新型蛋白质及其dna的制作方法

专利名称：新型蛋白质及其dna的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型蛋白质及其DNA，其用于支气管哮喘和慢性阻塞性肺部疾患等的诊断标记物，试剂靶，或者用作感染性疾病，免疫机能缺陷病等的治疗药物或预防药物等。
背景技术：
支气管哮喘是呼吸道的慢性炎症，表明呼吸道狭窄，症状表现为发作性呼吸困难，哮喘，咳嗽。其起始症状和病情的进展与呼吸道的上皮细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等多种细胞有关。支气管哮喘最重要的特征之一是呼吸道对刺激反应敏感(过敏性呼吸道)。这种过敏性被认为是主要与浸润呼吸道内的嗜酸性粒细胞等分泌的化学传递物质导致呼吸道上皮剥离而引起的呼吸道炎症，但是更倾向于这种炎症与复杂的遗传因素及环境因素有关。
若从外界来的刺激(过敏原，排除物)和病毒等引起的呼吸道炎症发生，则在呼吸道上皮细胞和支气管周边的毛细血管内皮细胞上将有粘着分子进行表达，如VCAM-1和ICAM-1等[(J.Allergy Clin.Immunol.)，第96卷，第941项(1995)]，并产生细胞因子和化学游走物质。支气管哮喘的患者其Th2型辅助T细胞的机能产生亢进，其Th2型细胞因子包括IL-3、IL-4、IL-5、IL-13、GM-CSF等，和趋化因子包括eotaxin、RANTES等增加。IL-4和IL-13对IgE具有诱导作用，同时IL-3和IL-4对肥大细胞的增殖具有诱导作用。IL-5、GM-CSF等可使嗜酸性粒细胞增殖分化，eotaxin、RANTES可使呼吸道发生浸润现象[(Allergy Asthma Proc.)，第20卷，第141项(1999)]。
覆盖在气管或支气管上的黏膜上皮细胞不仅具有屏障作用以及排除分泌物或异物的作用外，而且还能控制由于上皮分泌的平滑肌迟缓因子对气管的收缩作用，所述屏障作用是指为了防止从外界来的刺激直接传递到黏膜下部的组织内。浸润到支气管哮喘患者呼吸道的嗜酸性粒细胞以脱颗粒的方式释放细胞内的颗粒蛋白[(Compr.Ther.)第20卷，第651项(1994)]，其中包括活化的MBP(主要为碱性蛋白)和ECP(嗜酸性粒细胞阳离子蛋白)等。这些颗粒蛋白对上皮细胞具有杀伤作用使上皮细胞脱落损伤。由于上皮细胞的剥离使感觉神经末梢露出，上皮通透性亢进，造成上皮分泌的平滑肌弛缓因子的丧失。另外，嗜酸性粒细胞产生的白三烯(LTC4)和血小板活化因子(PAF)可使支气管平滑肌紧张度亢进。以上这些变化引起慢性重复性发作进而可导致支气管壁加厚，成为过敏性呼吸道。
如众所周知，上述的细胞因子和粘着分子的基因表达不断增加与呼吸道炎症相关，然而在肺或支气管病变的部位进行表达并系统地分析基因的变化与呼吸道过敏性的成立以及相互关系至今尚无报道。
曾经在がゥチヤ-病患者的血浆中检测出几丁质分解酶的活性[(J.Clin.Invest.)，第93卷，1288页(1994)]，这种酶作为哺乳类唯一的分解酶[(J.Biol.Chem.)，第270卷，2198页(1995)]已经被纯化和克隆[(J.Biol.Chem.)，第270卷，26252页(1995)]，虽然已经作为该疾病的表记物，但是未见有关支气管哮喘和几丁质分解酶之间的相关性的报道。
本发明在对过敏性呼吸道亢进的肺或支气管方面提供能够增加表达的新型蛋白质或其盐；该蛋白质的部分肽或其盐；信号肽；编码该蛋白质；部分蛋白质或信号的DNA；重组载体；转化体；制备该蛋白质的方法；含有该蛋白质或DNA的药物；针对该蛋白质的抗体；筛选能促进或抑制所述蛋白质的化合物的方法；筛选能促进或抑制所述蛋白质活性的化合物的方法以及用于筛选法获得的化合物等。

发明内容
本发明人为了解决所述的技术方案反复钻研终于从哮喘型肺或支气管的小鼠模型中发现与之有关的基因表达显著增加。根据这个基因的碱基序列，又从人的胃cDNA文库中成功地克隆了具有新的碱基序列cDNA。同时又发现被编码的蛋白质属于几丁质分解酶的家族。
本发明人根据这些建树经过反复研究，最后终于完成了本发明的技术课题。
因此，本发明涉及(1)一种蛋白质或其盐，其中包括与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列；
(2)一种(1)所述的蛋白质的部分肽或其盐；(3)一种信号肽或其盐，其中包括与SEQ ID NO2所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列；(4)一种DNA，其中包括编码(1)所述蛋白质或(2)所述部分肽的DNA；(5)(4)所述的DNA，其中包括SEQ ID NO3所示的碱基序列；(6)一种DNA，其中包括编码权利要求3所述信号肽的DNA；(7)(6)所述的DNA，其中包括SEQ ID NO4所示的碱基序列；(8)一种重组载体，其中包括(4)所述的DNA；(9)一种转化体，其用(8)所述的重组载体转化而成；(10)一种(1)所述蛋白质或(2)所述部分肽或其盐的制备方法，其特征在于，培养(9)所述的转化体，并从中生成积累(1)所述的蛋白质或(2)所述的部分肽得到所需蛋白质或部分肽；(11)一种药物，其中包括(1)所述的蛋白质或(2)所述的部分肽或其盐；(12)一种药物，其中包括(4)所述的DNA；(13)一种抗体，其针对(1)所述的蛋白质或(2)所述的部分肽或其盐；(14)一种用于筛选化合物或其盐的方法，所述化合物或其盐能够促进或抑制(1)所述蛋白质或(2)所述部分肽或其盐的活性，该方法的特征在于包括应用(1)所述的蛋白质或(2)所述的部分肽或其盐；(15)一种用于筛选化合物或其盐的试剂盒，所述化合物或其盐能够促进或抑制(1)所述蛋白质或(2)所述部分肽或其盐的活性，其中所述试剂盒包括(1)所述的蛋白质或(2)所述的部分肽或其盐；(16)一种化合物或其盐，它能够促进或抑制(1)所述的蛋白质或(2)所述的部分肽或其盐的活性，该化合物或其盐可通过使用(14)的筛选法或(15)的筛选试剂盒而获得；(17)一种药物，其中包括能促进或抑制(1)所述蛋白质或(2)所述部分肽或其盐活性的化合物或其盐，所述化合物或其盐可通过使用(14)的筛选法或(15)的筛选试剂盒而获得；(18)一种用于筛选化合物或其盐的方法，所述化合物或其盐具有抑制蛋白质或其部分肽或其盐的活性，其特征在于，利用所述蛋白质或其部分肽或其盐，所述蛋白质或其部分肽或其盐包含与SEQ ID NO18所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列；
(19)一种用于筛选化合物或其盐的试剂盒，所述化合物或其盐具有抑制蛋白质或其部分肽或其盐的活性，其中包含所述蛋白质或其部分肽或其盐，该蛋白质或其部分肽或其盐包含与SEQ ID NO18所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列；(20)一种化合物或其盐，它能抑制蛋白质或其部分肽或其盐的活性，所述蛋白质或其部分肽或其盐包含与SEQ ID NO18所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列，其中所述化合物或其盐可通过使用(18)所述的筛选法或(19)所述的筛选试剂盒而获得；(21)一种药物，其中包括(20)所述的化合物或其盐，等等。


图1为实施例2正常或小鼠过敏性呼吸道亢进模型ECF-L基因产物(mRNA)的组织分布示意图。图中Lu，H，Li，Ki，Br，Thy，Sp，SI，LI，St和PBL分别表示肺、心脏、肝脏、肾脏、脑、胸腺、脾、小肠、大肠、胃和外周血淋巴细胞。
图2为实施例3实验中所示的给药计划。
图3为呼吸道对给药乙酰胆碱500ug/kg后随时间变化的反应。Ach表示乙酰胆碱。
图4为在实施例3肺胞洗涤液中渗入细胞数与时间变化的关系。Mφ、Eos、Neu和Lym分别表示噬菌体，嗜酸性粒细胞，嗜中性粒细胞和淋巴细胞。
图5为实施例3小鼠过敏性呼吸道亢进模型ECF-L的基因产物(mRNA)随时间变化的关系。
图6为实施例4正常小鼠或过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型在肺部冷冻切片中ECF-L基因的表达部位。
图7为编码源于人的ECF-L样蛋白质的DNA(人ECF-L)和小鼠ECF-L基因(小鼠ECF-L)之间的碱基序列的比较。
图8为源于人的ECF-L样蛋白质(人ECF-L)和小鼠ECF-L蛋白质(小鼠ECF-L)之间的氨基酸序列的比较图9为源于人的ECF-L样蛋白质(人ECF-L)以及除了属于几丁质分解酶家族以外的蛋白质(人壳三糖酶，人HC-gp39prt，人YKL-39)之间的氨基酸序列的比较(下接图10)。
图10为源于人的ECF-L样蛋白质(人ECF-L)以及除了属于几丁质分解酶家族以外的蛋白质(人壳三糖酶，人HC-gp39prt，人YKL-39)之间的氨基酸序列的比较(上接图9)。
图11为编码源于人的ECF-L样蛋白质的基因(mRNA)的组织分布。
具体实施例方式
具有与本发明SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同序列的蛋白质(下文通常称为本发明蛋白质I)或被本发明使用的与SEQ ID NO18所示氨基酸序列相同或基本相同序列的蛋白质(下文通常称为本发明蛋白质II)均可来自人或温血动物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、家鸡、兔子、猪、绵羊、牛、猴子等)细胞如肝细胞、脾细胞、神经细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞、骨髓细胞、肾小球膜细胞、朗格罕氏细胞、表皮细胞、上皮细胞、杯细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、脂肪细胞、免疫细胞(例如，巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞)、巨核细胞、滑膜细胞、软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、乳腺细胞、或间质细胞、或者这些细胞的前体细胞、干细胞或癌细胞等)或者含此类细胞的组织，例如脑、脑的任何部分(例如，嗅球、屏状核、大脑基底神经节、海马、丘脑、下丘脑、大脑皮质、延髓、小脑)、脊髓、垂体、胃、胰腺、肾、肝、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、肾上腺、皮肤、肌肉、肺、消化道(例如大肠、小肠)、血管、心脏、胸腺、脾、领下腺、外周血、前列腺、睾丸、卵巢、胎盘、子宫、骨、关节、骨骼肌等。
作为与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，可举例为，具有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列同源性至少约80％，优选至少约90％，更优选至少约95％的氨基酸序列。
作为包括与本发明SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的序列的蛋白质，例如优选具有与上述SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同，并且具有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白质性质基本相同的蛋白质等。
所述性质基本相同的例子包括，对肺或支气管随时间变化的表达和表达类型以及几丁质分解酶的活性等。所谓性质基本相同是指，它们的性质在定性上相同。因此，优选肺或支气管随时间变化的表达和表达类型以及几丁质分解酶的活性相同。然而，这些性质的强弱或蛋白质分子量等其量化要素可以不尽相同。
作为蛋白质I可进一步举例为，①在SEQ ID NO1所示氨基酸序列中至少有1或2个以上氨基酸缺失(优选1～30个，更优选1～10个，最优选1～5个)，②在SEQ ID NO1所示氨基酸序列中至少有1或2个以上氨基酸附加(优选1～30个，更优选1～10个，最优选1～5个)，③在SEQ IDNO1所示氨基酸序列中至少有1或2个以上氨基酸插入(优选1～30个，更优选1～10个，最优选1～5个)，④在SEQ ID NO1所示氨基酸序列中至少有1或2个以上氨基酸被置换(优选1～30个，更优选1～10个，最优选1～5个)，以及⑤上述氨基酸序列的组合，同时也可包括突变蛋白质等。
作为与SEQ ID NO18所示氨基酸序列基本相同的序列，可举例为，具有与上述SEQ ID NO18所示氨基酸序列同源性相同的至少约80％，优选至少约90％，更优选至少约95％的氨基酸序列。
作为包括与本发明SEQ ID NO18所示氨基酸序列基本相同的序列的蛋白质，例如优选具有与上述SEQ ID NO18所示氨基酸序列基本相同，并且具有与SEQ ID NO18所示氨基酸序列的蛋白质性质基本相同的蛋白质等。
所述性质基本相同的例子有，对肺或支气管随时间变化的表达和表达类型等。所谓性质基本相同是指，它们的性质在定性上相同。因此，优选肺或支气管随时间变化的表达和表达类型相同。然而，这些性质的强弱或蛋白质分子量等其量化要素可以不尽相同。
作为蛋白质II可进一步举例为，①在SEQ ID NO18所示氨基酸序列中至少有1或2个以上氨基酸缺失(优选1～30个，更优选1～10个，最优选1～5个)，②在SEQ ID NO18所示氨基酸序列中至少有1或2个以上氨基酸附加(优选1～30个，更优选1～10个，最优选1～5个)，③在SEQ IDNO18所示氨基酸序列中至少有1或2个以上氨基酸插入(优选1～30个，更优选1～10个，最优选1～5个)，④在SEQ ID NO18所示氨基酸序列中至少有1或2个以上氨基酸被置换(优选1～30个，更优选1～10个，最优选1～5个)，以及⑤上述氨基酸序列的组合同时也可包括突变蛋白质等。
本说明书中所述的蛋白质，可以用本领域已知的描述肽的方法来定义。即，左端为N-末端(氨基端)，右端为C-末端(羧基端)。主要以包含SEQ IDNO1或SEQ ID NO18所示氨基酸序列的蛋白质，该蛋白质包括蛋白质I或蛋白质II，其中C-末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，但是C-末端也可为酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
这里R所代表的酯如C1-6烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、或正丁基等；C3-8环烷基包括环戊基和环己基等；C6-12芳基包括苯基和α-萘基等；以及C7-14芳烷基包括苯基-C1-2烷基如苯甲基、苯乙基等；或α-萘基-C1-2烷基如α-萘甲基，还有通常用作口服给药的酯的三甲基乙酰氧甲基。
当本发明蛋白质I或蛋白质II在C-末端以外的位置上包括一个羧基(或羧酸盐)时，它可以酰胺化或酯化，则这类酰胺或酯也可以包括在本发明所述蛋白质I或蛋白质II的范围之内。所述酯基可以与上述C-末端酯基相同。
另外，本发明蛋白质I还可以包括下述衍生物，其中N-末端氨基酸残基(如甲硫氨酸)的氨基用保护基(C1～6酰基，如甲酰基、乙酰基等C1～6烷酰基)保护；所述N末端在体内切割，形成的谷氨酰基焦谷氨酸化；所述蛋白质分子中氨基酸侧链上的取代基(例如，-OH，-SH，氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)受适当基团(C1～6酰基，如甲酰基、乙酰基等C1～6烷酰基)保护，或为结合蛋白质如通过糖链连接的糖蛋白质等。
作为本发明蛋白质I的具体之例，如包括SEQ ID NO1所示氨基酸序列的来源于人胃的蛋白质等。
另外，作为蛋白质II的具体之例还有，如包括SEQ ID NO18所示氨基酸序列的来源于小鼠的蛋白质等。
在包括与本发明SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的序列蛋白质中，也包括前体蛋白质，其中如上述在本发明蛋白质I的N-末端或/和C-末端中有1或2个以上氨基酸的结合，优选1～200个，更优选1～100个，最优选1～50个(以下简称；前体蛋白质I)。
本发明前体蛋白质I如上述从人或其它温血动物(如豚鼠、大鼠、小鼠、家鸡、兔子、猪、绵羊、牛、猴子等)细胞或组织中得来的蛋白质或合成的蛋白质。
另外，本发明前体蛋白质I只要是能生成并能得到所述的本发明蛋白质的任何蛋白质均可。因此，蛋白质分子量等其量化要素可以不尽相同。
然而，本发明前体蛋白质I，其C-末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，但是C-末端也可为酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
进一步，本发明前体蛋白质I与前述的本发明前体蛋白质I相同并在C-末端以外的位置上包括一个羧基(或羧酸酯)时，它可以为下述的衍生物，即其C-末端以外的位置上的羧基(或羧酸酯)被酰胺化或酯化，N-末端氨基酸残基(如甲硫氨酸)的氨基使用保护基；所述N末端在体内切割，形成的谷氨酰基焦谷氨酸化；所述分子内的氨基酸侧链上的取代基受适当基团保护，或为结合蛋白质如通过糖链连接的糖蛋白质等。
作为本发明蛋白质I的具体之例，如在包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列的本发明蛋白质N末端上结合有包含后面将要叙述的SEQ ID NO2所示氨基酸序列的本发明信号肽的蛋白质(即包含SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白质)。
例如，有关后述信号肽的本发明前体蛋白质I，能够较好的在细胞外分泌蛋白质I。另外，它可作为制造本发明蛋白质I的中间体。
进而，本发明的前体蛋白质与本发明的蛋白质I发挥同样的活性，同样的使用性。
在包含与SEQ ID NO18所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列的蛋白质中，也包含前体蛋白质如在上述蛋白质II的N-末端或/和C-末端上结合有1或2个以上氨基酸，优选1～200个，更优选1～100个，最优选1～50个(以下简称；前体蛋白质II)。
前体蛋白质II如上述从人或其它温血动物(如豚鼠、大鼠、小鼠、家鸡、兔子、猪、绵羊、牛、猴子等)细胞或组织中得来的蛋白质或合成的蛋白质。
另外，本发明前体蛋白质II只要是能生成并能得到所述的本发明蛋白质的任何蛋白质均可。因此，蛋白质分子量等其量化要素可以不尽相同。
然而，本发明前体蛋白质II，其C-末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，但是C-末端也可为酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
进一步，本发明前体蛋白质II与前述的本发明前体蛋白质II相同并在C-末端以外的位置上包括一个羧基(或羧酸酯)时，可以酰胺化或酯化，N-末端氨基酸残基(如甲硫氨酸)的氨基使用保护基；所述N末端在体内切割，形成的谷氨酰基焦谷氨酸化；所述分子内的氨基酸侧链上的取代基受适当基团保护，或为结合蛋白质如通过糖链连接的糖蛋白质等。
作为本发明前体蛋白质II的具体之例，如为这样一种蛋白质，在包含SEQ ID NO18所示氨基酸序列的蛋白质II之N末端上结合有信号肽等(即，包含有SEQ ID NO17所示氨基酸序列的蛋白质)。
例如，含有信号肽的前体蛋白质II(SEQ ID NO17所示第1至21位氨基酸残基)能够较好的在细胞外分泌蛋白质II。另外，它可作为制造蛋白质II的中间体。
进而，前体蛋白质II与蛋白质II发挥同样的活性，同样的使用性。
作为本发明蛋白质I的部分肽(以下简称本发明的部分肽)，与上述本发明蛋白质I的部分肽相同或与上述本发明蛋白质I具有相同的性质。如本发明蛋白质I的氨基酸序列构成所使用的肽至少有20个以上的氨基酸，优选50个以上，较优选70个，更优选100个以上，最优选200个以上。
本发明的部分肽1，它的氨基酸序列中有1或者2个以上氨基酸缺失(优选1～10个，最优选1～5个)，或在氨基酸序列中有1或2个以上氨基酸附加(优选1～20个，更优选1～10个，最优选1～5个)，或在氨基酸序列中有1或2个以上氨基酸插入(优选1～20个，更优选1～10个，最优选1～5个)，或在氨基酸序列中有1或2个以上氨基酸被置换(优选1～10个，更优选数个，最优选1～5个)。
另外，本发明的部分肽I的C-末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，但是C-末端也可为酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
本发明的部分肽I还与上述本发明的蛋白质I同样在C-末端以外的位置上包括一个羧基(或羧酸盐)时，可以酰胺化或酯化，N-末端氨基酸残基(如甲硫氨酸)的氨基使用保护基；所述N末端在体内切割，形成的谷氨酰基焦谷氨酸化；所述分子内的氨基酸侧链上的取代基受适当基团保护，或为结合蛋白质如通过糖链连接的糖蛋白质等。
本发明的部分肽I可作为抗原制作抗体。
作为蛋白质II的部分肽(以下简称部分肽II)，与上述蛋白质II的部分肽或与上述蛋白质II有相同的性质。如蛋白质II的氨基酸序列构成中所使用的肽至少包括20个以上的氨基酸，优选50个以上，较优选70个，更优选100个以上，最优选200个以上。
部分肽II，它的氨基酸序列中有1或者2个以上氨基酸缺失(优选1～10个，最优选1～5个)，或在氨基酸序列中有1或2个以上氨基酸附加(优选1～20个，更优选1～10个，最优选1～5个)，或在氨基酸序列中有1或2个以上氨基酸插入(优选1～20个，更优选1～10个，最优选1～5个)，或在氨基酸序列中有1或2个以上氨基酸被置换(优选1～10个，更优选数个，最优选1～5个)。
另外，部分肽II的C-末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，但是如前面描述的蛋白质II，其C-末端也可为酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
进一步，部分肽II与上述本发明的蛋白质II同样在C-末端以外的位置上包括一个羧基(或羧酸酯)时，可以酰胺化或酯化，N-末端氨基酸残基(如甲硫氨酸)的氨基使用保护基；所述N末端在体内切割，形成的谷氨酰基焦谷氨酸化；所述分子内的氨基酸侧链上的取代基受适当基团保护，或为结合蛋白质如通过糖链连接的糖蛋白质等。
部分肽II可作为抗原制作抗体。
本发明所使用的信号肽，如包括与SEQ ID NO2所示氨基酸序列相同或基本相同的序列(以下简称本发明的信号肽I)。
本发明的信号肽I如上述从人或其它温血动物(如豚鼠、大鼠、小鼠、家鸡、兔子、猪、绵羊、牛、猴子等)细胞或组织中由来的蛋白质或合成的蛋白质。
作为与SEQ ID NO2所示氨基酸序列基本相同的序列，可举例为，具有与上述SEQ ID NO18所示氨基酸序列同源性相同至少约70％以上，优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％的氨基酸序列。更具体地具有与SEQ ID NO2所示氨基酸序列基本相同的序列，只要能发挥信号肽的作用任何肽均可。因此，蛋白质分子量等其量化要素可以不尽相同。
另外，本发明的信号肽I，它的氨基酸序列中有1或者2个以上氨基酸缺失(优选1～10个，教优选1～5个，更优选1～3个)，或在氨基酸序列中有1或2个以上氨基酸附加(优选1～10个，更优选1～5个，最优选1～3个)，或在氨基酸序列中有1或2个以上氨基酸插入(优选1～10个，更优选1～5个，最优选1～3个)，或在氨基酸序列中有1或2个以上氨基酸被置换(优选1～10个，更优选1～5个，最优选1～3个)。
进而，本发明的信号肽I的C-末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，如前面描述的蛋白质I，其C-末端也可为酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
进一步，本发明的信号肽I与上述本发明的蛋白质I同样在C-末端以外的位置上包括一个羧基(或羧酸酯)时，可以酰胺化或酯化，N-末端氨基酸残基(如甲硫氨酸)的氨基使用保护基；所述N末端在体内切割，形成的谷氨酰基焦谷氨酸化；所述分子内的氨基酸侧链上的取代基受适当基团保护，或为结合蛋白质如通过糖链连接的糖蛋白质等。
作为本发明信号肽I的具体之例，使用下述肽，如从SEQ ID NO5所示氨基酸序列的本发明前体蛋白质I中，除去SEQ ID NO1所示氨基酸序列的本发明蛋白质I之外包括SEQ ID NO2所示氨基酸序列之肽等。
本发明信号肽I主要为本发明蛋白质I并且是在各种细胞外分泌的蛋白质，该信号肽I能够有效地向细胞外分泌这种蛋白质。
作为本发明的蛋白质I、前体蛋白质I、部分肽I或信号肽I或蛋白质II、前体蛋白质II或部分肽II的盐，可以使用生理上可接受的碱(如碱金属盐)或酸(如无机酸或有机酸)形成的盐，优选生理上可接受的酸加成盐。这样的盐有，与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐，与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等。
本发明的蛋白质I、前体蛋白质I、部分肽I、蛋白质II、前体蛋白质II、部分肽II或它们的盐如上述从，可从人或其它温血动物细胞或组织中按照公知的蛋白质纯化方法进行制备，也可以通过培养转化体其中包含编码所述蛋白质或肽的DNA来制备或根据以后将要叙述的肽合成法制备。
制备人和哺乳动物的组织或细胞时，先将人和哺乳动物的组织或细胞匀浆后，使用酸进行抽提，用反相层析法，离子交换层析法等组合的方法进行纯化分离。
本发明的蛋白质I、前体蛋白质I、部分肽I、蛋白质II、前体蛋白质II、部分肽II或其盐或其酰胺物的合成，可以使用可用于蛋白质合成的商用树脂。这类树脂包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲胺树脂、氨甲基树脂、4-苄氧基苯甲醇树脂、4-甲基二苯甲基胺树脂、PAM树脂、4-羟甲基甲苯乙酰胺甲基树脂、聚丙烯酰胺树脂、4-(2′，4′-二甲氧基苯羟甲基)苯氧基树脂以及4-(2′，4′二甲氧苯基-Fmoc-氨乙基)苯氧基树脂。使用这些树脂时，将那些α-氨基及侧链上官能团受到相应保护的氨基酸，在树脂上按目标蛋白质或肽的序列顺序，用本领域公知的各种缩合方法缩合。反应结束时，将蛋白质或肽从树脂上切除下来，同时除去保护基团。然后在高度稀释的溶液中进行分子内二硫键的形成反应，以获得目标蛋白质或肽、或其酰胺物。
进行上述受保护氨基酸的缩合反应时，可使用蛋白质合成的多种活化试剂，但优选使用碳二亚胺。所述碳二亚胺有DCC、N，N′-二异丙基碳二亚胺以及N-乙基-N′-(3-二甲基氨基脯氨酰基)碳二亚胺。用这些试剂活化时，直接在树脂上添加受保护的氨基酸及外消旋抑制剂(例如，HOBt，HOOBt)，或先将受保护的氨基酸活化为对称酸酐、HOBt酯或HOOBt酯，然后添加到树脂上。
适用于受保护氨基酸的活化反应或适用于与树脂的缩合反应的溶剂选自已知可用于蛋白质缩合反应的溶剂。这样的溶剂有酰胺类如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺以及N-甲基吡咯烷酮等；卤化烃类如亚甲基盐酸盐和氯仿等；醇类如三氟乙醇等；亚砜类如二甲亚砜等；醚类如吡啶、二恶烷和四氢呋喃等；腈类如乙腈和丙腈等；酯类如乙酸甲酯和乙酸乙酯等；以及这些溶剂的适当混合物。反应温度从已知适用于蛋白质(蛋白质)成键反应的范围中选取，通常选约-20℃-50℃。活化的氨基酸衍生物通常以过量1.5～4倍的量使用。用茚三酮反应检验所述缩合反应；当所述缩合不充分时，可通过不除去保护基团而重复缩合反应来完成。当即使重复反应后仍未充分缩合时，用乙酸酐或乙酰咪唑将未反应的氨基酸乙酰化，以消除对后续反应的可能负影响。
用于保护初始氨基的保护基团有Z、Boc、叔戊氧基羰基、异冰片基氧羰基、4-甲氧苄氧羰基、Cl-Z、Br-Z、金刚烷(adamantyl)氧基羰基，三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基亚硫酰基、二苯硫膦基，以及Fmoc等。
羧基可用如下的酯化作用保护，例如烷基酯化(烷基如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基和2-金刚烷基等的直链、支链或环状烷基酯)，芳烷基酯化(例如酯化为苄酯、4-硝基苄酯、4-甲氧苄酯、4-氯苄酯以及二苯甲基酯等)，苯甲酰甲基酯化，苄氧羰基酰肼化，叔丁氧羰基酰肼化以及三苯甲基酰肼化等。
丝氨酸的羟基可以通过例如酯化作用或醚化作用来保护。适于酯化作用的基团有低级C1～6烷酰基如乙酰基，芳酰基如苯甲酰基，以及来自碳酸的基团如苄氧羰基和乙氧羰基。适于醚化的基团有苯甲基、四氢吡喃基和叔丁基等。
适于保护酪氨酸中酚羟基的基团有Bzl，Cl2-Bzl，2-硝基苄基、Br-Z和叔丁基等。
适于保护组氨酸中咪唑基的基团有Tos，4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺酰基、DNP、苄氧甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc等。
初始氨基酸中的活化羧基有相应的酸酐、叠氮化物、活化酯(带有醇的酯(如五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基酚、氰甲基醇、对硝基苯酚、HONB，N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、HOBt)。将初始物质中待活化氨基酸的氨基活化时，可以使用其相应磷酰胺。
为了除去(脱离)保护基，在氢气流下用Pd-黑或Pd-碳等催化剂进行催化还原；用氢氟酸酐、甲磺酸、三氟甲磺酸或三氟醋酸，或这些酸的混合液进行酸处理；用二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶或哌嗪等碱进行碱处理；以及用液态氨中的钠还原。用上述酸处理除去所述保护基团的反应通常在约-20℃～40℃进行。在酸处理中，添加阳离子清除剂以使反应有效进行，例如使用甲氧基苯、苯酚、硫代甲氧基苯、间甲酚、对甲酚、二甲基硫化物、1，4-丁二硫醇或1，2-乙二硫醇。此外，用苯硫酚处理以除去已知可作为组氨酸中咪唑的保护基团的2，4-二硝基苯基。用作色氨酸中吲哚的保护基团的甲酰基用下述方法去除在1，2-乙二硫醇或1，4-丁二硫醇存在时用上述酸进行处理，以及用氢氧化钠稀溶液和稀氨水等碱进行处理。
与起始物质之反应无关的官能团的保护、保护基的选择、该保护基的消除、以及与上述反应有关的官能团的活化，从公知的基团和公知的方法中适当选择。
获得目标蛋白质或肽的酰胺体的其它方法有，如先将羧基末端氨基酸的α-羧基酰胺化而加以保护；然后，将肽(氨基酸)链从氨基侧延伸至预期长度。然后，制备只将其中N-末端α-氨基的保护基团除去的蛋白质或肽以及只将其中C-末端羧基的保护基团除去的蛋白质或肽。将这两种蛋白质或肽浓缩在上述溶剂的混合液中。浓缩反应的细节同上。对浓缩所得被保护蛋白质或肽进行纯化后，通过上述方法除去所有的保护基团，获得所需粗制蛋白质或肽。该粗制蛋白质或肽可用各种已知的纯化方法进行纯化。冻干主要级分获得所需蛋白质或肽的酰胺物。
将羧基末端氨基酸的α-羧基与所选醇类缩合获得氨基酸酯，然后用与上述制备目标蛋白质或肽的酰胺物方法类似的方法获得所需蛋白质或肽的酯物。
本发明部分肽I，信号肽I，部分肽或它们的盐可通过已知的肽合成方法而制备，或本发明的蛋白质I，前体蛋白质I，蛋白质I或前体蛋白质II也可在适当的部位切断肽链制备。就肽合成的方法而言，固相合成或液相合成都可使用。即，将能构成本发明部分肽或信号肽的部分肽或氨基酸与本发明蛋白质的其他部分缩合在一起。当产物中包含保护基团时，除去这些保护基团得到所需肽。用来缩合或除去保护基团的公知方法见下列1)～5)。
1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti肽的合成，Interscience Publishers，纽约(1966)2)Schroeder和Luebke肽，Academic Press，纽约(1965)3)泉屋信夫等蛋白质合成与实验，丸善公司(1975)4)矢岛治明和榊原俊平生物化学实验教材1，蛋白质化学IV，205(1977)5)矢岛治明主编药物开发续篇，卷14，肽合成，广川书店反应完成后，可将常规纯化方法如溶剂提取、蒸馏、柱层析、液相层析以及重结晶等进行组合以纯化分离本发明蛋白质或肽。当用上述方法获得的蛋白质或肽为游离形式时，可以用公知的方法或其改良方法将所述蛋白质或肽转化为相应盐；当所述蛋白质或肽以盐形式获得时，可以用公知的方法或改良方法将其转化为游离形式或其他的盐。
编码本发明蛋白质I或蛋白质II的DNA可为任意DNA，只要其含有编码本发明所述蛋白质I或蛋白质II的碱基序列。这类DNA也可以是基因组DNA、基因组DNA文库、所述细胞或组织的cDNA、所述细胞或组织的cDNA文库、合成DNA。
用于上述文库的载体可以为噬菌体、质粒、粘粒以及噬菌粒中的任意一种。所述DNA可以用从上述细胞或组织中制备的总RNA或mRNA级分通过反转录聚合酶链反应(以下简称为RT-RCR)直接扩增。
作为编码本发明蛋白质I的DNA，如，SEQ ID NO3所示碱基序列含有的DNA，或者该DNA和能在严谨条件下与SEQ ID NO3所示碱基序列杂交的碱基序列，并且能编码与本发明蛋白质I性质基本相同的蛋白质的DNA，可以为任一种DNA。作为编码本发明蛋白质II，如SEQ ID NO14所示在第72～第1142位碱基序列中含有的DNA，或SEQ ID NO14所示在第72～第1142位碱基序列中含有DNA和在严谨条件下能与SEQ ID NO14所示碱基序列杂交的碱基序列，并且能编码与本发明蛋白质II性质基本相同的蛋白质的DNA，本发明蛋白质II的DNA可以为任一种DNA。
作为SEQ ID NO3所示碱基序列含有DNA和在严谨条件下与SEQ IDNO3所示碱基序列杂交的碱基序列，SEQ ID NO3所示碱基序列具有约80％以上同源性DNA，优选约90％以上，更优选约95％以上。
又，作为在严谨条件下与SEQ ID NO14所示第72～第1142位碱基序列能杂交的DNA，如SEQ ID NO14所示在第72～第1142位碱基序列具有约80％以上同源性的DNA，优选约90％以上，更优选约95％以上。
高度严谨条件是可以用公知方法或其改良方法进行所述杂交反应，如，分子克隆，第2版；J.Sambrook等，冷泉港实验室出版社(1989)中所述方法。也可以按照所附说明书使用商品文库。该杂交反应优选在高度严谨的条件下进行。
此处的高度严谨条件是，例如钠离子的浓度约为19-40mM，优选约19-20mM，而温度约为50-70℃，优选约60-65℃。特别优选钠离子的浓度约为19-40mM，温度约为65℃。
作为编码含有具体的SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白质的DNA，可使用SEQ ID NO3所示碱基序列的DNA等。
作为编码含有SEQ ID NO18所示氨基酸序列的蛋白质的DNA，具体的可使用SEQ ID NO14所示在第72～第1142位碱基序列的DNA等。
编码本发明的前体蛋白质I或前体蛋白质II的DNA，只要其含有编码本发明所述前体蛋白质I或前体蛋白质II的碱基序列即可。这类DNA也可以是基因组DNA、基因组DNA文库、所述细胞或组织的cDNA、所述细胞或组织的cDNA文库、合成DNA。
作为编码本发明中的前体蛋白质I的DNA，可以使用含SEQ ID NO16所示碱基序列的DNA，或SEQ ID NO16所示碱基序列的DNA和在严谨条件下与SEQ ID NO16所示碱基序列杂交的碱基序列，或上述编码本发明从蛋白质I生成的蛋白质的DNA等。
作为编码前体蛋白质II的DNA，如SEQ ID NO14所示在第9～第1142位碱基序列上含有DNA，或SEQ ID NO14所示在第9～第1142位碱基序列上含有DNA和在严谨条件下与SEQ ID NO14所示碱基序列杂交的碱基序列，蛋白质II生成所得编码蛋白质的DNA等。
作为在严谨条件下与SEQ ID NO16所示碱基序列杂交的DNA碱基序列，通常使用如与SEQ ID NO16所示碱基序列同源性较高的DNA如约80％以上的DNA，优选约90％以上，更优选约95％以上。
而作为SEQ ID NO14所示在第9～第1142位碱基序列中所含DNA和在严谨条件下杂交的DNA，如SEQ ID NO14所示在第9～第1142位碱基序列中所含同源性较高的约80％以上的DNA，优选约90％以上，更优选约95％以上。
有关碱基序列杂交的方法和严谨条件可与上述相同。
作为编码含有具体的SEQ ID NO5所示氨基酸序列的前体蛋白质I的DNA，可使用具有SEQ ID NO16所示碱基序列的DNA等。
然而，作为编码含有SEQ ID NO17所示氨基酸序列的前体蛋白质II，具体的可使用具有SEQ ID NO14所示在第9～第1142位碱基序列的DNA等。
编码本发明部分肽I或部分肽II的DNA，只要其含有编码本发明所述部分肽I或部分肽II的碱基序列即可。这类DNA也可以是基因组DNA、基因组DNA文库、所述细胞或组织的cDNA、所述细胞或组织的cDNA文库、合成DNA。
对于编码本发明部分肽I的DNA，含SEQ ID NO3所示碱基序列的DNA，或含SEQ ID NO3所示碱基序列的DNA和在严谨条件下与SEQ IDNO3所示碱基序列杂交的碱基序列，可以使用与本发明的蛋白质I活性基本相同的编码含一部分这样蛋白质的DNA等。
能与含SEQ ID NO3所示碱基序列的DNA杂交的DNA，意义同前。
对于编码肽II的DNA含SEQ ID NO14所示在第72～第1142位碱基序列中具有部分的DNA，或含SEQ ID NO14所示在第72～第1142位碱基序列的DNA和在严谨条件下与SEQ ID NO14所示碱基序列杂交的碱基序列，可以使用与蛋白质II活性基本相同的编码含有一部分所述蛋白质的DNA等。
SEQ ID NO14所示在第72～第1142位碱基序列中的DNA和能与其杂交的DNA，其意义同前所述。
有关碱基序列杂交的方法和严谨条件可与上述相同。
对于编码本发明信号肽I的DNA，只要其含有编码上述本发明信号肽I的碱基序列。这类DNA也可以是基因组DNA、基因组DNA文库、所述细胞或组织的cDNA、所述细胞或组织的cDNA文库、合成DNA。
对于编码本发明信号肽I的DNA，可以使用含SEQ ID NO4所示碱基序列的DNA，或者在严谨条件下能与SEQ ID NO4所示碱基序列DNA杂交的碱基序列，并且具有信号肽功能且编码这种肽的DNA等。
所述能与SEQ ID NO4所示碱基序列DNA杂交的DNA，可以使用SEQ ID NO4所示碱基序列同源性较高的DNA如同源性约70％以上，优选约80％以上，更优选约90％以上，最优选约95％以上。
有关碱基序列杂交的方法和严谨条件可与上述相同。
作为编码含有具体的SEQ ID NO2所示氨基酸序列的本发明信号肽I的DNA，可使用SEQ ID NO4所示碱基序列的DNA等。
对完全编码本发明蛋白质I，前体蛋白质I，部分肽I，信号肽I，蛋白质II，前体蛋白质II或部分肽II(以下简称本发明的蛋白质)的DNA进行克隆时，可以用含有本发明蛋白质之部分碱基序列的合成型DNA引物按公知的PCR进行扩增，或通过与编码本发明蛋白质之部分或完整区的标记的DNA片段或合成DNA片段杂交来筛选已插入合适载体中的DNA。杂交反应可以根据分子克隆第二版(J.Sambrook等，冷泉港实验室出版社，1989)描述的方法进行。也可用商品化的文库根据所附说明书进行杂交。
DNA碱基序列的转换可根据众所周知的方法如ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunlel法等Gupped duplex法或Kunkel法或其改进方法，使用PCR或众所周知的商品化试剂盒如MutanTM-super Express K、MutanTM-K(均来自宝酒造株式会社)进行。
已经克隆的编码本发明蛋白质的DNA，根据需要，或者单独使用或者经限制酶消化后或连接一接头之后使用。该DNA可能在其5′端包含ATG作为翻译起始密码子，而在其3′端有TAA、TGA或TAG作为翻译终止密码子。这些翻译起始和终止密码子也可用合适的合成型DNA接头加上。
本发明蛋白质的表达载体可通过以下方法生产，例如，(a)从编码本发明蛋白质的DNA上切下所需DNA片段，(b)将该DNA片段连接到一合适载体上的启动子下游。
可以使用的载体包括来自大肠杆菌的质粒(例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、来自枯草杆菌的质粒(例如，pUB110、pTP5、pC194)、来自酵母的质粒(例如，pSH19、pSH15)、噬菌体如λ噬菌体等、动物病毒如反转录病毒、痘苗病毒、杆状病毒等以及pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo等。
本发明所使用的启动子可以是任意启动子，只要它能同所用基因表达宿主匹配。在使用动物细胞作为宿主时，启动子有SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV启动子、HSV-TK启动子等。
在这些启动子中，优选CMV(巨细胞病毒)启动子或SRα启动子。如果宿主为大肠杆菌属的细菌，优选的启动子有trp启动子、1ac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、T7启动子等。在使用枯草杆菌属的细菌作宿主时，优选的启动子有SPO1启动子、SPO2启动子和penP启动子等。在用酵母作宿主时，优选的启动子有PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子和ADH启动子等。在用昆虫细胞作宿主时，优选的启动子有多角体蛋白启动子和P10启动子等。
除了前述的实例，根据需要，表达载体还可使用包含增强子、剪接信号、poly A加尾信号、选择标记、SV40复制起始子(下文通常简写为SV40ori)等。选择标记的例子包括，二氢叶酸还原酶(下文通常缩写为dhfr)基因[甲氨喋呤(MTX)抗性]、氨苄青霉素抗性基因(下文通常缩写为Ampr)、新霉素抗性基因(下文通常缩写为Neor，Geneticin抗性)等。尤其是，当CHO(dhfr-)细胞缺少dhfr基因并用dhfr基因作为选择标记时，使用无胸腺嘧啶脱氧核苷的培养基可以进行筛选。
根据需要，可在本发明蛋白质的N-端加上同宿主匹配的信号序列。在用大肠杆菌属细菌作宿主时，可以使用的信号序列为Pho A信号序列、OmpA信号序列等；当用枯草杆菌属的细菌作宿主时，可以使用的信号序列为α-淀粉酶信号序列、枯草杆菌蛋白酶信号序列等；在用酵母作宿主时，可以使用的信号序列为MFα信号序列、SUC2信号序列等；在用动物细胞作宿主时，可以使用的信号序列为胰岛素信号序列、α-干扰素信号序列、抗体分子信号序列等。
使用含有如此构建的编码本发明蛋白质的DNA序列的载体，可获得转化体。
可以使用的宿主的实例有，属于大肠杆菌属的细菌、属于枯草杆菌属的细菌、酵母、昆虫细胞、昆虫以及动物细胞等。
大肠杆菌属的细菌有，大肠杆菌(Escherichia coli)K12 DH1(美国国家科学院院刊，60，160(1968))、JM103(核酸研究，9，309(1981))、JA221(分子生物学杂志，120，517(1978))、HB101(分子生物学杂志，41，459(1969))、C600(遗传学，39，440(1954))等。
枯草杆菌属的细菌有，枯草杆菌MI 114(基因，24，255(1983))、207-221(生物化学杂志，95，87(1984))等。
酵母有，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913、NCYC2036、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)KM71等。
就昆虫细胞而言，病毒为AcNPV时有草地夜蛾幼虫(Spodopterafrugiperda，Sf)的细胞株、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)中肠的MG1细胞、粉纹夜蛾卵的High FiveTM细胞、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)的细胞、Estigmenaacrea的细胞等；病毒为BmNPV时有家蚕(Bombyx mori)的N细胞(BmN细胞)等。可用的Sf细胞有Sf9细胞(ATCC CRL1711)和Sf21细胞(这两种细胞均由Vaughn，J.L等在In Vivo，13，213-217(1977)中描述)。
作为昆虫的例子，可以使用家蚕的幼虫(前田等，自然，315，592(1985))。
动物细胞包括猴COS-7细胞、Vero、中华仓鼠细胞CHO(以下简称CHO细胞)、dhfr基因缺陷的中华仓鼠细胞CHO(以下简称CHO(dhfr-)细胞)、小鼠L细胞、小鼠AtT-20细胞、小鼠骨髓瘤细胞、大鼠GH3、人FL细胞等。
大肠杆菌属的细菌可以根据美国国家科学院院刊，69，2110(1972)或基因，17，107(1982)中描述的方法进行转化。
枯草杆菌属的细菌可以根据分子及普通遗传学，168，111(1979)中描述的方法进行转化。
酵母可以根据酶学方法，194，182-187(1991)或美国国家科学院院刊.，75，1929(1978)中描述的方法进行转化。
昆虫细胞或昆虫可以根据生物/技术，6，47-55(1988)中描述的方法进行转化。
动物细胞的转化可以根据《细胞工程学增订版8，细胞工程学实验最新方法》秀润出版社，263-267(1995)或病毒学，52，456(1973)中描述的方法进行。
由此，可以获得用含有本发明蛋白质之编码DNA的表达载体转化的转化体。
当培养宿主为大肠杆菌或枯草杆菌的转化体时，用于培养的培养基为液体培养基，该培养基含有转化体生长所必需的物质例如碳源、氮源、无机物等。碳源包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等。氮源包括无机或有机物质如铵盐、硝酸盐、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、酵母提取液、肉汁、黄豆饼粉、马铃薯抽提物等。无机物又包括氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等。此外，在培养基中也可加入酵母提取液、维生素、促生长因子等。培养基的pH值优选约5-8。
用于培养大肠杆菌属细菌的培养基优选为，加有葡萄糖和酪蛋白水解物的M9培养基(Miller，分子遗传学实验杂志，431-433，冷泉港实验室，纽约，1972)。必要时可以在培养基中加入试剂如3β-吲哚基丙烯酸，来有效激活启动子。
当用大肠杆菌属的细菌作为转化宿主时，转化体通常在大约15-43℃培养约3-24小时。必要时培养物可以进行充气或搅拌。
当用枯草杆菌属的细菌作为转化宿主时，转化体通常在大约30-40℃培养约6-24小时。必要时培养物可以进行充气或搅拌。
当用酵母作为宿主时，转化体培养在，例如Burkholder氏基本培养基(Bostian，K.L等，美国国家科学院院刊，77，4505(1980))或加了0.5％酪蛋白水解物的SD培养基(Bitter，G.A.等，美国国家科学院院刊，81，5330(1984))上。优选培养基pH值调节到大约5-8。转化体通常在大约20-35℃培养约24-72小时。根据需要，培养物可以进行充气或搅拌。
当用昆虫细胞或昆虫作为宿主时，转化体培养在，例如Grace’s昆虫培养基(Grace，T.C.C.，自然，195，788(1962))上，其中添加有固相化10％牛血清等适当添加剂。优选培养基pH值调节到大约6.2-6.4。转化体通常在大约27℃培养大约3-5天。根据需要，培养物可以进行充气或搅拌。
当用动物细胞作为宿主时，转化体培养在，例如含有大约5-20％牛胎血清的MEM培养基(科学，122，501(1952))、DMEM培养基(病毒学，8，396(1959))、RPMI 1640培养基(美国医学会杂志，199，519(1967))、199培养基(Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1(1950))等中。优选培养基pH值调节到大约6-8。转化体通常在大约30-40℃培养大约15-60小时。根据需要，培养物可以进行充气或搅拌。
如上所述，本发明的蛋白质可以产生在转化体的细胞膜上。
可以根据下述方法从上述培养物中分离纯化本发明的蛋白质。
在培养后，用众所周知的方法收集转化体或细胞，悬浮在一合适的缓冲液中，从中抽提本发明的蛋白质。然后用众所周知的方法破碎转化体或细胞，如超声处理、溶菌酶处理和/或反复冻融等，然后离心、过滤，获得本发明蛋白质的粗提物。此过程的缓冲液可包含蛋白变性剂如尿素或盐酸胍、或表面活性剂如Triton X-100TM等。当所述蛋白质分泌在培养液中时，在培养结束后，用众所周知的方法从转化体或细胞中经分离而收集上清。
上清或包含在所获抽提物中的蛋白质可通过将已知的分离和纯化方法适当组合来进行纯化。这些众所周知的分离纯化方法包括，利用溶解性差异的方法如盐析、溶剂沉淀等；主要利用分子量差异的方法如透析、超滤、凝胶过滤、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等；利用电荷差异的方法如离子交换层析等；利用特异性亲和力差异的方法如亲和层析等；利用疏水性差异的方法例如反相高效液相色谱等；利用等电点差异的方法如等电聚焦电泳。
当如此获得的蛋白质为游离形式时，可用众所周知的方法或其改良法将其转换为盐。相反，当获得的蛋白质为盐时，可用众所周知的方法或其改良法将其转换为游离形式或另一种盐形式。
重组产生的蛋白质，在纯化前或纯化后，可用相应蛋白修饰酶处理，从而使蛋白质经适当修饰，部分去除一段蛋白质。其中所述蛋白修饰酶的例子包括胰酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酰内肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。
由此产生的本发明蛋白质的存在，可通过利用特异性抗体的酶免疫分析法或蛋白质印迹法等进行测定。
针对本发明的蛋白质I、前体蛋白质I、部分肽I、蛋白质II、前体蛋白质II、部分肽II或其盐的抗体，只要所述抗体能够识别本发明蛋白质I、前体蛋白质I、部分肽I、蛋白质II、前体蛋白质II、部分肽II或其盐即可，可为多克隆抗体或单克隆抗体。
针对本发明蛋白质I、前体蛋白质I、部分肽I、蛋白质II、前体蛋白质II、部分肽II或其盐(以下简称发明的蛋白质)的抗体可使用本发明蛋白质作为抗原，根据本领域公知的抗体或抗血清的生产法制备。
(a)产生单克隆抗体细胞的制备将本发明的蛋白质或其盐，单独或与载体或稀释剂一起给药于温血动物体内能产生抗体的部位。为了增加给药后抗体的产量，可给予福氏完全或不完全佐剂。有效给药通常约为每2-6周一次，一共2-10次。使用的温血动物包括猴子、兔子、狗、豚鼠、大鼠、小鼠、绵羊、山羊、家鸡，优选大鼠和小鼠。
在制备产生单克隆抗体细胞时，从抗原免疫的温血动物如小鼠中选择抗体滴度比较明显的动物，在最后一次免疫的2-5天后取脾脏或淋巴结，使其中产生抗体的细胞与同种或异种动物的骨髓瘤细胞融合，获得产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。抗血清中抗体滴度的测定可以通过使抗血清与标记的随后所述的蛋白质反应，然后测定标记试剂同抗体的结合活性。可以根据Koehler和Milstein(自然，256，495，1975)的方法进行融合。融合加速剂的例子为聚乙二醇(PEG)、仙台病毒等，优选PEG。
温血动物骨髓瘤细胞的例子包括NS-1、P3U1、SP2/0和AP-1，优选P3U1。所用抗体产生细胞(脾脏细胞)同骨髓瘤细胞的比例优选约为1∶1到20∶1，加入浓度约为10％-80％的PEG(优选PEG 1000-6000)。然后在20-40℃保温。为了有效实施细胞融合，优选30-37℃保温约1-10分钟。
可以用各种方法筛选产生单克隆抗体的杂交瘤。这些方法有将作为抗原的蛋白质直接或与载体一起吸附至一种固相(如微量反应板)，将杂交瘤上清加入到该固相中，然后加入标记的放射性物质或酶的抗免疫球蛋白抗体(如果用小鼠细胞作融合，则用抗小鼠的免疫球蛋白抗体)或蛋白A，检测结合到固相上的单克隆抗体；另一方法为，将杂交瘤上清加入到吸附有抗免疫球蛋白抗体或蛋白A的固相中，加入标记的放射性物质或酶的蛋白质，检测结合到固相上的单克隆抗体。
单克隆抗体的筛选可以根据众所周知的方法或其改进方法进行。一般地，在含有HAT(次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸腺嘧啶)的动物细胞培养基中进行筛选。可以使用任何筛选和生长培养基，只要杂交瘤可以在其中生长。例如，可以使用含有1％-20％，优选10-20％牛胎血清的RPMI 1640培养基、含有1％-10％牛胎血清的GIT培养基(和光纯药工业株式会社)、无血清的杂交瘤培养基(SFM-101，日水制药株式会社)作为筛选或生长培养基。通常在含5％CO2的条件下于20-40℃(优选37℃)培养约5天-3周(优选1-2周)。杂交瘤培养上清液中抗体滴度的测定同上述抗血清中抗体滴度测定方法相同。
(b)单克隆抗体的纯化单克隆抗体的分离和纯化可根据公知方法，例如免疫球蛋白的分离和纯化方法(如盐析、乙醇沉淀、等电点沉淀、电泳、离子交换剂(如DEAE)吸附和去吸附、超离心、凝胶过滤、或一种特异性纯化方法，其包括仅收集与结合了抗原的固相、蛋白A或蛋白G等已活化吸附剂相结合的抗体并使之分离以获得该抗体)。
本发明多克隆抗体的制备用众所周知的方法或其改进方法进行。例如，用与上述生产单克隆抗体相似的方法生产免疫原(蛋白质抗原)或配制免疫原与载体蛋白形成的复合物并用其免疫温血动物。从已免疫的动物收集产物，其中含有本发明蛋白质或其盐的抗体，分离和纯化该抗体。
在由免疫原和载体蛋白组成的用于免疫温血动物的复合物中，对载体蛋白的类型和载体同半抗原的混合比率无限定，只要能针对与载体一起免疫的半抗原有效产生抗体。例如，牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或匙孔虫威血蓝蛋白与半抗原以载体比半抗原重量比约0.1-20(优选约1-5)的比率偶联。
不同的缩合剂可用于偶联载体和半抗原。戊二醛、碳二亚胺、马来酰亚胺活化的酯和含有巯基或二硫代吡啶基的活化的酯试剂可用于偶联。
将缩合产物单独或与载体或稀释剂一起给药于温血动物体内能产生抗体的部位。为了增加给药后抗体的产量，可给予福氏完全或不完全佐剂。大约每2-6周给药一次，共3-10次。
多克隆抗体从用上述方法免疫的温血动物的血液、腹水等(优选血液)中收集。
抗血清中多克隆抗体滴度的测定同上述测定血清抗体滴度的方法相同。可以根据上述用于分离和纯化单克隆抗体的免疫球蛋白分离纯化方法来分离和纯化多克隆抗体。
具有与编码本发明蛋白质I、前体蛋白质I、部分肽I、蛋白质II、前体蛋白质II、部分肽II的DNA(下文，有时称作本发明DNA)互补或基本互补的碱基序列的反义DNA可为任一种反义DNA，只要其含有与本发明DNA互补或基本互补的碱基序列，并能抑制该DNA的表达。
与本发明DNA基本互补的碱基序列，包括具有与互补于本发明DNA之碱基序列(即本发明DNA互补链)的全部或部分碱基序列至少约70％，优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％同源性的DNA。尤其是在本发明DNA互补链的全部碱基序列中，反义DNA具有与编码本发明蛋白质上N-末端区的部分碱基序列(如起始密码子附近的碱基序列等)的互补链至少约有70％同源性，优选至少约80％同源性，更优选至少约90％，最优选至少约95％。这些反义DNA可以使用公知的DNA合成装置生产合成。
本发明蛋白质I、前体蛋白质I、部分肽I或其盐(以下简称本发明的蛋白质a)；蛋白质II、前体蛋白质II、部分肽II或其盐(以下简称本发明的蛋白质b)；编码本发明蛋白质a的DNA(以下简称本发明的DNAa)；编码本发明蛋白质b的DNA(以下简称本发明的DNAb)；针对本发明蛋白质I、前体蛋白质I、部分肽I、蛋白质II、前体蛋白质II、部分肽II、信号肽I或其盐的抗体(以下通常称为本发明抗体)以及反义DNA的用途。本发明的蛋白质a和蛋白质b总称为本发明的蛋白质，本发明的DNAa和DNAb总称为本发明的DNA。
本发明的蛋白质a和蛋白质b在哮喘型肺或支气管动物模型的特异组织中表达增高，可利用它作为该疾病的标记物。另外，也可用它作为对伴有肺或呼吸道炎症的肺部或胸部疾患的早期诊断、症状严重程度的判定及疾病预后判断的标记物。
(1)与本发明蛋白质a相关的各种疾病的预防药物与治疗药物本发明蛋白质a属于几丁质分解酶家族。几丁质分解酶是肌体防御从外界进入的细菌、病毒等病原体的重要物质。所以，本发明的蛋白质a或DNAa可作为对免疫性疾患(如自体免疫疾患，免疫机能缺陷病，过敏性疾病等)，感染性疾病[如HIV感染(人体缺乏对病毒免疫能力)，HBV感染(肝脏B型病毒)，HCV感染(肝脏C型病毒)，结核菌感染，条件感染等]的预防药物与治疗药物。
假如机体内本发明的蛋白质a缺陷或其表达水平异常减少，机体防御功能过度发挥作用或者不能正常发挥作用时，本发明DNA a可以通过以下3种方式充分地或正常地为该患者提供本发明蛋白质a的作用(a)给予该患者本发明的DNA a，以便在体内表达本发明蛋白质a；(b)将本发明DNA a插入细胞中，表达本发明蛋白质之后，将该细胞转移到患者体内，或(c)直接将本发明蛋白质a给药于该患者体内。
当本发明DNA a用作上述预防或治疗药物时，该DNA本身可单独使用，或插入合适载体如反转录病毒载体、腺病毒载体或腺伴随病毒载体后按常规方法给药于人或其它温血动物。本发明DNA a也可以以裸露DNA a的形式给药，或与生理学上承认的用于促进吸收的辅助剂等的载体一起制成药剂并给药以便于其被基因枪摄入或通过含有水凝胶的导管导入。
当本发明蛋白质a用作所述治疗或预防药物时，优选所用纯度至少90％，优选95％以上，更优选98％以上，最优选99％以上。
例如，本发明的蛋白质a必要时加糖衣、胶囊、酏剂、微囊剂等剂型口服，或以可注射型制剂如，与水或其它可药用液体形成的无菌溶液或悬浮制剂经非胃肠道给药。例如，将本发明的蛋白质a与生理学上可接受的已知载体、调味剂、赋形剂、载色剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂等制成符合制药规定要求的常用单位剂型。控制制剂中的活性成分使得在给定范围内获得合适剂量。
可与片剂、胶囊等混合的添加剂包括，粘和剂如明胶、玉米淀粉、西黄耆胶和金合欢胶；赋形剂如结晶纤维素；膨胀剂如玉米淀粉、明胶和藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖和糖精；加味剂如薄荷、akamonooil和樱桃。当单位剂型为胶囊形式时，可进一步将液体载体如油和脂肪同上述添加剂一起使用。可根据常规制药方法制备注射用无菌组合物，例如将活性成分与天然植物油如芝麻油和椰子油等溶解或悬浮在载体，如注射用的水中来制备药物。
用于注射的液体介质的例子包括，生理盐水、及包含葡萄糖和其它辅助制剂(如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化钠等)的等渗溶液，并可以进一步同合适的助溶剂如醇(如乙醇等)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50等)等结合使用。油性介质有芝麻油和大豆油，它们可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。此外，上述的治疗/预防制剂可进一步与缓冲液(例如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液等)、镇静剂(例如苯扎氯胺和盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂(例如苯甲醇、酚等)、抗氧化剂等结合使用。由此制备的注射液体一般装在合适的安瓿中。
本发明DNAa所插入的载体用与上述类似的方法制成制剂，这类制剂通常经非胃肠道途径给药。
如此所获制剂安全、低毒，因此可用于人或其它温血动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、鸡、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴、黑猩猩等)。
本发明蛋白质a的剂量依赖于病症、受试者和给药方法等而异；例如口服给药本发明蛋白质a治疗感染性疾病时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。当非胃肠道给药时，该蛋白质一次投药量依赖于给药受体、症状等而变，例如在治疗感染性疾病时，成年人(体重60kg)优选活性成分静脉注射，剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
(2)筛选可作为疾病治疗药物的侯选化合物由于本发明蛋白质a是属于几丁质分解酶的家族，因此能促进本发明蛋白质a活性(如，几丁质分解酶活性等)的化合物或其盐均可作为以下各种疾病的治疗或预防药物例如免疫性疾患(如自体免疫疾患，免疫机能缺陷病，过敏性疾病等)，感染性疾病[如HIV感染(人体缺乏对病毒免疫能力)，HBV感染(肝脏B型病毒)，HCV感染(肝脏C型病毒)，结核菌感染，条件感染等]。
另一方面，本发明蛋白质a的表达增高早于肺或呼吸道的炎症，所以能够抑制本发明蛋白质a活性的化合物或其盐可作为药物用于治疗和预防以下疾病，例如伴有支气管哮喘和慢性阻塞性肺部疾患等肺或呼吸道炎症的肺部或胸部的疾病。
因此，本发明蛋白质a可作为一种试剂，用于筛选能促进或抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐。
即，本发明提供
(1)一种筛选方法，其用于筛选能促进本发明蛋白质I、前体蛋白质I、部分肽I或其盐活性(如，几丁质分解酶活性等)的化合物或其盐(下文通常简称为促进剂)，或者其用于筛选能抑制本发明蛋白质I、前体蛋白质I、部分肽I或其盐活性的化合物(下文通常简称为抑制剂)，其特征为，该筛选法包括应用本发明蛋白质I、前体蛋白质I、部分肽I或其盐，具体的例子为(2)一种用于筛选促进剂或抑制剂的方法，其特征在于，在以下情况时进行比较(i)本发明蛋白质I、前体蛋白质I、部分肽I或其盐与几丁质分解酶的底物的接触和(ii)本发明蛋白质I、前体蛋白质I、部分肽I或其盐与几丁质分解酶的底物和被检化合物的接触。
针对上述的筛选方法，测定了本发明蛋白质a的几丁质分解酶活性，比较了它们的特征。
对于底物可使用如4-甲基伞形酮基β-D-N，N’-二乙酰基壳二糖，4-甲基伞形酮基β-D-N，N′，N”-三乙酰基壳二糖，p-硝基苯β-D-N，N’-二乙酰基壳二糖，p-硝基苯β-D-N，N”-三乙酰基壳二糖，甲克质天蓝等。
对于被检化合物包括新型化合物及公知的化合物如肽，蛋白，非肽性化合物，合成化合物，发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液等。
为了实施上述筛选法，将本发明的蛋白质a放在适于本发明蛋白质a的缓冲液中来制备本发明蛋白质a的标样。只要缓冲液对本发明的蛋白质a和底物的反应无抑制作用，其中pH约为4～10(优选pH约为6～8)含有磷酸缓冲液和Tris-HCl的缓冲液等均可。
本发明的蛋白质a的几丁质分解酶活性可采用公知的如J.Biol.Chem.第270卷2198页(1995)己载的方法或改良的方法测定。
如上述(ii)中所述的几丁质分解酶活性与(i)比较，可以选择以可升高约20％以上，优选约30％以上，更优选约50％以上的被检化合物作为促进本发明蛋白质a的几丁质分解酶活性的化合物，另外，在上述(ii)中所述的几丁质分解酶活性与(i)比较，可以选择以可抑制约20％以上，优选约30％以上，更优选约50％以上的被检化合物作为抑制本发明蛋白质a的几丁质分解酶活性的化合物。
本发明的筛选用试剂盒中含有本发明的蛋白质I，前体蛋白质I，部分肽I或它们的盐。
本发明筛选法或筛选用试剂盒获得的化合物或其盐是从上述所说的被检化合物中选择出来的，如肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液、血浆等。该化合物具有促进或抑制本发明蛋白质a的活性(如几丁质分解酶活性等)。
针对该化合物的盐，可以使用与上述本发明蛋白质I的盐相同的物质。
能促进本发明蛋白质a活性的化合物可作为以下各种疾病的治疗或预防药物例如免疫性疾患(如自体免疫疾患，免疫机能缺陷病，过敏性疾病等)，感染性疾病(如HIV感染，HBV感染，HCV感染，结核菌感染，条件感染等)。
另一方面，能抑制本发明蛋白质a活性的化合物可作为以下各种疾病的治疗或预防药物例如伴随肺或呼吸道炎症的肺或胸部的疾病，如支气管哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等。
当将通过使用本发明筛选法或筛选用试剂盒获得的化合物用作上述治疗或预防药物时，可以按照常规方法进行实施。例如，含有本发明蛋白质a的药物可以制成片剂、胶囊、酏剂、微胶囊、无菌溶液、悬浮液剂型等。
如此所获制剂安全、低毒，因此可对人或其它温血动物(例如，大鼠、小鼠、兔子、鸡、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴，黑猩猩等)给药。
该化合物或其盐的剂量依赖于该化合物的作用、病症、受试者和给药方法等而异；例如用能够抑制本发明蛋白质a活性的口服药物治疗支气管哮喘疾病时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。当非经口给药时，该化合物一次投药量依赖于给药受体、症状等而定，例如用能够抑制本发明蛋白质a活性的注射药物治疗支气管哮喘疾病时，成年人(体重60kg)优选静脉注射，剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
另一方面，用能够促进本发明蛋白质a活性的口服药物治疗感染性疾病时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。非经口给药时，该化合物一次投药量依赖于给药受体、症状等而定，例如用能够促进本发明蛋白质a活性的注射药物治疗感染性疾病时，成年人(体重60kg)优选静脉注射，剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
(3)有关本发明蛋白质a或蛋白质b作为疾病治疗药物的侯选化合物的筛选由于本发明蛋白质是一种分泌蛋白质，例如蛋白质II的生成早于哮喘型小鼠的肺或呼吸道的炎症发生，并且与嗜酸性粒细胞和巨噬细胞等的浸润、激活有关。依据可抑制本发明蛋白质a或b活性的化合物或其盐，可作为治疗或预防伴随肺或呼吸道炎症的肺或胸部的疾病，如支气管哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等的药物。
所以，本发明的蛋白质可作为抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐用于筛选的试剂药物。
因此，本发明提供了下述的筛选方法(1)应用本发明蛋白质作为其方法特征，提供一种能够抑制本发明蛋白质活性(如游走性嗜酸性粒细胞活性等)的化合物(以下简称抑制剂)，具体地就是提供其特征为(2)(i)当本发明蛋白质与嗜酸性粒细胞接触和(ii)本发明蛋白质与嗜酸性细胞和待测化合物接触时进行比较的方法。
有关上述筛选方法的特征，具体地举例为，测定并比较(i)和(ii)的中所述的本发明蛋白质的在嗜酸性粒细胞中的游走活性。
关于嗜酸性粒细胞，以小鼠的嗜酸性粒细胞为例，可用公知的J.Leukocyte Biol.第60卷，第573项(1996)描述的方法或其改良方法制备。
关于待测化合物，如肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液、血浆等，这些化合物可为新的化合物或公知的化合物。
上述筛选方法的实施，经过适合于筛选的缓冲液来制备本发明蛋白质的标样。只要缓冲液对游走性嗜酸性粒细胞无抑制作用，其中pH约为4～10(优选pH约为6～8)的磷酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液等均可。
本发明蛋白质的嗜酸性粒细胞的游走活性可根据公知的Immunity，第4卷，1项(1996)描述的方法或其改良方法测定。
如关于在上述(ii)中所述的嗜酸性粒细胞的游走活性与(i)比较，可以选择以可抑制约20％以上，优选约30％以上，更优选约50％以上的被检化合物作为抑制本发明蛋白质的嗜酸性粒细胞的游走活性的化合物。
应用本发明的筛选方法或筛选用的试剂盒所得到的化合物或其盐是从上述待测化合物如肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液、血浆等选择出来的化合物，它们是抑制本发明蛋白质活性(如嗜酸性粒细胞的游走活性等)的化合物。
有关该化合物的盐可使用与上述本发明蛋白质I的盐相同的物质。
能抑制本发明蛋白质活性的化合物可用作以下疾病的治疗或预防药物，所述疾病为伴随肺或呼吸道炎症的肺或胸部的疾病，如支气管哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等。
应用本发明的筛选方法或筛选用的试剂盒所得化合物用于上述疾病的治疗和预防药物时，可以按照常规方法进行实施。例如，含有本发明蛋白质a的药物可以制成片剂、胶囊、酏剂、微胶囊、无菌溶液、悬浮液剂型等。
如此所获制剂安全、低毒，因此可对人或其它温血动物(例如，大鼠、小鼠、兔子、鸡、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴，黑猩猩等)给药。
该化合物或其盐的剂量依赖于该化合物的作用、病症、受试者和给药方法等而异；例如用能够抑制本发明蛋白质a活性的口服药物治疗支气管哮喘疾病时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。当非经口给药时，该化合物一次投药量依赖于给药受体、症状等而定，例如用能够抑制本发明蛋白质a活性的注射药物治疗支气管哮喘疾病时，成年人(体重60kg)优选静脉注射，剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
(4)本发明蛋白质a或蛋白质b的定量针对本发明蛋白质的抗体(下文通常简称为本发明抗体)能特异地识别本发明的蛋白质，因此可用于定量测试样品溶液中的本发明蛋白质，尤其是通过夹心免疫分析进行定量。因此，本发明提供了下述的定量方法(i)一种定量待测样品液中本发明蛋白质的方法，其包括，使本发明的抗体与待测样品液以及标记的本发明蛋白质进行竞争反应，测定与该抗体结合的本发明标记性蛋白质的比率；和，(ii)一种定量待测样品液中本发明蛋白质的方法，其包括，同时或先后使所述待测样品液与固定在固相载体上的本发明抗体以及标记的本发明其它抗体反应，测定固相载体上标记试剂的活性。
在上述方法(ii)中，优选一种抗体能识别本发明蛋白质(优选本发明蛋白质I或II)的N-末端，而另一抗体能识别本发明蛋白质(优选本发明蛋白质I或II)的C-末端。
针对本发明蛋白质的单克隆抗体(下文，通常称作本发明单克隆抗体)可用于定量本发明蛋白质。此外，也可通过组织染色来定量本发明蛋白质。为此，可用抗体本身或使用抗体分子的F(ab’)2、Fab’或Fab片段。
对使用本发明蛋白质的抗体进行的定量方法没有特别的限制；可以使用任何方法，只要它涉及以下方法，即根据待测样品液中相应抗原含量(例如蛋白质的量)，用化学或物理方法检测抗体、抗原或抗体-抗原复合物的量，然后根据含已知量抗原的标准溶液制备的标准曲线来计算。优选的方法为，例如比浊法、竞争法、免疫测定法和夹心法；就敏感性和特异性而言，特别优选后面将要描述的夹心法。
用于分析方法的标记试剂的例子为放射性同位素、酶、荧光物质和化学发光物质等。同位素的例子包括[125I]、[131I]、[3H]、[14C]等。优选酶的例子为稳定、具有高比活的酶，包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶。荧光物质的例子包括荧光胺、异硫氰酸荧光素等。化学发光物质的例子包括鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、光泽精等。此外，也可使用生物素-链霉素系统来对抗原或抗体标记。
在固定抗原或抗体时，可以使用物理吸附。作为替代方法，也使用传统上来固定蛋白质或酶的化学结合。载体的例子包括，固相多糖如琼脂糖、葡聚糖和纤维素；合成树脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、硅；或玻璃等。
在夹心法中，待测样品溶液与本发明的固定化单克隆抗体反应(第一反应)，然后与本发明的标记的其它单克隆抗体反应(第二反应)，测定固相载体上的标记试剂活性，由此可以测定待测样品中本发明蛋白质的量。第一和第二反应可以以相反次序进行，或同时或有间隔的先后进行。标记试剂的类型和固定的方法同上述的相同。在夹心法免疫分析中，用于标记的抗体和用于固相的抗体未必是一种类型或一个种类的抗体，也可使用两种或多种抗体的混合物来改善测定的灵敏度等。
在根据本发明的夹心方法测定本发明蛋白质时，优选用于第一和第二反应的单克隆抗体与本发明蛋白质的结合位点彼此不同。也就是说，在第一和第二反应用的抗体为，当第二反应的抗体识别本发明蛋白质的C端时，优选在第一反应中使用能识别除C端以外的位点，如N端。
本发明的单克隆抗体可用于除夹心法以外的其它分析方法，例如竞争法、免疫测定法和比浊法。
在竞争法中，待测溶液中的抗原和标记抗原竞争与抗体反应，然后将未反应的标记抗原(F)及结合于抗体的标记抗原(B)分离(即B/F分离)，测定B或F的标记量，从而可以测定待测溶液中的抗原量。在此类方法的反应中，有一种液相方法和一种固相方法，前者使用可溶性抗体，即加入针对第一抗体的第二抗体后，用聚乙二醇来有效分离B/F；后者可用固定的抗体作为第一抗体，或用可溶性抗体作为第一抗体但第二抗体为固相抗体。
在免疫测定法中，待测溶液中的抗原和固相抗原竞争性地与一定量的标记抗体反应，然后使液相与固相分离；或待测溶液中的抗原与过量标记抗体反应，然后加入固相抗原，使未反应的标记抗体与该固相结合，然后使液相与固相分离。随后，测定两相的标记量，来测定待测溶液中的抗原量。
在比浊法中，测定抗原-抗体在凝胶或溶液中反应产生的固相沉淀的量。即使待测溶液中抗原量很少且仅获得小量的沉淀，利用激光散射的激光比浊法也可以测定。
本发明应用这些免疫分析方法中任何一个进行分析时，不需要任何特殊条件和操作。除了每种方法的常规条件和操作外，本领域技术人员可构建测定本发明蛋白质的分析系统。所述常规技术的细节，参见如入江宽(编)“放射免疫分析”(1974，讲谈社，日本)；入江宽(编)“放射免疫分析，续编”(1979，讲谈社，日本)；石川荣治等(编)“酶免疫分析”(医学书院，1978)；石川荣治等(编)“酶免疫分析，第二版”(医学书院，1982)；石川荣治等(编)“酶免疫分析，第三版”(医学书院，1987)；“酶学方法”卷70(免疫化学技术(A))；同上，卷73(免疫化学技术(B))；同上，卷74(免疫化学技术(C))；同上，卷84(免疫化学技术(D选择性免疫分析))；同上，卷92(免疫化学技术(E单克隆抗体及普通免疫分析方法))；同上，卷121(免疫化学技术(I杂交瘤技术及单克隆抗体))(Academic Press出版)等)。
如上所述，使用本发明的抗体可高度敏感地定量本发明蛋白质。
此外，使用本发明的抗体可定量本发明蛋白质的浓度，(1)从而当检出本发明蛋白质浓度的增加时，能够诊断出如下各种疾病或者将来对这些疾病的高度易感性例如所述疾病为伴随肺或呼吸道炎症的肺或胸部的疾病，如支气管哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等。
另外，本发明抗体可用于检出体液或者组织等待检标本液中存在的本发明蛋白质。又可用于抗体柱的制作，该抗体柱可用于纯化本发明蛋白质；检出各纯化组分中的本发明蛋白质；对被检细胞内本发明蛋白质的行踪进行分析等。
(5)基因诊断制剂例如，本发明的DNA作为一种探针可以检出人或温血动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、鸡、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴、黑猩猩等)中编码本发明蛋白质的DNA或mRNA的异常(基因异常)，因此，本发明的DNA可用作基因诊断制剂，用于诊断DNA或mRNA的损伤、突变，或其表达量的减少、或该DNA或mRNA的增加或DNA或mRNA的过表达。
上述基因诊断通过使用编码本发明蛋白质的DNA，用众所周知的Northern杂交分析或PCR-SSCP分析来完成(Genomics，5，874-879(1989)；美国科学院学报，86，2766-2770(1989))。
例如，当用Northern杂交分析表达量过多时和PCR-SSCP分析检出DNA突变时，能够很大程度地诊断出如下各种疾病所述疾病为伴随肺或呼吸道炎症的肺或胸部的疾病，如支气管哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等。
(6)含有反义DNA的药物反义DNA能与本发明DNA互补地结合并抑制该DNA的表达，因此反义DNA能够抑制生物体内中本发明蛋白质产生，因此它可用作治疗或预防以下各种疾病的药物例如，伴随肺或呼吸道炎症的肺或胸部的疾病，如支气管哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等。
当将所述反义DNA用作上述各种疾病的治疗或预防药物时，同前所述含有本发明DNA的各种疾病的治疗或预防药物一样可以实施。
例如，当反义DNA用作上述预防/治疗药物时，反义DNA可单独使用，或插入合适载体如反转录病毒载体、腺病毒载体或腺伴随病毒载体后按常规方法给药。该反义DNA可以以裸露DNA的形式给药，或与生理学上承认的用于促进吸收的辅助剂等的载体一起制成药剂并给药以便于其被基因枪摄入或通过含有水凝胶的导管导入。或者作为雾化吸入剂可在呼吸道局部给药。
该反义DNA也可用作诊断寡核苷酸探针，其目的是检查组织或细胞中是否有本发明DNA的存在或者该DNA的表达。
(7)含有本发明抗体的药物本发明抗体具有中和本发明蛋白质活性的作用，例如，该抗体可用作治疗或预防以下各种疾病的药物例如，伴随肺或呼吸道炎症的肺或胸部的疾病，如支气管哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等。
上述各种疾病的治疗药物或预防药物含有本发明抗体，其可直接以原始液体制剂或以适当剂型的药用组合物，对人或哺乳动物(例如，大鼠、兔子、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)经过口服或非口服形式给药。本发明抗体的剂量依赖于给药受体、症状和给药方法等而异；当用于治疗或预防支气管哮喘疾病患者(成人)时，静脉注射的一次剂量为每天大约0.01-20mg/kg体重，优选大约0.1-10mg/kg体重，更优选0.1-5mg/kg体重，一天1-5次，优选一天1-3次。其他非胃肠道给药或经口给药均依据此量。症状特别严重者根据其病症可以增加使用量。
本发明的抗体可以直接给药或者制成适当的药用组合物给药。所述药用组合物包含上述抗体或它们的盐和可药用载体、稀释剂或赋形剂。这种组合物可以为适于经口或非胃肠道给药的剂型。
也就是说，适于经口给药的组合物包括固体型制剂或液体型制剂，具体地有片剂(包括糖衣片、薄膜包衣片剂)、丸剂、颗粒剂、粉剂、胶囊(包括软胶囊)、糖浆、乳剂、悬浮剂等。这种组合物可以通过公知的方法生产，其制剂通常包括制药领域常规使用的载体、稀释剂、赋形剂。例如用于片剂的载体或赋形剂有乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸镁等。
适于非胃肠道给药的组合物有针剂、栓剂等，针剂包含的剂型有静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、点滴注射剂等。这类注射剂根据公知方法，例如将所述抗体或它们的盐溶解、悬浮或者乳化于无菌水性溶液或无菌油性溶液而制备。注射用水溶液有生理盐水、含葡萄糖及其它辅助制剂的等渗溶液，并还可以进一步与合适的助溶剂如醇(如乙醇)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇)、非离子表面活性剂(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50(加氢的蓖麻油的聚氧乙烯(50ml)加成化合物)等结合使用。油性溶液有芝麻油和大豆油，它们可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。由此制备的注射液一般装在合适的安瓿中。用于直肠给药的栓剂通过将所述抗体或它们的盐与一般的栓剂基质混合而制备。
上述口服或非口服的药用组合物，最好制成适合于活性成分投药剂量的用药剂型。其投药剂型包括，片剂、丸剂、胶囊、注射制剂(安瓿)、栓剂等，每个单位剂型通常含有上述抗体5-500mg，注射剂优选含5-100mg，其他制剂优选含有10-250mg。
此外，前面所述各种组合物也可含有其它活性成分，只要与上述抗体的结合不发生不利的相互作用。
(8)转基因动物本发明提供一种非人哺乳动物，其具有编码外源性本发明蛋白质的DNA(以下简称为本发明外源性DNA)或其DNA变体(通常简称为本发明外源性DNA变体)。
即，本发明提供(1)一种非人哺乳动物，其具有本发明外源性DNA或其DNA变体；(2)(1)中所述非人哺乳动物，其为啮齿动物；(3)(2)中所述啮齿动物，其为小鼠或大鼠；以及(4)一种重组载体，其含有本发明外源性DNA或其DNA变体，并能在哺乳动物中表达。
具有本发明外源性DNA或其DNA变体的非人哺乳动物(以下简称为本发明转基因动物)可如下产生将所需DNA转染至未受精卵、受精卵、精子以及含有相应原始细胞的胚细胞等，优选它们处于非人哺乳动物发育过程中胚胎发育期(更优选单细胞或受精卵细胞期，一般在8细胞期以前)，可用方法有磷酸钙法、电脉冲法、脂转染技术、凝集法、显微注射法、粒子枪法、DEAE-葡聚糖法等。可根据这些转基因法将本发明外源DNA转移至体细胞、活器官、组织细胞，对转化体进行组织培养或细胞培养。可以进一步地根据公知细胞融合法使这些细胞与所述胚细胞或本领域公知的细胞融合法而产生本发明的转基因动物。
非人哺乳动物的例子有牛、猪、绵羊、山羊、兔子、狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠等，就构建人类疾病的动物模型而言，优选个体发育以及生命周期比较短，容易繁殖的啮齿动物，主要是小鼠(例如，其纯种系有C57BL/6系、DBA2系等；杂种系有B6C3F1系、BDF1系、B6D2F1系、BALB/c系、ICR系等)或大鼠(例如，Wistar，SD等)等。
能够在哺乳动物中进行表达的重组载体中的[哺乳动物]除了所述非人哺乳动物外还有人等。
所说本发明外源性DNA不是非人哺乳动物本来具有的DNA，而是指从哺乳动物中分离并提取的本发明DNA。
所述本发明的DNA变体包括因本发明原始DNA的碱基序列发生变异(例如，突变等)产生的DNA，具体地说，包括碱基添加、缺失、用其它碱基置换产生的DNA，还有异常DNA。
该异常DNA是指能表达异常的本发明蛋白质的DNA，例如，所述DNA表达的蛋白质可抑制本发明蛋白质的正常功能。
本发明外源性DNA可以来自任一哺乳动物，不论是与靶动物同种还是异种均可。当把本发明DNA转移至靶动物体中时，优选使用DNA构建体，其中使该DNA连接在能于该靶动物中表达该DNA的启动子下游。例如，转移本发明的人源DNA时，以高水平表达本发明DNA的转基因动物可如下制备选择携有与所述人源DNA高度同源的本发明DNA的各种哺乳动物，以及能在该靶动物中对来源于各种哺乳动物(如兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠等)的DNA进行表达的各种启动子，将所述本发明人源DNA连接于所述各种启动子的下游形成DNA构建体(如载体等)，然后显微注射至所述靶动物的受精卵中，如小鼠受精卵。
本发明蛋白质的表达载体有大肠杆菌质粒、枯草杆菌质粒、酵母质粒、噬菌体如λ噬菌体、反转录病毒如鼠白血病病毒、动物病毒如痘苗病毒或杆状病毒。其中优选使用大肠杆菌质粒、枯草杆菌质粒、或酵母质粒。
进行上述DNA表达调节的启动子通常使用如下的启动子①来自病毒(如，人类猿病毒、巨细胞病毒、鼠白血病病毒、JC病毒、乳腺癌病毒、脊髓灰质炎病毒等)DNA的启动子；②来自各种哺乳动物(人、兔子、狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠等)的启动子，例如下述蛋白启动子白蛋白、胰岛素II、尿空斑蛋白(uroplakin)II、弹性蛋白酶、促红细胞生成素、内皮素、肌酸激酶、胶质原纤维酸性蛋白、谷光甘肽S-转移酶、血小板衍生的生长因子β、角蛋白K1、K10以及K14、胶原蛋白I型及II型、cAMP依赖性蛋白激酶βI亚单位、肌营养不良蛋白、抗酒石酸碱性磷酸酶、心房利钠激素、内皮受体-酪氨酸激酶(缩写为Tie2)、Na/K-ATP酶、神经微丝轻链、金属硫蛋白I及IIA、金属蛋白酶1组织抑制剂、MHC I类抗原(H-2L)、H-ras、肾素、多巴胺β-羟化酶、甲状腺过氧化物酶(TPO)、多肽链延伸因子1α(EF-1α)、β-肌动蛋白、α及β-肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链1及2、髓磷脂基质蛋白、甲状腺球蛋白、Thy-1、免疫球蛋白、H链可变区(VNP)、血清淀粉样蛋白P成分、肌红蛋白、肌钙蛋白C、平滑肌α-肌动蛋白、前脑啡肽原A、加压素等。其中最好使用能在全身高效表达的巨细胞病毒启动子、人多肽链延伸因子1α(EF-1α)启动子、人及家鸡β-肌动蛋白启动子等。
优选上述载体在转基因动物中有终止信使RNA转录的序列(一般称为终止子)，例如，可以使用来自病毒以及各种哺乳动物的各种DNA的序列，优选使用类人猿病毒的SV40终止子。
此外，为了更进一步提高外源目标DNA的表达，可根据不同目的将各种DNA的剪接信号、增强子区、真核DNA内含子的一部分连接在该启动子区的5′上游、或启动子区和翻译区之间或翻译区的3′下游。
本发明蛋白质正常的翻译领域，可从人类或各种哺乳动物(如兔子、狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠等)肝脏、肾脏、甲状腺细胞、成纤维细胞的DNA和市场上出售的各种基因组DNA文库而来的全部DNA或部分DNA，或根据公知的方法从肝脏、肾脏、甲状腺、成纤维细胞的RNA制备互补DNA以该DNA为原料来获得翻译领域。另外，外源性的异常DNA可利用位点突变方法从上述细胞或组织中获得的正常蛋白质的翻译区域制备变异的翻译区域。
该翻译区可以通过常规基因工程方法构建成能在转基因动物中进行表达的DNA构建体，其中将所述DNA连接至所述启动子下游，必要时还同时位于转录终止位点的上游。
在受精卵细胞阶段转移本发明外源DNA必须保证靶动物的所有胚细胞及体细胞中都存在该外源DNA。在转基因DNA之后产生的动物的胚细胞中所述本发明外源性DNA的存在表明该动物的所有后代均在其胚细胞及体细胞中含有本发明外源性DNA。继承了这种本发明外源性DNA的动物后代在其所有胚细胞及体细胞中均携有本发明外源性DNA。
已转移有正常的本发明外源性DNA的非人哺乳动物通过杂交证实该外源DNA的稳定维持后，可作为携有该DNA的动物在一般饲养环境下传代。
在本发明受精卵细胞阶段中外源DNA的转移必须保证靶动物的所有胚细胞及体细胞中都存在过量外源DNA。在转移DNA之后产生的动物胚细胞中所述本发明外源性DNA的过量存在意味着产生的动物后代均在其所有胚细胞及体细胞中含有过量本发明外源性DNA。继承了这种本发明外源性DNA的动物后代在所有胚细胞及体细胞中均保持有过量的本发明外源性DNA。
通过获得一对同源染色体上都有导入的DNA的纯合体动物，再通过它们的雌雄杂交其所有的后代就可以维持过量的该DNA。
非人哺乳动物具有正常本发明DNA，其中正常的本发明DNA高效地表达，通过促进内源性正常DNA的功能最终将导致本发明蛋白质发生功能亢进病，这时，该动物可以用作这种疾病的动物模型。例如，使用本发明的正常DNA转基因动物，可以阐明本发明蛋白质发生功能亢进病症以及与本发明蛋白质有关的疾病的病理机制以及研究这些疾病的治疗方法。
又，由于哺乳动物转染了正常的本发明外来DNA，其具有游离的本发明蛋白质增加症状，因此这种动物也可用于筛选药物的实验该药物用于治疗与本发明蛋白质相关的疾病。
另一方面，具有异常的本发明外源性DNA的非人哺乳动物通过杂交当确定了外源性DNA稳定保持之后，可以在一般饲养环境下传代。可通过将目标外源DNA重组到所述质粒中而将该DNA作为起始材料使用。带有启动子的DNA构建体可以通过一般DNA工程学方法制备而成。在受精卵细胞阶段中本发明的异常DNA的转基因必须保证靶动物的所有胚细胞及体细胞中都存在该异常DNA。在转基因DNA之后产生的动物的胚细胞中所述本发明异常DNA的存在表明该动物的所有后代均在其胚细胞及体细胞中携带本发明异常DNA。继承了这种本发明外源性DNA的动物后代在其所有胚细胞及体细胞中均携有本发明异常DNA。通过获得一对同源染色体上都有导入的DNA的纯合体动物，再通过它们的雌雄杂交，其所有的后代就可以携带该DNA。
由于具有本发明异常DNA的非人哺乳动物可使该异常DNA高效表达，通过抑制内源性的正常DNA功能，最终将导致该动物发生本发明蛋白质的功能失活型无反应病症，因而该动物可用作相应疾病的模型动物。例如，使用本发明的异常DNA转基因动物，可以阐明本发明蛋白质的功能失活型无反应病症以及研究这些疾病的治疗方法。
又，本发明异常DNA高效表达的转基因动物还可能用于阐明本发明蛋白质的功能失活型无反应病症中本发明异常蛋白质对正常蛋白质的功能的抑制(显性失活作用)作用。
由于携有本发明之异常外源DNA的哺乳动物中存在游离形式的本发明蛋白质增加症状，因此这类动物也可用作筛选药物的实验，该药物是针对本发明蛋白质的功能失活型无反应症的治疗。
上述2种转基因动物的其它可能应用包括①作为组织培养的细胞源；②通过直接分析本发明转基因动物组织中的DNA或RNA，或者间接分析该DNA所表达的蛋白质组织，来阐述它们与被本发明蛋白质特异性表达或活化的蛋白质的关连性；③用标准组织培养技术培养的含有所述DNA的组织细胞，研究难以培养的组织中细胞的功能；④用上述③中细胞筛选能够提高该细胞功能的药物；⑤分离纯化本发明蛋白质的变体并制备其抗体。
用本发明的转基因动物可以研究与本发明蛋白质有关的疾病的临床症状，其中包括本发明蛋白质的功能失活型无反应病症，同时在与本发明蛋白质有关的疾病模型中还能得到各器官中更详细的病理学发现，从而开发新治疗方法，以及用于研究和治疗与该疾病相关的继发性疾病的方法。
从本发明转基因动物中取出各种器官，切碎后，用胰蛋白酶等蛋白质酶(蛋白)分解可以得到游离的转基因细胞，然后建立培养细胞系。本发明的转基因动物还可用于鉴定能产生本发明蛋白质，研究这些细胞的特殊性、其与细胞凋亡、分化或增殖的关系，或者这些特性中的信号传递机制，从而研究其中的任何异常性，因此本发明的转基因动物可以为研究本发明蛋白质并阐明其作用提供有用的研究材料。
为了利用本发明转DNA基因动物，开发与本发明蛋白质相关的疾病(包括本发明蛋白质的功能失活型无反应病症)的治疗药物，可利用上述检查法以及定量法提供有效而快速的药物筛选法。还可利用本发明转基因动物或能表达本发明外源性DNA的载体，研究并开发与本发明蛋白质有关的疾病的基因治疗方法。
(9)基因敲除实验动物本发明提供携有无活性的本发明DNA的非人哺乳动物胚胎干细胞及在本发明DNA的表达中有缺陷的非人哺乳动物。
即，本发明提供(1)携有无活性的本发明DNA的非人哺乳动物胚胎干细胞；(2)第(1)所述胚胎干细胞，其中通过导入报道基因(例，大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因)使该DNA灭活；(3)第(1)所述胚胎干细胞，其具有抗新霉素的作用；(4)第(1)所述胚胎干细胞，其中所述非人哺乳动物为啮齿动物；(5)第(4)所述胚胎干细胞，其中所述啮齿动物为小鼠；(6)一种对本发明DNA的表达有缺陷的非人哺乳动物，其中本发明DNA不具活性；(7)第(6)所述非人哺乳动物，通过导入报道基因(例，大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因)使该DNA灭活，该报道基因能在本发明DNA的启动子调控下表达；(8)第(6)所述非人哺乳动物，其为啮齿动物；(9)第(8)所述非人哺乳动物，其中所述啮齿动物为小鼠，以及(10)一种对本发明DNA的启动子活性具有促进或抑制作用的化合物或其盐的筛选方法，包括给第(7)所述动物投与待测化合物，并检测报道基因的表达。
所谓携有无活性本发明DNA的非人哺乳动物胚胎干细胞是指，通过对本发明DNA进行人工诱突而抑制该非人哺乳动物表达所述DNA，或通过使该DNA编码的本发明蛋白质活性基本丧失，从而使该DNA基本上不具有表达本发明蛋白质的能力(下文有时称本发明的基因敲除DNA)的胚胎干细胞(简称ES细胞)。
非人哺乳动物可以用与前述同样的动物。
对本发明DNA进行人工诱变的方法包括，删除该DNA序列的部分序列或全部序列，插入或用其它DNA置换。通过这些诱变，可以利用诸如读码框的移动，或启动子或外显子功能的破坏来制备本发明的基因敲除DNA。
携有无活性本发明DNA的非人哺乳动物胚胎干细胞(下文简称携有无活性本发明DNA的ES细胞或本发明的基因敲除ES细胞)可如下获得分离所选非人哺乳动物所具有的本发明DNA，在其外显子部分插入抗药基因如抗新霉素基因、抗潮霉素基因，或插入报道基因如lacZ(β-半乳糖苷酶基因)、cat(氯霉素乙酰转移酶基因)以破坏外显子的功能，或在外显子之间的内含子上插入能够终止基因转录的DNA序列(如，polyA加尾信号等)以抑制完整mRNA的合成，将如此构建的含有被破坏的上述DNA的序列(下文简称为靶载体)通过同源重组整合至该动物的染色体上。对如此获得的ES细胞用本发明DNA上或其附近的DNA序列作为探针进行Southern杂交分析，或用上述靶载体上的DNA序列和另一种位于本发明DNA附近但不包括在上述靶载体中的DNA序列作为引物进行PCR，从而筛选得到本发明的基因敲除ES细胞。
通过同源重组使本发明DNA失活的亲本ES细胞可以是上述已建立的细胞株，也可以是根据Evans及Kaufma方法建立新的细胞株。例如，目前常用的小鼠ES细胞是129系ES细胞，但其免疫学背景不十分清楚，故优选使用遗传免疫学背景清晰的纯系ES细胞等，例如，其中所述BDF1小鼠(C57BL/6和DBA/2的F1代)是使C57BL/6通过与DBA/2杂交而改良其卵数少的特点。BDF1小鼠其优点卵数多且卵饱满，具有C57BL/6小鼠的背景，因此用其ES细胞作为小鼠病理模型时，通过再与C57BL/6小鼠进行回交可以使其遗传背景恢复为C57BL/6小鼠的背景。
当建立ES细胞时，一般使用受精后第3.5天的胚泡，本发明优选在8细胞胚期采集胚胎并培养至胚泡，通过使用此胚泡可以更有效地获得大量的初期胚。
虽然可以利用的ES细胞无所谓性别，但是通常雄性ES细胞比较容易形成生殖细胞系的嵌合体。为了减少培养时的繁杂过程最好尽快判断雌雄性。
ES细胞的雌雄判断方法有，用PCR法扩增并检测Y染色体上性决定区的基因。如果使用这种方法，只需一个菌落(约50个)的ES细胞就足以进行性别分析，而进行核型分析则需要约106个细胞；因此可在培养初期根据对性别的鉴定对ES细胞进行第一次筛选，及早选出雄性细胞，从而大大缩短培养初期的时间。
可用G带法确定染色体数而完成第二次选择。优选所获得的ES细胞染色体数为100％的正常数，但经物理操作建立细胞系很难获得具有正常染色体数的细胞时，优选对ES细胞的基因实施基因敲除后，再克隆成正常细胞(如，染色体数为2n＝40的小鼠体细胞)。
这样所得的胚胎干细胞通常繁殖能力强，但个体发育能力低，因此必须传代。例如，在适当饲养细胞如STO成纤维细胞上，在有LIF(1-10000U/ml)的情况下，在CO2培养箱(优选约5％CO2和约95％空气，或约5％CO2、约5％O2和90％空气)内约37℃培养所述胚胎干细胞系，传代时，可用胰酶/EDTA溶液(通常约0.001-0.5％胰酶/约0.1-5mM EDTA，优选约0.1％胰酶/1mM EDTA)处理以获得单细胞，然后接种至新鲜制备的饲养细胞。通常每1-3天传代一次，并在传代时观察细胞，将形态异常的细胞除去。
ES细胞在适当条件下，在单层培养中长至高密度，或在悬浮培养中形成细胞集团后，它们可自发分化成各种类型的细胞，如头顶肌细胞、内脏肌细胞、心肌细胞等[M.J.Evans及M.H.Kaufman，自然，292，154(1981)；G.R.Martin，美国国家科学院院刊，78，7634(1981)；T.C.Doetschman等，胚胎学和实验形态学杂志87，27(1985)]，从本发明分化的ES细胞得到对本发明DNA的表达有缺陷的细胞，它们可用于体外进行本发明蛋白质的细胞生物学研究。
可用公知方法测定所选动物的mRNA量，并间接比较表达量，从而使本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物与正常动物有所区别。
非人哺乳动物的例子如前所述。
对本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物而言，可将如上制备的靶载体导入小鼠胚胎干细胞或小鼠卵细胞，然后通过同源重组使小鼠胚胎干细胞或小鼠卵细胞染色体上的本发明DNA被靶载体上的已失活的本发明DNA序列所取代，从而完成对本发明DNA的基因敲除。
以位于本发明DNA内或附近的一段DNA序列作为探针通过DNA杂交分析，或以靶载体上的一段DNA序列以及不包含在该靶载体中的另一DNA序列为引物通过PCR分析，可以鉴定携有本发明已破坏的DNA的基因敲除细胞。当使用非人哺乳动物胚胎干细胞时，对其中所含本发明DNA已失活的一个细胞系通过同源重组进行克隆；在适当时期如8细胞期将所得已克隆的细胞注射至，例如非人哺乳动物胚胎或胚泡中。将所得嵌合体胚胎移植到非人哺乳动物的假妊娠子宫。所得动物是由具有正常的本发明DNA位点的细胞和具有人工诱变的本发明DNA位点的细胞构成的嵌合体。
当该嵌合体动物的部分生殖细胞中本发明DNA位点发生突变后，可从这种嵌合动物与正常动物交配得到的子代群体中，通过毛色(coat color)鉴定等方法，筛选以下个体，其所有组织均由具有突变的本发明DNA位点的细胞组成。所得杂合个体通常在本发明蛋白质的表达中有缺陷。通过这些杂合体的交配后代可获得本发明蛋白质的表达有缺陷的纯合个体。
使用卵细胞时，可将DNA溶液显微注射至细胞核内，获得一种非人哺乳类转基因动物，其中已将靶载体导入其染色体上。可根据同源重组从这些非人哺乳类转基因动物中筛选本发明DNA位点上有变异的个体。
如上述，针对本发明DNA的基因敲除个体的杂交后代在证实了带有此基因敲除后，可通过常规培养条件进行繁衍。
可按照常规方法获得并维持繁殖系。即通过含有所述非活性DNA的雌雄动物交配，可以获得两条同源染色体上都具有该非活性DNA的纯合体。对于母本动物来说，在1个正常个体、多个纯合体的状态下饲养，就能更有效地得到这种纯合体动物。通过雌雄杂合体的杂交，可繁殖并传代具有该非活性DNA的纯合体以及杂合体动物。
本发明DNA已失活的非人哺乳动物胚胎干细胞在产生本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物方面十分有用。
由于本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物丧失了由本发明蛋白质诱导所得的各种生物活性，故可作为本发明蛋白质的生物活性失活的疾病模型，并因此有利于阐明这些疾病的原因及研究其治疗方法。
(10)对本发明DNA之缺失或损伤等所致疾病能进行有效治疗或预防的化合物的筛选方法可用本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物筛选对本发明DNA之缺失或损伤所致疾病(如感染性疾病等)进行有效预防或治疗的化合物。
即，本发明提供对本发明DNA之缺失或损伤等所致疾病能进行有效预防或治疗的化合物或其盐的筛选方法，其特征为，对本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物施用一种待测化合物，观察和测定该动物的变化。
可用于所述筛选方法的本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物实例如上述。
所述待测化合物如肽、蛋白质、非肽化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液、血浆等，它们既可为新化合物也可为已知化合物。
具体地，用待测化合物处理本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物，与未处理的对照动物比较，以该动物的各个器官、组织、疾病的症状变化为指标，可以评价此待测化合物的治疗或预防效果。
所述用待测化合物处理被测动物的方法，可以口服给药、静脉注射，可以根据待测动物的症状和待测化合物的性质等适当地进行选择。另外，待测化合物的给药量还可以根据投药途径、待测化合物的性质等进行适当选择。
当筛选针对支气管哮喘具有治疗或预防效果的化合物时，对本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物免疫抗原(如OVA)，再吸入同样的抗原(如OVA)使过敏性呼吸道发生亢进时，给予待测化合物，定期地测定该动物的呼吸道抵抗情况及嗜酸性粒细胞浸润等的变化。
在这种筛选方法过程中，由于所述动物吸入抗原而导致呼吸道抵抗增大约为10％以上、优选约为30％以上，更优选50％以上，当对被检动物施用待测化合物时，这种抵抗被抑制的时候，即可筛选该待测化合物对支气管哮喘疾病具有治疗或预防效果的化合物。
用该筛选法得到的化合物是从上述的待测化合物中选出的化合物，对因本发明蛋白质的表达增加引起的疾病(如，支气管哮喘等)具有治疗和预防效应，所以这种化合物可以用作治疗和预防该类疾病的药物，既安全又毒性低。另外，如上述筛选的化合物所衍生的化合物也可以使用。
用上述筛选法得到的化合物可以形成盐的形式，也可以与生理上可接受的碱(如碱金属盐)或酸(如无机酸或有机酸)形成盐而使用，优选为生理上可接受的酸加成盐。这样的盐有，与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐，与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等。
含有用上述筛选法所得的化合物或其盐的药物，可以用类似于制备含上述本发明蛋白质的药物的方法进行制备。如此得到的制剂安全、低毒，因此可以对人或哺乳动物投药，例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴子等。
该化合物或其盐的剂量依赖于病症、受试者和给药方法等而异；例如经口投药用于治疗支气管哮喘疾病时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。非胃肠道给药时，一次投药量依赖于给药受体、症状等而变，例如，以针剂注射该化合物用于治疗支气管哮喘疾病时，成年人(体重60kg)的剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
(11)筛选能促进或抑制本发明DNA中启动子之活性的化合物的方法本发明提供用于筛选能促进或抑制本发明DNA中启动子之活性的化合物或其盐的方法，其特征为，对本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物给予待测化合物，并检测报道基因的表达。
在上述筛选方法中，本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物选自上述本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物，该动物中通过导入报道基因使本发明DNA失活，而该报道基因是在本发明DNA的启动子控制下表达。
用于筛选的具体化合物实例同上。
所述报道基因同上，优选β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、可溶性碱性磷酸酶基因或荧光素酶基因等。
由于本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物之中，本发明DNA以报道基因取代，而报道基因又受本发明DNA启动子的调控而表达，因此追踪报道基因编码物质的表达可以检测启动子活性。
例如，当用大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)取代编码本发明蛋白质的DNA区的一部分时，原本表达本发明蛋白质的组织中，表达了β-半乳糖苷酶以代替本发明蛋白质。因此，用试剂β-半乳糖苷酶的底物如5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖吡喃糖苷(X-gal)染色可以很容易地观察到本发明蛋白质在动物体内的表达状态。具体地，选取本发明蛋白质缺陷型小鼠或其经戊二醛等固定的组织切片，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，用含有X-gal的染色液在室温或37℃左右反应约30分至1个小时，之后将组织标本用1mMEDTA/PBS溶液洗涤以停止β-半乳糖苷酶反应，观察β-半乳糖苷酶产生的颜色。可按照常规法再检测编码lacZ的mRNA。
用该筛选法得到的化合物或其盐是从上述待测化合物中选出的，其为具有促进或抑制本发明DNA启动子活性的化合物。
用上述筛选法得到的化合物可以形成盐，所述盐可以优选使用与生理上可接受的碱(如碱金属盐)或酸(如无机酸或有机酸)形成盐，尤其优选为生理上可接受的酸加成盐。这样的盐有，与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐，与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等。
由于具有促进本发明DNAa启动子的活性的化合物或其盐，可促进本发明蛋白质a的表达，可促进本发明蛋白质的活性，因此它们可作为安全、低毒性药物用于治疗和预防感染性疾病(如HIV感染、HBV感染、HCV感染、结核感染、条件感染等)。
另外，作为抑制本发明的DNAa或DNAb启动子的活性的化合物或其盐，可抑制本发明蛋白质的表达及蛋白质活性，因此它们可作为治疗和预防以下疾病的药物，所述药物安全、低毒，其疾病为伴随肺或呼吸道炎症的肺或胸部的疾病，如支气管哮喘及慢性阻塞性肺部疾病等。
再者，由上述筛选得到的化合物进而衍生的化合物同样可以使用。
含有用上述筛选法所得的化合物或其盐的药物，可以用类似于制备含上述本发明蛋白质或其盐的药物的方法进行制备。
如此得到的制剂安全、低毒，因此可以对人或哺乳动物投药，例如大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、绵羊、猪、牛、马、猫、狗、猴子等。
该化合物或其盐的剂量依赖于病症、受试者和给药途径等而异；例如经口投药以治疗支气管哮喘为目的给予抑制本发明DNA启动子活性的化合物时，一般成年人(体重60kg)的正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。非胃肠道给药时，一次投药量依赖于给药受体、症状等而变，例如，以针剂注射抑制本发明DNA启动子活性的化合物时，成年人(体重60kg)的剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
相反，经口服治疗感染性疾病为目的给予促进本发明DNAa启动子活性的化合物时，一般成年人(体重60kg)正常剂量为大约0.1-100mg/天，优选大约1.0-50mg/天，更优选1.0-20mg/天。非胃肠道给药时，一次投药量依赖于给药受体、症状等而变，例如，以针剂注射促进本发明DNA启动子活性的化合物时，成年人(体重60kg)的剂量为大约0.01-30mg/天，优选大约0.1-20mg/天，更优选大约0.1-10mg/天。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应给药剂量。
根据上述，本发明DNA表达缺陷型非人哺乳动物极为有效地用于筛选能促进或抑制本发明DNA启动子活性的化合物或其盐，并可以阐明本发明DNA表达缺陷的各种疾病的病因，和开发针对这些疾病的预防和治疗药物。
另外，用含有本发明蛋白质的启动子领域的DNA，连接于位于其下游的编码蛋白质的基因，把连接好的基因注入到动物的卵细胞内，用于制作所谓的转基因动物，合成特异性蛋白质，可对它们在体内的作用进行研究。进一步在上述启动子的一部分上结合适当的报道基因，建立所表达的细胞株，可应用该细胞株探索能够特异地促进或抑制本发明蛋白质本身能在体内中产生一种具有促进或者抑制作用的低分子化合物。还可通过分析该部分启动子发现新的顺式元件或与该顺式元件结合的转录因子。
在说明书和附图中，碱基和氨基酸的代码使用IUPAC-IUB生化命名委员会规定的或本领域通用的代码，如下述例示。对于有光学异构体的氨基酸，除非特别说明，均指L形式。
DNA脱氧核糖核酸cDNA 互补的脱氧核糖核酸A 腺嘌呤T 胸腺嘧啶G 鸟嘌呤C 胞嘧啶RNA核糖核酸mRNA 信使核糖核酸
dATP脱氧腺苷三磷酸dTTP脱氧胸腺嘧啶三磷酸dGTP脱氧鸟苷三磷酸dCTP脱氧胞嘧啶三磷酸ATP 腺苷三磷酸EDTA乙二胺四乙酸SDS 十二烷基硫酸钠Gly 甘氨酸Ala 丙氨酸Val 缬氨酸Leu 亮氨酸Ile 异亮氨酸Ser 丝氨酸Thr 苏氨酸Cys 半胱氨酸Met 甲硫氨酸Glu 谷氨酸Asp 天冬氨酸Lys 赖氨酸Arg 精氨酸His 组氨酸Phe 苯丙氨酸Tyr 酪氨酸Trp 色氨酸Pro 脯氨酸Asn 天冬酰胺Gln 谷氨酰胺pGlu焦谷氨酸另外，在本说明书中，频繁使用的取代基、保护基以及试剂用下列符号表示。
Me 甲基
Et 乙基Bu 丁基Ph 苯基TC 四氢噻唑-4(R)-氨甲酰Tos对甲苯磺酰基CHO甲酰基Bzl苄基Cl2-Bzl 2，6-二氯苄基Bom苄氧甲基Z 苄氧羰基Cl-Z 2-氯苄氧羰基Br-Z 2-溴苄氧羰基Boc叔丁氧基羰基DNP二硝基苯酚Trt三苯甲基Bum叔丁氧基甲基Fmoc N-9-芴基甲氧基羰基HOBt 1-羟基苯并三唑HOOBt 3，4-二羟基-3-羟基-4-氧基-1，2，3-苯并三嗪HONB 1-羟基-5-降冰片烯基-2，3-二羧基亚胺DCCN，N′-二环己基碳二亚胺本说明书序列表中的序列编号分别表示如下[SEQ ID NO1]表示来源于人胃蛋白质(成熟蛋白)的氨基酸序列。
表示信号肽的氨基酸序列。
表示编码来源于人胃的本发明蛋白质(成熟蛋白)的DNA碱基序列，其中蛋白质包括SEQ ID NO1所示氨基酸序列。

表示编码本发明信号肽的DNA碱基序列，其中信号肽包括SEQ IDNO2所示氨基酸序列。
表示来源于人胃蛋白质的前体蛋白质氨基酸序列。
表示实施例1中引物-PR1的碱基序列。
表示实施例1中引物-PR2的碱基序列。
表示实施例1及4中引物-PR3的碱基序列。
表示实施例1中引物-PR4的碱基序列。
表示实施例1中引物-PR5的碱基序列。
表示实施例1中引物-PR6的碱基序列。
表示实施例1中引物-PR7的碱基序列。
表示实施例1中引物-PR8的碱基序列。
表示实施例1中所得的含有ECF-L全部基因的cDNA碱基序列。
表示实施例2中ECF-L基因探针的碱基序列。
表示实施例5中所得的克隆hECF-L-2的碱基序列。
表示实施例1中所得的编码ECF-L全部基因的蛋白质氨基酸序列。
表示ECF-L蛋白质(成熟蛋白)的氨基酸序列。
实施例下面，用实施例进一步详细说明本发明，但并非限制本发明的范围。使用大肠杆菌进行基因操作按“分子克隆”的方法进行。
在实施例1中，将小鼠ECF-L全部基因DAN片段克隆为pT7 Blue-TVector并得到其质粒，将该质粒的Escherichichia coli JM109/pT7-mECFL于1999年9月20日保藏在日本国茨城县茨城市东1-1-3(邮编305-8566)的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，保藏编号为FERMBP-6881，该保藏已于1999年8月24日保藏在日本国大阪市淀川区十三本町2-17-85(邮编532-8686)的财团法人发酵研究所(IFO)，保藏编号为IFO16315。
含有实施例6中得到的质粒pcDNA-hECFL的Escherichichia coli DH5α/pcDNA-hECFL于1999年9月20日保藏在NIBH，保藏编号为FERM BP-6878，该保藏已于1999年8月24日将其保藏在财团法人发酵研究所(IFO)，保藏编号为IFO 16312。实施例1利用过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型克隆能够提高ECF-L基因的表达过敏性呼吸道亢进小鼠模型的制作为采用BALB/c小鼠(雄性，6周龄)，在腹腔注射400μl的20μg OVA(卵清蛋白)及含有2mg柱的生理盐水，1周后再注射200μl的10μgOVA及含有1mg柱的生理盐水使其产生增敏作用，再过1周连续7天将溶于1/2浓度的PBS中的5％OVA溶液，在动物无麻醉自主呼吸下吸入25分钟。在吸入OVA一小时前腹腔注射1mg/kg地塞米松作为类固醇给药组。进行雾化时使用超声喷雾器(索尼喷雾器305、ATOM医疗)。过敏性呼吸道亢进在最后吸入抗原24小时之后，用乙酰胆碱(62.5-2000μg/kg)引起呼吸道狭窄反应然后用Konzett-Rossker方法测定并判断过敏性呼吸道亢进。使用戊巴比妥麻醉药致死小鼠，然后插入气管套管，再用0.5ml的PBS洗涤气管套管3次以制备支气管肺胞洗涤液(BALF)。接着用细胞离心机(700rpm.1min)制作涂抹标本，经过Diff-Quick染色镜检，并计算巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞以及其它细胞的比例。
作为样本poly(A)+RNA使用正常小鼠和过敏性呼吸道亢进小鼠的肺或支气管以及地塞米松给药组中的ISOGEN(和光纯药)来抽提总RNA，通过寡(dT)纤维素柱(Pharmacia)，制备poly(A)+RNA。各自以2μg的poly(A)+RNA作为起始材料使用PCR-select cDNA减影试剂盒(Clontech)进行减影在过敏性呼吸道亢进小鼠的肺或支气管中特异性表达，表达的cDNA片断的两端添加用于减影的接头碱基序列，并用限制酶RsaI消化这种接头的碱基序列，经过DNA片断末端平滑处理之后，再对该片断进行亚克隆形成pT7Bkye T-Vector(ノバゲン)。解读经过亚克隆的cDNA片断的碱基序列，将确认的碱基序列为基础用公知的Geneble数据库进行blastN同源性的检索。
其结果表明，在所研究的120个克隆中有10个克隆均与编码公知的小鼠ECF-L基因(GENBANK ACCESSION NUMBERD87757)碱基序列完全一样。因此，用cDNA合成试剂盒(宝酒造)从过敏性呼吸道亢进小鼠肺的poly(A)+RNA合成cDNA，再以该cDNA为模板使用ECF-L基因的5′非翻译区(PR1SEQ ID NO6)和3′的非翻译区(PR2SEQ ID NO7)的2种引物DNA进行PCR，从而获得ECF-L全部基因(SEQ ID NO14)。扩增反应使用TaKaRa EX TaqTM(宝酒造)，并用热循环仪Gene Amp PCR system9700(Perkin-Elmer)，按照以下循环周期进行最初在98℃静置1分钟后，再以98℃10秒、60℃1分钟、72℃3分钟为一个反应周期，扩增30个周期循环，最后在72℃延长10分钟。接着将扩增所得ECF-L全部基因的DNA片断克隆至pT7 Blue-T载体上。进一步用合成引物(PR1-8SEQ ID NO6-13)进行环状排序反应，通过荧光DNA测序仪(ABI PRISM TM377、Perkin-Elmer)证实了所得反应物的碱基序列。实施例2利用过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型分析ECF-L基因产物在组织中的分布从正常或过敏性呼吸道亢进小鼠体内摘除以下组织器官，它们包括肺、心脏、肝脏、肾脏、脑、胸腺、脾脏、小肠、大肠、胃，使用ISOGEN(和光纯药)制备总RNA。将该总RNA上样于寡(dT)纤维素柱(Pharmacia)，制备poly(A)+RNA。将0.5μg的poly(A)+RNA在含2.2M福尔马林的琼脂糖凝胶上走电泳，然后根据毛细作用印迹法将RNA从凝胶上转移至尼龙膜过滤器(HybondN+Amersham pharmacia biotech)上，所需时间为18个小时。通过紫外线处理将RNA固定在尼龙膜过滤器之后，在Express HybHybridization Solution(Clontech)中65℃下进行再杂交。用[α-32P]dCTPBcaBEST Labeling Kit(宝酒造)标记作为探针的如实施例1所示的一个ECF-L cDNA片段(SEQ.ID.NO5)。杂交是在65℃下含有标记探针的ExpressHyb Hybridization Solution中进行的，所需时间为2个小时。其过滤膜是在最终浓度为0.1xSSC、0.1％SDS溶液中洗涤的，其温度为50℃，使用BAS-2000(富士胶片)进行检测。其检测结果是，ECF-L的基因产物(mRNA)在正常小鼠体内中检测出肺、胸腺、胃基因的表达。进一步得知在过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型中肺的表达非常明显，而且强烈引起过敏性呼吸道亢进。在胸腺、胃中也证实了基因表达的增强(图1)。实施例3利用过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型分析ECF-L基因的表达与时间的变化关系如实施例1所述，本实施例使用过敏性呼吸道亢进模型中的小鼠按照实施例1的方法，在吸入OVA之前以及吸入OVA之后的第2、3、4、5、6、7天对过敏性呼吸道亢进以及在肺胞洗涤液中的浸润细胞数进行测定(图2、3、4)。另外，还将在吸入OVA之前以及吸入OVA之后的第2、3、4、5、6、7天的肺器官摘除，按照实施例2的方法进行了Northern印迹杂交分析(图5)。其结果是，在吸入OVA之后的第4天开始出现过敏性呼吸道亢进以及在肺胞洗涤液中的浸润嗜酸性粒细胞，而ECF-L基因的表达却在吸入OVA之后的第2天明显出现。也就是说，ECF-L基因的表达要早于过敏性呼吸道亢进以及在肺胞洗涤液中的浸润嗜酸性粒细胞的出现，由此本实验可以暗示，呼吸道炎症并不是由于ECF-L基因表达造成的，很有可能是ECF-L基因表达导致了过敏性呼吸道亢进以及在肺胞洗涤液中的浸润嗜酸性粒细胞的出现。实施例4利用过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型对ECF-L基因表达的定位用4％的多聚甲醛灌流固定后摘除正常及过敏性呼吸道亢进模型小鼠的肺部，4℃下固定过夜，然后依次增加蔗糖的浓度以取代蔗糖-HBSS溶液，使蔗糖-HBSS溶液最终浓度为18％，用干冰冻结。将冰冻的肺在低温温箱内14℃下放置3小时，切割厚度为10-15μl，并粘贴在经过APS涂膜处理的载玻片上。为了制备DIG标记探针，首先以实施例1ECF-L的全部基因片段为模板，使用合成引物(PR3SEQ ID NO8、PR6SEQ ID NO11)，按照PCR法扩增为0.6kb ECF-L DNA片段。扩增反应使用TaKaRa EX TaqTM(宝酒造)，并用热循环仪Gene Amp PCR system 9700(Perkin-Elmer)，按照以下期循环进行最初在94℃静置1分钟后，再以94℃10秒、60℃30秒、72℃90秒为一个反应周期，扩增30个周期循环，最后在72℃延长10分钟。接着将扩增所得DNA片断插入至pCRII-TOPO载体(Invitrogen)上，使用DIGLabeling Kit(ベ一リンが一·マンハィム)，按照说明书上的说明根据SF6 RNA polymerase及T7 RNA polymerase在载体的两端进行延长，制备带有DIG标签的反义探针和有义探针。使用ISHR Starter Kit(nipongene)按照说明书上的说明进行In situ杂交。其结果为，CEF-1基因在过敏性呼吸道亢进小鼠动物模型中证实了高水平的表达。而在正常小鼠中其CEF-L基因的表达在肺部的任何部位都没有被证实(图6)。实施例5克隆编码人的ECF-L样蛋白质基因将实施例1所示的小鼠ECF-L全部基因用于探针，对人RNA主要印迹(Clontech)进行Northern印迹杂交分析。在含有标记探针的Express HybHybridization Solution(Clontech)中65℃下进行杂交2个小时，杂交后的洗涤是在最终浓度为0.1xSSC、0.1％SDS溶液中50℃下进行的。使用BAS-2000(富士胶片)进行检测。结果在胃中明显地检测到信号。从人胃cDNA文库中得到了ECF-L基因的配对物。
把人胃5′-加长cDNA文库(用λgt11噬菌体DNA作为载体，Clontech)感染至大肠杆菌Y1090r-株后，在软琼脂培养平板上每20万个噬菌斑播种7片，在37℃下过夜培养从而形成噬菌斑。将噬菌斑转移至尼龙膜过滤器(Hybond-N，Amersham pharmacia biotech)之后，依次用变性溶液(0.5NNaOH，1.5M NaCl)、中和溶液(0.5M Tris Cl pH8.0、1.5M NaCl)、2xSSC处理，风干后紫外线照射，将噬菌体DNA固定在尼龙膜过滤器上。噬菌斑杂交在含有标记探针的Express Hyb Hybridization Solution(Clontech)中65℃下进行杂交至少3个小时。过滤器的洗涤是在最终浓度为0.1xSSC、0.1％SDS溶液中50℃下进行的。然后根据放射自显影片检索探针和杂交的噬菌斑。将上述方法重复操作直至纯化为信号克隆，用キアゲンλ微型试剂盒(キアゲン)，按照说明书的说明从纯化的噬菌体克隆为hECF-L-1、2、3、10、13、a、b在这7个克隆中制备λDNA。然后用BioDye Terminator Cycle SequencingReady Reaction Kit(Perkin-Elmer)进行反应，用DNA测序仪-377(Perkin-Elmer)确定被插入的cDNA片段的碱基序列，所得到的7个克隆均含相同的DNA片段，最长的DNA片段hECF-L-2具有1678个碱基序列(SEQID NO6)。476个氨基酸被该cDNA编码，人源的新型ECF-L样蛋白质被编码(SEQ ID NO5)。所述蛋白质在碱基水平上与小鼠的ECF-L具有70％的同源性，而在氨基酸水平上有68％的同源性(图7、图8)。另外使用Geneble数据库对blast N同源性进行了检索，检索结果表明该cDNA是一种属于几丁质分解酶的新型基因(图9、图10)。该蛋白质具有几丁质分解酶催化中心的序列，而且与报道过的唯一的人几丁质分解酶，即人壳三糖酶(J.Biol.Chem.第270卷，第26252页(1995))在碱基水平上显示了57％的同源性，在氨基酸水平上显示了51％的同源性。实施例6编码人的新型ECF-L样蛋白质基因用于在动物细胞中进行表达而构建其载体如实施例5所示的编码人的新型ECF-L样蛋白质基因被转导至λgt11噬菌体DNA上，用限制酶EcoRI消化该噬菌体DNA，得到一种含有编码人的新型ECF-L样蛋白质基因的1.7kbp DNA片段，同样用EcoRI消化而得到的一种pcDNA3.1质粒(Invitrogen)，把1.7kbp DNA片段插入到该质粒上，则得到一种质粒pcDNA-hECFL，其在巨细胞病毒增强子/启动子的下游处具有编码人的新型ECF-L样蛋白质基因，并具有选择标记抗新霉素基因。实施例7编码人的新型ECF-L样蛋白质基因在COS-7细胞中的表达以及几丁质分解酶活性的检测用T-75烧瓶将9×105的COS-7细胞培养在含有10％胎牛血清(FCS)Dulbecco改良的必需极限培养基(DMEM)中，培养24个小时。用脂质转染胺试剂(リポフェクトァミン)(Gibco BRL)将实施例6所述的表达质粒pcDNA-hECFL(每孔为7.5μg)导入该细胞中。转染2天之后，将培养基换成不含FCS的DMEM培养基，培养4天后，获得该培养物的上清液。几丁质分解酶的测定按照Renkema，G.H.等所描述的方法进行(J.Biol.Chem.第2卷，第2198页(1995))。也就是说，溶解一种荧光底物(4-甲基伞形酮基β-D-N，N’-二乙酰基壳二糖(4MU-壳二糖)，4-甲基伞形酮基β-D-N，N，N’-三乙酰基壳二糖(4MU-壳二糖))使该底物的最终浓度为0.027mM，在含有这种底物的反应缓冲液100μl(McIlvain buffer，pH5.2)中添加上述得到的培养物上清夜10μl，37℃下温育30分钟。加1ml的反应终止缓冲液(0.3MGlycine/NaOH、buffer pH10.6)，停止反应，使用荧光测定仪(激发波长为355nm，测定波长为460nm)测定几丁质分解酶的活性，阴性对照组使用未导入质粒的COS-7细胞培养物上清液，而阳性对照组使用0.001U的Serratiamarcesccens激酶。其结果是，导入表达质粒(pcDNA-hECFL)的COS-7细胞培养物上清液中，检测出几丁质分解酶的活性。实施例8分析编码人的新型ECF-L样蛋白质基因在组织中的分布如实施例4所示的编码人的新型ECF-L样蛋白质基因片段(1.7kbp)用作探针对人RNA主要印迹(Clontech)进行杂交分析。在68℃下，在含有标记探针的Express Hyb Hybridization Solution中进行2个小时杂交，最后在50℃下0.1xSSC、0.1％SDS溶液中进行洗涤。用BAS-2000(富士胶片)进行检测，其检测结果为在胃中明显地检测出信号，而在肺部及胎儿肺中观察到该基因的表达。
产业上的利用本发明的蛋白质以及编码该蛋白质的DNA，可用作治疗或预防感染性疾病等的药物。本发明的蛋白质可作为一种试剂用于筛选能够促进或抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐。进而，这种化合物或其盐以及抑制本发明蛋白质活性的中和抗体可用作治疗或预防支气管哮喘、慢性阻塞性肺部疾病等的药物。本发明蛋白质的抗体还能进一步地特异性识别本发明的蛋白质，因此它可用于定量待测溶液中的本发明蛋白。
序列表<110>武田药品工业株式会社(Takeda Chemical Industries，Ltd.)<120>新型蛋白质及其DNA<130>2670WOOP<150>JP 11-324467<151>1999-11-15<160>18<210>1<211>455<212>PRT<213>人<400>1Tyr Gln Leu Thr Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala Gln Tyr Arg Pro Gly5 10 15Leu Gly Arg Phe Met Pro Asp Asn Ile Asp Pro Cys Leu Cys Thr His20 25 30Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Arg Gln Asn Asn Glu Ile Thr Thr Ile35 40 45Glu Trp Asn Asp Val Thr Leu Tyr Gln Ala Phe Asn Gly Leu Lys Asn50 55 60Lys Asn Ser Gln Leu Lys Thr Leu Leu Ala Ile Gly Gly Trp Asn Phe65 70 75 80Gly Thr Ala Pro Phe Thr Ala Met Val Ser Thr Pro Glu Asn Arg Gln85 90 95Thr Phe Ile Thr Ser Val Ile Lys Phe Leu Arg Gln Tyr Glu Phe Asp100 105 110Gly Leu Asp Phe Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser Arg Gly Ser Pro Pro115 120 125Gln Asp Lys His Leu Phe Thr Val Leu Val Gln Glu Met Arg Glu Ala130 135 140Phe Glu Gln Glu Ala Lys Gln Ile Asn Lys Pro Arg Leu Met Val Thr145 150 155 160Ala Ala Val Ala Ala Gly Ile Ser Asn Ile Gln Ser Gly Tyr Glu Ile165 170 175Pro Gln Leu Ser Gln Tyr Leu Asp Tyr Ile His Val Met Thr Tyr Asp180 185 190Leu His Gly Ser Trp Glu Gly Tyr Thr Gly Glu Asn Ser Pro Leu Tyr195 200 205Lys Tyr Pro Thr Asp Thr Gly Ser Asn Ala Tyr Leu Asn Val Asp Tyr210 215 220Val Met Asn Tyr Trp Lys Asp Asn Gly Ala Pro Ala Glu Lys Leu Ile225 230 235 240Val Gly Phe Pro Thr Tyr Gly His Asn Phe Ile Leu Ser Asn Pro Ser245 250 255Asn Thr Gly Ile Gly Ala Pro Thr Ser Gly Ala Gly Pro Ala Gly Pro260 265 270Tyr Ala Lys Glu Ser Gly Ile Trp Ala Tyr Tyr Glu Ile Cys Thr Phe275 280 285Leu Lys Asn Gly Ala Thr Gln Gly Trp Asp Ala Pro Gln Glu Val Pro290 295 300Tyr Ala Tyr Gln Gly Asn Val Trp Val Gly Tyr Asp Asn Ile Lys Ser305 310 315 320Phe Asp Ile Lys Ala Gln Trp Leu Lys His Asn Lys Phe Gly Gly Ala325 330 335Met Val Trp Ala Ile Asp Leu Asp Asp Phe Thr Gly Thr Phe Cys Asn340 345 350Gln Gly Lys Phe Pro Leu Ile Ser Thr Leu Lys Lys Ala Leu Gly Leu355 360 365Gln Ser Ala Ser Cys Thr Ala Pro Ala Gln Pro Ile Glu Pro Ile Thr370 375 380Ala Ala Pro Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly385 390 395 400Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Phe Cys Ala Val Arg Ala Asn Gly Leu405 410 415Tyr Pro Val Ala Asn Asn Arg Asn Ala Phe Trp His Cys Val Asn Gly420 425 430Val Thr Tyr Gln Gln Asn Cys Gln Ala Gly Leu Val Phe Asp Thr Ser435 440 445Cys Asp Cys Cys Asn Trp Ala450 455<210>2<211>21<212>PRT<213>人<400>2Met Thr Lys Leu Ile Leu Leu Thr Gly Leu Val Leu Ile Leu Asn Leu5 10 15Gln Leu Gly Ser Ala
20<210>3<211>1368<212>DNA<213>人<400>3taccagctga catgctactt caccaactgg gcccagtacc ggccaggcct ggggcgcttc 60atgcctgaca acatcgaccc ctgcctctgt acccacctga tctacgcctt tgctgggagg120cagaacaacg agatcaccac catcgaatgg aatgatgtga ctctctacca agctttcaat180ggcctgaaaa ataagaacag ccagctgaaa actctcctgg ccattggagg ctggaacttc240gggactgccc ctttcactgc catggtttct actcctgaga accgccagac tttcatcacc300tcagtcatca aattcctgcg ccagtatgag tttgacgggc tggactttga ctgggagtac360cctggctctc gtgggagccc tcctcaggac aagcatctct tcactgtcct ggtgcaggaa420atgcgtgaag cttttgagca ggaggccaag cagatcaaca agcccaggct gatggtcact480gctgcagtag ctgctggcat ctccaatatc cagtctggct atgagatccc ccaactgtca540cagtacctgg actacatcca tgtcatgacc tacgacctcc atggctcctg ggagggctac600actggagaga acagccccct ctacaaatac ccgactgaca ccggcagcaa cgcctacctc660aatgtggatt atgtcatgaa ctactggaag gacaatggag caccagctga gaagctcatc720gttggattcc ctacctatgg acacaacttc atcctgagca acccctccaa cactggaatt780ggtgccccca cctctggtgc tggtcctgct gggccctatg ccaaggagtc tgggatctgg840gcttactacg agatctgtac cttcctgaaa aatggagcca ctcagggatg ggatgcccct900caggaagtgc cttatgccta tcagggcaat gtgtgggttg gctatgacaa catcaagagc960ttcgatatta aggctcaatg gcttaagcac aacaaatttg gaggcgccat ggtctgggcc 1020attgatctgg atgacttcac tggcactttc tgcaaccagg gcaagtttcc cctaatctcc 1080accctgaaga aggccctcgg cctgcagagt gcaagttgca cggctccagc tcagcccatt 1140gagccaataa ctgctgctcc cagtggcagc gggaacggga gcgggagtag cagctctgga 1200ggcagctcgg gaggcagtgg attctgtgct gtcagagcca acggcctcta ccccgtggca 1260aataacagaa atgccttctg gcactgcgtg aatggagtca cgtaccagca gaactgccag 1320gccgggcttg tcttcgacac cagctgtgat tgctgcaact gggcataa1368<210>4<211>63<212>DNA<213>人<400>4atgacaaagc ttattctcct cacaggtctt gtccttatac tgaatttgca gctcggctct 60gcc 63<210>5<211>476<212>PRT<213>人<400>5Met Thr Lys Leu Ile Leu Leu Thr Gly Leu Val Leu Ile Leu Asn Leu5 10 15Gln Leu Gly Ser Ala Tyr Gln Leu Thr Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala20 25 30Gln Tyr Arg Pro Gly Leu Gly Arg Phe Met Pro Asp Asn Ile Asp Pro35 40 45Cys Leu Cys Thr His Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Arg Gln Asn Asn50 55 60Glu Ile Thr Thr Ile Glu Trp Asn Asp Val Thr Leu Tyr Gln Ala Phe65 70 75 80Asn Gly Leu Lys Asn Lys Asn Ser Gln Leu Lys Thr Leu Leu Ala Ile85 90 95Gly Gly Trp Asn Phe Gly Thr Ala Pro Phe Thr Ala Met Val Ser Thr100 105 110Pro Glu Asn Arg Gln Thr Phe Ile Thr Ser Val Ile Lys Phe Leu Arg115 120 125Gln Tyr Glu Phe Asp Gly Leu Asp Phe Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser130 135 140Arg Gly Ser Pro Pro Gln Asp Lys His Leu Phe Thr Val Leu Val Gln145 150 155 160Glu Met Arg Glu Ala Phe Glu Gln Glu Ala Lys Gln Ile Asn Lys Pro165 170 175Arg Leu Met Val Thr Ala Ala Val Ala Ala Gly Ile Ser Asn Ile Gln180 185 190Ser Gly Tyr Glu Ile Pro Gln Leu Ser Gln Tyr Leu Asp Tyr Ile His195 200 205Val Met Thr Tyr Asp Leu His Gly Ser Trp Glu Gly Tyr Thr Gly Glu210 215 220Asn Ser Pro Leu Tyr Lys Tyr Pro Thr Asp Thr Gly Ser Asn Ala Tyr225 230 235 240Leu Asn Val Asp Tyr Val Met Asn Tyr Trp Lys Asp Asn Gly Ala Pro245 250 255Ala Glu Lys Leu Ile Val Gly Phe Pro Thr Tyr Gly His Asn Phe Ile260 265 270Leu Ser Asn Pro Ser Asn Thr Gly Ile Gly Ala Pro Thr Ser Gly Ala275 280 285Gly Pro Ala Gly Pro Tyr Ala Lys Glu Ser Gly Ile Trp Ala Tyr Tyr290 295 300Glu Ile Cys Thr Phe Leu Lys Asn Gly Ala Thr Gln Gly Trp Asp Ala305 310 315 320Pro Gln Glu Val Pro Tyr Ala Tyr Gln Gly Asn Val Trp Val Gly Tyr
325 330 335Asp Asn Ile Lys Ser Phe Asp Ile Lys Ala Gln Trp Leu Lys His Asn340 345 350Lys Phe Gly Gly Ala Met Val Trp Ala Ile Asp Leu Asp Asp Phe Thr355 360 365Gly Thr Phe Cys Asn Gln Gly Lys Phe Pro Leu Ile Ser Thr Leu Lys370 375 380Lys Ala Leu Gly Leu Gln Ser Ala Ser Cys Thr Ala Pro Ala Gln Pro385 390 395 400Ile Glu Pro Ile Thr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly405 410 415Ser Ser Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Phe Cys Ala Val420 425 430Arg Ala Asn Gly Leu Tyr Pro Val Ala Asn Asn Arg Asn Ala Phe Trp435 440 445His Cys Val Asn Gly Val Thr Tyr Gln Gln Asn Cys Gln Ala Gly Leu450 455 460Val Phe Asp Thr Ser Cys Asp Cys Cys Asn Trp Ala465 470 475<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6aagacaccat ggccaagctc20<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7acaagcatgg tggttttaca ggaa24<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8tggtgaagga aatgcgta18<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9ttacgcattt 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Leu Phe Ser Val Leu Val Lys Glu Met Arg Lys Ala130 135 140Phe Glu Glu Glu Ser Val Glu Lys Asp Ile Pro Arg Leu Leu Leu Thr145 150 155 160Ser Thr Gly Ala Gly Ile Ile Asp Val Ile Lys Ser Gly Tyr Lys Ile165 170 175Pro Glu Leu Ser Gln Ser Leu Asp Tyr Ile Gln Val Met Thr Tyr Asp180 185 190Leu His Asp Pro Lys Asp Gly Tyr Thr Gly Glu Asn Ser Pro Leu Tyr195 200 205Lys Ser Pro Tyr Asp Ile Gly Lys Ser Ala Asp Leu Asn Val Asp Ser210 215 220Ile Ile Ser Tyr Trp Lys Asp His Gly Ala Ala Ser Glu Lys Leu Ile225 230 235 240Val Gly Phe Pro Ala Tyr Gly His Thr Phe Ile Leu Ser Asp Pro Ser245 250 255Lys Thr Gly Ile Gly Ala Pro Thr Ile Ser Thr Gly Pro Pro Gly Lys260 265 270Tyr Thr Asp Glu Ser Gly Leu Leu Ala Tyr Tyr Glu Val Cys Thr Phe275 280 285Leu Asn Glu Gly Ala Thr Glu Val Trp Asp Ala Pro Gln Glu Val Pro290 295 300Tyr Ala Tyr Gln Gly Asn Glu Trp Val Gly Tyr Asp Asn Val Arg Ser305 310 315 320Phe Lys Leu Lys Ala Gln Trp Leu Lys Asp Asn Asn Leu Gly Gly Ala325 330 335Val Val Trp Pro Leu Asp Met Asp Asp Phe Ser Gly Ser Phe Cys His340 345 350Gln Arg His Phe Pro Leu Thr Ser Thr Leu Lys Gly Asp Leu Asn Ile355 360 365His Ser Ala Ser Cys Lys Gly Pro Tyr370 37权利要求
1.一种蛋白质或其盐，其中包括与SEQ ID NO1所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。
2.一种权利要求1所述的蛋白质的部分肽或其盐。
3.一种信号肽或其盐，其中包括与SEQ ID NO2所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。
4.一种DNA，其中包括编码权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述部分肽的DNA。
5.权利要求4所述的DNA，其中包括SEQ ID NO3所示的碱基序列。
6.一种DNA，其中包括编码权利要求3所述信号肽的DNA。
7.权利要求6所述的DNA，其中包括SEQ ID NO4所示的碱基序列。
8.一种重组载体，其中包括权利要求4所述的DNA。
9.一种转化体，其用权利要求8所述的重组载体转化而成。
10.一种权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述部分肽或它们的盐的制备方法，其特征在于，培养权利要求9所述的转化体，并从中生成积累权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的部分肽从而得到所需蛋白质或部分肽。
11.一种药物，其中包括权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的部分肽或其盐。
12.一种药物，其中包括权利要求4所述的DNA。
13.一种抗体，其针对权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的部分肽或其盐。
14.一种用于筛选化合物或其盐的方法，所述化合物或其盐能够促进或抑制权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述部分肽或其盐的活性，该方法的特征在于包括应用权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的部分肽或其盐。
15.一种用于筛选化合物或其盐的试剂盒，所述化合物或其盐能够促进或抑制权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述部分肽或其盐的活性，其中所述试剂盒包括权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的部分肽或其盐。
16.一种化合物或其盐，它们能够促进或抑制权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的部分肽或其盐的活性，该化合物或其盐可通过使用权利要求14的筛选法或权利要求15的筛选试剂盒而获得。
17.一种药物，其中包括能促进或抑制权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述部分肽或其盐活性的化合物或其盐，所述化合物或其盐可通过使用权利要求14的筛选法或权利要求15的筛选试剂盒而获得。
18.一种用于筛选化合物或其盐的方法，其特征在于，应用一种包含与SEQ ID NO18所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐，而所述化合物或其盐具有抑制蛋白质或其部分肽或其盐的活性。
19.一种用于筛选化合物或其盐的试剂盒，其中包括一种包括与SEQ IDNO18所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其部分肽或其盐，而所述化合物或其盐具有抑制蛋白质或其部分肽或其盐的活性。
20.一种化合物或其盐，它们能抑制蛋白质或其部分肽或其盐的活性，所述蛋白质或其部分肽或其盐包含与SEQ ID NO18所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列，其中所述化合物或其盐可通过使用权利要求18的筛选法或权利要求19的筛选试剂盒而获得。
21.一种药物，其中包括权利要求20所述的化合物或其盐。
全文摘要
本发明的蛋白质以及编码该蛋白的DNA,可用作治疗或预防感染性疾病等的药物。本发明的蛋白质可作为一种试剂用于筛选能够促进或抑制本发明蛋白质活性的化合物或其盐。进而,这种化合物或其盐以及抑制本发明蛋白质活性的中和抗体可用作治疗或预防支气管哮喘、慢性阻塞性肺部疾病等的药物。
文档编号C12N1/21GK1390256SQ00815629
公开日2003年1月8日 申请日期2000年11月14日 优先权日1999年11月15日
发明者中西淳, 森田滋 申请人:武田药品工业株式会社