基因转移的方法

专利名称：基因转移的方法
技术领域：
本发明涉及一种方法，该方法可以提高基因转移到目的细胞的效率，使目的细胞能够高效转化，以及一系列与此相关的在制药、细胞工艺、遗传工程、发育技术等领域的技术。
背景介绍许多人类疾病的机制已经被阐明。DNA重组技术和基因转移入细胞的技术也同样得到了快速的发展。在这样的情况下，用于治疗严重的遗传性疾病的体细胞基因疗法也就应运而生了。最近，科学家已经尝试将基因疗法用于治疗遗传性疾病，而且还将这种方法应用于病毒性感染疾病的治疗，如AIDS和癌症。
目前普遍应用的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒(AAV)载体。一个逆转录病毒载体的制备较简单并且它可以把外源基因整合到靶细胞的染色体DNA上。因此，对基因疗法中要求长期的基因表达这一点，逆转录病毒是非常有用的。但是，由于外源基因整合到染色体DNA上的位置是随机的，如果使用了逆转录病毒就可能潜伏地诱发癌症等病症。不仅如此，由于逆转录病毒载体不能转染处于休眠期的细胞，因此靶细胞的类型受到了限制。
虽然关于制备腺病毒载体的方法仍存在一些问题，但有一种简便的制备方法已经得到了发展。这种载体能有效地感染多种类型的细胞，包括处于休眠相的细胞。但是，由于缺乏使外源基因整合到靶细胞染色体DNA的这一机制，所以外源基因的表达通常是暂时的。
AAV载体能感染处于休眠相的细胞，并且它还具有使外源基因特异地整合到人类第19号染色体AAVS1位点的特性。因此，预计利用AAV载体转移基因，可以使基因长期表达而没有潜在的风险。然而，在使用AAV载体时会遇到一些实际的问题，就是AAV载体的制备非常繁琐以及它所能转移入细胞的基因的大小非常小。
如上所述，传统的病毒载体在基因治疗中有着它们各自的优点和不足。我们还不知道哪种基因转移的方法是既能方便的操作、高效的基因转移并又能使被转移的基因长期表达。我们迫切需要一个满足上述性质的系统。
为发展这样一个系统已经做出了努力。在这一系统中，外源基因位点特异性插入所需要的AAV区域被掺入到腺病毒载体上，这样就使它既具有很高的基因转移效率和容易制备出高滴度载体的优点，又可以克服腺病毒载体不能将外源基因插入靶细胞DNA的缺点(例如，见美国专利5,843,742)。
但是，由于Rep蛋白是由AAV区域编码的，Rep蛋白能抑制腺病毒的增殖，而AAV区域是外源基因位点性特异插入所必需的，所以含有AAV区域的腺病毒不能增殖。因此，制备这种载体是不可能的，并且基因转移中应用这种载体在实际中也是不可行的。
Recchia等曾试图用肝细胞特异启动子，α1AT启动子，来表达rep基因，以解决上述问题(Recchia等，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the USA，962615-2626(1999))。由于α1AT启动子是肝细胞特异启动子，所以它不能在生产腺病毒的宿主细胞里执行功能。因此，腺病毒载体里的rep基因就不能表达，腺病毒载体的增殖也就不会被抑制。
但是，Recchia等的方法有一个缺陷，这个缺陷就是外源基因能够整合到染色体DNA上的细胞类型只限于肝细胞，因为用于表达rep基因的启动子是一个肝细胞特异性的启动子。
如上所述，现有技术都存在缺陷。渴望能有这样一种方法，该方法有很高的基因转移效率，可以很容易地制备出高滴度的载体，这些载体能够将外源基因整合到靶细胞的染色体DNA上，并且可以将外源基因转入广泛类型的细胞中。
发明目的本发明的主要目的是提供一种基因转移的方法，该方法有很高的基因转移效率，可以很容易地制备出高滴度的载体，这些载体能够将外源基因整合到靶细胞的染色体DNA上，并且可以将外源基因转入广泛类型的细胞中。发明概述经过深入的研究，本发明人已经发现可以应用表达控制系统使外源基因转入广泛类型的细胞中并整合到染色体DNA上，这种表达控制系统利用重组酶和重组酶识别序列，例如Cre/loxP表达控制系统。具体地说，本发明人已经建立了一种方法并且构建了适用于该方法的一套系统。这种方法中，在病毒宿主细胞里，通过在重组酶识别序列间插入填充片断序列，阻遏了腺病毒载体上rep基因的表达。另一方面，在含有被转化的腺病毒载体的靶细胞中，通过重组酶的作用使插入重组酶识别序列间的填充片断序列移去，rep基因得以表达，并且与ITRs侧邻的被转移进靶细胞中的外源基因能被整合到靶细胞的染色体DNA上。由此，本项发明得以完成。
本发明提供了一种方法，该方法包括(1)第一条核酸，在这条链的序列中，来自AAV的ITRs定位在被转移的外源目的基因的两侧；和(2)第二条核酸，在这条链上，插入到两个重组酶识别序列间的填充片断序列定位于来自AAV的rep基因和一个启动子之间，这两条链通过腺病毒载体被转入细胞，并且外源目的基因能高效率地整合到广泛类型的细胞的染色体DNA上，这种整合是在细胞中重组酶的作用下以位点特异性方式进行的。
具体地说，当以上提到的两条链被转入正表达重组酶的靶细胞中时，在第二条核酸链上，两个重组酶识别序列间的填充片断序列通过细胞中重组酶的作用移去，从而使rep基因得以表达。在第一条核酸链上的外源基因被整合到靶细胞的染色体DNA上，这一过程是通过由rep基因表达的Rep蛋白和位于第一条核酸链上的ITRs共同作用完成的。
本发明要点如下本发明的第一方面涉及一种把外源基因转入细胞的方法，该方法包括(a)使用腺病毒载体转入细胞(1)第一条核酸链，在这条链的序列中，来自腺伴随病毒的ITRs定位在被转移的外源目的基因的两侧；和(2)第二条核酸链，这条链含有来自腺伴随病毒的rep基因和表达这个基因所需的启动子，以及在这条链上位于两个重组酶识别序列间的填充片断序列，该序列插入到rep基因和启动子之间；
(b)通过重组酶的作用，步骤(a)得到的细胞得以表达Rep蛋白，从而使外源目的基因整合到细胞染色体DNA上。
本发明的第二个方面涉及将外源基因转入细胞的系统，这种系统包括(1)具有第一条核酸链的腺病毒载体，这条核酸链的序列上来自腺伴随病毒的ITRs定位于被转移外源目的基因两侧；和(2)具有第二条核酸链的腺病毒载体，这条核酸链有来自腺伴随病毒的rep基因以及表达这个基因所需的启动子，以及在这条链上位于两个重组酶识别序列间的填充片断序列，该序列插入到rep基因和启动子之间。
本发明的第三个方面涉及将外源基因转入细胞的系统，这种系统包括腺病毒载体，该载体包括第一条核酸链，在这条链的序列中来自腺伴随病毒的ITRs定位在被转移的外源目的基因的两侧；和具有第二条核酸链的腺病毒载体，这条核酸链有来自腺伴随病毒的rep基因以及表达这个rep基因所需的启动子，以及在这条链上位于两个重组酶识别序列间的填充片断序列，该序列插入到rep基因和启动子之间。
本发明的第四个方面涉及被转化的细胞，利用第一方面所述的方法把外源基因转移进这种细胞中。
本发明的第五个方面涉及被转化的细胞，利用第二或第三方面所述的方法把外源基因转移进这种细胞中。
附图简述


图1图示了用斑点杂交检测位点特异性整合的结果。
发明详述本发明将被详细地阐述。
腺病毒是一类线性双链DNA病毒。它的基因组DNA的大小约为36kb。这类病毒所编码的末端蛋白与基因组DNA的两个5’末端以共价形式结合，形成DNA末端蛋白复合体(DNA-TPC)。
依据本发明，关于腺病毒被用作载体没有特定的限制。例如，具有高增殖效率和低致病性的人类2型或5型腺病毒就能被应用。通过去除腺病毒基因组中涉及病毒复制的E1区所构建的一种无法增殖的腺病毒被用作载体。由于缺失E1区的腺病毒缺乏增殖的能力，所以病毒增殖这一可能诱发靶细胞疾病状态的情况就不会发生。因此，依据本发明，从安全角度考虑，应优选这种腺病毒。
关于病毒基因组的去除是没有特定的限制的，只要是这一结果不影响它执行载体的功能。除了缺失上面提及的E1区外，一种部分或完全去除E3区的腺病毒也能被用作载体，因为E3区不是细胞培养中病毒增殖所必需的。
缺失E1区或同时缺失E1区和E3区的腺病毒能在来自人胚肾的293细胞株中增殖，该类细胞能够永久地表达位于E1区的基因。
虑及减少免疫原的产生可引起副作用，除缺失E1区和E3区，进一步缺失E2区和/或E4区的腺病毒也能被使用。同样，当病毒基因完全被去除时，这种空病毒腺病毒载体(a gutless adenouirus vector)仍能被使用(Parks et al.，Proceedings of the National Academyof Sciences of the USA，9313565-13570(1996))。
在表达包含于病毒缺失区的基因的细胞中，或与含有缺失区的辅助病毒协同感染细胞时，这类腺病毒能够增殖。
依据本发明，所使用的第一条核酸链是一种含有来自腺伴随病毒(AAV)末端反向重复序列(ITRs)的链，ITRs定位在被转移外源目的基因的两端。虽然没有想限制本发明的意图，但是应优选将第一条核酸链与腺病毒载体结合使用。这条核酸链上的目的基因以位点特异性的方式整合到靶细胞基因组上，这种整合是由来自于AAV的ITRs及有第二条核酸链上表达的Rep蛋白共同作用完成的，以下将详细描述。
ITRs呈T-型发夹结构，每个ITRs由145个碱基组成，位于AAV单链DNA的两端。它们包含整合到AAVS1位点上所必需的序列，当以人为宿主时这一位点位于第19号染色体上。(Yukihiko Hirai，JikkenIgaku(Experimental Medicine)，12(15)1811-1816(1994))。依据本发明，所使用的ITRs没有被特定限制，只要它们具有在AAVS1位点上的整合活性即可，它们也可以是经过了替换、缺失、插入或添加。
关于被插入到两个ITRs之间的外源基因是没有特定限制的。它可以是想转移的任何基因。这一基因可以是编码酶或其他与疾病相关的蛋白质的基因，以及编码功能性核酸分子如反义核苷酸、核酶或诱饵分子(decoy)等的基因。并且关于基因的来源也没有特别的限制。这种基因可以是一个来源于与被外源基因转入的细胞相同或不同的物种的基因，也可以是一个化学合成的基因，或是两种方法结合得到的基因。适当的调节元件如调节基因表达的启动子和增强子可以被加入到该基因上。
虽然没有想限制本发明的意图，但是插入到两个ITRs之间的外源目的基因有所需要的大小，例如，在缺失一个E1区和E3区的载体上，从重组腺病毒载体包装的角度看，外源目的基因大小应约为7.2kb或更小。即使是空病毒载体的情况下，外源目的基因大小最好是37kb或更小。
依据本发明，第一条核酸链所用的启动子没有特定的限制，只要它能在靶细胞中表达目的基因即可。例如，这样的启动子包括CAG启动子、SRα启动子、EF1α启动子、CMV启动子和PGK启动子，也可以根据需要选择。如果选用了组织特异性启动子，那么目的基因就以组织特异性的方式表达。例如，使用肝特异性的α1AT启动子，表达就能被引导以肝细胞特异性的方式进行，使用骨骼肌特异的α-肌动蛋白启动子，就可以以骨骼肌特异的方式进行，使用神经特异的烯醇酶启动子，就可以以神经特异的方式进行，使用血管内皮细胞特异的tie启动子，就可以以血管内皮细胞特异的方式进行，使用胃癌特异的CEA启动子，就可以以胃癌特异的方式进行，或是使用肝癌特异的AFP启动子以肝癌特异的方式进行表达。
依据本发明，第二条核酸链是一条以启动子/重组酶识别序列/填充片段序列/重组酶识别序列/来自AAV的rep基因为顺序排列的链。虽然并没有想限制本发明的意图，但是应优选将第二条核酸链与腺病毒载体结合使用。这条核酸链在靶细胞中表达rep基因。rep基因是外源目的基因整合到靶细胞的染色体DNA上所必需的基因，外源目的基因位于前面所提及的第一条核酸链上。
当用于扩增腺病毒的宿主细胞(生产细胞)里没有重组酶时，具有细胞毒性和抑制腺病毒增殖活性的rep基因就不能表达。这是因为在这条核酸链上启动子和rep基因之间存在填充片段序列。因此，它能被用来使病毒大量地增殖。另一方面，在任何能表达重组酶的细胞中，两个重组酶识别序列之间插入的填充片段序列能在重组酶的作用下被剪切掉。这样的结果是，启动子正好与rep基因的起始密码子紧邻，从而使rep基因得以表达。
AAV的Rep区编码四种蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。在这四种蛋白中，Rep78蛋白或Rep68蛋白(被称为大Rep)是AAV基因组整合到人类第19号染色体的AAVS1位点所不可缺少的。根据本发明，所使用的rep基因没有受到特定的限制，只要它具有将外源目的基因整合到靶细胞染色体DNA上的活性，外源目的基因位于第一方面所指的核苷酸链上。例如，这种基因可以是一个编码Rep78蛋白或Rep68蛋白的基因，或者是一个编码Rep78蛋白或Rep68蛋白经过替换、缺失、添加或插入后仍不失其活性的蛋白的基因。
编码Rep78蛋白和Rep68蛋白的区域同时也编码Rep52蛋白和Rep40蛋白。Rep52蛋白和Rep40蛋白具有抑制腺病毒增殖的活性。因此，依据本发明，为了阻止Rep52蛋白和Rep40蛋白的表达，有必要利用定点突变等方法来改造所用的rep基因。例如，把Rep78蛋白的第225个氨基酸残基从甲硫氨酸改变为甘氨酸，就可以阻止Rep52蛋白和Rep40蛋白的表达。
依据本发明，用在第二条核酸链上的启动子没有特定的限制，只要它能在靶细胞中表现活性并且能在去除填充片断序列后表达rep基因即可。启动子可以根据需要选择。用在第二条核酸链上的启动子在选择时可以不考虑它在生产细胞中的表达，因为由于存在填充片断序列这些启动子的表达在生产细胞中几乎都被阻遏。
例如，来自于AAV的P5启动子，SRα启动子，EF1α启动子，CMV启动子，SV40启动子，以及来自于病毒的启动子如来自于鼠白血病病毒的5’LTR启动子，带有部分病毒的融合启动子如CAG启动子，不管其组织来源，它们是已知的可以在广泛类型细胞中起作用的启动子。因此如果以多种类型的细胞为靶细胞时他们都非常适合。
另外，可以通过选择组织特异性的启动子使目的基因以组织特异性方式表达。关于目的基因待转入的组织或细胞是没有特定限制的，只要它能被腺病毒转染并且其染色体上存在AAVS1位点。可以通过随意选择启动子而将外源基因转入基本上所有的人类组织和细胞。例如，如果外源基因要分别转入骨骼肌、神经或血管内皮细胞，就可以选择骨骼肌特异的α-肌动蛋白启动子，神经特异的烯醇酶启动子或血管内皮细胞特异的tie启动子。另外，如果要将自杀基因转入的癌细胞中，就可以选用胃癌特异的CEA启动子、肝癌特异的AFP启动子等。
在本发明的系统中，由于rep基因的表达增加了，所以外源目的基因整合到染色体DNA上的效率也就增加了。然而，另一方面，也要考虑到对靶细胞的毒性也相应增加了。由于rep基因的产物，Rep蛋白，对细胞的毒性依细胞类型的不同而有区别，所以有必要根据靶细胞来优化rep基因的表达水平。为此目的，应该选择对靶细胞来说所具有最佳表达力度的启动子。例如，已知上面提到的CAG，CMV和SV40启动子在许多细胞类型中的表达力度依次为CAG启动子＞CMV启动子＞SV40启动子。例如，因此，如果选用的靶细胞类型对Rep蛋白的细胞毒性表现出高、低或中度敏感，就可以分别选用SV40启动子CAG启动子或CMV启动子。
另外，当Rep蛋白存在时，来自AAV的p5启动子的表达就会被阻遏。如果使用了类似p5的启动子，一旦rep基因表达，启动子的活性随后就被rep基因表达的Rep蛋白阻遏。结果，rep基因的过表达被阻遏。因此，由Rep蛋白所带来的毒性就能被限制到最低值。
根据本发明，填充片段序列是为了阻遏从启动子处开始rep基因的表达而插入到位于第二条核酸链上启动子和rep基因之间的一段序列。只要介于启动子和rep基因之间的填充片段序列能抑制rep基因的表达，关于填充片段序列没有特定的限制。然而，从精确的表达控制来看，它最好能包含一个终止序列，一个poly(a)序列或类似序列。由于第二条核酸链上从启动子处开始的表达几乎被填充片段序列完全的阻遏了，可以预期重组的腺病毒能在宿主细胞中有效的得以生产。在宿主细胞中，由填充片段序列导致的启动子的阻遏可以在转录水平(e.g.，using Northern blotting or RT-PCR)或通过测定宿主细胞生产重组的腺病毒的能力得到证实。
表达控制系统即利用重组酶和重组酶识别序列的系统，包括Cre/loxP表达控制系统(Kanegae et al.，Nucleic Acids Research，232816-3821(1995))；利用来自酵母2μ质粒的FLP基因编码的重组酶的表达控制系统(Broarch et al.，Cell，29227-234(1982))；以及利用来自Zygosaccharomyces rouxii pSR1质粒的R基因编码的重组酶的表达控制系统(Matsuzaki et al.，Molecular and Cellular Biology，8955-962(1988))。虽然没有想限制本发明的意图，依据本发明，从重组效率来看，应优选Cre/loxP表达控制系统。
依据本发明，关于所使用的重组酶识别序列是没有特定限制的，只要重组酶能识别它并把位于两个序列间的填充片段序列去掉。重组酶识别序列可以用loxP序列来例证，在Cre/loxP表达控制系统中，loxP序列是能被重组酶Cre识别的序列。
loxP序列是一种能被Cre识别的序列，Cre是由一种由大肠杆菌P1噬菌体编码的位点特异性重组酶。(Abremski et al.，Journal ofBiological Chemistry，2591509-1514(1984)，Hoess et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，811026-1029(1984)，Hoess et al.，Journal of MolecularBiology，181351-362(1985))。重组酶Cre特异地识别loxP序列上由34个碱基组成的最小单位，以实现DNA的剪切和两条loxP序列之间的链置换。具体地说，如果两条loxP序列以相同方向出现在同一个分子上，那么loxP序列之间DNA序列将被重组酶Cre以环状分子切除(剪切反应)。依据本发明，仅有Hoess等(Hoess et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，811026-1029(1984))描述的最小单位可以被用作loxP序列。
依据本发明，loxP序列的应用没有特定的限制，只要重组酶Cre能识别它而实现剪切反应即可。它可以是来自大肠杆菌P1噬菌体的野生型的loxP序列，或者是在一定范围内经过替换、缺失、添加或插入造成的突变序列，重组酶Cre识别它从而实现剪切反应。这样的突变序列可以从Lee等(Gene，21655-65(1998))描述的loxP2272、loxP5171、loxP2271、loxP3171、loxP5272或loxP5372中得到例证。
依据本发明，关于所用的重组酶没有特定的限制。只要能够识别位于第二条核酸链上的重组酶识别序列从而实现剪切反应的重组酶都可以被选择和使用。例如，来源于大肠杆菌P1噬菌体位点特异性重组酶Cre，能被用来剪切置于两个loxP序列间的填充片断序列。依据本发明，所用的重组酶没有特定的限制，只要它能识别重组酶识别序列而表现出DNA重组活性即可。例如，它可以是这样一个重组酶，该重组酶是野生型重组酶的氨基酸序列在一定范围内经过替换、缺失、添加或插入的结果，而且它仍能表现出活性。另一个选择是，为了促进细胞里核转运，一种被添加了核转运信号的重组酶也可以被使用。
关于在靶细胞中表达重组酶的方法没有特定的限制。例如，为了表达重组酶可以把一条编码重组酶的核苷酸链转移入细胞。虽然转移这样的核苷酸没有特定的限制，但是利用腺病毒载体来转移的方法更为优选，因为腺病毒载体能有高的转移效率并且为了转移基因可以很容易地制备出高滴度的载体。
关于载体上用于表达重组酶的启动子没有特定的限制，只要它能表达重组酶基因以诱导Rep蛋白的表达并使外源目的基因整合即可。例如，它可以是在各种各样组织中都具有活性的启动子如CAG启动子、SRα启动子、EF1α启动子、CMV启动子或PGK启动子。另一种选择是，它可以是只在特定组织中执行功能的组织特异性启动子，如前面所提到的肝特异性α1AT启动子。如果使用的是组织特异性启动子，则有可能外源基因只能特异地整合到特定组织细胞的染色体DNA上。
为了将外源目的基因转入靶细胞，一个包含第一条核酸链的腺病毒载体和一个包含第二条核酸链的腺病毒载体可以被转入同一个表达重组酶的细胞中。这两种载体可以同时或分别地被转移。另一种选择是，单独一个同时包含有第一和第二条核酸链的腺病毒载体也可以被转入细胞中。具体的说，一个腺病毒载体，它既包含第一条核酸链的元件(被置来自AAV的ITRs之间的目的基因)，又包含第二条核酸链的元件(启动子/重组酶识别序列/填充片段序列/重组酶识别序列/来自AAV的rep基因)，这样一个独立的载体可以被转移。
如果重组酶是通过转移入细胞的重组酶基因表达得到的，那么包含第一条核酸链的腺病毒载体，包含第二条核酸链的腺病毒载体以及一个将重组酶基因转移入细胞的载体都可以被转入靶细胞中。这三种载体可以是同时或单独地被转移。第一条和第二条核酸链可以包含在同一个载体上。在这种情况下，这个载体要与转移重组酶基因进入细胞的载体结合使用。另一种选择是，第一条核酸链和重组酶基因可以被包含在同一个载体上。换言之，被使用的载体包括，第一条核酸链的元件(目的基因被置于来自AAV的两个ITRs间)和重组酶基因被构建在同一个载体上的腺病毒载体和包含有第二条核酸链的腺病毒载体。
靶细胞里表达的重组酶(如重组酶Cre)识别位于第二条核酸链上的两个重组酶识别序列(如loxP序列)，并且通过剪切反应将位于两个重组酶识别序列间的填充片断序列去除。结果是rep基因在启动子的作用下得以表达，这个启动子在第二条核酸链上与rep基因相邻。在由第二条核酸链上产生的Rep蛋白的作用下，在第一条核酸链上位于两个之间ITRs的目的基因整合到靶细胞的第19号染色体的AAVS1位点。以上描述的目的基因整合到靶细胞染色体上后可以长时间稳定的保持和表达。此外，由于可以使用任意启动子作为rep基因表达的启动子，所以目的基因可以在任意细胞中表达。
依据本发明，所使用的腺病毒载体可以像传统腺病毒一样很容易地制备出高滴度的病毒。依据本发明，可以以COS-TPC法(Proceedingsof the Natioal Academy of Sciences of the USA，931320(1996))为例制备腺病毒载体。依据本发明，利用此种方法可以高效地制备载体而不必经过繁琐的过程。
依据本发明，所使用的腺病毒载体可以像腺病毒一样高效地感染许多类型的细胞包括处于休眠相的细胞。因此，它可以用于不同组织和细胞的基因治疗。另外，由于它可以像AAV一样以位点特异的方式整合外源基因，所以它能够用来长期表达外源基因，而没有由于随机位点整合所诱发癌症等疾病的风险。
此外，依据本发明，腺病毒载体可以使用任意启动子来表达外源目的基因，而不必像逆转录病毒载体那样。由于rep基因同样可以用任意启动子来表达，所以关于本发明所使用的细胞类型没有特定的限制，并且外源基因能够转移入任何类型的靶细胞。另外，与AAV不同，它可以插入大片断的外源目的基因，。
因此，本发明所使用的基因转移方法是卓越的系统，这种系统克服了传统系统的所有缺点，这些缺点包括受限于细胞类型、转染效率低、表达时间短以及表达难以控制。因此，基因治疗的效果由于传统方法的局限性而受限以及期望得到显著的疗效时，此方法能被用于所有的这类基因治疗。
使用本发明的基因转移方法时，接受基因治疗的疾病是没有特定限制的。这种方法可以用于治疗遗传性疾病，这些疾病被发现是先天性遗传异常，也可以治疗病毒感染如AIDS和癌症。由于使用本发明的基因转移方法可以将基因整合到靶细胞的染色体上，这使外源基因长期表达成为可能。因而这种方法特别适用于治疗被发现是先天性遗传异常的遗传疾病，例如腺苷脱氨酶缺失症、肌肉营养不良症或苯丙酮尿症。
此外，本发明的基因转移方法不仅可以用于基因治疗，而且还可以用来在体外获得带有各种外源基因的细胞。这样得到的含有转入基因的细胞可以用来生产有用物质、建立疾病模型等。
此外，依据本发明，可以使用试剂盒很方便地完成本发明，这个试剂盒包括含第一条核酸链的腺病毒载体和含第二条核酸链的腺病毒载体。例如，这个试剂盒包括构建腺病毒载体的成分，该腺病毒载体含有整合有所选择的外源目的基因的第一条核酸链以及含第二条核酸链的腺病毒载体。试剂盒可以进一步包括表达重组酶的载体。另外，用于制备腺病毒的培养细胞(宿主细胞)，培养基，培养皿等也可以包括在内。
以下举例说明本发明的基因转移方法是怎样进行的。
按如下方法制备包含第一条核酸链的腺病毒载体。
将rep区和帽子区从含有来自AAV基因组DNA的质粒中去除，并且将待转移的外源基因插入到产物中。待转移的外源基因的来源没有特定的限制。它可以来自于基因组或重组体，也可以是PCR扩增的或化学合成的。如上所述得到的质粒包含有一个整合单位，这个整合单位包含了来自于AAV的ITR序列，ITR序列被定位在外源基因的两侧。
下一步，利用限制酶消化从得到的质粒上制得整合单位。整合单位被插入粘粒pAxcw(包含除了E1和E3基因的几乎所有的腺病毒基因组)的Swa I位点，在腺病毒表达试剂盒(Takara Shuzo，下文提到的试剂盒1)中包含这个粘粒。包含整合单位的重组腺病毒可以利用试剂盒1从获得的重组粘粒制备得到。
按如下方法制备包含第二条核酸链的腺病毒载体。
以包含来自AAV基因组DNA的质粒来制备编码Rep78蛋白的区域。Rep78蛋白的编码区可以通过使用上面提到的质粒为模板进行PCR扩增得到，或将质粒用限制酶处理得到。
这样得到的DNA片断包含有Rep52蛋白的编码区，该蛋白可以阻遏腺病毒的增殖。接下来，为了阻止那个区域的表达，利用位点突变的技术，将编码Rep78蛋白第225个氨基酸残基的核苷酸序列由编码甲硫氨酸的ATG改变为编码甘氨酸的GGA。
下一步，突变的rep78基因片断被插入到粘粒pAxCALNLw上，此粘粒包含有腺病毒的基因组，启动子/loxP序列/填充片断序列/loxP序列/位于Swa I位点的Swa I克隆位点以制备含启动子/loxP序列/填充片断序列/loxP序列/突变的rep78基因片断的粘粒(第二条核酸链)。利用试剂盒1，可以由以上所得粘粒制备得到一种腺病毒，该腺病毒包括启动子/loxP序列/填充片断序列/loxP序列//突变的rep78基因片断(第二条核酸链)。
利用腺病毒Cre/loxP调节表达载体试剂盒(Takara Shuzo，以下指试剂盒2)里的粘粒pAxCALNLw可以制备包含第二条核酸链的腺病毒。它是通过在pAxCAwt的Swa I位点按照如下顺序插入以下序列制得的loxP序列，新霉素抗性基因，SV40多聚A信号，loxP序列，Swa I接头，其中pAxCAwt包含在试剂盒1中。pAxCAwt是一种粘粒，它是通过在上述的粘粒pAxcw上插入GAG启动子序列制备得到的。在这种情况下，新霉素抗性基因和SV40多聚A信号对应于填充片断序列。
表达cre的腺病毒载体可以用试剂盒1由重组粘粒制备得到，该重组粘粒是在粘粒pAxcw的Swa I位点插入cre基因得到的，正如第一种和第二种载体的制备方法一样。另一种选择是，一种用于表达cre基因的腺病毒载体，AxCANCre，也可以被使用，见Kanege等的描述(Nucleic Acid Rearch，233816-3821(1995))。还可以使用腺病毒Cre/loxP调节表达载体试剂盒(Takara Shuzo，试剂盒2)中的腺病毒载体AxCANCre。按以上方法制备的重组腺病毒滴度的测定方法在现有技术中是已知的。例如，可以依据试剂盒1中的方法来测定滴度。
依据传统的方法将得到的上述三种类型腺病毒载体转入到靶细胞中。在细胞内，cre基因表达产生的重组酶Cre将置于loxP序列间的填充片断序列移除。随后，rep基因表达产生的Rep蛋白把定位在IRTs间的外源目的基因整合到细胞染色体DNA上。通过应用PCR，确定外源目的基因是否以位点特异性的方式整合到靶细胞染色体DNA的AAVS1位点上是可能的。在PCR反应中，以染色体DNA作为模板，该染色体DNA得自用于基因转移的靶细胞，并使用了与整合单位退火的引物以及与AAVS1位点整合的引物。
单位数量的细胞特异整合的频率(整合频率)可以被确定，例如，通过以下方法。
制备第一条核酸链，该链包含一种药物抗性基因(例如，新霉素抗性基因)，该基因被插入到整合单位上。如果此第一条核酸链整合到靶细胞染色体DNA上，那么由靶细胞增殖所产生的子细胞就能表现出抗药性，因为他们总是带有药物抗性基因。另一方面，如果没有发生整合到靶细胞染色体DNA这一过程，那么靶细胞增殖所生成的子细胞就会成为药物敏感型，因为子细胞中不再保留有被转移进细胞的药物抗性基因。因此，当转移了含有药物抗性基因的第一条核酸链并将其插入到靶细胞后，将靶细胞在含有药物的培养基中长时间培养，只有发生整合的细胞才能增殖并形成集落(药物抗性集落)。
外源基因整合到靶细胞中的频率可以用一种比率确定，该比率是药物抗性集落的数量(药物抗性集落)比上在不含药物的培养基中长时间培养后所形成的集落数(总集落数)，公式如下(整合频率)＝(药物抗性集落)÷(总集落数)。
应该注意的是，上述确定的整合频率包括了非位点特异性的整合。位点特异性的整合频率可以用如下方法确定挑选数个药物抗性集落；通过以上提到的使用PCR的方法可以确定特异性整合；确定发生了位点特异性整合的集落在药物抗性克隆中所占的比率；然后，将以上提到的整合频率乘以确定的比率，就可以确定外源基因在靶细胞中位点特异性整合的频率。
实例以下实例进一步详细阐明了本发明，但是它们并不意味着限定本发明的适用范围。
例1重组腺病毒载体的制备1.1第一种载体的制备(包含第一条核酸链的腺病毒载体)用以下方法制备包含以β-半乳糖苷酶为外源基因的腺病毒载体AxAAVZ。
质粒pAV1(ATCC 37215)包含有来自AAV的基因组DNA，该AAV含有SEQ ID NO1的核苷酸序列。一种双链的EcoRV接头插入到pAV1的Ava II位点(在SEQ ID NO1上的第191个核苷酸)上，该接头包括合成的含有SEQ ID NO4的核苷酸序列的DNA和合成的含有SEQ IDNO5的核苷酸序列的DNA。另一种双链的EcoR V接头进一步插入到pAV1的Nco I位点(在SEQ ID NO1上的第4485个核苷酸)上，该接头包括两种合成的相互退火的DNA链，每一条链都含有SEQ ID NO6的核苷酸序列。结果，得到了一种质粒pAV1E5。用EcoR I和Hind III消化质粒pβgal(Clontech)得到一种DNA片断，该DNA片断包括CMV启动子，β-半乳糖苷酶基因和SV poly(A)信号。应用DNA平端试剂盒(Takara Shuzo)使该片断产生平末端，这样得到的片断插入到pAV1E5的EcoR V位点上。用Bgl II消化由此得到的质粒以制备βgal表达单位，该表达单位被置于来自AAV的ITRs之间(以下都称为整合单位)。整合单位插入到粘粒pAxcw的Swa I位点上，该粘粒是腺病毒表达载体试剂盒中(Takara Shuzo，试剂盒1)含有的。使用试剂盒1由上面得到的重组粘粒制备出重组的腺病毒AxITRZ。
1.2第二种载体的制备(包含第二条核酸链的腺病毒载体)用以下方法制备在靶细胞中表达rep基因的腺病毒载体AxCALNLRep78。
用PCR扩增SEQ ID NO1上第313至2205个核苷酸的区域，该区域包含rep78基因，该PCR是以质粒pAV1为模板，以含有SEQ ID NO2的核苷酸序列REPF和含有SEQ ID NO3的核苷酸序列REPR为引物。使用Takara Taq酶(Takara Shuzo)来进行PCR。
这样经扩增得到的DNA片断包含有rep52基因，该基因是除rep78外又一个阻遏腺病毒增殖的基因。为了消除rep78基因的抑制功能，Rep78蛋白上第225个氨基酸残基由甲硫氨酸被改变为甘氨酸。具体地说，利用质粒pAV1为模板，一种含有SEQ ID NO11核苷酸序列的寡聚核苷酸以及Mutan Super Expression Km(Takara Shuzo)，使SEQ ID NO1上第993-995的核苷酸由ATG改变为GGA。这样，按上述方法就得到了经过扩增的DNA片断。
扩增的突变DNA片断插入到粘粒pAxCALNLw的Swa I位点，该粘粒可以在腺病毒Cre/loxP调节表达试剂盒(Takara Shuzo，试剂盒2)中得到。然后用试剂盒1制备出腺病毒AxCALNRep78。
1.3第三种载体(用于表达Cre基因的载体)
使用腺病毒Cre/loxP调节表达试剂盒(Takara Shuzo，试剂盒2)中的腺病毒载体AxCANCre来表达Cre基因。
例2转染试验在24孔培养板(Iwaki Glass)上培养Hela细胞(ATCC CC1-2)。使用含有10％胎牛血清的DMEM的培养基(两者均为Bio Whittaker产品)培养这些细胞。使用重组腺病毒载体AxCANCre，AxCALNRep78和AxITRZ之一或其中组合，并依照试剂盒1所附说明书来进行转染试验。在培养细胞两天后，用以下方法可以检测整合单位在被转染细胞的AAVS1位点插入的情况。
用试剂盒1所附说明书所述方法制备来自被转染细胞的基因组DNA。以由此得到的基因组DNA为模板，以能与整合单位退火的引物81(SEQ ID NO7)和能与AAVS1位点退火的引物1722(SEQ ID NO8)作为引物来进行PCR。每1μl的PCR产物被点到尼龙膜上。使用DIG标记及检测试剂盒(Boehringer-Mannheim)进行点杂交以检测特异性整合。以人类基因组DNA为模板，以分别含有SEQ ID NO9和SEQ IDNO10核苷酸序列的引物79和80为引物，以PCR DIG探针合成试剂盒(Boehringer-Mannheim)制备探针。以此得到的探针带有AAVS1位点的核苷酸序列。结果如
图1所示。如
图1所示，当使用重组腺病毒载体，AxCANCre，AxCALNRep78和AxITRZ之一或其中两种进行转染时，将不会发生外源基因的位点特异性整合。只有当三种重组的腺病毒载体协同转染细胞时，位点特异性整合才能在细胞内被检测到。
例3接下来，使用人类肺来源的细胞系A549(ATCC CCL-185)或人类肝来源的细胞系HepG2(ATCC HB-8065)而不是Hela细胞作为靶细胞进行转染试验，以检测外源基因转移到细胞的情况。
转染试验按照例2所述进行，该转染使用重组腺病毒载体，AxCANCre，AxCALNRep78和AxITRZ之一或其中组合，这三种重组腺病毒载体是用例1方法得到的。依照例2所述方法来检测位点特异性整合。
结果是，对于A549和HepG2细胞来说，当使用三种重组腺病毒载体，AxCANCre，AxCALNRep78和AxITRZ之一或其中两种进行转染时，将不会发生外源基因的位点特异性整合，并且与在Hela细胞中发现的一致，只有当三种重组的腺病毒载体协同转染细胞时，位点特异性整合才能在细胞内被检测到。
这些结果表明依照本发明的方法，外源基因不仅能以位点特异性的方式整合到Hela细胞中，而且还能以这种方式整合到各种各样的人类细胞中。
工业可应用性本发明提供了一种转移外源基因的方法，该方法能够将外源基因有效地转移到人类细胞或人类个体中并且发生整合，具体地说是整合在第19号染色体的AAVS1位点。本发明在基因治疗中尤其有用。
序列列表自由原文SEQ ID NO2用于扩增Rep78基因命名为REPF的PCR引物SEQ ID NO3用于扩增Rep78基因命名为REPR的PCR引物SEQ ID NO4EcoRV接头SEQ ID NO5EcoRV接头SEQ ID NO6EcoRV接头SEQ ID NO7与整合单位退火的被命名为82的PCR引物SEQ ID NO8与AAVS 1区退火的被命名为1722的PCR引物SEQ ID NO9用以扩增被用作探针的AAVS1区的被命名为80的PCR引物SEQ ID NO10用以扩增被用作探针的AAVS1区的被命名为80的PCR引物SEQ ID NO11为了在Rep78基因中引入突变所设计的寡聚核苷酸序列表<110>Takara Shuzo Co.，Ltd.<120>基因转移方法<130>662206<150>JP 11-308839<151>1999-10-29<160>11<210>1<211>4675<212>DNA<213>腺伴随病毒(adeno-associated virus)<400>1ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120gccaactcca tcactagggg ttcctggagg ggtggagtcg tgacgtgaat tacgtcatag 180ggttagggag gtcctgtatt agaggtcacg tgagtgtttt gcgacatttt gcgacaccat 240gtggtcacgc tgggtattta agcccgagtg agcacgcagg gtctccattt tgaagcggga 300ggtttgaacg cgcagccgcc atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg 360accttgacgg gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg 420aatgggagtt gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga 480ccgtggccga gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc 540cggaggccct tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc 600tcgtggaaac caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg 660aaaaactgat tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg 720tcacaaagac cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc 780ccaattactt gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac 840agtatttaag cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga 900cgcacgtgtc gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc 960cggtgatcag atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca 1020aggggattac ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca 1080atgcggcctc caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta 1140tgagcctgac taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt 1200ccagcaatcg gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt 1260ccgtctttct gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg 1320ggcctgcaac 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caccccttgg gggtattttg acttcaacag 3060attccactgc cacttttcac cacgtgactg gcaaagactc atcaacaaca actggggatt 3120ccgacccaag agactcaact tcaagctctt taacattcaa gtcaaagagg tcacgcagaa 3180tgacggtacg acgacgattg ccaataacct taccagcacg gttcaggtgt ttactgactc 3240ggagtaccag ctcccgtacg tcctcggctc ggcgcatcaa ggatgcctcc cgccgttccc 3300agcagacgtc ttcatggtgc cacagtatgg atacctcacc ctgaacaacg ggagtcaggc 3360agtaggacgc tcttcatttt actgcctgga gtactttcct tctcagatgc tgcgtaccgg 3420aaacaacttt accttcagct acacttttga ggacgttcct ttccacagca gctacgctca 3480cagccagagt ctggaccgtc tcatgaatcc tctcatcgac cagtacctgt attacttgag 3540cagaacaaac actccaagtg gaaccaccac gcagtcaagg cttcagtttt ctcaggccgg 3600agcgagtgac attcgggacc agtctaggaa ctggcttcct ggaccctgtt accgccagca 3660gcgagtatca aagacatctg cggataacaa caacagtgaa tactcgtgga ctggagctac 3720caagtaccac ctcaatggca gagactctct ggtgaatccg gccatggcaa gccacaagga 3780cgatgaagaa aagttttttc ctcagagcgg ggttctcatc tttgggaagc aaggctcaga 3840gaaaacaaat gtgaacattg aaaaggtcat gattacagac gaagaggaaa tcggaacaac 3900caatcccgtg gctacggagc agtatggttc tgtatctacc aacctccaga gaggcaacag 3960acaagcagct accgcagatg tcaacacaca aggcgttctt ccaggcatgg tctggcagga 4020cagagatgtg taccttcagg ggcccatctg ggcaaagatt ccacacacgg acggacattt 4080tcacccctct cccctcatgg gtggattcgg acttaaacac cctcctccac agattctcat 4140caagaacacc ccggtacctg cgaatccttc gaccaccttc agtgcggcaa agtttgcttc 4200cttcatcaca cagtactcca cgggacacgg tcagcgtgga gatcgagtgg gagctgcaga 4260aggaaaacag caaacgctgg aatcccgaaa ttcagtacac ttccaactac aacaagtctg 4320ttaatcgtgg acttaccgtg gatactaatg gcgtgtattc agagcctcgc cccattggca 4380ccagatacct gactcgtaat ctgtaattgc ttgttaatca ataaaccgtt taattcgttt 4440cagttgaact ttggtctctg cgtatttctt tcttatctag tttccatggc tacgtagata 4500agtagcatgg cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc 4560cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg 4620gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaa 4675<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>被称为PCR引物的REPF，用于扩增Rep78基因<400>2gggaggtttg agatctcagc cgccat 26<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>被称为PCR引物的REPF，用于扩增Rep78基因<400>3ataaccatcg gcatgcatac ctgatt26<210>4<211>9<212>DNA<213>人工序列<220><223>EcoRV接头<400>4gtcgatatc 9<210>5<211>9<212>DNA<213>人工序列<220><223>EcoRV接头<400>5gacgatatc 9<210>6<211>10<212>DNA<213>人工序列<220><223>EcoRV接头<400>6catggatatc 10<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>被称为82的PCR引物，它与整合单位退火<400>7aggaacccct agtgatggag t 21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>它与AAVS1区退火被命名为1722的PCR引物<400>8ccatcctaag aaacgagaga t 21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>被称为79的PCR引物，用于扩增AAVS1区，被用作探针<400>9actttgagct ctactggctt c 21<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>称为80的PCR引物，用于扩增AAVS1区，被用作探针<400>10ggaggatccg ctcagagg 18<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>为了在Rep78基因中引入突变所设计的寡聚核苷酸<400>11gccaggtacg gagagctggt cg 2权利要求
1.一种将外源基因转入细胞的方法，此方法包括(a)用腺病毒载体转入细胞(1)第一条核酸链，该链包含一个序列，此序列有来自腺伴随病毒并定位在待转移的外源目的基因两侧的ITRs序列；以及(2)第二条核酸链，该链包含一个来自腺伴随病毒的rep基因，一个表达rep基因的启动子和一个位于两个重组酶识别序列之间的填充片断序列，该填充片断被插入到rep基因和启动子之间；(b)步骤(a)得到的细胞在重组酶的作用下表达Rep蛋白，从而将外源目的基因整合到细胞染色体DNA上。
2.权利要求1中的方法，其中使用单个腺病毒将第一条核酸链和第二条核酸链转入细胞。
3.权利要求1中的方法，其中使用相互独立的腺病毒载体将第一条核酸链和第二条核酸链转入细胞。
4.权利要求1到3中之一的方法，其中重组酶是被转入细胞的重组酶基因表达的。
5.权利要求4的方法，其中重组酶基因是用腺病毒载体转移进入细胞的。
6.权利要求5的方法，其中重组酶基因和第一条核酸链是用单个腺病毒载体转移转移进入细胞的。
7.权利要求5的方法，其中重组酶基因是用腺病毒载体转移进入细胞的，该腺病毒载体不同于转移第一条核酸链或第二条核酸链的腺病毒载体。
8.权利要求1到7中之一的方法，其中位于第二条核酸链上的重组酶识别序列是loxP序列，重组酶是来自于大肠杆菌(Escherichiacoli)P1噬菌体的Cre。
9.一种转移外源基因进入细胞的系统，该系统包括(1)一种腺病毒载体，该载体包含第一条核酸链，第一条核酸链中有一个序列，这个序列中来自于腺伴随病毒的IRTs被定位在待转移目的基因的两侧；以及(2)一种腺病毒载体，该载体包含第二条核酸链，此链包含一个来自于腺病毒的rep基因，一个表达rep基因的启动子和一个位于两个重组酶识别序列之间的填充片断序列，该填充片断被插入到rep基因和启动子之间。
10.一种转移外源基因进入细胞的系统，该系统包含一种腺病毒载体，该载体含有第一条核酸链，该链包含一个序列，此序列内有来自腺伴随病毒并定位在被转移的外源目的基因两侧的ITRs序列；以及第二条核酸链，此链包含一个来自腺病毒的rep基因，一个表达rep基因的启动子和一个位于两个重组酶识别序列之间的填充片断序列，该填充片断被插入到rep基因和启动子之间。
11.权利要求9或10的系统，该系统包含一个转移重组酶基因进入细胞的载体。
12.权利要求1系统，其中将重组酶基因转移进入细胞的载体是腺病毒载体。
13.权利要求12的系统，其中将重组酶基因转入细胞的载体与包含第一条核酸链的腺病毒载体同一，但是与包含第二条核酸链的腺病毒载体不同一。
14.权利要求12的系统，其中包含第一条核酸链的腺病毒载体，包含第二条核酸链的腺病毒载体和将重组酶基因转入细胞的载体是彼此不同的。
15.权利要求9到14之一的系统，其中在第二条核酸链上的重组酶识别序列是loxP核苷酸序列，重组酶是来自于大肠杆菌P1噬菌体的Cre。
16.一种转化得到的细胞，外源基因的转移使用权利要求1到8中所定义的任一方法。
17.一种转化得到的细胞，外源基因的转移使用权利要求9到15中所定义的任一系统。
全文摘要
一种将外源基因转入细胞的方法,其特征包括:使用腺病毒载体转化细胞的步骤,第一条核酸链,该链包含腺伴随病毒来源的定位在待转移目的基因两侧的ITRs序列,和第二条核酸链,该链包含腺伴随病毒来源的rep基因和表达该基因的启动子,并携带一个三明治式插入到两个重组酶识别序列间的填充片断序列,并且该序列被定位在rep基因和启动子之间;在重组酶作用下表达Rep蛋白的步骤,该表达是在上述步骤得到的细胞中进行的,从而使外源目的基因整合到染色体DNA上。
文档编号C12N7/01GK1387574SQ00815224
公开日2002年12月25日 申请日期2000年10月23日 优先权日1999年10月29日
发明者上野高嗣, 松村肇, 田中启二, 岩崎朋子, 上野充博, 藤永蕙, 浅田起代蔵, 加藤郁之进 申请人:宝酒造株式会社