的增殖，T细胞产生的干扰素-γ，T细胞产生的肿瘤坏死因子，T细胞对靶细胞的细胞溶解作用。
依据本发明的一个方面，提供了疫苗组合物。疫苗组合物包括前述MAGE-A12 HLA结合肽，前述T淋巴细胞，前述抗原呈递细胞，和/或前述分离的核酸分子。在某些实施方案中，前述疫苗组合物包括辅剂和/或药学上可接受的载体。
在本发明的另一个方面中，提供了包括一种或多种分离的MAGE-A12 HLA I类结合肽，或其结合HLA I类分子的功能变体的蛋白质微排列(microarrays)。功能变体包括一种或多种氨基酸添加，替换或缺失。在某些实施方案中，分离的MAGE-A12HLA I类结合肽包括SEQ ID NO6氨基酸序列。在其他实施方案中，分离的MAGE-A12 HLA I类结合肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，以及它们的功能变体。本发明还提供了这种微排列在诊断中的应用，特别是在诊断癌症中的应用。诊断方法包括将蛋白质微排列与从怀疑患有病变的受试体获得的生物样品接触，确定生物样品的组成与分离的MAGE-A12 HLA I类结合肽的结合。在某些实施方案中，生物样品的组成是从下列组中选取的，包括抗体，T淋巴细胞，和HLA分子。优选的病变是癌症。
本发明还提供含有任何一种或多种本文所描述的组合物的药物制备品。这样的药物制备品可以包括药学上可接受的稀释剂载体或赋形剂。本发明还提供了使用这样的组合物制备药物，特别是制备治疗癌症的药物。
在前述方法和组合物中，HLA分子优选地是HLA Cw*07，更优选的是HLA Cw*0701。本文所使用的病变是癌症，如膀胱癌，恶性黑素瘤，食道癌，肺癌，头和颈部癌症，乳腺癌，结肠癌，骨髓瘤，脑肿瘤，恶性肉瘤，前列腺癌和肾癌。
本发明的这些目的和其他目的结合本发明的详细描述进行更详细的描述。
本发明示图的简述


图1演示了CTL501 D/19对自身和同种异型HLA-Cw*07阳性肿瘤细胞系的识别作用(A)裂解，(B)TNF释放。
图2演示了CTL 501D/19识别由HLA-Cw7呈递的MAGE-12编码的抗原。
图3演示了确定编码由CTL 501 D/19识别的抗原肽的MAGE-A12区域。
图4演示了用MAGE-12肽VRIGHLYIL(SEQ ID NO4)和RIGHLYIL(SEQ ID NO6)脉冲的自身细胞系LB-831-EBV被CTL 501D/19裂解。
本发明的详细描述本发明提供了分离的MAGE-A1肽，其中一些肽由HLA I类分子呈递，这样的肽刺激CD8+T淋巴细胞的增殖和活化。这样的肽本文称为“MAGE-A12免疫原性多肽”和“MAGE-A12HLA I类结合肽”和“MAGE-A12 HLA肽”，等等。因此，本发明的一个方面是包括SEQ ID NO6氨基酸序列的分离的肽。
下面的实例显示了是MAGE-A12 HLA结合肽的肽的分离。这些示例肽是SEQ ID NO1核酸的加工的翻译产物。这样，此领域中的普通技术人员可以理解，从中MAGE-A12免疫原性多肽被加工成用来呈递的最终形式的翻译产物可以是只要其包括HLA结合肽的任何长度或序列。在某些实施例中，HLA结合肽包括含有SEQ ID NO4，5或6的氨基酸序列的MAGE-A12HLA结合肽。如下面实施例中所演示的，小到8个氨基酸的肽或蛋白质适合于加工，由HLA I类分子呈递并可有效刺激CD8+T淋巴细胞。SEQ ID NO4，5或6的肽可以有一个，两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个，十个，或更多个氨基酸添加在一个末端或两个末端。添加的氨基酸可以对应于MAGE-A12多肽(SEQ ID NO2)，或可以是不相关的。如此领域中众所周知的，这种肽的抗原部分在生理学条件下裂解，由HLA I类分子呈递。
其他从MAGE-A12多肽衍生出来的HLA结合肽当由HLACw*07分子呈递时可以刺激免疫应答。本发明包括MAGE-A12多肽的所有这样的免疫原片段。
如本文所使用的，MAGE-A12 HLA结合肽的“功能变体”或“变体”是含有的一种或多种对MAGE-A12 HLA结合肽的基本氨基酸序列修饰的并保持本文所公开的HLA I类结合特性以及刺激CD8+T淋巴细胞的增殖和/或活化的能力的分子。产生MAGE-A12免疫原性多肽功能变体的修饰可以制作以1)增强MAGE-A12 HLA结合肽的特性，如在表达系统中的肽稳定性或蛋白质-蛋白质结合如HLA-肽结合的稳定性；2)给MAGE-A12免疫原性多肽提供新活性或特性，如添加抗原表位或添加可鉴别的组成；或3)提供产生相同或类似的T细胞刺激属性的不同氨基酸序列。对MAGE-A12 HLA结合肽的修饰可以对编码肽的核酸制作，修饰包括缺失，点突变，截短，氨基酸替换和氨基酸添加。可替换地，修饰可以直接对多肽制作，如通过裂解，添加接头分子，添加可鉴别组成，如生物素，添加脂肪酸，一个氨基酸替换另一个氨基酸等等。修饰也包括含有全部或部分MAGE-A12免疫原性多肽氨基酸序列的融合蛋白质。
MAGE-A12免疫原性多肽的氨基酸序列可以是天然的或是非天然来源的，即，它们可以是天然的MAGE-A12免疫原性多肽分子或可以包括修饰的序列，只要氨基酸序列在呈递时保持刺激溶细胞性T细胞的能力并且保持与HLA I类分子如HLACw*07分子结合的特性。例如，在本文中MAGE-A12免疫原性多肽可以是MAGE-A12 HLA结合肽和不相关氨基酸序列的融合蛋白质，在SEQ ID NO4，5和6中显示的氨基酸序列的合成肽，标记肽，从患有MAGE-A12表达癌的患者中分离的肽，从表达MAGE-A12的培养细胞中分离的肽，与非肽分子偶联的肽(如在某些药物给药系统中)以及包括SEQ ID NO6氨基酸序列的其他分子。
优选地，MAGE-A12 HLA结合肽是不可水解的。为了提供这样的肽，可以从不可水解的肽(如含有一个或多个D-氨基酸的肽或含有一个或多个不可水解肽键结合氨基酸的肽)文库中选取MAGE-A12 HLA结合肽。可替换地，可以选取诱导CD8+T淋巴细胞最优的肽，然后按需要修饰这样的肽以降低被蛋白酶水解的可能性。例如，为了确定对蛋白水解裂解的易感性，可以将肽标记并用细胞提取物或提纯蛋白酶温育，然后分离以确定哪种肽键对蛋白水解易感，如通过对肽和蛋白水解片段测序。可替换地，潜在的易感性肽键可以通过比较MAGE-A12免疫原性多肽的氨基酸序列和蛋白酶测试组的已知裂解位点特异性来确定。根据这种测试结果，可能蛋白水解的个体肽键可以通过体外肽合成用不可水解的肽键替换。
许多不可水解的肽键以及合成含有这种肽键的肽的方法在此领域中是众所周知的。不可水解肽键包括-psi[CH2NH]-还原酰胺肽键，-psi[COCH2]-酮亚甲基肽键，-psi[CH(CN)NH]-(氰亚甲基)氨基肽键，-psi[CH2CH(OH)]-羟基亚乙基肽键，-psi[CH2O]-肽键，-psi[CH2S]-硫代亚甲基肽键。
肽的非肽类似物，例如提供稳定的结构或降低的生物降解作用的非肽类似物也考虑在内。肽模拟类似物可以根据选取的MAGE-A12 HLA结合肽通过用非肽组成替换一个或多个残基来制备。优选地，非肽组成使得肽能保持其天然构象，或稳定优选的如生物活性构象。一个从肽制备非肽模拟类似物的方法的实例在Nachman等人，Regul.Pept.57359-370(1995)中描述。肽类似物也可以依据这样的分子的HLA结合属性和/或T细胞刺激属性从合成化合物(如小有机分子的组合文库)或天然分子文库中选取。鉴别从文库中获得的MAGE-A12免疫原性多肽的类似物的测试法如结合测试法在此领域中是众所周知的。如本文使用的肽包括所有前述物。
如果变体包括MAGE-A12免疫原性多肽(SEQ ID NO4，5或6)的变化，含有保守性氨基酸替换的MAGE-A12免疫原性多肽的功能变体通常是优选的，即，保持源氨基酸性质如电荷，疏水性，构象等的替换。氨基酸保守性替换的实例包括在下列组中的氨基酸中实施的替换(a)M，I，L，V；(b)F，Y，W；(c)K，R，H；(d)A，G；(e)S，T；(f)Q，N；以及(g)E，D。
鉴别MAGE-A12免疫原性多肽的功能变体的其他方法在Strominger和Wucherpfennig的PCT申请(US/96/03182)中公开。这些方法取决于显现潜在的抗原表位可以与之比较的氨基酸序列基元。每种基元描述了有限的氨基酸序列组，其中在每个(相对)位置上的残基可能(a)被限定在单一残基上，(b)在限制性组残基中可以变化，或(c)在所有可能的残基中可以变化。例如，基元可能指定在第一位置上的残基可以是残基缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，或苯丙氨酸中的任何一个；可能指定在第二位置上的残基必须是组氨酸；指定在第三位置上的残基可以是任何氨基酸残基；指定在第四位置上的残基可以是残基缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸中的任何一个；指定在第五位置上的残基必须是赖氨酸。
MAGE-A12 HLA结合肽功能变体的序列基元可以通过分析主要组织相容性复合物HLA Cw蛋白质的结合域或结合袋和/或本文所描述的MAGE-A12免疫原性多肽的T细胞受体(“TCR”)接触点来显现。通过提供与形成HLA I类结合袋有关的残基的详细结构分析，此领域中的普通技术人员能对结合任何HLA I类蛋白质的序列基元作出预测。
使用这些序列基元作为研究，评定，或设计标准，此领域中的普通技术人员能鉴别具有与具体HLA分子结合的以及与T细胞相互作用以诱导T细胞应答的合理可能性的肽类别(本文所公开的MAGE-A12 HLA结合肽的功能变体)。如本文所描述的，这些肽可以合成并测试活性。使用这些基元，与纯序列同源性(其不包括抗原性相似但序列相当不同的多种肽)或带有非限制的“保守性”替换的序列同源性(其包括在高度保守位点不同的多种肽)相反，表示一种此领域中的普通技术人员能用其评定肽使用在疾病治疗中可能性的方法。
Strominger和Wucherpfennig PCT申请(本文引用的参考文献，文献的全部内容参考收入本篇)，描述了接触HLA II类肽的残基的HLA II类和TCT结合袋。同样地，通过保持可能结合在HLA I类和/或TCR结合袋中的残基的一致性，或仅允许特异替换，保持与HLA I类和T细胞受体结合的MAGE-A12HLA结合肽的功能变体可以制备。
在蛋白质序列中定位一个或多个抗原肽可以得到通过根据已建立的结合可能性原则(如，Parker等人，免疫学期刊，152163，1994；Rammensee等人，免疫遗传学41178-228，1995)作出的HLA肽结合预测的辅助。HLA结合预测可以使用通过国际互联网在(美国)国立卫生研究院(Nation Institutes ofHealth)网站在统一资源定位器(URL)http//bimas.dcrt.nih.gov的World Wide Web站获得的运送法则方便地进行。
提供了鉴别MAGE-A12免疫原性多肽的方法。通常，方法包括选取MAGE-A12 HLA结合肽，结合MAGE-A12 HLA结合肽的HLA I类结合分子，以及由HLA I类结合分子呈递的MAGE-A12 HLA结合肽刺激的T细胞。在优选实施方案中，MAGE-A12免疫原性多肽包括SEQ ID NO6氨基酸序列。更优选地，肽包括SEQ ID NO4，SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的氨基酸序列。MAGE-A12 HLA结合肽的第一氨基酸残基被突变以制备变体肽。根据上述HLA和T细胞接触点原理，氨基酸残基可以被诱变。任何制备变体肽的方法都可以使用，如变体肽的合成，使用突变核酸分子重组植被变体肽，等等。
根据标准方法确定变体肽与HLA I类结合分子的结合和/或对T细胞的刺激作用。例如，如下面所示例的，变体肽可以与含有与MAGE-A12 HLA结合肽结合的HLA I类分子抗原呈递细胞接触，形成变体肽和抗原呈递细胞的复合物。然后可以将这种复合物与识别由HLA I类结合分子呈递的MAGE-A12 HLA结合肽的T细胞接触。T细胞可以从患有特点在于表达MAGE-A12的病况的患者中获得。T细胞对变体肽的识别可以通过测定T细胞刺激作用的指示剂(如TNF或IFNγ的产生)来确定。
变体肽与HLA I类结合分子的结合和/或由HLA I类结合分子呈递的变体肽对T细胞的刺激作用说明变体肽是功能变体。方法也可以包括比较MAGE-A12 HLA结合肽对T细胞的刺激作用和功能变体对T细胞的刺激作用来确定功能变体对T细胞刺激作用的有效性的步骤。通过将MAGE-A12 HLA结合肽与功能变体比较，可以制备具有增加的T细胞刺激属性的肽。
如果需要，可以对通过任何前述方法制备的MAGE-A12 HLA结合肽的变体进行测序，以确定氨基酸序列，推出编码这种变体的核苷酸序列。
因此，编码MAGE-A12免疫原性多肽或其变体，包括等位基因变体的核酸序列也是本发明的一部分。在对编码MAGE-A12免疫原性多肽的核酸的筛查中，可以使用32P探针在严格条件下实施核酸杂交，如Southern印迹或Northern印迹。如本文所使用的“严格条件”是指此领域中熟知的参数。核酸杂交参数可以在汇集这种方法的文献中找到，如分子克隆实验室手册，J.Sambrook等人，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约1989，或分子生物学的当前方案，F.M.Ausubel等人编辑，JohnWiley & Sons有限公司，纽约。示例的严格条件包括在65摄氏度杂交缓冲液(3.5×SSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清清蛋白，25mM NaH2PO4(pH7)，0.5％SDS，2mMEDTA)中杂交。SSC是0.15M氯化钠/0.015M柠檬酸钠，pH7；SDS是十二烷基硫酸钠；EDTA是乙二胺四乙酸。杂交后，可以冲洗DNA转移到其上的膜，如，在室温用2×SSC，然后在室温到68摄氏度用0.1-0.5×SSC/0.1×SDS。在冲洗编码MAGE-A12免疫原性多肽的DNA最终转移到其上的膜后，将膜对着X-射线胶片放置以测定放射性信号。
还有可以使用并可以产生相似严格性程度的其他条件，试剂。技术人员熟知这样的条件，因此这些条件没有在这里给出。然而可以理解认为，技术人员将能以能清楚地确定编码本发明的MAGE-A12免疫原性多肽的核酸的同系物和等位基因的方式操作这些条件。技术人员也熟知筛查表达这样的分子的细胞和文库，并且随后按常规分离，接着分离相关的核酸分子并测序的方法。
本发明还包括包括编码MAGE-A12免疫原性多肽的相同氨基酸残基的可变密码子的核酸序列的应用。例如，如本文所公开的，肽VRIGHLYIL(SEQ ID NO4)是MAGE-A12 HLA结合肽。亮氨酸残基可以由密码子CUA，CUC，CUG，CUU，UUA和UUG编码。六个密码子的每一个对于编码亮氨酸残基是等同物。因此，对此领域中的普通技术人员来说显然的是，任何亮氨酸-编码核苷酸三联体都可以用来定向蛋白质合成装置，体内或体外掺入亮氨酸。类似地，编码包括SEQ ID NO4的MGAE-A12 HLA结合肽的其他氨基酸残基的核苷酸序列三联体包括GUA，GUC，GUG和GUU(缬氨酸密码子)；GGU，GGA，GGG，GGC(甘氨酸密码子)；UGC和UAU(酪氨酸密码子)。其他氨基酸残基可以通过多种核苷酸序列类似地编码。因此，本发明包括由于遗传密码子的简并在密码子序列方面不同于天然MAGE-A12免疫原性多肽编码核酸的简并核酸。
优选的编码MAGE-A12多肽的核酸是优选地表达MAGE-A12免疫原性多肽，如本文所描述的HLA结合肽的核酸。本发明的MAGE-A12核酸不编码全部MAGE-A12多肽，但确实包括编码MAGE-A12 HLA结合肽的核苷酸序列。
本发明还提供了包括添加，替换和缺失一个或多个核苷酸的修饰核酸分子。在优选实施方案中，这些修饰的核酸和/或其编码的多肽保持至少一种未修饰核酸分子和/或多肽的活性或功能，如抗原性，酶活性，受体结合，通过MHC I类和II类分子结合肽形成的复合物，等等。在某些实施方案中，修饰的核酸分子编码修饰的多肽，优选地多肽含有如本文别处所描述的保守性氨基酸替换。修饰的核酸分子结构上与未修饰的核酸分子相关，并且在优选实施方案中，修饰的核酸分子在结构上充分地与未修饰的核酸分子相关，这样在此领域中的技术人员熟知的严格条件下修饰核酸和未修饰核酸分子杂交。
例如，可以制备编码具有单一氨基酸变化的多肽的修饰核酸分子(例如，优选地不是那些是HLA结合接触点的氨基酸)。这些核酸分子的每一种除了对应于本文所描述的遗传密码子的简并的核苷酸变化外可以具有一个，两个或三个核苷酸替换。同样地，编码含有两个氨基酸变化的多肽的修饰的核酸分子可以制备，这样的核酸分子具有如2-6个核苷酸变化。此领域中的技术人员可以方便地预想到和这些核酸相同的多种修饰的核酸，包括如在编码氨基酸2和3，2和4，2和5，2和6的密码子中核苷酸的替换，等等。在前述实施例中，两种氨基酸的每种组合都包括在修饰核酸分子，以及编码氨基酸替换的所有核苷酸替换的组中。如此领域中的普通技术人员可方便地预想到的，编码具有其他替换(即，3个或多个)的，添加或缺失(如，通过引入终止密码子或剪接位点)的多肽的其他核酸分子也可制备，并包括在本发明中。任何前述的核酸或多肽都可通过常规实验测定对于本文所公开的核酸和/或多肽的结构相关性和活性的保持。
同样可以理解的是，本发明包括在表达载体中使用序列，以及转染宿主细胞和细胞系，如原核细胞(E.coli)，或真核细胞(如，树状细胞，CHO细胞，COS细胞，酵母表达系统以及昆虫细胞中重组体杆状病毒表达)。表达载体需要相关序列，即，上面所描述的那些与启动子可操作结合。另外，已发现人类HLA-Cw*07分子呈递MAGE-A12 HLA I类结合肽，表达载体也可以包括编码HLA-Cw*07分子的核酸序列。(对于其他I类或II类结合肽，可以使用不同的HLA分子。)在载体包括两种编码序列的情况中，载体可以用来转染没有正常表达任何一个的细胞。当宿主细胞已经表达HLA-Cw*07分子时，MAGE-A12HLA I类结合肽编码序列可以单独使用。当然，如果需要，对能用作为含有可以使用在没有表达HLA-Cw*07分子的宿主细胞中的两个编码序列的载体的具体宿主细胞是没有限制的，并且编码MAGE-A12 HLA I类结合肽的核酸也可以使用在表达HLA-Cw*07分子的抗原呈递细胞中。如本文所使用的，“HLA-CW*07分子”包括亚型HLA-Cw*0701(07011，07012)，0702，0703，0704，0705，0706，0707，0708，0709，0710，0711，0712，0713和0714。HLA-Cw*07分子也包括能在Bodmer等人，组织抗原49297，1996中可以找到的亚型。目前确定的HLA-Cw*07亚型清单可以在国际互联网URL http//www.ebi.ac.uk/imgt/hla/中的IMGT/HLA数据库中找到。
同样可以理解的是，本发明包括在表达载体中使用序列，表达载体包括重组体质粒，噬菌粒，病毒等，以及使用序列转染宿主细胞和细胞种系，如原核细胞(E.coli)，或真核细胞(如，树状细胞，CHO细胞，COS细胞，酵母表达系统以及昆虫细胞中重组体杆状病毒表达)。。表达载体需要相关序列，即，上面所描述的那些与启动子可操作结合。含有MAGE-A12序列的表达载体在体内或体外的输送可以通过此领域中已知的核酸输送系统(参看，如Allsopp等人，欧洲免疫学期刊，26(8)1951-1959，1996)。包括从下列病毒组中选取的病毒的重组体载体可以使用在这样的输送系统中，如可用作为疫苗，病毒组包括腺病毒，腺相关病毒，痘病毒(包括疫苗病毒和减毒痘病毒如NYVAC)，Semliki Forest病毒，Venezuelan马脑炎(Venezuelan equineencephalitis)病毒，逆转录病毒，Sindbis病毒，和Ty类病毒颗粒，质粒(如“裸”DNA)，细菌。其他病毒，表达载体和用来制备疫苗的类似物对此领域中的普通技术人员是已知的。MAGE-A12输送系统可以在标准模式系统中测试，如鼠中，以确定输送系统的有效性。系统也可以在人类临床实验中测试。
此外，非-MAGE-A12肿瘤相关肽也可以服用以增加通过HLA I类和/或II类的免疫应答。已经充分确定癌症可以表达不止一种肿瘤相关基因。对于此领域中的普通技术人员来说，确定具体受试体是否表达其他肿瘤相关基因属于常规实验范围内，并且包括从这种基因在MAGE-A12组合物和疫苗中的表达产品衍生的HLA I和/或HLA II类结合肽。
特别优选的是编码系列抗原表位(称为“多表位”)的核酸。多个抗原表位可以以连续方式或重叠方式排列(参看如，Thomoson等人，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 925845-5849，1995；Gilbert等人，Nature Biotechnol.151280-1284，1997)，有或没有天然的侧翼序列，如果需要表位可以被不相关的接头序列间隔。将多表位加工成由免疫系统识别来产生免疫应答的产物个体表位。
因此，由MHC分子呈递并由CTL(或T辅助性淋巴细胞)识别的MAGE-A12 HLA结合肽，如SEQ ID NO4，5和6，可以与从其他肿瘤排斥抗原(如通过制备杂交核酸或多肽)获得的肽组合以形成“多表位”。能服用来诱导或增强免疫应答的示例肿瘤相关肽是从肿瘤相关基因和编码的蛋白质衍生，包括MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A5，MAGE-A6，MAGE-A7，MAGE-A8，MAGE-A9，MAGE-A10，MAGE-A11，MAGE-A12，GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7，GAGE-8，GAGE-9，BAGE-1，RAGE-1，LB33/MUM-1，PRAME，NAG，MAGE-Xp2(MAGE-B2)，MAGE-Xp3(MAGE-B3)，MAGE-Xp4(MAGE-B4)，酪氨酸酶，脑糖原磷酸化酶，Melan-A，MAGE-C1，MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-C4，MAGE-C5，NY-ESO-1，LAGE-1，SSX-1，SSX-2(HOM-MEL-40)，SSX-1，SSX-4，SSX-5，SCP-1和CT-7。例如，肿瘤特点的抗原肽包括下面表I中所列出的。
表I示例抗原
HLA I类HLA II类结合肽的其他实例对此领域中的普通技术人员是已知的(如，参看Coulie，干细胞13393-403，1995)，并可以以本文所描述的类似方式使用在本发明中。根据分子生物学的标准方法，此领域中的普通技术人员可以制备包括一个或多个MAGE-A12肽和一个或多个前述肿瘤排斥肽，或编码这种多肽的核酸的多肽。
因此，多表位是能以多种排列结合在一起的(如多联的，重叠的)两种或多种可能的免疫原性或免疫应答刺激肽的组。多表位(或编码多表位的核酸)可以用标准免疫方案服用，如给动物服用，以测试多表位在刺激，增强和/或促进免疫应答方面的有效性。
可以直接结合在一起或通过使用侧翼序列结合在一起的形成多表位的肽，以及使用多表位作为疫苗在此领域中是众所周知的(参看，如Thomson等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA92(13)5845-5849；Gilbert等人，Nature Biotechnol.15(12)1280-1284，1997；Thomson等人，免疫学期刊，157(2)822-826，1996；Tem等人，J.Exp.Med 171(1)299-306，1990)。例如，Tam显示包括MHC I类和II类结合表位的多表位在鼠模型中成功地产生抗体和保护性免疫。Tam还演示了包括表位“串”的多表位加工产生有MHC分子呈递并由CTL识别的个体抗原表位。因此，含有不同数量和组合的抗原表位的多表位可以制备，并测试CTL的识别作用，以及测试在增加免疫应答中的有效性。
众所周知，肿瘤表达了一组肿瘤抗原，其中仅某些亚组可以在任何给定的患者的肿瘤中表达。可以制备对应于代表在具体患者中表达的肿瘤排斥抗原亚组的抗原表位的不同组合的多表位。也可以制备反映宽光谱的已知要由一肿瘤类型表达的肿瘤排斥抗原的多表位。多表位可以引入到需要这种治疗如多肽结构的患者中，如通过使用此领域中已知的核酸输送系统(参看，如Allsopp等人，欧洲免疫学期刊，26(8)1951-1959，1996)。腺病毒，痘病毒，Ty-病毒类颗粒，腺相关病毒，质粒，细菌等可以使用在这样的输送系统中。可以在鼠模型中测试多表位输送系统以确定输送系统的有效性。系统也可以在人类临床实验中测试。
如已经发现的，人类HLA-Cw*07分子呈递MAGE-A12免疫原性多肽，表达载体也可以包括编码HLA-Cw*07分子的核酸序列。编码包括与HLA-Cw*07融合的MAGE-A12免疫原性肽的单链可溶HLA/肽复合物的核酸可以如lone等人的描述制备(J.Immunother.21283-294，1998)。
在载体包括两种编码序列的情况中，载体可以用来转染没有正常表达任何一个的细胞。当宿主细胞已经表达HLA-Cw*07分子时，MAGE-A12 HLA I类结合肽编码序列可以单独使用。当然，如果需要，对能用作为含有可以使用在没有表达HLA-Cw*07分子的宿主细胞中的两个编码序列的载体的具体宿主细胞是没有限制的，并且编码MAGE-A12 HLA I类结合肽的核酸也可以使用在表达HLA-Cw*07分子的抗原呈递细胞中。
如本文所使用的，“载体”可以是任何数量的核酸，其中所需序列可以限制性连接插入，以在不同遗传环境之间转运或在宿主细胞中表达。尽管RNA载体也可以使用但载体通常包括DNA。载体包括但不限于，质粒，噬菌粒，细菌和如本文所描述的病毒基因组，如腺病毒，痘病毒和BCG。克隆载体是能在宿主细胞中复制的载体或是在其整合到宿主细胞基因组中后复制的载体，其进一步特点在于具有一个或多个内切核酸酶限制性位点，在其上载体可以以可确定方式被切，并且所需DNA序列可以连接到其中，这样新重组体载体保持其在宿主细胞中复制的能力。在质粒情况中，当质粒在宿主细菌中的拷贝数量增加时，所需序列的复制可以发生多次，或在宿主通过有丝分裂繁殖前每个宿主发生一次。在噬菌体情况中，复制可以在裂解阶段主动发生或在溶源阶段被动发生。表达载体是其中所需DNA序列可以限制性连接插入以使其可以可操作地与调节序列结合并能表达为RNA转录体的载体。载体可以进一步包括一种或多种适于用来鉴别已经或还没有被载体转染或转化的细胞的标记序列。标记包括，例如，编码增加或降低对抗生素或其他化合物抗性或敏感性的蛋白质的基因，编码其活性可通过此领域中已知的标准测试法检测的酶的基因(如，β-版乳糖苷酶，荧光素酶或碱性磷酸酶)，以及其明显影响转化的或转染的细胞，宿主，集落或噬菌体(如，绿荧光蛋白质)的显型的基因。优选的载体是能自身复制并表达呈递在与它们可操作结合的DNA片段中的结构基因产物的载体。
如本文所使用的，当编码序列和调节序列以将编码序列的表达或转录置于调节序列的控制和影响之下的方式共价结合时，编码序列和调节序列是“可操作地”结合的。如果需要将编码序列翻译到功能蛋白质中，如果5’调节序列中的启动子的诱导产生编码序列的转录，并且如果两个DNA序列之间的连接的没有(1)产生移码突变引入，(2)干扰启动子区域指导编码序列的转录的能力，(3)干扰相应的RNA转录体被翻译到蛋白质中的能力，两个DNA序列可以说是可操作地结合了。因此，如果启动子区域能影响DNA序列的转录以使产物转录体可能被翻译到所需的蛋白质或多肽中，那么启动子区域于编码序列可操作地结合了。如上面指出的，某些优选的核酸仅表达包括本文所描述的HLA结合肽的MAGE-A12多肽片段。
基因表达所需的调节序列的精确性质可以在物种或细胞种类之间变化，但是通常应包括，分别与转录和翻译有关的5’-非转录序列和5’-非翻译序列，如TATA框，帽序列，CAAT序列等等。特别地，5’-非转录调节序列将包括含有可操作结合的基因转录控制的启动子序列的启动子区域。调节序列也可以按所需包括增强子序列或上游激活物序列。本发明的载体可以任意地包括5’前导序列或信号序列。选择及设计适合的载体属于此领域中普通技术人员的能力范围。
含有表达需要的所有必需因子的表达载体可以购得，并且对此领域中的技术人员是众所周知的。参看，如Sambrook等人，分子克隆“实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，1989。通过将编码MAGE-A12免疫原性多肽的异源DNA(RNA)引入到细胞中对细胞进行遗传工程设计。将异源DNA(RNA)置于转录因子可操作控制下以使异源DNA在宿主细胞中表达。
mRNA在哺乳动物细胞中表达的优选系统是如pcDNA3.1(从Invitrogen，Carlsbad，CA获得)，其含有可选取的标记如具有G418抗性(有利于选取稳定转染的细胞种系)的基因以及人类巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子序列。因此，适于在灵长类或犬科动物中表达的是pCEP4载体(Invitrogen)，其含有Epstein Barr病毒(EBV)复制起点，有利于将质粒保持为多拷贝染色体外遗传因子。另一种表达载体是含多肽延长因子1α启动子的pEF-BOS质粒，其有效地刺激体外转录。该质粒由Mishizuma和Nagata(Nuc.Acids Res.185322，1990)描述，其在转染试验中的应用由如Demoulin(分子细胞生物学，164710-4716，1996)公开。其他优选表达载体是由Stratford-Perricaudet描述的腺病毒，其缺少E1和E3蛋白质(J.Clin.Invest.90626-630，1992)。使用腺病毒表达蛋白质进行免疫接种由Warnier等人描述，使用在鼠科动物中皮下注射进行抗P1A免疫接种(Int.J.Cancer，67303-310，1996)。
本发明还包括所谓的表达试剂盒，表达试剂盒使得技术人员能制备所需的表达载体或多种表达载体。这样的表达试剂盒包括至少分离的至少两种前面讨论的物质。其他组成可以按需要加入。
如本文所描述的，本发明具有多种用途，本文描述其中的一部分。首先，使技术人员能诊断特点在于表达MAGE-A12免疫原性多肽的病变。这些方法包括在生物样品中确定MAGE-A12 HLA结合肽的表达，或确定MAGE-A12 HLA结合肽和HLA I类分子的复合物的表达。肽的表达或肽和HLA I类分子复合物的表达可以通过用肽或复合物的结合组对，如抗体的测试来确定。在生物样品(如肿瘤生物切片)中MAGE-A12的表达也可通过使用MAGE-A12引物的标准PCR扩增法来测定。肿瘤表达的实施例本文提供了，MAGE-A12扩增的进一步的示例条件和引物可在美国序列号No.09/018,422文献中找到。
优选地，诊断方法包括将从受试体分离的生物样品与对MAGE-A12 HLA结合肽特异的试剂接触，以检测在生物样品中存在MAGE-A12 HLA结合肽。如本文所使用的，“接触”意指在适当的条件(如浓度，温度，时间，离子强度)下将生物样品充分接近试剂放置，以使试剂和存在于生物样品中的MAGE-A12 HLA结合肽之间发生相互作用。通常，将试剂于生物样品接触的条件是此领域中的技术人员已知的有利于生物样品中的分子和其关联物(如蛋白质和器受体关联物，抗体和其蛋白质抗原关联物，核酸和其互补序列关联物)之间的特异相互作用的条件。有利于分子和其关联物之间的特异相互作用的示例条件在颁给Low等人的美国专利No.5,108,921中描述。
生物样品可以固定在体内或体外。例如，生物样品可以是体内的组织，对MAGE-A12免疫原性多肽特异的试剂可用来检测在组织中存在这样的分子。可替换地，生物样品可以在体外固定(如血液样品，肿瘤切片，组织提取物)。在特别优选的实施方案中，生物样品是含细胞样品，更优选的是含肿瘤细胞的样品。
本发明进一步包括核酸或包括MAGE-A12 HLA结合肽或编码这种肽的核酸的蛋白质微排列。在本发明的这个方面中，微排列技术的标准技术可用来评定MAGE-A12 HLA结合肽的表达和/或鉴别结合这种肽的生物组成。生物样品的组成包括抗体，HLA分子，淋巴细胞(特别是T淋巴细胞)，等等。微排列技术，其也被称为其他名称，包括蛋白质碎片技术(protein chiptechnology)和固相蛋白质排列技术，是此领域中的普通技术人员众所周知的，其依据但不限于，在固定底物上获得鉴别的肽或蛋白质的排列，将靶分子或生物组成与肽结合，评定这样的结合。参看，如G.MacBeath和S.L.Schreiber，“Printing Proteins asMicroarrays for High-Throughput Function Determination，”科学，289(5485)1760-1763，2000年。核酸排列，特别是结合MAGE-A12 HLA结合肽的排列相似法则也可用来诊断。如用来鉴别患有特点在于MAGE-A12 HLA结合肽表达的病况的受试体。
微排列底物包括但不限于，玻璃，硅，铝矽酸盐，硼硅酸盐，金属氧化物如氧化铝和氧化镍，多种粘土，硝化纤维，或尼龙。微排列底物可以用化合物涂覆，以增强在底物上探针的合成(肽或核酸)。在底物上的偶联试剂或试剂组可以用来将第一核苷酸或氨基酸共价结合到底物上。多种偶联试剂或试剂组对此领域中的介技术人员是众所周知的。肽或核酸探针可以以预定载网直接合成到底物上。或者，肽或核酸可以点定在底物上，在这样的情况中，底物可以用化合物涂覆以增强探针与底物的结合。在这些实施方案中，预先合成的探针可以以精确的，预定的量和载网模式涂抹在底物上，优选地使用计算机控制的机器人将探针以接触-印制方式或以非接触方式(如喷墨或压电式-电子输送方式)涂抹在底物上。探针可以与底物共价结合。
在一些实施方案中，一种或多种对照肽或核酸分子附着在底物上。优选地，对照核酸分子可以确定如结合特性，试剂质量和有效性，杂交成功率以及分析极限值和成功率等因素。
本发明还使技术人员能治疗患有特点在于表达MAGE-A12免疫原性多肽的病变的受试体。治疗包括服用增加受试体体内MAGE-A12 HLA结合肽和HLA I类分子的复合物的试剂，以及服用对这种复合物特异的CD8+T淋巴细胞。使用在前述治疗中的试剂包括MAGE-A12免疫原性多肽和其功能变体，这样的肽和HLA I类结合分子(如HLA Cw*07)的复合物，带有MAGE-A12免疫原性多肽和HLA I类结合分子的复合物的抗原呈递细胞，HLA和MAGE-A12多肽的可溶单链融合物，等等。本发明还使技术人员能选择性地增加T淋巴细胞群，对MAGE-A12 HLA结合肽特异的CD8+T淋巴细胞。
分离MAGE-A12 HLA结合肽也使分离或设计编码MAGE-A12 HLA结合肽的核酸成为可能。核酸可以用来在体外或在原核宿主细胞中或在真核宿主细胞中制备MAGE-A12 HLA结合肽或含有这种肽的蛋白质。此领域中熟练技术人员众所周知的多种方法可以用来获得分离的MAGE-A12 HLA结合肽。例如，表达载体可以引入到细胞中以产生肽。在另一种方法中，mRNA转录物可以被显微注射到细胞中或用其他方式引入到细胞中产生编码的肽。在不含细胞的提取物中如在网状细胞裂解系统中翻译mRNA也可用来产生肽。包括本发明的MAGE-A12HLA结合肽的肽也可以在体外合成。为了获得分离的MAGE-A12 HLA结合肽，此领域中的技术人员也可方便地使用已知的分离肽的方法。这些方法包括，但不限于，免疫层析法，HPLC，大小排阻层析法，离子交换层析法和免疫亲和层析法。
这些分离的MAGE-A12 HLA结合肽，或肽和HLA I类分子如HLA-Cw*07分子的复合物，可以与如辅剂物质组合，以制备应用于治疗特点在于表达MAGE-A12免疫原性多肽的病变中的疫苗。此外，疫苗可以从在其表面上呈递MAGE-A12HLA结合肽/HLA复合物的细胞制备，如转染的树状细胞，转染的B细胞，非增殖性的转染子，等等。在所有其中细胞用作为疫苗的情况中，这些细胞可以是用编码序列转染过的具有一种或两种刺激CD8+淋巴细胞所需的组成的细胞，或可以是已经表达两种分子不需要转染的细胞。疫苗也可以包括表达载体和裸DNA或RNA，编码MAGE-A12 HLA结合肽，其前体，或其融合蛋白质，疫苗可以在体外制备并通过注射，颗粒轰击，鼻吸入以及其他方法服用。“裸核酸”类型的疫苗已经显示出能刺激免疫原性应答，包括产生对由裸核酸编码的肽特异的CTL(科学2591745-1748，1993)。
使用此领域中的标准技术，MAGE-A12 HLA结合肽，以及MAGE-A12 HLA结合肽和HLA分子的复合物，也可用来制备抗体。列出抗体生产的通用原理的标准文献著作包括Catty，D.，Antibodies，A Practical Approach(抗体，实践方法)，1卷，IRL出版社，Washington DC(1988)；Klein，J.，Immunology；The Scienceof Cell-Non-Cell Discrimination(免疫学细胞-非-细胞辨别的科学)，John Wiley and Sons，New York(1982)；Kennett，R.，等人Monoclonal Antibodies，Hybridoma，A New Dimension InBiological Analyses(单克隆抗体，杂交瘤，生物学分析中的方向)，Plenum出版社，New York(1980)；Campbell，A.，MonoclonalAntibody Technology，in Laboratory Techniques and Biochemistryand Molecular Biology(实验室技术和生物活性和分子生物学中的单克隆抗体技术，)，13卷(Burdon，R.等人EDS.)，ElsevierAmsterdam(1984)；以及Eisen，H.N.，Microbiology(微生物学)，第三版，Davis，B.D.等人EDS(Harper & Rowe，Philadelphia(1980))。
因此，本发明的抗体可以通过多种方法制备，包括给动物服用蛋白质，蛋白质片段，表达蛋白质或其片段的细胞以及适当的HLA I类分子以诱导多克隆抗体。单克隆抗体的制备可依据此领域中众所周知的技术。
值得注意的，如在此领域中众所周知的，仅小部分抗体分子(互补位)与抗体与其抗原表位的结合有关(参看，Clark，W.R.(1986)The Experimental Foundations of Modern Immunology(现在免疫学试验基础)Wiley & Sons有限公司，纽约；Roitt，I.(1991)Essential Immunology(基本免疫学)，第七版，BlackwellScientific Publications.Oxford)。例如，pFc’和Fc区域是互补级联的效应子，但与抗原结合无关。从其中pFc’区域被酶裂解的抗体，或被制备成没有pFc’区域，指定的F(ab’)2片段的抗体，保持了完整抗体的两个抗原结合位点。类似地，从其中Fc区域被酶裂解的抗体，或被制备成没有Fc区域，指定的Fab片段的抗体，保持了完整抗体的一个抗原结合位点。并且，Fab片段包括共价结合的抗体轻链和一部分抗体重链称为Fd。Fd片段是抗体特异性的主要决定因素(单一Fd片段在没有改变抗体特异性的情况下与多达10种不同的轻链有关)，Fd片段在分离中保持了抗原表位结合能力。
在抗体的抗原结合部分内，如此领域中众所周知的，有互补决定区域(CDR)，其直接与抗原的抗原表位相互作用，以及构架区域(FR)，其保持互补位的三级结构(参看，如Clark，1986；Roitt，1991)。在重链Fd片段和轻链IgG免疫球蛋白中，有四个构架区域(FR1到FR4)，分别被三个互补决定区域(CDR1到CDR3)隔开。CDR，特别是CDR3区域，更具体地是重链CDR3对抗体特异性起到很大作用。
此领域中目前已充分确定的是，在保持源抗体的抗原表位的特异性同时，哺乳动物抗体的非CDR区域可以用共同特异或不同特异抗体的类似区域来替换。这一点在发展并使用其中非人类CDR于人类FR和/或Fc/pFc’区域共价结合以产生功能抗体的“人源化”抗体中得到最清楚的证明。参看如，美国专利No4,816,567，5,225,539，5,585,089，5,693,762和5,859,205。
因此，例如PCT国际申请序列号WO92/04381教授了制备及使用至少部分鼠科动物FR区域已经被人源FR区域替换的人源化鼠科动物RSV抗体。这样的抗体，包括具有抗原结合能力的完整抗体的片段，常常都称为“嵌合”抗体。
因此，对此领域中的普通技术人员来说显然的是，本发明还提供了F(ab)2，Fab，Fv和Fd片段；其中Fc和/或FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域已经被同源人类或非人类序列替换的嵌合抗体；其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域已经被同源人类或非人类序列替换的嵌合F(ab)2片段抗体；其中FR和/或CDR1和/或CDR2和/或轻链CDR3区域已经被同源人类或非人类序列替换的嵌合Fab片段抗体；其中FR和/或CDR1和/或CDR2区域已经被同源人类或非人类序列替换的嵌合Fd片段抗体。本发明还包括所谓的单链抗体和人类单克隆抗体，如由具有功能人类免疫球蛋白基因座的鼠科动物产生的抗体。
这样的抗体可用来鉴别表达蛋白质的组织或用来提纯蛋白质。为了治疗抗体也可以与用来成像的特异标记试剂偶联或与抗肿瘤试剂偶联，包括但不限于，氨甲叶酸，放射性碘标记化合物，毒素如蓖麻毒素，其他细胞抑制药物或细胞溶解药物，等等。依据本发明制备的抗体同样优选地对本文所描述的肽/HLA复合物特异。
当本文使用“病变”或“病况”时，是指其中MAGE-A12免疫原性多肽表达的任何病理状况。这样的病变包括癌症，包括膀胱癌，恶性黑素瘤，食道癌，肺癌，头部和颈部癌症，乳癌，结肠癌，骨髓瘤，脑肿瘤，恶性肉瘤，前列腺癌和肾癌。依据公开内容的一些治疗方法的前提是诱导受试体的免疫系统对MAGE-A12免疫原性多肽呈递细胞的应答。一种这样的方法是给怀疑患有异常细胞显型的受试体服用对MAGE-A12 HLA结合肽和HLA I类分子的复合物特异的自身CD8+T细胞。在体外发展这种CD8+T细胞在技术人员的技能范围内。通常，将从受试体获得的样品细胞如血细胞与呈递复合物并能刺激CD8+T淋巴细胞增殖的细胞接触。靶细胞可以是转染子，如转染的COS细胞，或转染的带有HLA I类分子的抗原呈递细胞，如树状细胞或B细胞。这些转染子在它们的表面转染所需的复合物，并且当与有兴趣的CD8+T淋巴细胞结合时，刺激其增殖。COS细胞是广泛使用的其他合适的宿主细胞。然后给受试体服用克隆扩展的自身CD8+T淋巴细胞。CD8+T淋巴细胞刺激受试体的免疫应答，从而达到所需的治疗目的。
选取抗原-特异CTL克隆体的另一种方法已有描述(Altman等人，科学27494-96，1996；Dunbar等人，Curr.Biol.8413-416，1998)，其中使用MHC I类分子/肽复合物的荧光团四聚体来检测特异CTL克隆体。简单地，将可溶MHC I类分子在体外在β2-微小球蛋白和结合I类分子的肽抗原中折叠。提纯后，将MHC/肽复合物提纯并用生物素标记。通过将生物素化的肽-MHC复合物与标记的抗生物素蛋白(如藻红蛋白)以摩尔比率4∶1混合制备四聚体。然后将四聚体与CTL源接触如外周血液或淋巴节。四聚体结合识别肽抗原/MHC I类复合物的CTL。由四聚体结合的细胞可通过荧光激活细胞分选仪分选以分离活性CTL。然后分离的CTL可在体外扩展进行如上所描述的应用。
为了详细描述治疗方法，称为过继转移的方法(Grenberg，J.Immunol.136(5)1917，1986；Riddel等人，科学257238，1992；Lynch等人，欧洲免疫学期刊，211403-1410，1991；Kast等人，细胞59603-614，1989)，呈递所需复合物的细胞与CTL接触，导致对其特异的CTL增殖。然后将增殖的CTL给患有细胞异常的受试体服用，细胞异常的特点在于某些呈递具体复合物的细胞异常。CTL裂解异常细胞，从而达到所需的治疗目的。
前述治疗法假定，至少一些受试体的异常细胞呈递相关的HLA/TRA复合物。这一点很容易确定，由于此领域非常熟悉鉴别呈递具体HLA分子的细胞的方法，以及如何鉴别表达呈递有关序列DNA的细胞，在这种情况中相关序列是肿瘤相关基因序列。一旦通过前述筛查技术鉴别出呈递相关复合物的细胞，这些细胞可以与从患者获得的样品结合，其中样品含有CTL。如果复合物呈递细胞被混合CTL样品裂解，就可以假定肿瘤相关基因衍生的TRA存在，受试体是上述治疗方法的合适候选人。
过继转移不是本发明仅能使用的治疗法。CD8+T淋巴细胞也可以使用多种方法在体内刺激。一种方法是使用非增殖性细胞表达复合物。使用在这种方法中的细胞可以是正常表达复合物的细胞，它们可以是树状细胞或用一种或两种呈递复合物所需的基因转染的细胞。Chen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA88110-114，1991)示例说明了这种方法，显示在治疗法中使用转染的细胞表达HPV-E7肽。可以使用多种细胞种类。类似地，带有一种或两种有兴趣基因的载体也可以使用。病毒或细菌载体是特别优选的。例如，编码MAGE-A12 HLA结合肽的核酸可以与指导MAGE-A12 HLA结合肽在某些组织或细胞种类中的表达的启动子和增强子序列可操作地结合。核酸可以掺入到表达载体中。表达载体可以是未修饰的染色体外核酸，质粒或构建或修饰能插入外源核酸(如编码MAGE-A12 HLA结合肽的核酸)的病毒基因组。编码MAGE-A12 HLA结合肽的核酸也可以插入到逆转录病毒基因组中，这样有利于将核酸整合到靶组织或细胞种类的基因组中。在这些系统中，有兴趣的由微生物携带，如疫苗病毒，逆转录病毒或细菌BCG，以及事实上“感染”宿主细胞的物质。呈递兴趣复合物的细胞，由自身CD8+T细胞识别，接着增殖。
通过将MAGE-A12 HLA结合肽与辅剂结合以促使其在体内掺入到HLA I类呈递细胞中可以获得相似的效果。如果MAGE-A12 HLA结合肽大于HLA I类结合部分，如果需要可加工MAGE-A12HLA结合肽，以产生HLA分子的肽组对，当TRA呈递时不需要作进一步加工。通常，受试体可皮下注射有效量的MAGE-A12免疫原性多肽。根据此领域中的标准免疫接种方案，初始剂量可接着推进剂量。
作为某些免疫接种组合物的组成，一种或多种癌症相关抗原或其刺激性片段可以与一种或多种辅剂一起服用，以诱导免疫应答或增加免疫应答。辅剂是掺入到加强免疫应答的抗原中或与加强免疫应答的抗原一起服用的物质。辅剂可以通过提供抗原贮槽(如在细胞外或巨噬细胞内)，活化巨噬细胞以及刺激特异组淋巴细胞来增强免疫原性应答。许多种辅剂在此领域中是众所周知的。辅剂的具体实例包括单磷酰脂质A(MPL，SmithKline Beecham)，Salmonella minnesota Re595脂多糖酸水解及提纯后获得的同种物；皂角苷，包括QS21(SmithKlineBeecham)，从Quillaja saponaria提取物中提纯的纯QA-21皂角苷；在PCT申请WO96/33739中描述的DQS21(SmithKlineBeecham)，QS-7，QS-17，QS-18，和QS-L1(So等人，分子细胞7178-186，1997)；不完全Freund辅剂；完全Freund辅剂；montanide；免疫刺激性寡聚核苷酸(参看如，Kreig等人在自然374546-9，1995中描述的CpG寡聚核苷酸)；多种从生物可降解油(如鲨烯和/或维生素E)中制备的油包水乳液。优选地，肽与DQS21/MPL混合一起服用，DQS21与MPL的比率一般为约1∶10到10∶1，优选的为约1∶5到5∶1，更优选的为约1∶1。一般对于人类服用，DQS21和MPL存在于疫苗配方中，范围在约1ug到约10ug。其他辅剂也是此领域中已知的，并且可以使用在本发明中(参看，如Goding，单克隆抗体原理与实践，第二版1986)。制备肽和辅剂的混合物或乳液的方法对疫苗领域中的普通技术人员是众所周知的。
刺激受试体的免疫应答的其他试剂也可以给受试体服用。例如，由于其他细胞因子的淋巴细胞调节属性，它们也可以使用在疫苗方案中。许多用于这种目的的其他细胞因子对此领域中的普通技术人员是众所周知的，包括已显示能增强疫苗的保护性效果的白细胞介素-12(IL-12)(参看如，科学2681432-1434，1995)，GM-CSF和IL-18。因此，细胞因子可以与抗原和辅剂结合服用以增加对抗原的免疫应答。
有许多可以使用在疫苗方案中的其他免疫应答增强化合物。这些化合物包括以多种或者核酸形式提供的共同刺激分子。这样的共同刺激分子包括B7-1和B7-2(分别为CD80和CD86)，其表达在树状细胞(DC)上并与表达在T细胞上的CD28分子相互作用。这种相互作用提供对抗原/MHC/TCR刺激的(信号1)T细胞的共同刺激(信号2)，增加T细胞增殖和效应子功能。B7也与T细胞上的CTLA4(CD152)相互作用，有关CTLA4和B7配体的研究显示B7-CTLA4之间的相互作用能增强抗肿瘤免疫性和CTL增殖(Zheng，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA956284-6289，1998)。
B7通常不表达在肿瘤细胞上，所以对于T细胞它们不是有效的抗原呈递细胞(APC)。诱导B7表达将能更有效地刺激CTL增殖以及效应子功能。B7/IL-6/IL-12共同刺激的组合已显示出能诱导IFN-γ和Th1细胞因子在T细胞群中的分布，致使进一步增强T细胞活性(Gajewski等人，免疫性期刊，1545637-5648，1995)。Wang等人(J.Immnother.191-8，1996)已经在体外CTL扩展以进行过继转移中讨论了用B7转染肿瘤细胞。B7分子的其他输送系统将包括核酸(裸DNA)免疫接种(Kim等人，Nature Biotechnol.157641-646，1997)和重组体病毒如腺病毒和痘病毒(Kim等人，Gene Ther.4726-735，1997)。这些系统也适合用于B7与其他选取的分子如本文所讨论的抗原或抗原片段(包括多表位)或细胞因子共表达的表达盒的应用和构建中。这些输送系统可用来体外诱导适当的分子以及使用在体内疫苗接种情况中。使使用抗-CD28抗体体内和体外直接刺激T细胞也可以考虑。类似地，诱导T细胞对外源抗原应答的可诱导共同刺激性分子ICOS也可以被调制，例如通过使用抗-ICOS抗体(Hutloff等人，自然397263-266，199)。
淋巴细胞功能相关抗原-3(LFA-3)表达在APC和一些肿瘤细胞上，并且与T细胞上表达的CD2相互作用。这种相互作用诱导T细胞IL-2和IFN-γ产生，并因此能互补单不替换，B7/CD28共同刺激相互作用(Parra等人，免疫性期刊，158637-642，1997；Fenton等人，J.Immunother.2195-108，1998)。
淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)表达在白细胞上，并且与在APC和一些肿瘤细胞上表达的ICAM-1相互作用。这种相互作用诱导T细胞IL-2和IFN-γ产生，并因此能互补单不替换，B7/CD28共同刺激相互作用(Fenton等人，1998)。因此，LFA-1是能在上面讨论的B7的免疫接种方案中以多种方式提供的共同刺激分子的另一个实例。
完全CTL活化作用和效应子功能需要通过Th细胞CD40L(CD40配体)分子和由DC表达的CD40分子之间的相互作用的Th细胞辅助(Ridge等人，自然393474，1998；Bennett等人，自然393478，1998；Schoenberger等人，自然393480，1998)。这种共同刺激信号的机理可能包括B7正调节和由DC(APC)产生的相关的IL-6/IL-12。因此，CD-40-CD40L相互作用互补信号1(抗原/MGC-TCR)和信号2(B7-CD28)相互作用。
使用抗-CD40抗体来直接刺激CD细胞预计能增强对肿瘤相关抗原的应答，肿瘤相关抗原通常在炎性环境外遇到，或由非-专职APC(肿瘤细胞)呈递。在这些情况中，Th辅助性和B7共同刺激信号没有提供。这种机理可以使用在抗原脉冲DC基治疗法中，或使用在Th表位还没有限定在已知肿瘤相关抗原前体内的情况中。
当服用时，本发明的医用组合物以药学上可接受的制备品来服用。这样的制备品可以按常规含有药学上可接受的浓度的盐，缓冲试剂，防腐剂，相容载体，补充免疫增强试剂，如辅剂和细胞因子，以及任意其他治疗试剂。“药学上可接受的”意指不会干扰活性成分的生物活性的有效性的无-毒性物质。载体的特点将取决于服用途径。
本发明的治疗物可通过任何传统途径服用，包括注射或通过一段时间渐增灌注。用药可以是口服用药，静脉内用药，腹腔内用药，肌肉内用药，鼻内用药，腔内用药，皮下用药，真皮内用药或经皮用药。
非肠道用药的制备品包括无菌水溶液或非水溶液，悬浮液和乳液。非水溶剂的实例包括丙二醇，聚乙二醇，植物油如棕榈油，和可注射有机酯，如油酸乙酯。水溶载体包括水，乙醇/水溶液，乳液或悬浮液。包括盐水和缓冲介质。注射载体包括氯化钠溶液，Ringer右旋糖，右旋糖和氯化钠，乳酸化的Ringer溶液或固定油。静脉内用药载体包括液体和营养补充物，电解液补充物(如基于Ringer右旋糖的补充物)，等等。防腐剂和其他添加剂也可以存在，如抗微生物，抗氧化剂，螯合剂，和惰性气体等等。
本发明还考虑到了基因治疗。体外实施基因治疗的方法在美国专利No.5,399,346中以及在该专利的提交过程中提交的展示品中描述，所有文献都是公众可获得的文件。通常，基因治疗包括在体外将基因的功能拷贝引入到含有该基因的有缺陷拷贝的受试体的细胞中，然后将遗传工程设计的细胞返回到受试体中。基因的功能拷贝是在使得基因在遗传工程设计细胞中表达的调节因子的可操作控制之下的。许多转染和转导技术以及适当的表达载体对此领域中的普通技术人员来说是众所周知的，一些这样的技术在PCT申请WO95/00654中描述。依据本发明，使用载体如腺病毒的体内基因治疗也考虑到了。
本发明的制备品以有效量服用。有效量是指单独或与进一步的剂量一起能刺激所需的应答的药物制备品的量。在治疗癌症的情况中，所需的应答是抑制癌症的发展。这可以仅包括临时减缓疾病的发展，虽然更优选地，包括长久地停止疾病的发展。在诱导免疫应答的情况中，所需的应答是增加对使用的MAGE-A12免疫原特异的抗体或T淋巴细胞。这些所需的应答可以通过常规方法监测，或可以根据本文描述的本发明的诊断方法来监测。
在需要使用本发明的医用组合物刺激免疫应答的情况中，这也可以包括刺激体液抗体应答，体液抗体应答导致血清中抗体滴定度增加，细胞毒性淋巴细胞的克隆表达，或一些其他的所需的免疫原性应答。可以相信认为，范围在1纳克/千克到100毫克/千克的免疫原剂量将是有效的，免疫原的剂量取决于服用方式。优选的范围相信在500纳克到500毫克/千克之间。绝对量取决于多种因素，包括所选取的服用物质，服用是单一剂型还是多剂型，以及个体患者参数，包括年龄，身体状况，体型大小，体重，以及疾病的阶段。这些因素对此领域中的普通技术人员是众所周知的，并且通过常规实验就可获得。
实施例物料和方法细胞种系从65岁的高加索人患者的初期侵入膀胱肿瘤(pT3，G3)衍生膀胱癌细胞种系LB831-BLC，LB831(HLA-A*2403，-A3，-B*4403，-B*4901，-Cw*0401，-Cw*07)。在传代7表现的细胞种系染色质组型显示染色体数量在56到144个变化，证实LB831细胞种系是肿瘤种系。MI13443-MEL是恶性黑素瘤细胞种系，LE9211-RCC是肾癌细胞种系。两个种系都是从HLA-Cw7-阴性患者中衍生的。LB373-MEL是从HLA-Cw7-阴性患者衍生的恶性黑素瘤种系。将肿瘤细胞在8％二氧化碳的温育器中在含有10％人血清或10％FCS(Life Technologies)的Iscove培养基(Life Technologies，Gaithersburg，MD)中培养。使用标准技术使用1ug/毫升的环孢菌素A(Cyclosporine A)(Sandoz，Basel，Switzerland)和20％(体积比)EBV转染的B95-8细胞的上清液从患者LB831的PBL衍生成淋巴细胞(lymphoblastoid)细胞种系LB-831-EBV。将这种细胞种系在5％二氧化碳的温育器中在含有10％FCS的RPMI-1640培养基(Life Technologies)中生长。通过用1.0％(体积比)PHA(Difco)和100U/毫升IL-2(Eurocetus，Amsterdam，Netherlands)刺激PBL制备PBL-PHA细胞，并将PBL-PHA细胞在8％二氧化碳的温育器中在含有10％人血清的Iscove培养基中培养。所有介质中补充加入L-精氨酸(116ug/毫升)，L-天冬酰胺(36ug/毫升)，L-谷氨酰胺(216ug/毫升)，链霉素(0.1毫克/毫升)和青霉素(200U/毫升)。
抗肿瘤CTL克隆体使用Lymphoprep(Nycomed，Oslo，Norway)密度梯度离心作用将患者LB831的血液单核细胞分离并保存在-80摄氏度下。如以前所描述的(Gueguen等人，免疫学期刊1606188-6194，1998)，将作为刺激物的照射过的B7-1转染LB831-BLC细胞和作为应答物的CD8+T淋巴细胞混合来实施自身混合淋巴细胞-肿瘤细胞培养。用与抗-CD8抗体(MACS，Miltenyi BiotecGmbH)共价结合的磁珠将CD8+T淋巴细胞分选。在第一次刺激中将照射过的非-CD8+细胞加入到混合的培养物中。在第三天，加入IL-2(25U/毫升)。在一周后，用照射过的B7-1转染的肿瘤细胞和25U/毫升的IL-2重新刺激5×105淋巴细胞。在第28天，通过在补充IL-2(50U/毫升)的Iscove培养基中有限稀释从培养物中获得的淋巴细胞。如以前所描述的(Herin等人，Int.J.Cancer39390-396，1987)实施CTL克隆体长期培养。
细胞毒性测试如以前所描述的(Boon等人，J.Exp.Med.1521184-1193，1980)，在铬释放测试中检测CTL的裂解活性。简单地，将100ul中的1000个铬标记的细胞在96-培养皿微型板中以不同的效应子与靶比率与等体积的CTL一起温育。测定温育四个小时后的铬释放。为了进行肽测试，将标记LB831-EBV细胞在37摄氏度与不同浓度的肽一起温育30分钟。然后加入CTL，如上所述测定铬释放/CTL刺激作用测定将总量3000个CTL加入到含有10000个刺激物细胞(在补充有10％人血清和25U/毫升的IL-2的Iscove培养基中)微型培养皿中。24小时后，收集上清液，通过在MTT集落计量测试(Hansen等人，J.Immunol.Meth.119203-210，1989)中测定对WEHI-164克隆体13个细胞的细胞毒性作用来确定上清液的TNF含量(Espevik和Nissen-Meyer，J.Immunol.Methods 9599-105，1986)。通过在测试中加入1/20-1/30稀释的腹水，用mAbsW6/32(抗-HLA I类)，Bi.23.3(抗-HLA-B和-C)，B9.4.1(抗-CD8)，1B8.2(抗-CD4，由D.Olive捐赠，INSERM U119，Marseille，France)，GAPA-3(抗-HLA-A3)，C7709A2.6(抗-HLA-A24)实施抑制作用。
瞬时转染用LipofectAMINETM试剂(Life Technologies)实施瞬时转染。简单地，将5×104个293-EBNA细胞(表达EBV核抗原EBNA-1的293细胞)在平底96培养皿板中用100ngMAGE-A12cDNA的DNA或克隆到pcDNA3(Invitrogen，Carlsbad，CA)中的亚基因片段，50ng含有HLA-Cw*0701的质粒pcDNA3，和1.5ulLipofectAMINETM转染。LB373-MEL细胞(10,000)用150ngHLA-Cw7构建和1ul LipofectAMINETM转染。24小时后，在CTL刺激测试中测定转染的细胞。
如以前所描述的(Gueguen等人，1998)，实施从LB831-BLC克隆HLA-Cw7 cDNA。其序列与等位基因亚型Cw*07011相同，除了在编码序列的1087位置上，其中G替换了A。这种核苷酸的变化致使在分子的胞质内区域中丙氨酸替换了苏氨酸。在Cw*0704和Cw*0711等位基因之间相同的差别已经有描述(Baurain和Coulie，组织抗原53510-512，1999)。
肿瘤细胞种系的稳定转染如以前所描述的(Traversari等人，免疫遗传学35145-152)，通过磷酸钙沉淀法来转染膀胱癌细胞LB831-BLC。将1×106个细胞用20ug含cDNA B7-1的质粒pEF-BOS嘌呤-PL3转染。简单地，使用从细胞种系LB23-EBV获得的cDNA作为模板，在PCT反应中使用有义引物5’-GGGTCCAAATTGTTGGCTTTCACT(SEQ ID NO7)和反义引物5’-GAAGAATGCCTCATGATCCCCA(SEQ ID NO8)扩增B7-1。PCR条件由Gueguen等人1998年描述。然后将B7-1插入体克隆到质粒pEF-BOS嘌呤-PL3中，质粒pEF-BOS嘌呤-PL3是通过插入嘌呤霉素抗性基因和多接头从pEF-BOS(Mishizuma和Nagata，核酸研究185322，1990)衍生。嘌呤霉素抗性LB831-BLC细胞在0.8ug/毫升嘌呤霉素(Sigma，St.Louis，MO)中选取，然后通过有限稀释克隆。
基因MAGE-A12的亚基因片段的克隆含有945个碱基对的完整开放读框(ORF)的MAGE-A12cDNA用作为PCR扩增的模板(DePlaen等人，免疫遗传学40360-369，1994)。含有MAGE-A12 ORP的首先195，342，525，540，591，651，683和816个核苷酸的八个片段分别使用下列引物扩增5’-CCTACCTGCTGCCCTGACCA-3’(LHE7；SEQ ID NO46)和反向引物5’-CCAACTAAGCCATCTTCCTA-3’(LHE2；SEQ ID NO47)5’-CCAACTAAGCCATCTTCCTA-3’(LHE3；SEQ ID NO48)
5’-GTGACAAGGATCTACAAGTG-3’(LHE4；SEQ IDNO49)5’-CCAGTCAGGTGACAAGGATG-3’(LHE10；SEQ IDNO50)5’-CCTGTCTAGGGCACGATCTG-3’(LHE8；SEQ ID NO51)5’-CTCCTAAGGGGCACAGTCGC-3’(LHE8；SEQ IDNO52)5’-TCAGATGCCTACAACACACT-3’(LHE5；SEQ ID NO53)5’-GGACCCTACAGGAACTCGTRA-3’(LHE6；SEQ IDNO54)。Taq DNA聚合酶(TaKaRa，Taq)用来PCR扩增。第一变性步骤在94摄氏度实施5分钟，然后实施25个周期的扩增，包括94摄氏度所有引物1分钟，62摄氏度LHE3，LHE4和LHE5引物2分钟或在64摄氏度LHE2，LHE6，LHE8，LHE9和LHE10引物2分钟，以及在72摄氏度所有引物3分钟。循环在72摄氏度10分钟的最后延伸步骤结束。使用BidirectionalEukaryotic TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)将PCR产物克隆到pcDNA3载体中。
MAGE-A12表达的PCR测试实施RT-PCR检测肿瘤组织中MAGE-A12的表达。如以前所描述的(Weynants等人，Int.J.Cancer 56826-829，1994)，实施总RNA提纯和cDNA合成。使用有义引物5’-CGTTGGAGGTCAGAAACAG-3’(SEQ ID NO55)和反义引物5’-GCCCTCCACTGATCTTTAGCAA-3’(SEQ ID NO56)将从2ug总RNA产生的cDNA的四十分之一扩增。对于PCR，第一变性步骤在94摄氏度实施4分钟，然后实施32个周期的扩增，包括94摄氏度1分钟，62摄氏度2分钟，以及在72摄氏度3分钟。循环在72摄氏度15分钟的最后延伸步骤结束。
实施例1从基因MAGE-A12衍生并由膀胱癌患者的HLA-Cw*0701限制性CTL识别的新型抗原肽LB831-BLC是表达至少三种由自身CTL识别的抗原的膀胱癌细胞种系。它们中的一个已经被描述过(Gueguen等人，免疫学160618806194，1998)。将作为刺激物的在血清中培养的照射过的B7-1转染LB831-BLC细胞和作为应答物的CD8+T淋巴细胞混合来实施自身混合淋巴细胞-肿瘤细胞培养。用与抗-CD8抗体(磁性活化细胞分选仪，MACS，Miltenyi Biotec，Gergisch-Gladbach，Germany)共价结合的磁珠将CD8+T淋巴细胞分选。在第一次刺激中将照射过的非-CD8+细胞加入到混合的培养物中。在第三天，加入IL-2(50U/毫升)。在一周后，用照射过的B7-1转染的肿瘤细胞和25U/毫升的IL-2重新刺激5×105淋巴细胞。在第28天，通过在补充IL-2(50U/毫升)的Iscove培养基中有限稀释从培养物中获得的淋巴细胞。获得一组BL831-特异CTL-克隆体，其中CTL 501D/19识别自身肿瘤种系但不识别自身EBV-转化的B-细胞(即，它识别不同于首先三个抗原的抗原，称为LB831-D)。
为了确定MHC对这些CTL克隆体的限制作用，研究抗-HLAmAb对克隆体刺激作用的影响。当用LB831-细胞刺激时，CTL克隆体501D/19产生TNF，在存在抗-HLA I类mAbW6/32时或存在定向抵抗HLA-B和-C分子的共同决定子的单克隆抗体(mAb B1.23.2)时，这种产出完全被阻断。由于LB831的HLA类有HLA-A*2403，-A*3，-B*4901，-Cw*0401，和-Cw*07，这个结果说明靶基因由HLA-B*44，B*49，CW*04呈递或由CW*04呈递。
在标准4小时铬释放测试中通过CTL501D/19识别其他靶细胞。如
图1A所示，CTL 501D/19也裂解两种同种异型肿瘤种系，恶性黑素瘤MI13443-MEL和肾癌细胞种系LE9211-RCC。靶为LB831-BLC(自身膀胱癌细胞种系)；LB831-EBV(自身EBV-转化B细胞)；LE9211-RCC(同种异型HLA-Cw4和HLA-Cw7-阳性肾癌细胞种系)；MI13443-MEL(同种异型HLA-Cw4和HLA-Cw7-阳性恶性黑素瘤细胞种系)；以及K562(天然杀伤靶)。在用作为靶之前，将同种异型和自身肿瘤细胞种系分别用IFNγ预先处理1或5天，测定4小时后的铬释放。
所有前述肿瘤细胞对B*44和B*49是阴性的，但对Cw*04和Cw*07是阳性的。为了证实哪种HLA呈递肿瘤抗原，将恶性黑素瘤瞬时用Cw*04或Cw*07转染，并测试CTL501D/19的识别作用。仅Cw*07转染子被CTL识别。如
图1B所示，将LB373-MEL(从HLA-Cw7阴性患者衍生的恶性黑素瘤细胞种系)用HLA-Cw7质粒构建瞬时转染。将三千个CTL加入到10000刺激物细胞中，24小时后测定CTL产生的TNF。由于CTL501D/19也识别 HLA-Cw*07-阳性恶性黑素瘤细胞种系NaMe16，所以可以得出结论，抗原LB831-D由HLA-Cw*07分子呈递。LB831-BLC的Cw*07的等位基因亚型确定并发现是HLA-Cw*07011。
为了确定由CTL501D/19识别的LB831-D抗原是否由已经知道的基因编码，将293-EBNA细胞用含有HLA-Cw*0701cDNA的表达载体和包括发现在患者LB831的膀胱肿瘤样品中大量表达的MAGE，BAGE，GAGE，RAGE，LAGENY-ESOcDNA(以及其他)的一系列基因共同转染。测定转染子刺激CTL501D/19产生TNF的能力。转染24小时后，用3000个细胞的CTL501D/19温育细胞。24小时后，通过测定TNF对WEHI-164-13细胞的细胞毒性来测定上清液中的TNF。LB831-BLC细胞用作为正对比物。仅当用HLA-Cw*07和基因MAGE-A12转染的293-EBNA细胞刺激时CTL产生TNF(图2)。仅用HLA-Cw7或用HLA-Cw7和任何其他基因组合转染的293-EBNA细胞没有观察到刺激作用。
通过RT-PCR，可以确定，所有由CTL501D/19识别的肿瘤细胞种系表达MAGE-A12，证实抗原由这种基因编码的。还检测到了产生在MLTC中的其他HLA-Cw7限制性CTL克隆体。六种其他CTL克隆体发现识别用MAGE-A12和HLA-Cw7转染的293-EBNA细胞。
为了鉴别编码抗原肽的MAGE-A12先序列，通过PCR产生不同长度MAGE-A12片段。这些亚基因片段克隆到pcDNA3中并与HLA-Cw*0701构建一起转染到293-EBNA细胞中。用转染子实施CTL刺激作用测试(图3)。将转染的细胞用CTL501D/19温育24小时，通过测定TNF对WEHI-164.13细胞的毒性来测定其在上清液中的产出。PCR片段的编号对应于编码区域的核苷酸。
用540个或更多个碱基对转染的细胞能刺激CTL501D/19，而用更短的片段转染的细胞不能刺激CTL501D/19。这说明，编码抗原肽的序列的末端位于MAGE-A12 ORF的核苷酸525和540之间。在对应于核苷酸525-540的氨基酸序列中，发现两个重叠九肽，EVVRIGHLY(MAGE-A12的密码子168-176；SEQ IDNO3)和VRIGHLYIL(MAGE-A12的密码子170-178；SEQ IDNO4)，其与HLA-Cw7肽结合基元一致，即，在C末端的酪氨酸或亮氨酸(Rammensee等人，免疫遗传学41178，1995)。十肽VVRIGHLYIL(SEQ ID NO5)，九肽VRIGHLYIL(SEQ IDNO4)和八肽RIGHLYIL(SEQ ID NO6)使自身成淋巴细胞种系LB-831-EBV对CTL501D/19的裂解敏感(图4)。将自身细胞种系用MAGE-A12肽VRIGHLYIL(SEQ ID NO4)，VVRIGHLYIL(SEQ ID NO5)，或RIGHLYIL(SEQ ID NO6)负载，并与CTL501D/19接触。用指定浓度的肽(VRIGHLYIL(SEQ ID NO4)或RIGHLYIL(SEQ ID NO6))脉冲铬标记的细胞30分钟。以效应子与靶的比率为10加入CTL501D/19。4小时后测定铬释放。也测定缺少C-末端亮氨酸的肽(如，EVVRIGHLY，SEQ ID NO3)，但没有识别。使用非常低浓度的九肽VRIGHLYIL(SEQ ID NO4)获得半量最大裂解，100pM，说明CTL501D/19可非常有效地识别这种肽。
实施例2MAGE-A12在肿瘤样品中的表达通过RT-PCR确定MAGE-A12在肿瘤样品和/或多种肿瘤的细胞种系中表达。使用如上所述的MAGE-A12特异引物和条件实施PCR扩增。MAGE-A12 RT-PCR扩增的结果在表I中提供。
通过RT-PCR检测的MAGE-A12的表达
等同物此领域中的技术人员会认识到，或仅使用常规实验就能确定本文所描述的发明的具体实施方案的许多等同物。这样的等同物包括在下面的权利要求书中。本文所公开的所有参考文献都全文收入本篇。
序列表<110>路德维哥癌症研究院<120>MAGE-A12抗原肽及其应用<130>L0461/7075WO<140>PCT/US00/28852<141>2000-10-19<150>US 60/160,374<151>1999-10-19<150>US 60/179,570<151>2000-02-01<160>56<170>FastSEQ的Windows 3.0版<210>1<211>4523<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(2960)…(3904)<400>1tggcctggga cccgcagcca ttctctacaa ggggtgcagc tgtgcaaatg cacagacgtt 60acagaaacag agtatctcct gccaatcact tcatccaaca gccaggagtg aggaagagga120ccctcttgag tgaggactga gggtccaccc tcccccacgt agtgaccaca gaatccagct180cagtccctct tgtcagccct gctaaactta ggcaataatg tcaccccgac cgcacccctc240ccccagtgcc acttcagggg gactcagagt cagagacttg gtctgagggg agcagacaca300atcggcagag gatggcggtc caggctcagc ctggcatcca agtcaggacc ttgagggatg360accaaaggcc cctcccaccc ccaactcccc caaccccacc aggatctaca gcctcatgat420ccccgtccct atccctaccc ctacccccaa caccatcttc atcgttacct ccacctccat480ctggatcccc atccaggaag aatccagttc cacccctgct gtgaacccag ggaagtcacg540gggccggatg tgacgccact gacttgcgcg ttggaggtca gagaacagcg agattctcgc600cctgagcaac ggcctgacgt cggcggaggg aagcaggcgc aggctccgtg aggaggcaag660gtaagatgcc gagggaggac tgaggcgggc ctcaccccag acagagggcc cccaataatc720cagcgctgcc tctgctgcca ggcctggacc accctgcagg ggaagacttc tcaggctcag780tcgccaccac ctcaccccgc caccccccgc cgctttaacc gcagggaact ctggtgtaag 840agctttgtgt 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<210>47<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>47cctaaggact gtggggagga 20<210>48<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>48ccaactaagc catcttccta 20<210>49<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>49gtgacaagga tctacaagtg 20<210>50<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>50ccagtcaggt gacaaggatg 20
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<210>55<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>55cgttggaggt cagagaacag 20<210>56<211>22<212>DNA<213>Homo sapiens<400>56gccctccact gatctttagc aa2权利要求
1.一种分离的MAGE-A12HLA I类结合肽，包括SEQ ID NO6的氨基酸序列，或其结合HLA I类分子的包括一个或多个氨基酸添加，替换或缺失的功能变体。
2.根据权利要求1所述的分离的MAGE-A12 HLA I类结合肽，其中分离的肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQID NO4，SEQ ID NO5，它们的片段，和它们的功能变体。
3.根据权利要求1所述的分离的MAGE-A12 HLA I类结合肽，其中分离的肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，它们的片段，和它们的功能变体。
4.一种分离的MAGE-A12 HLA I类结合肽，包括结合HLACw*07的SEQ ID NO2氨基酸序列的片段，或包括一个或多个氨基酸添加，替换或缺失的其功能变体，其中功能变体结合HLA Cw*07。
5.根据权利要求1或4所述的分离的MAGE-A12 HLA I类结合肽，其中分离的肽是不可水解的。
6.根据权利要求5所述的分离的MAGE-A12 HLA I类结合肽，其中肽是从下列组中选取的，包括含D-氨基酸的肽，含-psi[CH2NH]-还原酰胺肽键的肽，含-psi[COCH2]-酮亚甲基肽键的肽，含-psi[CH(CN)NH]-(氰亚甲基)氨基肽键的肽，含-psi[CH2CH(OH)]-羟基亚乙基肽键的肽，含-psi[CH2O]-肽键的肽，含-psi[CH2S]-硫代亚甲基肽键的肽。
7.一种包括权利要求1所述的分离的MAGR-A12 HLA I类结合肽和非-MAGE-A12肿瘤抗原的分离的HLA I类或II类结合肽的组合物。
8.一种包括权利要求4所述的分离的MAGR-A12 HLA I类结合肽和非-MAGE-A12肿瘤抗原的分离的HLA I类或II类结合肽的组合物。
9.根据权利要求7或8所述的组合物，其中MAGE-A12 HLA I类结合肽和非-MAGE-A12肿瘤抗原的HLA I类或II类结合肽结合为多表位多肽。
10.一种编码从包括权利要求1-4中任何一个的肽的组中选取的肽的分离的核酸，其中核酸不编码全长MAGE-A12。
11.根据权利要求10所述的分离的核酸，其中核酸包括SEQ IDNO1核苷酸序列片段。
12.一种表达载体，包括与启动子可操作结合的权利要求11所述的分离的核酸。
13.根据权利要求12所述的表达载体，进一步包括编码HLA-Cw*07分子的核酸。
14.一种用从包括权利要求12的表达载体和权利要求13的表达载体的组中选取的表达载体转染或转化的宿主细胞。
15.一种用权利要求12的表达载体转染或转化的宿主细胞，其中宿主细胞表达HLA Cw*07分子。
16.一种选择性增加含有对MAGE-A12 HLA结合肽特异的T淋巴细胞群的方法，包括将含有T淋巴细胞群的T淋巴细胞源与足以选择性地增加含有对MAGE-A12 HLA结合肽特异的T淋巴细胞的T淋巴细胞群的量的呈递MAGE-A12HLA结合肽和HLA分子的复合物的试剂接触。
17.根据权利要求16所述的方法，其中试剂是用MAGE-A12蛋白质或其HLA结合片段接触过的抗原呈递细胞。
18.根据权利要求16所述的方法，其中MAGE-A12 HLA结合肽是从下列组中选取的，包括(i)包括SEQ ID NO2氨基酸序列的片段的肽；(ii)包括SEQ ID NO6氨基酸序列的肽；以及(iii)(i)和(ii)肽的功能变体。
19.一种诊断特点在于表达MAGE-A12 HLA结合肽的病变的方法，包括将从受试体分离的生物样品与对MAGE-A12 HLA结合肽特异的试剂接触，确定试剂和MAGE-A12 HLA结合肽之间的结合来确定病变。
20.根据权利要求19所述的方法，其中MAGE-A12 HLA结合肽是从下列组中选取的，包括(i)包括SEQ ID NO2氨基酸序列的片段的肽；(ii)包括SEQ ID NO6氨基酸序列的肽；以及(iii)(i)和(ii)肽的功能变体。
21.一种诊断患有特点在于表达MAGE-A12的病变的受试体的方法，包括将从受试体分离的生物样品与结合复合物的试剂接触，确定试剂和复合物之间的结合来确定病变。
22.根据权利要求21所述的方法，其中MAGE-A12 HLA结合肽是从下列组中选取的，包括(i)包括SEQ ID NO2氨基酸序列的片段的肽；(ii)包括SEQ ID NO6氨基酸序列的肽；以及(iii)(i)和(ii)肽的功能变体。
23.一种治疗患有特点在于表达MAGE-A12的病变的受试体的方法，包括给受试体服用足以减轻病变的量的MAGE-A12HLA结合肽。
24.根据权利要求23所述的方法，其中MAGE-A12 HLA结合肽是从下列组中选取的，包括(i)包括SEQ ID NO2氨基酸序列的片段的肽；(ii)包括SEQ ID NO6氨基酸序列的肽；以及(iii)(i)和(ii)肽的功能变体。
25.一种治疗患有特点在于表达MAGE-A12的病变的受试体的方法，包括给受试体服用足以减轻病变的量的权利要求7或权利要求8的组合物，
26.一种治疗患有特点在于表达MAGE-A12的病变的受试体的方法，包括给受试体服用足以减轻病变的量的选择性地增加受试体中HLA分子和MAGE-A12 HLA结合肽的复合物的存在量的试剂。
27.根据权利要求26所述的方法，其中试剂包括MAGE-A12HLA结合肽。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中MAGE-A12 HLA结合肽是从下列组中选取的，包括(i)包括SEQ ID NO2氨基酸序列的片段的肽；(ii)包括SEQ ID NO6氨基酸序列的肽；以及(iii)(i)和(ii)肽的功能变体。
29.一种治疗患有特点在于表达MAGE-A12的病变的受试体的方法，包括给受试体服用足以减轻病变的量自身T淋巴细胞，其中T淋巴细胞对HLA分子和MAGE-A12结合肽的复合物特异。
30.根据权利要求29所述的方法，其中MAGE-A12 HLA结合肽是从下列组中选取的，包括(i)包括SEQ ID NO2氨基酸序列的片段的肽；(ii)包括SEQ ID NO6氨基酸序列的肽；以及(iii)(i)和(ii)肽的功能变体。
31.一种鉴别MAGE-A12 HLA结合肽的功能变体的方法，包括选取MAGE-A12 HLA结合肽，结合MAGE-A12 HLA I类结合肽的HLA结合分子，以及受到由HLA结合分子呈递的MAGE-A12 HLA结合肽刺激的T细胞；诱变MAGE-A12HLA结合肽的第一氨基酸残基制备变体肽；确定变体肽与HLA结合分子的结合以及T细胞的刺激作用，其中变体肽与HLA结合分子结合以及T细胞受到由HLA结合分子呈递的变体肽刺激的表示该变体肽是功能变体。
32.根据权利要求31所述的方法，其中MAGE-A12 HLA结合肽是从下列组中选取的，包括(i)包括SEQ ID NO2氨基酸序列的片段的肽；(ii)包括SEQ ID NO6氨基酸序列的肽；以及(iii)(i)和(ii)肽的功能变体。
33.根据权利要求31所述的方法，进一步包括比较MAGE-A12HLA结合肽对T细胞的刺激作用和功能变体对T细胞的刺激作用的步骤来确定功能变体对T细胞的刺激作用的有效性的步骤。
34.一种分离的多肽，其选择性地结合权利要求1-4中任何一个的多肽，只要分离的多肽不是HLA分子。
35.根据权利要求34所述的分离的多肽，其中分离的多肽的抗体。
36.根据权利要求35所述的分离的多肽，其中抗体是单克隆抗体。
37.根据权利要求34所述的分离的多肽，其中分离的多肽是从下列组中选取的抗体片段，包括Fab片段，F(ab)2片段或或包括对MAGE-A12 HLA结合肽具有选择性的CDR3区域的片段。
38.一种选择性地结合HLA分子和MAGE-A12 HLA结合肽的复合物的分离的T淋巴细胞。
39.根据权利要求38所述的分离的T淋巴细胞，其中MAGE-A12 HLA结合肽是从下列组中选取的，包括(i)包括SEQ IDNO2氨基酸序列的片段的肽；(ii)包括SEQ ID NO6氨基酸序列的肽；以及(iii)(i)和(ii)肽的功能变体。
40.一种包括HLA分子和MAGE-A12 HLA结合肽的复合物的分离的抗原呈递细胞。
41.根据权利要求40所述的抗原呈递细胞，其中MAGE-A12HLA结合肽是从下列组中选取的，包括(i)包括SEQ ID NO2氨基酸序列的片段的肽；(ii)包括SEQ ID NO6氨基酸序列的肽；以及(iii)(i)和(ii)肽的功能变体。
42.一种包括权利要求1-4中任何一个的多肽和药学上可接受的载体的疫苗组合物。
43.根据权利要求42所述的疫苗组合物，进一步包括辅剂。
44.一种包括从包括权利要求38和39的T淋巴细胞和权利要求40和41的抗原呈递细胞，以及药学上可接受的载体的疫苗组合物。
45.根据权利要求44所述的疫苗组合物，进一步包括辅剂。
46.一种包括权利要求10的分离的核酸分子和药学上可接受的载体的疫苗组合物。
47.根据权利要求46所述的疫苗组合物，进一步包括辅剂。
48.一种由权利要求31的方法鉴别的分离的MAGE-A12 HLA结合肽的功能变体。
49.一种鉴别MAGE-A12 HLA结合肽的侯选类似物的方法，包括提供结合MAGE-A12 HLA结合肽的HLA分子，将HLA分子与测试分子接触，确定测试分子与HLA分子的结合，其中结合HLA分子的测试分子是MAGE-A12 HLA结合肽的侯选类似物。
50.根据权利要求49所述的方法，进一步包括制成HLA分子和侯选类似物的复合物，将复合物与结合HLA分子和MAGE-A12 HLA结合肽的复合物的T细胞接触，测试T细胞的活化作用。
51.根据权利要求50所述的方法，其中T细胞的活化作用通过从下列组中选取的性质来指示，包括T细胞的增殖，T细胞产生的干扰素-γ，T细胞产生的肿瘤坏死因子，T细胞对靶细胞的细胞溶解作用。
52.一种包括分离的MAGE-A12 HLAI类结合肽，或其结合HLAI类分子的包括一种或多种氨基酸添加，替换或缺失的功能变体的蛋白质微排列(microarrays)。
53.根据权利要求52所述的蛋白质微排列，其中分离的MAGE-A12 HLA I类结合肽包括SEQ ID NO6氨基酸序列。
54.根据权利要求52的蛋白质微排列，其中分离的MAGE-A12HLA I类结合肽包括从下列组中选取的氨基酸序列，包括SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，以及它们的功能变体。
55.一种诊断患有特点在于表达MAGE-A12的病变的受试体的方法，包括将蛋白质微排列与从怀疑患有病变的受试体获得的生物样品接触，确定生物样品的组成与分离的MAGE-A12 HLAI类结合肽的结合。
56.根据权利要求55所述的方法，其中生物样品的组成是从下列组中选取的，包括抗体，T淋巴细胞，和HLA分子。
57.根据权利要求55所述的方法，其中病变是癌症。
全文摘要
本发明提供由HLA分子呈递的从MAGE－A12多肽衍生的抗原肽。本发明还提供了与多肽有关的治疗和诊断方法。
文档编号C12N1/21GK1402782SQ00814604
公开日2003年3月12日 申请日期2000年10月19日 优先权日1999年10月19日
发明者利奥诺拉·海德克尔, 本奥特·范登艾德, 斯瑞·布恩－福尔尤, 弗朗西斯·布拉斯尤 申请人:路德维哥癌症研究院