专利名称：编程性细胞死亡蛋白关联蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及编程性细胞死亡领域。编程性细胞死亡是一种活性程序性生理过程，用以消除多余的、改变的或恶性的细胞(Earnshaw，1995，Duke等，1996)。在大多数细胞中，编程性细胞死亡的特征在于细胞收缩，细胞核分裂，DNA浓缩并裂解为结构域大小的片段，随后核小体间(internucleosomal)降解。编程性细胞死亡的细胞分裂成为膜包裹的编程性细胞死亡体。最后，相邻的细胞和/或巨噬细胞迅速吞噬这些死亡的细胞(Wyllie等，1980；White，1996)。可对在组织培养条件下生长的细胞和得自组织的细胞，用DNA染色剂如DAPI分析其编程性细胞死亡，DAPI规律性地强染色正常DNA，而只微弱和/或不规则地染色编程性细胞死亡DNA(Noteborn等，1994，Telford等，1992)。
编程性细胞死亡过程可通过各种调控刺激物启动(Wyllie，1995，White，1996，Levine，1997)。细胞存活率的变化在人体疾病的发病机理中起重要作用，例如在癌症产生和自身免疫疾病中，在其中观测到细胞增殖增强或细胞死亡降低(Kerr等，1994，Paulovich，1997)。已经证明许多化疗化合物和放疗在许多情况中，通过野生型p53蛋白诱导肿瘤细胞的编程性细胞死亡(Thompson，1996，Bellamy等，1995，Steller，1995，McDonell等，1995)。
然而，一些肿瘤在其发生期间获得一个p53的突变，这通常与对癌症治疗的反应低下相关。某些致瘤性DNA病毒的转化基因可通过直接与p53结合而使p53失活(Teodoro，1997)。这种因子例如是肿瘤DNA病毒SV40的大T抗原对一些肿瘤(白血病)而言，原癌基因Bcl-2或Bcr-abl的高水平表达与对各种诱导编程性细胞死亡的化疗剂的强烈抗性关联(Hockenberry 1994，Sachs和Lotem，1997)。
对这些缺失功能性p53的肿瘤而言(代表一多半的肿瘤)，另一种抗肿瘤治疗是基于诱导不依赖于p53的编程性细胞死亡而研究开发的(Thompson 1995，Paulovich等，1997)。研究人员需探求参与诱导编程性细胞死亡的因子，这种因子不需要p53和/或可以不被抗编程性细胞死亡活性阻断，如类似Bcl-2或Bcr-abl等的因子。这些因子可以是独特的编程性细胞死亡途径的一部分或可以是抑制编程性细胞死亡的化合物的(非常)下游。
编程性细胞死亡蛋白(Apoptin)是衍生自鸡贫血病病毒(CAV；Noteborn和De Boer，1995，Noteborn等，1991，Noteborn等，1994；1998a)的一种小蛋白质，其能在人体恶性转化细胞系中诱导编程性细胞死亡，但在非转化性人体细胞培养物中无此功能。在体外，编程性细胞死亡蛋白在正常的淋巴，皮肤，表皮，内皮和平滑肌细胞中不能诱导程序化细胞死亡。然而，当正常细胞是转化的时，它们通过编程性细胞死亡蛋白对编程性细胞死亡变得易感。编程性细胞死亡蛋白在正常人体成纤维细胞中长期表达表明编程性细胞死亡蛋白在这些细胞中无毒性或转化活性(Danen-van Oorschot，1997和Noteborn，1996)。
在正常细胞中，发现编程性细胞死亡蛋白在胞质中占优势，而在转化的或恶性的细胞中，即特征在于增生的，化生的，发育异常的或发育不全的细胞，其位于细胞核中，这提示编程性细胞死亡蛋白的位置与其活性相关(Danen-van Oorschot等，1997)。编程性细胞死亡蛋白诱导的编程性细胞死亡在不存在功能性p53的情况中发生(Zhuang等，1995a)，而且不能被Bcl-2，Bcr-abl(Zhuang等，1995)，或被Bcl-2关联蛋白BAG-1阻断(Danen-Van Oorschot，1997a，Noteborn，1996)。
因此，编程性细胞死亡蛋白是一种治疗性化合物，其选择性破坏肿瘤细胞，或其它增生的，化生的，发育异常的或发育不全的细胞，尤其由于缺失功能性p53以及Bcl-2和其它抑制编程性细胞死亡的因子(过)表达所致，对(化)疗法诱导的编程性细胞死亡已经有抗性的那些肿瘤细胞(Noteborn和Pietersen，1998)。看起来甚至前恶性的，最小转化的细胞也对编程性细胞死亡蛋白的诱导死亡的作用敏感。另外，Noteborn和Zhang(1998)已经示出编程性细胞死亡蛋白诱导的编程性细胞死亡可用于诊断癌变倾向的细胞及治疗癌变倾向的细胞。
编程性细胞死亡蛋白在正常人体细胞中不诱导编程性细胞死亡，至少在体外不诱导，这一事实表明在体内进行编程性细胞死亡蛋白处理的毒性作用会非常小。Noteborn和Pietersen(1998)和Pietersen等(1998)已经提供了这样的证据，即腺病毒表达的编程性细胞死亡蛋白在体内不具有急性毒性作用。另外，在裸鼠中示出编程性细胞死亡蛋白具有强抗肿瘤活性。
然而，为进一步扩大本领域可利用的治疗性抗癌或抗自身免疫疾病化合物的范围，需要其它的治疗性化合物，将这种化合物设计为单独起作用，或者在使用编程性细胞死亡蛋白之后使用或与其共同使用，尤其在p53是(部分)无功能的那些情况中。
本发明提供了新的治疗可能性，例如新的组合治疗方法或新的治疗性化合物，其可单独起作用，或者在使用编程性细胞死亡蛋白之后使用或与其共同使用，尤其在p53是(部分)无功能的那些情况中。
在第一个实施方案中，本发明提供了一种分离的或重组的核酸或其功能等价物或片段，其编码编程性细胞死亡蛋白关联蛋白质物质，其单独或与其它诱导编程性细胞死亡的物质如编程性细胞死亡蛋白组合能提供编程性细胞死亡。本文中此蛋白质物质是指包含肽，多肽或蛋白质的一种物质，其任选地已经例如通过糖基化，十四烷基化，磷酸化，加入脂质，通过同源或异源二聚或多聚化，或本领域已知的任何其它(翻译后)修饰加以修饰。
本文中与编程性细胞死亡蛋白关联(apoptin-associating)是指属于特异地参与可通过编程性细胞死亡蛋白诱导的编程性细胞死亡途径中发现的事件级联中的物质级联，优选特异地参与非p53依赖型编程性细胞死亡途径的那些物质。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种分离的或重组的核酸或其功能等价物或片段，其编码能提供编程性细胞死亡的与编程性细胞死亡蛋白关联的蛋白质物质。当以下这两种诱导编程性细胞死亡的物质存在于相同细胞中时，更优选地所编码的与编程性细胞死亡蛋白关联的蛋白质物质与其它诱导编程性细胞死亡的物质例如编程性细胞死亡蛋白共定位。在正常的非转化性细胞中，这两种诱导编程性细胞死亡的蛋白质共定位于胞质中，而在转化的或恶性的细胞中，这两种诱导编程性细胞死亡的蛋白质共定位于细胞核中。在另一实施方案中，与编程性细胞死亡蛋白关联的物质能结合小鼠转录因子YY1，后者已示出结合小鼠AAP-1同源物-RYBP(Garcia等，1999)。在一个更优选的实施方案中，编码能提供编程性细胞死亡的与编程性细胞死亡蛋白关联的蛋白质物质的所述分离的或重组的核酸或其功能等价物或片段衍生自一个cDNA文库，如可衍生自家禽的文库，但更优选衍生自一个哺乳动物cDNA文库，优选地其中所述cDNA文库包含人cDNA。
在另一实施方案中，本发明提供了一种编码能提供编程性细胞死亡的与编程性细胞死亡蛋白关联的蛋白质物质的分离的或重组的核酸或其功能等价物或片段，其能与编码能提供编程性细胞死亡的编程性细胞死亡蛋白关联的蛋白质物质的如图1或2所示的核酸分子杂交，尤其是编码一种能提供编程性细胞死亡的新蛋白质或其功能等价物，这种新蛋白质称为编程性细胞死亡蛋白关联蛋白质1，简称AAP-1。当然，本发明还提供了编码另外的能与AAP-1关联的编程性细胞死亡蛋白关联的蛋白质物质的一种分离的或重组的核酸或其功能等价物或片段，达到位于编程性细胞死亡蛋白级联中的种另外的蛋白质的手段和方法在以下加以详细阐述。
特别地，本发明提供了一种编码能提供编程性细胞死亡的编程性细胞死亡蛋白关联蛋白质物质的分离的或重组的核酸或其功能等价物或片段，其与编码图1或2所示编程性细胞死亡蛋白关联的蛋白质物质的核酸分子或其功能等价物或片段的核酸有至少70％的同源性，优选至少80％的同源性，更优选至少90％同源性，最优选至少95％同源性。
另外，本发明提供了一种包含本发明核酸的载体。这种载体的实例在下文详细阐述；如载体pMT2SM-AAP-1-a或b，表达Myc标记的AAP-1-a或AAP-1-b cDNA的pMT2SM载体，表达编程性细胞死亡蛋白关联的蛋白质片段的质粒，包含本发明核酸的大肠杆菌过表达载体如pMAL和pET22b等。这些和其它载体例如可用于发现来自上述级联的额外的编程性细胞死亡蛋白关联蛋白质物质，或者用于(过)表达由本发明的核酸编码的蛋白质。
在另一实施方案中，本发明提供了一种包含本发明核酸的载体，所述载体包括基因输送运载体，使本发明在基因疗法中非常有效。通过装备具有本发明核酸的基因运载体，及通过将所述运载体定向于已经过度增殖和/或已经示出死亡率降低的细胞，所述基因输送运载体给所述细胞提供编程性细胞死亡所需手段，提供了远程到达治疗的可能性。
另外，本发明提供了一种包含本发明核酸或载体的宿主细胞。例子包括转化的或转染的细菌或酵母细胞。根据本发明优选的宿主细胞是转化的真核细胞如酵母细胞，或脊椎动物细胞如用本发明核酸或载体转化或转染的哺乳动物细胞，或COS细胞。所述细胞一般能表达或产生具有关联编程性细胞死亡蛋白能力的能提供编程性细胞死亡的蛋白质物质。
本发明还提供了一种分离的或重组的编程性细胞死亡蛋白关联蛋白质物质，其能提供编程性细胞死亡。例如如图4所示，这种编程性细胞死亡蛋白关联蛋白质物质在细胞例如在肿瘤细胞或其它过度增殖的细胞中的表达，诱导编程性细胞死亡。其可以单独发挥作用，也可与其它诱导编程性细胞死亡的物质如编程性细胞死亡蛋白组合发挥作用，尤其不依赖于p53而起作用，这表明在功能性p53缺乏的情况中，编程性细胞死亡可通过本发明的物质诱导。当能提供编程性细胞死亡的编程性细胞死亡蛋白关联蛋白质物质与另一种诱导编程性细胞死亡的物质如编程性细胞死亡蛋白一起使用时，这两种蛋白质物质共定位于正常细胞的胞质内，但不引起编程性细胞死亡。而在转化的或恶性的细胞中，这两种诱导编程性细胞死亡的蛋白质共定位于细胞核中并诱导编程性细胞死亡。本发明还提供了一种蛋白质物质，其结合转录因子YY1，该转录因子已经示出结合AAP1小鼠同源物RYBP。尤其地，本发明提供了一种由本发明核酸编码的蛋白质物质，例如包含图3所示的至少一部分氨基酸序列或其功能等价物或功能片段，其单独或与诱导编程性细胞死亡的物质如编程性细胞死亡蛋白组合使用能提供编程性细胞死亡。
本发明还提供了一种分离的或合成的抗体，其特异地识别本发明的蛋白质物质或其功能等价物或功能片段。这种抗体例如可通过用编程性细胞死亡蛋白关联蛋白质物质或其免疫原性片段或等价物免疫接种实验动物，并从所述免疫接种的动物中收集多克隆抗体而获得(如以下详细阐述)，或者可通过本领域已知的其它方法获得，如通过产生单克隆抗体，或表达自核酸文库衍生的重组核酸的(单链)抗体或结合蛋白而获得，例如通过噬菌体展示方法获得。
利用这种抗体，本发明还提供了一种可由本发明这种抗体特异识别的蛋白质物质，例如通过免疫沉淀，Western印迹，或本领域已知的其它免疫学方法获得。
另外，本发明提供了本发明的核酸，载体，宿主细胞或蛋白质物质诱导编程性细胞死亡的应用，如图4所示。尤其地，提供了这种应用，其中所述编程性细胞死亡是不依赖于p53的。尤其地，这种应用进一步包括使用编码编程性细胞死亡蛋白或其功能等价物或片段的核酸，或使用编程性细胞死亡蛋白或其功能等价物或片段。如图4所示，组合这些诱导编程性细胞死亡的物质，可提高被处理的肿瘤细胞的编程性细胞死亡的百分率。
本发明提供的这种应用从治疗观点看是特别有益的。本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的核酸，载体，宿主细胞或蛋白质物质。另外，本发明提供的这种药物组合物还包含一种编码编程性细胞死亡蛋白或其功能等价物或片段的核酸，或编程性细胞死亡蛋白或其功能等价物或片段。
提供的这种药物组合物尤其是为了诱导编程性细胞死亡，例如其中所述编程性细胞死亡是非依赖于p53的，以治疗细胞增殖增强或细胞死亡降低的疾病，当所述疾病包括癌症或自身免疫疾病时，一般情况下均有细胞增殖增强或细胞死亡降低这种情况。本发明提供了一种治疗患有这样一种疾病的个体的方法，所述疾病表现为细胞增殖增强或细胞死亡降低，这种治疗方法包括用本发明的药物组合物治疗所述个体。特别地，这些组合物包含一种编程性细胞死亡途径的因子，这种因子是特异于转化的细胞的。因此，这些组合物对于与编程性细胞死亡过程的异常相关的疾病的新治疗方法是重要的，对于其诊断也是重要的，这种疾病例如是癌症或自身免疫疾病。
在诊断领域，本发明提供了一种在细胞样品中检测癌细胞或有癌变倾向细胞的方法，包括在所述样品中用本发明的核酸或载体转染细胞，培养所述细胞并确定样品中细胞编程性死亡的百分率。例如，我们可断定与正常非转化性细胞相比，AAP-1的细胞定位在致瘤性/转化的细胞中是不同的。另外，AAP-1在细胞核中累积与诱导编程性细胞死亡相关，而在胞质中累积与细胞存活性和正常增殖能力相关。本发明因此提供了一种在细胞样品中检测癌细胞或有癌变倾向的细胞的方法，包括在所述样品中用本发明的核酸或载体转染细胞，并确定所述样品中衍生自所述核酸或载体的蛋白质物质在细胞中的胞内位置。特别地，本发明提供了一种方法，其中所述细胞中的所述蛋白质物质是通过用抗体对所述细胞进行免疫染色而检测的，如用免疫荧光分析，或本领域已知的其它免疫分析方法。优选地，所述抗体包括本发明的抗体。
本发明还提供了一种鉴别推定的诱导癌症的因子如转化基因或其功能片段的方法，包括将细胞样品与所述因子例如通过转染相接触，或只将此因子提供给细胞周围的培养基，并用本发明的方法检测细胞样品中癌细胞或有癌变倾向的细胞的存在情况。
另外，本发明提供了一种检测细胞样品的癌变倾向，及从而检测细胞样品来源的个体的癌变倾向的方法，包括将所述细胞与诱导癌症的因子如UV光相接触，并用本发明的方法检测细胞样品中癌细胞或有癌变倾向的细胞的存在情况。
本发明在以下的详细论述中加以更详尽的阐述，其并非限制本发明。
发明详述我们使用酵母双杂交系统(Durfee等，1993)鉴别编程性细胞死亡蛋白关联的细胞化合物，其是诱导编程性细胞死亡所必需的。所用的系统是一种体内策略，以鉴别能与编程性细胞死亡蛋白自然关联的人体蛋白。该系统已经用于从cDNA文库中筛选编码能结合感兴趣蛋白质的蛋白质的克隆(Fields和Song，1989，Yang等，1992)。本发明提供了一种新的编程性细胞死亡蛋白关联蛋白，其中之一称为编程性细胞死亡蛋白关联蛋白1，简称为AAP-1。本发明还提供了一种诱导编程性细胞死亡的方法，通过干扰这种新揭示的AAP-1蛋白或其功能等价物或片段的功能，和/或通过(过)表达AAP-1蛋白或相关基因或其功能等价物或片段诱导编程性细胞死亡。
本发明还提供了一种抗肿瘤疗法，其基于干扰类AAP-1蛋白的功能和/或所述蛋白(过)表达。类AAP-1蛋白通常在无限增殖的细胞系中不是非常丰富的。因此，类AAP-1蛋白的异常高水平将导致与细胞转化相反的过程产生，这个过程称为编程性细胞死亡。本发明还提供了编程性细胞死亡蛋白诱导的编程性细胞死亡的介质，其是肿瘤特异性的。本发明提供了治疗癌症，自身免疫疾病或相关疾病的疗法，这种疗法基于单独使用类AAP-1蛋白或与编程性细胞死亡蛋白和/或类编程性细胞死亡蛋白化合物组合使用。构建pGBT9-VP3为构建能通过酵母双交系统鉴别编程性细胞死亡蛋白关联蛋白的饵质粒，将质粒pET-16b-VP3(Noteborn，未公布结果)用NdeI和BamHI处理。将0.4kb的NdeI-BamHI DNA片段从低熔点琼脂糖中分离。将质粒pGBT9(Clontech实验室，Palo Alto，美国)用限制酶EcoRI和BamHI处理。分离大约5.4kb的DNA片段，并连接于EcoRI-NdeI接头和含有从其自己的ATG起始密码子起始的编程性细胞死亡蛋白编码序列的0.4kb的DNA片段。将含有在酵母启动子ADH调节下的GAL4结合结构域序列和编程性细胞死亡蛋白的融合基因的最后构建体称为pGBT-VP3，并根据Sanger所述方法(1977)通过限制酶分析和DNA测序加以证实是正确的。
所有克隆步骤基本如Maniatis等所述(1992)进行。将质粒pGBT-VP3通过在CsCl梯度离心及在Sephacryl S500层析柱(Pharmacia)中层析进行纯化。GAL4活化结构域标记的cDNA文库将表达载体pACT用于检测编程性细胞死亡蛋白关联蛋白，所述载体含有与GAL4转录活化结构域融合的来自Epstein-Barr病毒转化的人B细胞的cDNA。此pACT cDNA文库衍生自λ-ACT cDNA文库，如Durfee等，1993所述。细菌和酵母菌株大肠杆菌JM109是质粒pGBT9和pGBT-VP3的转化受体。将菌株electromax/DH10B用于转化，以回收编程性细胞死亡蛋白关联的pACT-cDNA，该菌株得自美国GIBCO-BRL。
将酵母菌株Y190用于筛选cDNA文库和所有其它的转化体，其是所用的酵母双杂合体系统的一部分。培养基为进行药物选择，将培养大肠杆菌用的Luria Broth(LB)平板补加氨苄青霉素(50ug/ml)。酵母YPD和SC培养基如Rose等(1990)所述制备。
用质粒pGBT-VP3和pACT-cDNA转化感受态酵母菌株Y190，并筛选β-半乳糖苷酶活性。
根据Klebe等(1983)所述方法制备感受态酵母菌株Y190并转化。酵母细胞首先用pGBT-VP3转化，接着用pACT-cDNA转化，并将这些转化的酵母细胞生长于减去组氨酸的平板中，该平板中也没有亮氨酸和色氨酸。
将Hybond-N滤膜铺布于组氨酸阳性的酵母菌落上，并使其完全湿润。取出滤膜并淹没于液氮中以透化酵母细胞。将此滤膜解冻并使其有菌落一侧铺布于培养皿中的Whattman 3MM纸上，该培养皿具有含有0.27％β-巯基乙醇和1mg/ml X-gal的Z-缓冲液(每升16.1g Na2HPO4.7H2O，5.5g Na2HPO4.H2O，0.75g KCl和0.246gMgSO4.7H2O，pH7.0)。将滤膜温育至少15分钟或过夜。从酵母中回收质粒得自组氨酸和β-半乳糖苷酶阳性酵母细胞的总DNA，是通过使用如Hoffman和Winston(1987)所述的碱性蜗牛酶裂解方法制备的，并用于通过使用Bio-Rad基因脉冲仪，根据生产者的指导经电穿孔转化Electromax/DH10B细菌。
将转化体铺板于含有抗生素氨苄青霉素的LB平板上。分离编程性细胞死亡蛋白关联pACT克隆通过菌落—滤膜分析将菌落裂解，并与特异于pACT的放射性标记的17-mer寡聚体杂交(见序列分析章节)。从pACT-克隆中分离质粒DNA，通过XhoI消化分析cDNA插入体的存在情况。序列分析将含有编码编程性细胞死亡蛋白关联蛋白的序列的亚克隆，根据Sanger方法使用双脱氧NTPs测序，这是由Eurogentec(Seraing，Belgium)进行的。所用的测序引物是pACT特异性17-mer，其包含DNA序列5 -TACCACTACAATGGATG-3。
将编程性细胞死亡蛋白关联cDNAs的序列与来自EMBL/Genbank的已知基因序列相对比。构建pMAL-AAP1和pET22b-AAP1为构建能产生和分离编程性细胞死亡蛋白关联蛋白的蛋白质过表达质粒，使用质粒pMALTB和pET22b。质粒pMALTB是pMAL-C2(New England Biolabs)的一种衍生物，其中因子Xa位点已经由Trombin位点置换。将质粒pMALTB用BamHI和SalI处理，并从琼脂糖/TBE凝胶(QIAGEN凝胶提取试剂盒)中分离±7.0kb的DNA片段。编码完整开放读框的AAP1序列是在pACT-AAP-1b上通过PCR反应获得的，使用正向引物5′AACGGGATCCGGCGGCATGGGCGACAAGAAGAGCCCGACC3′，和反向引物5′AAAAGTCGACTCAGAAAGATTCATCATTGACTGCTGACAT3′；将±0.7kb的PCR片段用BamHI和SalI消化，并从琼脂糖/TBE凝胶中分离(QIAGEN凝胶提取试剂盒)。将含有在IPTG诱导的tac启动子调节下的MBP基因和AAP1基因之间的融合体的最终构建体称为pMAL-AAP1。
将质粒pET22b(Novagen)用NdeI和NotI消化，并从琼脂糖/TBE凝胶(QIAGEN凝胶提取试剂盒)中分离±5.5kb的DNA片段。编码完整开放读框的AAP1序列是在pACT-AAP-1b上通过PCR反应获得的，使用正向引物5′GGGAATTCCATATGGGCGACAAGAAGAGCCCGACC3′，和反向引物5 AAGGAAGTACGCGGCCGCGAAAGATTCATCATTGACTGCTGACATGT3′；将PCR产物用NdeI和NotI处理，并从琼脂糖/TBE凝胶中分离±0.7kb的片段(QIAGEN凝胶提取试剂盒)。将含有在IPTG诱导的T71ac启动子调节下的AAP1基因和(His)6-尾之间的融合体的最终构建体称为pET22b-AAP1。
根据Sanger所述方法(1977)通过限制酶分析和DNA测序证实这两个构建体是适当的。
所有克隆步骤基本如Maniatis等(1992)所述进行。过表达MBP-AAP1和AAP1-(His)6的细菌菌株为用质粒pMAL-AAP1产生蛋白质，使用大肠杆菌菌株B834(λDE3)，为用质粒pET22b-AAP1产生蛋白质，使用大肠杆菌菌株BL21(DE3)。这两个菌株均得自Novagen。结果与讨论编程性细胞死亡蛋白在转化的细胞如衍生自人体肿瘤的细胞系中特异性诱导编程性细胞死亡。为鉴别在这种细胞转化特异性和/或肿瘤特异性编程性细胞死亡途径中必需的化合物，对酵母进行遗传筛选。我们使用一种人cDNA文库，其是基于含有完整cDNA拷贝的质粒载体pACT，所述完整cDNA拷贝得自Epstein-Barr病毒转化的人B细胞(Durfee等，1993)。构建表达GAL4-DNA结合结构域和编程性细胞死亡蛋白的融合基因产物的饵质粒为检测人转化/致瘤性cDNA文库中编程性细胞死亡蛋白关联蛋白的存在情况，要构建一种所谓的饵质粒。为此，将侧翼为编程性细胞死亡蛋白基因下游的约40个碱基对的完整编程性细胞死亡蛋白编码区，克隆入质粒pGBT9的多克隆位点中。
将称为pGBT-VP3的最终构建体通过限制酶分析，并对编程性细胞死亡蛋白和GAL4-DNA结合结构域之间的融合区域进行测序。
编码编程性细胞死亡蛋白关联蛋白的一个基因(片段)是在酵母中通过反式激活GAL4应答启动子而确定的。
将编程性细胞死亡蛋白基因融合于质粒pGBT-VP3的GAL4-DNA结合结构域，而将衍生自转化的人B细胞的所有cDNAs融合于质粒pACT的GAL4-激活结构域。如果由所述cDNAs编码的一种蛋白质物质结合编程性细胞死亡蛋白，则GAL4-DNA结合结构域将位于GAL4-激活结构域附近，导致GAL4应答启动子激活，该启动子调节报道基因HIS3和LacZ。
含有表达编程性细胞死亡蛋白的质粒和表达编程性细胞死亡蛋白关联蛋白片段的质粒的酵母克隆，可生长于减去组氨酸的培养基上，并在β-半乳糖苷酶分析中染蓝。接着，可分离和定性具有编码编程性细胞死亡蛋白关联蛋白的cDNA插入体的质粒。
然而在我们可以这样做之前，我们已经确定单独用质粒pGBT-VP3，或组合空的pACT载体转化酵母细胞，不引起GAL4应答启动子激活。鉴别由衍生自人体转化的B细胞系的cDNA编码的编程性细胞死亡蛋白关联蛋白我们已经发现基于用pGBT-VP3和pACT-cDNA转化的两个酵母菌落，其能在减去组氨酸的培养基(也缺失亮氨酸和色氨酸)上生长，及在β-半乳糖苷酶分析中染成蓝色。这些结果表明所观测到的酵母菌落除了含有饵质粒pGBT-VP3之外，还含有编码潜在的编程性细胞死亡蛋白关联蛋白的质粒pACT。
从阳性酵母菌落中分离质粒DNA，转化到细菌中。通过使用pACT特异性标记的DNA探针进行滤膜杂交分析，可以确定含有pACT质粒的克隆。接着，分离pACT DNA并用限制酶XhoI消化，这是存在cDNA插入体的标示。最后，使用Sanger方法(Sanger等，1977)对含有cDNA插入体的pACT质粒进行测序。关于编程性细胞死亡蛋白关联蛋白的描述对编程性细胞死亡蛋白关联蛋白进行酵母遗传筛选，可检测到两个cDNA克隆A和B，其包含一个单一类型的蛋白质，将此新蛋白质称为编程性细胞死亡蛋白关联蛋白1，简称AAP-1。cDNAAAP-1-b具有含ATG起始密码子的完整的开放读框，而AAP-1-acDNA序列含有部分AAP-1开放读框，其完全同源于AAP-1-b DNA序列。
确定的AAP-1-a和AAP-1-b cDNA克隆的DNA序列分别示于图1和2。衍生自克隆AAP-1-b的检测的DNA序列的氨基酸序列示于图3，此氨基酸序列代表完整的AAP-1氨基酸序列。构建用于在哺乳动物细胞中鉴别AAP-1蛋白的表达载体为研究克隆的cDNAs AAP-1-a和AAP-1-b是否确实编码(编程性细胞死亡蛋白关联的)蛋白质产物，我们进行以下实验。
DNA质粒pMT2SM含有腺病毒5主要晚期启动子(MLP)和SV40 ori，能在转化的哺乳动物细胞如在SV-40转化的COS细胞中高水平表达外源基因，。另外，pMT2SM载体含有Myc标记(氨基酸EQKLISEEDL)，其与外源基因产物同框。此Myc标记使得能通过Myc标记特异性9E10抗体识别例如编程性细胞死亡蛋白关联蛋白。
如下构建表达Myc标记的AAP-1-a或AAP-1-b cDNAs的pMT2SM载体。将pACT-AAP-1-a和pACT-AAP-1-b cDNA克隆用限制酶XhoI消化，并分离cDNA插入体。将表达载体pMT2SM用XhoI消化，并用牛小肠碱性磷酸酶处理，与分离的AAP-1 cDNA插入体连接。通过序列分析，鉴别正确方向的含有AAP-1-a或AAP-1-b cDNA的pMT2SM构建体。
通过用质粒pMT2SM-AAP-1-a或pMT2SM-AAP-1-b转染COS细胞，分析Myc标记的AAP-1蛋白的合成。作为阴性对照，将COS细胞模拟转染。在转染2天后，将细胞裂解，并用Myc标记特异性抗体9E10进行Western印迹分析。
用pMT2SM-AAP-1-a和pMT2SM-AAP-1-b转染的COS细胞，证实可合成特异性Myc标记的AAP-1产物，该产物具有期望的大小33kDa(AAP-1-a)或35kDa(AAP-1-b)。正如所预期的，模拟转染的COS细胞的裂解物不含有与Myc标记特异性抗体反应的蛋白质产物。
这些结果表明我们已经能分离cDNAs，该cDNAs能产生具有关联诱导编程性细胞死亡的编程性细胞死亡蛋白蛋白的能力的蛋白质产物。在转化的哺乳动物细胞系中共免疫沉淀Myc标记的AAP-1蛋白和编程性细胞死亡蛋白接下来，我们使用Myc标记特异性抗体9E10，通过共免疫沉淀分析了编程性细胞死亡蛋白和AAP-1蛋白的关联情况。9E10抗体已示出不直接结合编程性细胞死亡蛋白，这可使得使用9E10进行共免疫沉淀(myc标记的)编程性细胞死亡蛋白关联蛋白和编程性细胞死亡蛋白。
为此，将COS细胞用编码编程性细胞死亡蛋白的质粒pCMV-VP3和质粒pMT2SM-AAP-1-a共转染。作为阴性对照，将细胞用表达编程性细胞死亡蛋白的pCMV-VP3和编码不与编程性细胞死亡蛋白关联的myc标记的β-半乳糖苷酶的质粒pcDNA3.1.LacZ-myc/His-LacZ转染。
在转染2天后，将细胞在缓冲液中裂解，该缓冲液含有50mM Tris(7.5)，250mM NaCl，5mM EDTA，0.1％Triton×100，1mg/mlNa4P2O7，和新鲜加入的蛋白酶抑制剂如PMSF，Trypsine抑制剂，Leupeptine和Na3VO4。将此特异性蛋白质如Noteborn等(1998)所述，使用Myc标记特异性抗体9E10进行免疫沉淀，并通过Western印迹分析。
用分别特异性抗myc标记和编程性细胞死亡蛋白的9E10抗体和111.3抗体进行的Western印迹染色示出，“总”细胞裂解物含有编程性细胞死亡蛋白和Myc标记的AAP-1蛋白或β-半乳糖苷酶产物。Myc标记的AAP-1产物的免疫沉淀是与16kDa的编程性细胞死亡蛋白产物的免疫沉淀相关联的。相反，免疫沉淀myc标记的β-半乳糖苷酶不产生明显的编程性细胞死亡蛋白蛋白共沉淀。
总共进行了3个独立的免疫沉淀实验，均示出编程性细胞死亡蛋白与AAP-1蛋白的关联能力。
这些结果表明新确定的AAP-1蛋白能特异地与编程性细胞死亡蛋白关联，不仅在酵母背景中，在哺乳动物转化的细胞系统中也如此。
所述新的AAP-1蛋白在人转化性细胞中的过表达诱导编程性细胞死亡过程。
另外，我们已经测试了AAP-1是否具有编程性细胞死亡蛋白活性。首先，我们分析了新AAP-1蛋白在人体转化的细胞中的定位。为此，如Danen-van Oorschot(1997)所述，用质粒pMT2SM-AAP-1-a或pMT2SM-AAP-1-b转染人骨肉瘤衍生的Saos-2细胞，这两种质粒分别编码myc标记的AAP-1-a或AAP-1-b蛋白。
使用myc标记特异性抗体9E10和DAPI，进行间接免疫荧光分析，这种分析染色细胞核DNA，示出部分和完整AAP-1蛋白在细胞核中均存在。实际上，其共定位于染色质/DNA结构中。
最后，我们测试了编码完整的或部分AAP-1蛋白的cDNAs的(过)表达是否诱导编程性细胞死亡。在转染4天后，大部分AAP-1阳性细胞被DAPI异常染色，这表明诱导了编程性细胞死亡(Telford，1992，Danen-van Oorschot，1997)。
在人体肿瘤细胞如Saos-2细胞中共表达编程性细胞死亡蛋白和两种AAP-1蛋白导致比编程性细胞死亡蛋白或AAP-1蛋白的单独表达更快的编程性细胞死亡进程。完整的AAP-1蛋白的编程性细胞死亡活性的结果示于图4。AAP-1在减去p53的Saos-2细胞中可诱导编程性细胞死亡的事实表明，AAP-1可诱导非依赖于p53的编程性细胞死亡。这些结果意味着AAP-1在其它(化学)治疗剂失效的情况下，可用作抗肿瘤因子。另外，发现编程性细胞死亡蛋白和AAP-1均诱导不依赖于p53的途径，表明AAP-1适合编程性细胞死亡蛋白诱导的编程性细胞死亡途径。编程性细胞死亡蛋白和AAP-1在人体肿瘤细胞中的共定位为确定编程性细胞死亡蛋白和AAP-1在转化的人体细胞中共定位的可能性，将编码编程性细胞死亡蛋白和AAP-1的质粒在Saos-2细胞中转染。通过间接免疫荧光分析监测AAP-1和编程性细胞死亡蛋白的表达，通过聚焦激光扫描显微镜，使用抗AAP-1上myc标记的特异性抗体mAb myc 9E10和抗编程性细胞死亡蛋白的C末端的pAb VP3-c。用编码AAP-1的质粒和编码编程性细胞死亡蛋白的质粒共转染的细胞，主要在细胞核中表达这些蛋白质。编程性细胞死亡蛋白和AAP-1均具有粒状结构和上述特征性结构。通过聚焦结构扫描显微镜，可清晰地示出在这些核结构中发生AAP-1和编程性细胞死亡蛋白部分共定位。
结论是我们鉴别了一种编程性细胞死亡蛋白关联蛋白，即新AAP-1蛋白，其存在于细胞核中并能在人体肿瘤细胞的诱导编程性细胞死亡(非p53依赖性)。另外，当AAP1和编程性细胞死亡蛋白在相同细胞中表达时，这两个诱导编程性细胞死亡的蛋白共定位于人体肿瘤细胞的细胞核中。AAP-1位于人体正常二倍体细胞的胞质结构中接下来，我们检测了AAP-1在正常的人体二倍体非转化性细胞中的作用是否与在人体肿瘤细胞中的作用相似。
为此，将人体二倍体VH10成纤维细胞(Danen-Van Oorschot，1997)，根据生产者的指导使用Fugene(Roche，Almere，TheNetherland)，用编码myc标记的完整AAP蛋白的质粒pMT2SM-AAP-1b进行转染。并行地，将人体肿瘤衍生的Saos-2细胞也用质粒pMT2SM-AAP-1b转染。
通过使用myc标记的特异性抗体9E10进行的间接免疫荧光分析示出在正常的二倍体VH10成纤维细胞中，AAP-1蛋白位于胞质中。正如所期望的，在人体肿瘤Saos-2细胞中，AAP-1位于细胞核中。
另外，如在只表达AAP-1的细胞中所进行的测试相同，我们测试了在人体VH10成纤维细胞中AAP-1和编程性细胞死亡蛋白共表达对AAP-1细胞定位的作用。免疫荧光分析数据表明编程性细胞死亡蛋白和AAP-1均位于胞质结构中。这些发现表明AAP-1和/或编程性细胞死亡蛋白的表达在正常(人体)二倍体细胞中不产生一种蛋白或另一种的核定位。编程性细胞死亡蛋白和AAP-1在人体成纤维细胞中的共定位为确定编程性细胞死亡蛋白和AAP-1在非转化性细胞中共定位的可能性，将编码编程性细胞死亡蛋白和AAP-1的质粒在VH10细胞中转染。通过间接免疫荧光分析利用聚焦激光扫描显微镜，使用抗AAP-1上myc标记的特异性抗体mAb myc 9E10和抗编程性细胞死亡蛋白C末端的pAb VP3-c，监测AAP-1和编程性细胞死亡蛋白的表达。通过用DAPI进行核染色，对细胞进行扫描编程性细胞死亡蛋白和AAP-1的共定位情况，及编程性细胞死亡的诱导情况。
用编码AAP-1的质粒和编码编程性细胞死亡蛋白的质粒共转染的细胞，主要在胞质中表达这些蛋白质。编程性细胞死亡蛋白和AAP-1均具有线状结构，有时是粒状结构。利用聚焦激光扫描显微镜，可清晰地示出在这些胞质结构中出现AAP-1和编程性细胞死亡蛋白共定位。当单独表达AAP-1时观测到相似结构，或单独表达编程性细胞死亡蛋白时也如此。
因此，不管有或无编程性细胞死亡蛋白，AAP-1在非转化性人体成纤维细胞中均定位于胞质，并具有线性聚集的结构。
结论是我们鉴别了一种编程性细胞死亡蛋白关联蛋白，称为AAP-1，其在人体非转化性二倍体细胞中的定位与在人体致瘤性细胞中的定位不同。这些结果示出AAP-1在正常的二倍体细胞中和在致瘤性细胞中的作用方式不同。另外，当AAP1和编程性细胞死亡蛋白在相同的正常非转化性细胞中表达时，这两个诱导编程性细胞死亡的蛋白质均定位于胞质中。诱导SV40大T抗原核定位信号与编程性细胞死亡蛋白共价连接的作用在以下的实验中，我们测试了由编程性细胞死亡蛋白和SV40 LT抗原的核定位信号组成的嵌合蛋白的表达是否在非转化性和转化的人体细胞中诱导编程性细胞死亡，所述嵌合蛋白是SV40大T抗原的氨基酸N末端-脯氨酸-脯氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-赖氨酸-缬氨酸-C末端共价地连于编程性细胞死亡蛋白的N末端。此嵌合蛋白称为NLS-编程性细胞死亡蛋白。
为此，将非转化性VH10人体成纤维细胞和转化的人体骨肉瘤衍生的Saos-2细胞(Danen-van Oorschot等，1997)，用编码嵌合蛋白NLS-编程性细胞死亡蛋白的质粒转染。在转化的人体细胞中，NLS-编程性细胞死亡蛋白的表达导致编程性细胞死亡蛋白定位于细胞核，并诱导编程性细胞死亡。然而，NLS-编程性细胞死亡蛋白在正常人体成纤维细胞中的表达导致编程性细胞死亡蛋白定位于细胞核，但不诱导编程性细胞死亡。这表明将编程性细胞死亡蛋白“强迫”转运至细胞核本质上不产生其编程性细胞死亡活性。编程性细胞死亡似乎需要额外的肿瘤相关事件。在正常人体成纤维细胞中NLS-编程性细胞死亡蛋白的表达对AAP-1的作用接下来，我们测试了NLS-编程性细胞死亡蛋白的表达是否可影响AAP-1在正常人体成纤维细胞中的细胞定位和/或其编程性细胞死亡活性。为此，将VH10细胞用编码NLS-编程性细胞死亡蛋白或AAP-1的质粒共转染。利用间接免疫荧光分析和DAPI扫描，使用荧光显微镜，清晰地示出NLS-编程性细胞死亡蛋白和AAP-1均位于细胞核中但不诱导编程性细胞死亡。这表明将AAP-1通过NLS-编程性细胞死亡蛋白“强迫”转运至细胞核本质上不产生AAP-1编程性细胞死亡活性。AAP-1与编程性细胞死亡蛋白相似，似乎需要一种另外的肿瘤相关的事件以在转化的细胞的细胞核中成为有编程性细胞死亡活性的。AAP-1在人体非转化性二倍体细胞中不诱导编程性细胞死亡在以下实验中，我们测试了单独的AAP-1或与编程性细胞死亡蛋白组合在人体非转化性二倍体成纤维细胞中，是否也能诱导与在人体致瘤性/转化的细胞中所观测到的相同的编程性细胞死亡。
为此，将VH10细胞用上述质粒pMT2SM-AAP-1-b转染。将转染的细胞通过使用myc标记特异性的和/或编程性细胞死亡蛋白特异性抗体进行间接免疫荧光分析，和DAPI染色进行分析。DAPI以与染色编程性细胞死亡DNA不同的方式染色完整的DNA(Telford等，1992)。此分析清晰示出只含有AAP-1蛋白或含有AAP-1和编程性细胞死亡蛋白的VH10成纤维细胞，不经历编程性细胞死亡。
所得结果示出编程性细胞死亡蛋白相关的蛋白如AAP-1，也许在“健康”的细胞中的功能方式与在肿瘤细胞中不同。诊断分析癌细胞基于现有报道，我们能总结出AAP-1的细胞定位在致瘤性/转化的人体细胞中与在正常人体非转化性细胞中不同。另外，AAP-1在细胞核中的累积与编程性细胞死亡相关，而其定位于胞质则与细胞存活性和正常增殖能力相关。因此，我们能开发一种诊断分析，以鉴别与正常“健康”的非转化性细胞相反的(人体)癌细胞。
这种分析包括用编码AAP-1的质粒转染“可疑的”(人体)细胞，例如人源的，或用表达AAP-1的病毒载体感染细胞，接着，检测细胞1)通过过表达AAP-1基因经历编程性细胞死亡的能力和2)AAP-1的定位从胞质中移至细胞核中。
用特异于AAP-1和/或特异于连接于AAP-1的标记的单克隆抗体，通过免疫荧光分析可确定AAP-1的胞内定位，所述标记例如是本文所述的myc标记。如果在表达AAP-1的分析的细胞中编程性细胞死亡和/或AAP-1定位于细胞核的百分率明显高于在APP-1阳性对照的“健康”细胞中的结果，可证明所分析的细胞已经成为致瘤性/转化的细胞。作为阳性对照，已知人体致瘤性细胞用于表达AAP-1。共表达SV40大T抗原和AAP-1导致APP-1易位及诱导编程性细胞死亡我们已经测试了转化基因的表达在衍生自健康个体的正常人体细胞中，对AAP-1诱导的编程性细胞死亡的作用。为此，将人体VH10二倍体成纤维细胞用编码完整AAP-1蛋白的质粒pMT2SM，和编码SV40大T抗原的质粒pR-s884或阴性对照质粒pCMV-neo(Notebom和Zhang，1998)共转染。
通过间接免疫荧光分析，分析细胞的AAP-1诱导的编程性细胞死亡情况。当AAP-1用阴性对照的质粒转染时，正常的VH10细胞不经历编程性细胞死亡。这正如所期望的，此结果示出AAP-1的表达在正常人体二倍体细胞中不能诱导编程性细胞死亡，这通过上述数据证实。然而，表达AAP-1和SV40大T抗原的正常二倍体人体成纤维细胞出现AAP-1诱导的编程性细胞死亡。
正常细胞从AAP-1抗性变为AAP-1敏感性，可能可通过以下事实加以解释即AAP-1蛋白从定位于胞质易位为定位于细胞核。这种改变在用编码转化蛋白SV40大T抗原的质粒转染2天后变得显而易见。可以推断在此实施例中由于衍生自DNA肿瘤病毒的转化产物的表达而发生了一种事件，其导致过表达的AAP-1从胞质易位至细胞核，这随后诱导编程性细胞死亡。基于AAP-1诱导的编程性细胞死亡、诱导癌症的基因、因子和癌症倾向的诊断分析基于现有报道，我们能开发一种诊断分析以鉴别诱导和/或转化癌症的因子或基因。
第一类分析包括用编码AAP-1的质粒转染“正常的”细胞例如源自于人体的细胞，或用表达AAP-1的病毒载体，与编码推定的转化/诱导癌症的基因的质粒一起感染细胞。接着，测试细胞1)通过过表达AAP-1基因经历编程性细胞死亡的能力，和2)AAP-1从胞质易位于细胞核的变化。
使用特异于AAP-1和/或特异于连接于AAP-1的标记如本文所述的myc标记的单克隆抗体，通过免疫荧光分析，可以确定AAP-1的胞内定位。如果在共表达AAP-1和推定的转化/诱导癌症的基因的正常细胞中，编程性细胞死亡和/或AAP-1定位于细胞核的百分率明显高于在表达对照质粒的AAP-1阳性对照细胞中的结果，则可以推断所分析的基因确实具有转化/诱导癌症的活性。
另一种诊断分析例如是基于用推定的致癌因子处理培养的正常二倍体细胞。例如可将这种因子加入培养基中，时间长短不一。接着，将细胞用编码AAP-1的质粒转染。此方案也可通过首先转染/感染正常二倍体细胞，然后用测试的因子处理此细胞而进行。
接下来的分析步骤与在第一种诊断分析中所述步骤相同。如果在共表达AAP-1和推定的转化/诱导癌症的基因的正常细胞中，编程性细胞死亡和/或AAP-1定位于细胞核的百分率明显高于在表达对照因子的AAP-1阳性对照细胞中的结果，则可以推断所分析的因子确实具有转化/诱导癌症的活性。
第三种诊断分析例如是基于处理培养的正常二倍体细胞，该细胞衍生自被测试的具有潜在癌症倾向的个体的皮肤活检组织，并将其在适当培养基中培养。接着，将细胞用UV照射及随后用编码AAP-1的质粒转染，或用表达AAP-1的病毒载体感染，或者将细胞首先转染/感染，然后照射。并行地，将得自正常健康个体的二倍体细胞用作对照。
接下来的步骤与第一种诊断分析中所述的步骤相同。如果在用UV处理后，在衍生自潜在具有癌症倾向的个体的二倍体细胞中，编程性细胞死亡和/或AAP-1定位于细胞核的百分率明显高于在UV处理的AAP-1阳性对照细胞中的结果，可以推断所分析的个体具有癌症倾向。在转化的细胞中AAP-1和YY1的彼此关联AAP-1的小鼠同源物RYBP(Garcia等，1999)可与YY1相互作用。YY1可激活或抑制细胞和病毒蛋白的转录。蛋白质之间的相互作用可影响YY1的活性。AAP-1可以与YY1相互作用。AAP-1和YY1之间的相互作用可影响YY1的活性，导致转录抑制或激活。基因的转录对编程性细胞死亡蛋白和/或AAP-1的编程性细胞死亡活性是重要的。
为确定AAP-1是否与YY1在体外形成复合物，将编码AAP-1和YY1的质粒(pCMV-HAVY-1；Dr Yang Shi惠赠，Harvard医学院，美国波士顿)在COS细胞中共转染。作为阴性对照，将YY1与LacZ共表达。将细胞裂解，并用抗AAP-1(或LacZ)的myc标记的特异性抗体，抗myc 9E10，和抗YY1的特异性抗体，抗YY1，进行免疫沉淀分析。将所得复合物通过Western印迹进行分析。正如所期望的，在细胞裂解物中检测到AAP-1和/或YY1和/或LacZ。
在用AAP-1和YY1转染的细胞中，清晰地观测到当使用特异于myc标记的AAP-1的抗体进行免疫沉淀时，AAP-1和YY1均可检测到。印迹示出一个32kD的条带(AAP-1)和一个67kD的条带(YY1)。另外，我们使用特异于YY1的抗体进行了免疫沉淀。同样，YY1和AAP-1在Western印迹中均可检测到。
在用只表达AAP-1的质粒转染的细胞中，只可检测到AAP-1。用编码YY1的质粒转染的细胞示出YY1表达，但检测不到AAP-1。为排除AAP-1与YY1的非特异性结合，将细胞用AAP-1和LacZ转染，及使用特异于LacZ的抗体进行免疫沉淀。尽管在Western印迹上可清晰观测到LacZ蛋白，但观测不到AAP-1蛋白。
因此，所得结果示出AAP-1特异性结合转录相关的因子YY1。产生和分离MBP-AAP1和AAP1-(His)6为测试产生MBP-AAP1和AAP1-(His)6融合蛋白的可能性，将编码开放读框的AAP1核酸克隆入蛋白质过表达盒pMALTB和pET22b中。根据生产者的指导(Novagen)诱导大肠杆菌产生可溶的融合蛋白。
通过亲和分析(直链淀粉树脂，New England Biolabs)和离子交换层析(High-S，Biorad)分离MBP-AAP1融合蛋白，产生90-95％纯度的全长蛋白质。对此蛋白质进行的大小排阻层析(PharmaciaSuperose 6 HR 10/30)示出，MBP-AAP1制品的主要部分表现为是一个独特种类，一个同源三聚或四聚体。此发现提示重组AAP1(MBP融合蛋白形式)能正确折叠，及很可能是生物学活性的。
用金属亲和层析(Ni2+-NTA，QIAGEN)分离AAP1-(His)6蛋白产生±80％纯度的蛋白质。
结论是AAP1与MBP的融合产生正确折叠的，可溶的AAP1，其很可能是生物学活性的。产生抗AAP1蛋白的多克隆抗体为产生抗AAP-1蛋白的多克隆抗体，合成一种推定的免疫原性肽(由氨基酸N末端-CTKTSETNHTSRPRLK-C末端组成的AAP-1肽；EuroGentec SA，Belgium)。接着，将兔根据生产者的标准程序用该肽注射。
通过ELISA和Western印迹分析示出，用AAP-1肽注射的兔血清是特异于上述AAP-1产物的。这些结果意味着我们已经产生了特异性抗体，其可用于检测编程性细胞死亡蛋白关联蛋白AAP-1。
结论是我们提供了特异性因子对AAP-1蛋白功能的干扰作用诱导编程性细胞死亡。基于利用对AAP-1蛋白功能的干扰作用，诱导(非p53依赖性的)编程性细胞死亡的治疗方法是可行的。这种相互作用的因子例如是编程性细胞死亡蛋白。已知诱导编程性细胞死亡及还已知增强编程性细胞死亡蛋白活性的另一种CAV衍生的蛋白质是VP2(Noteborn等，1997)。
图1示出载体pMT2SM-AAP-1-a的部分序列。AAP-1-a cDNA的DNA序列以黑体字表示。
图2示出载体pMT2SM-AAP-1-b的部分序列。AAP-1-b cDNA的DNA序列以黑体字表示。
图3示出编程性细胞死亡蛋白关联克隆AAP-1-b的所分析区域的氨基酸序列(以黑体字表示)。另外，给出了pACT的多克隆位点的3个C末端氨基酸H-E-G，以例证AAP-1氨基酸序列与GAL4激活结构域同框。此特点证实了AAP-1区域确实是在酵母细胞中合成的。注意在图3中第23位氨基酸相当于类AAP-1蛋白的第一位氨基酸。本文中功能性结构域或片段可例如被鉴别为转录因子结合结构域，其是从第1位氨基酸(图3中为第23位)至大约54位；锌指基序，蛋白质之间相互作用和/或蛋白质与核酸之间相互作用结构域，其是从大约第25位(图3中第47位)至大约42位；编程性细胞死亡的相关区域，其在大约第32至226位；在大约第74氨基酸位至81位的核定位信号；在大约第102氨基酸位至108位的核定位信号，或者在另一种类AAP-1蛋白的等价位置。
图4示出当单独表达(实心方框)或与编程性细胞死亡蛋白组合表达(空心方框)时，AAP-1-b蛋白在Saos-2细胞中的编程性细胞死亡活性。也标示了编程性细胞死亡蛋白诱导的编程性细胞死亡的百分率(实心三角形)。
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权利要求
1.一种分离的或重组的核酸或其功能等价物或片段，其编码能提供编程性细胞死亡的编程性细胞死亡蛋白关联蛋白质物质。
2.权利要求1的核酸，其中所述编程性细胞死亡蛋白关联蛋白质物质与编程性细胞死亡蛋白共定位。
3.权利要求1或2的核酸，其中所述编程性细胞死亡蛋白关联蛋白质物质与小鼠转录因子YY1结合。
4.权利要求1-3任一项的核酸，其衍生自cDNA文库。
5.权利要求1-4任一项的核酸，其中所述cDNA文库包含人cDNA。
6.权利要求1-5任一项的核酸，其能杂交如图1或2所示编码编程性细胞死亡蛋白关联蛋白质物质的核酸分子。
7.权利要求1-6任一项的核酸，其与图1或2所示编码编程性细胞死亡蛋白关联的蛋白质物质的核酸分子，或其功能等价物或片段，具有至少70％的同源性。
8.一种包含权利要求1-7任一项的核酸的载体。
9.权利要求8的载体，其包括基因输送运载体。
10.一种宿主细胞，其包含权利要求1-7任一项的核酸，或包含权利要求8或9的载体。
11.权利要求10的宿主细胞，其是一种真核细胞如酵母细胞或脊椎动物细胞。
12.一种能提供编程性细胞死亡的分离的或重组的编程性细胞死亡蛋白关联的蛋白质物质。
13.权利要求12的蛋白质物质，其能与编程性细胞死亡蛋白共定位。
14.权利要求12或13的蛋白质物质，其与小鼠转录因子YY1结合。
15.权利要求12-14任一项的蛋白质物质，其由权利要求1-7任一项的核酸编码。
16.权利要求12-15任一项的蛋白质物质，其包含图3所示的氨基酸序列的至少一部分，或其功能等价物或片段。
17.一种分离的或合成抗体，其特异识别权利要求12-16任一项的蛋白质物质或其功能等价物或片段。
18.一种可由权利要求17的抗体特异识别的蛋白质物质。
19.权利要求1-7任一项的核酸、权利要求10或11的宿主细胞、权利要求12-16或18任一项的蛋白质物质在诱导编程性细胞死亡中的应用。
20.权利要求19的应用，其中所述编程性细胞死亡是不依赖于p53的。
21.权利要求19或20的应用，还包括编码编程性细胞死亡蛋白或其功能等价物或片段的核酸的应用，或编程性细胞死亡蛋白或其功能等价物或片段的应用。
22.一种药物组合物，其包含权利要求1-7任一项的核酸，权利要求8或9的载体，权利要求10或11的宿主细胞，或权利要求12-16或18的蛋白质物质。
23.权利要求22的药物组合物，还包含编码编程性细胞死亡蛋白或其功能等价物或片段的核酸，或包含编程性细胞死亡蛋白或其功能等价物或片段。
24.权利要求22或23的药物组合物，其诱导编程性细胞死亡。
25.权利要求24的药物组合物，其中所述编程性细胞死亡是不依赖于p53的。
26.权利要求22-25任一项的药物组合物，用以治疗其中观察到细胞增殖增强或细胞死亡降低的疾病。
27.权利要求26的药物组合物，其中所述疾病包括癌症或自身免疫疾病。
28.一种治疗具有这样一种疾病的个体的方法，所述疾病中观察到细胞增殖增强或细胞死亡降低，这种方法包括用权利要求22-27任一项的药物组合物治疗所述个体。
29.一种检测细胞样品中癌细胞或有癌变倾向的细胞存在与否的方法，包括用权利要求1-7任一项的核酸，或权利要求8或9的载体转染所述样品中的细胞，及确定所述样品中细胞编程性死亡的百分率。
30.一种检测细胞样品中癌细胞或有癌变倾向的细胞存在与否的方法，包括用权利要求1-7任一项的核酸，或权利要求8或9的载体转染所述样品中的细胞，及检测衍生自所述核酸或载体的蛋白质物质在所述样品细胞中的胞内定位。
31.权利要求30的方法，其中所述细胞中所述蛋白质物质的存在情况是通过用抗体免疫染色所述细胞而检测的。
32.权利要求31的方法，其中所述抗体包括权利要求17的抗体。
33.一种鉴别推定的诱导癌变的因子的方法，包括将细胞样品与所述因子接触，并用权利要求29-32任一项的方法检测细胞样品中癌细胞或有癌变倾向的细胞存在情况。
34.权利要求33的方法，其中所述推定的诱导癌变的因子包括一种基因或其功能片段。
全文摘要
本发明涉及编程性细胞死亡领域。本发明提供了新的治疗可能性,例如可单独发挥作用、在编程性细胞死亡蛋白之后或与其联合发挥作用的新的组合疗法或新的治疗化合物,特别是用于p53(部分)无功能的情况中。
文档编号C12N5/10GK1387569SQ00815255
公开日2002年12月25日 申请日期2000年9月1日 优先权日1999年9月2日
发明者马蒂厄·许贝特斯·玛丽亚·诺特博恩, 阿斯特丽德·阿德里安娜·安娜·玛丽, 亚·达南－范奥尔斯霍特 申请人:利德公司