专利名称：一种制备重组脱氧核糖核酸酶i的方法
技术领域：
本发明涉及一种重组脱氧核糖核酸酶类制备方法，特别是用原核宿主细胞制备重组脱氧核糖核酸酶I(以下简称为DNase I)的制备方法。由本发明方法所制备的脱氧核糖核酸酶I可用于制备治疗呼吸系统疾病、减少患者痰的粘度、通畅呼吸道的药物。
脱氧核糖核酸酶(以下简称为DNase)是一种可水解脱氧核糖核酸(DNA)的磷酸二酯酶，包括DNase-I和DNase-II，与限制性内切酶需要识别特定序列相比，其可以非特异降解DNA。DNase-I的最适pH值接近中性，必须有二价阳离子参与水解反应，产生5’-磷酸核苷酸和5′磷酸寡聚核苷酸。
来自许多物种的DNase已经被分离纯化，牛DNase A、B、C和D最早于1973年纯化并测序(Liao等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2492354，1973)，猪和绵羊的DNase也已经分离纯化并测序(Paudel等，生物化学杂志，26116006，1986)和(Paudel，生物化学杂志，26116012，1986)。
已知DNase有多种功能，并且可用于医药目的。其最主要的医药应用是降低肺粘性分泌物即痰的粘度，例如在治疗肺炎过程中，它可以帮助清洁呼吸道。由粘性分泌物引起的呼吸道阻塞可以导致呼吸不适，甚至导致窒息死亡。
从天然牛胰腺中提取制备的DNase曾经以Domavae为商品名出售，但是使用DNase引起部分患者明显的并发症如肺肿和过敏性反应(Raskin，美国呼吸系统疾病综述(Am.Rev.Resp.Dis.)，98697，1986)，最终从市场中撤回。产生这种并发症的原因是因为该天然来源的产品中含有引起上述不适的杂质蛋白酶。此外，诸多疾病产生粘稠的肺分泌物的症状通常是慢性的和复发性的，长期使用牛胰DNase来治疗此类疾病也不合适。为解决这个问题，可利用基因工程的方法，用原核或真核细胞制备重组人或牛DNase，从而避免蛋白酶的污染。
尽管第一个哺乳动物DNase的全长序列于1973年就已经获得，直到许多年以后才有了有关克隆和表达此类酶的工作的报道。1994年美国Genetic公司的特异性作用于大分子DNA的重组人脱氧核糖核酸酶(rhDNase)祛痰药物问世，用于降低痰液中的大分子DNA含量和缩短细胞外DNA分子的长度(从0.6-2.6kbp缩短到0.3-0.5kbp)，从而明显降低痰液的粘稠度，改善阻塞性等肺疾病的肺功能(FEV1和FVC均提高10％以上)，提高病人的生活质量，延长了病人的生命期。因而rhDNase可用于制备治疗慢性支气管炎、肺气肿、肺心病、支气管哮喘及其它呼吸道疾病的有效药物。
由于DNase对宿主细胞有毒性，重组表达尤其是在原核细胞中表达DNase的成功实例并不多。为了在原核细胞中特别是在大肠杆菌中重组表达特定目标蛋白质，目前一般的方法是将编码目标蛋白质的核苷酸序列插入适当表达质粒，然后用所述重组表达质粒转化宿主菌，得到重组工程菌，在适当的培养条件下培养所得重组工程菌，分离纯化表达的目标蛋白。但是，对于诸如DNase这样的对宿主细胞有毒性的目的蛋白质而言，使用通常所述的重组表达方法，非常少量的DNase的表达就会杀死宿主细胞，因而无法得到需要量的目标产物。因此，需要采用一种特殊的重组表达策略，通过利用严谨诱导型启动子控制目标蛋白质表达，即在重组宿主细胞生长过程中不表达重组基因，当重组宿主细胞生长到恰当浓度时，加入合适的诱导物诱导目标蛋白质的表达。本领域周知的诱导型启动子，如lac启动子，可在加入诱导物ITPG后在原核宿主细胞中启动重组蛋白质表达。但lac启动子并不是一种严格的诱导型启动子，在没有ITPG加入的情况下仍会有少量的本底表达。由于本发明的DNase I少量的本底表达对所得重组表达宿主来说都是致命的，所以需要特别设计一种非常严格的诱导表达体系。利用一般的表达策略，不仅在表达时很难得到产物，而且在获得重组菌株的过程中就会遇到很大的困难，例如由于菌种的急速退化，菌种的筛选、保存和性质分析等工作都将很难进行。Sheild等人利用温度诱导的方法在大肠杆菌克隆了牛DNase-I基因片段，并鉴定了融合蛋白表达克隆具有DNase生物学活性和免疫学活性(Biochem.Soc.Trans.16195，1988)。然而由于DNase具有的毒性，即使在低温启动子处于抑制状态也很难从克隆中提取出质粒。这极大地限制了DNase在原核细胞中表达的应用。所以目前只有在动物细胞中分泌表达人DNase的报道(Genentech，INC.EP 0449968B1，02/24/1999)。但是动物细胞培养生产DNase产率低、成本高，极大的限制了DNase作为药物的应用。人DNase在原核细胞中重组表达一直没有成功的报道。
为了解决上述重组表达脱氧核糖核酸酶的问题，本发明设计了独特的表达策略，利用一种严谨诱导表达的系统，即噬菌体诱导的T7-RNA聚合酶启动子表达系统(该表达系统只有在含T7-RNA聚合酶基因的噬菌体诱导后才能表达DNase)，成功地在T7-RNA聚合酶缺陷型大肠杆菌中表达了人和牛的DNase I，实现了重组DNase I生产，为DNase的广泛药物应用铺平了道路。这种表达方法不仅有效地解决了DNase对细胞的毒性问题，而且由于DNase本身的特性不易在细菌细胞中形成包涵体，解决了外源蛋白质在大肠杆菌中高表达过程中常见的包涵体形成及包涵体蛋白质折叠复性工艺复杂、复性率低等问题。
本发明一方面涉及一种制备具有生物学活性的重组脱氧核糖核酸酶I(DNase I)的方法，其包括(1)用含有编码脱氧核糖核酸酶I的核苷酸序列之重组表达载体转化适当的原核宿主细胞；(2)在适于所选原核细胞生长条件下培养经转化的宿主细胞；(3)在适于脱氧核糖核酸酶I表达的条件下诱导宿主细胞产生脱氧核糖核酸酶I；(4)从所得经转化的原核宿主细胞和/或培养液中回收脱氧核糖核酸酶I。
本发明另一方面涉及一种含有用如上所述的方法制备的脱氧核糖核酸酶I的酶制剂。
本发明的又一方面涉及用如上所述的方法制备的脱氧核糖核酸酶I用于制备治疗呼吸系统疾病、减少患者痰的粘度、通畅呼吸道的药物的用途。
图1、本发明采用的表达载体pBGI-2的图谱。
图2、用pBGI-2构建的含有人DNase I编码基因的重组表达质粒pBGI-2-hDNase的图谱。
图3、用pBGI-2构建的含有牛DNase I编码基因的重组表达质粒pBGI-2-bDNase的图谱。
本发明一方面涉及一种制备具有生物学活性的重组脱氧核糖核酸酶I的方法，其包括(1)用含有编码脱氧核糖核酸酶I的核苷酸序列之核酸构建体转化适当的原核宿主细胞；(2)在适于所选原核细胞生长条件下培养经转化的宿主细胞；(3)在适于脱氧核糖核酸酶I表达的条件下诱导宿主细胞产生脱氧核糖核酸酶I；(4)从所得经转化的原核宿主细胞和/或培养液中回收脱氧核糖核酸酶I。
此处所用术语“活性”是指具有非特异性水解脱氧核糖核酸(DNA)的磷酸二酯键，引起糖-磷酸DNA骨架的3’磷酸基脱氧的性质。
为实现本发明所述的严谨型诱导表达，所选表达系统一般包括带有适当的严谨诱导型启动子的表达载体，可有效诱导所述启动子的诱导物，以及与所选表达载体及诱导物相适应的适当表达宿主。可用于本发明的表达载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，例如，细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒、衍生于质粒和噬菌体DNA结合的载体、病毒DNA。不过，只要能在宿主中复制和存活，其它载体也可以利用。表达载体中的DNA序列被有效地与一个合适的表达控制序列(启动子)连在一起，从而指导mRNA的合成。本领域周知，可用多种适当的方法，例如温度转变、化学药品诱导、噬菌体诱导等方法诱导所选诱导型启动子，本发明可用的诱导型启动子包括但不限于，例如大肠杆菌的lac、trp或tac启动子、噬菌体的PL启动子、T5、T7启动子以及已知控制原核细胞中基因表达的其它启动子。表达载体也包含翻译起始所需要的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可以具有增强表达的合适序列。此外，为了便于筛选得到的重组表达载体，其优选包含能提供表型特征的一个或多个选择标记基因，以便于转化宿主细胞的筛选，例如大肠杆菌可用四环素、氨苄青霉素、氯霉素、新霉素或卡那霉素抗性。
本发明的所述载体上还应当含有适当的限制性酶切位点，以利于目的蛋白质编码序列的插入。在本发明的一个实施方案中，优选的使用带有T7-RNA聚合酶启动子的表达载体，例如本发明构建的含T7启动子的重组表达质粒pBGI-2(如
图1所示)。一旦将人或牛的DNase基因插入到可受T7启动子调节的位置中，只有当体系中含有T7-RNA聚合酶时，受所述启动子调节的目的基因才能被转录并在所选宿主中表达。
为了实现严谨型诱导表达，所选宿主细胞应当是非天然存在或产生可诱导所选启动子表达的诱导物的菌株。如本领域周知，可选用多种适当的表达宿主，只要该宿主的生长不会自主诱导目的蛋白质的表达。在本发明一个优选实施方案中，选用一种T7-RNA聚合酶缺陷型大肠杆菌，特别是对含T7 RNA聚合酶基因、并含相应启动子的噬菌体敏感的菌株，如T7-RNA聚合酶缺陷型大肠杆菌JM109。为了实现本发明的严谨型诱导表达，可以采用多种方式引入可诱导所选诱导型启动子表达所需的诱导物。本领域技术人员应当知晓，所选诱导物的引入取决于所选诱导型启动子以及采用的表达宿主，只要可实现严谨型诱导表达，任何方法均可使用。在本发明一个优选实施方案中，采用λCE6噬菌体感染所选宿主菌株。在本发明的一个实施方案中，用含有编码DNase I的核苷酸序列之重组表达质粒转化T7-RNA聚合酶缺陷型大肠杆菌JM109，在适当条件下培养所得重组工程菌，在宿主菌生长期间，由于不存在内源性T7聚合酶，受T7启动子调节的目标DNase I基因不能表达。当发酵液中重组基因工程菌的密度达到一定期望值，且其中所含质粒拷贝数也达到期望数量时，加入λCE6噬菌体，诱导表达DNase I。不拘泥于特定的理论，本发明人出人意料地发现，在本发明的所述条件下，尽管DNase I的产生对菌体具有毒性作用，会导致溶菌现象发生，但是在溶菌现象发生时，本发明所述的重组表达宿主细胞已经产生了大量的DNase I。由于DNase I的表达引发宿主细胞的裂解，大量目标蛋白质存在于培养液中，不同于利用大肠杆菌高效表达目标蛋白质的常规操作，无需变性、重折叠等多步费时费力的后处理，就可直接从培养本发明重组宿主细胞的培养液中回收具有生物学活性的脱氧核糖核酸酶。
本发明所述的脱氧核糖核酸酶I可以是任何来源的，包括但不限于人、牛、猪、小鼠、大鼠等。在本发明的一个实施方案中，优选使用人或牛脱氧核糖核酸酶I。
为了获得DNase I，可以通过本领域技术人员周知的PCR扩增技术和重组DNA技术。依据公开的DNase I编码序列设计相应的PCR引物，分别从人或牛的胰腺cDNA文库中扩增上述人或牛的DNase。将所得PCR产物通过本领域技术人员周知的方法导入合适的表达载体，构建重组DNA构建体。用所得DNA构建体转化合适的宿主细胞，在适于目标蛋白质表达的条件下培养如此转化的宿主细胞，并通过本领域周知的技术回收并纯化目标蛋白质。
合适的DNA序列可以通过许多方法插到载体中。通常，DNA序列用本领域中已知的方法插入到合适的限制性内切酶位点上。这些方法相信处于本领域技术人员的知识范围内。
包含上述合适的DNA序列、合适的启动子或控制序列的载体可以用于转化合适的宿主，让宿主表达该蛋白。
将构建体导入宿主细胞的方法有氯化钙转化、氯化镁转化、电穿孔或基因枪方法、TSS转化法、原生质体转化法、醋酸锂转化法等。
通常，重组表达载体包含复制起点和用于转化宿主细胞的选择标记，例如大肠杆菌的卡那霉素抗性基因和啤酒酵母TRP1基因，还包含来自高效表达基因的启动子，从而介导下游结构序列的转录。异源的结构序列以适当的方位与翻译起始和终止序列以及其它优选的序列装配在一起。可选择的情况是，DNA序列可以编码一个融合蛋白，该蛋白含有一个N末端或C末端确认肽，表现出预期的特征，例如所表达的重组产物的稳定化和简化提纯步骤。所融合的肽或蛋白可以是谷胱甘肽转移酶GST、麦芽糖结合蛋白MBP、金黄色葡萄球菌蛋白A、硫氧还蛋白Trx A、氯霉素酰基转移酶CAT、β-半乳糖苷酶、Flag肽、Intein标签、多聚组氨酸标签、多聚精氨酸标签及其它多聚氨基酸标签等。由于6×组氨酸标签使得目标蛋白质易于通过金属螯合层析纯化、不会改变蛋白质的结构、活性和抗原性而不必除去等，本发明优选在DNase I的N末端或C末端加入6×组氨酸标签。细菌适用的有效表达载体可这样来构建将编码目的蛋白的结构DNA序列随同适当的翻译起始和终止信号插入到带有功能启动子的可操纵的阅读框中。载体应包含一个或多个表型选择标记和复制起点，复制起点保证了载体在宿主中能保留下来，更理想的是能使载体得到扩增。适于转化的原核宿主有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各种细菌，其它的宿主也可以被选择。
在本发明的一个优选实施方案中，根据已知人和牛DNase-I基因序列，设计合成上下游引物，用PCR法扩增，从人胰腺cDNA库中获得成熟DNase基因序列，从牛胰腺cDNA库中获得全长基因序列，重组到表达质粒pBGI-2中，并转化大肠杆菌JM109，一定条件下经一段时间培养后，采用λCE6噬菌体诱导表达出目的蛋白人或牛DNase-I。
在本发明的一个实施方案中，从胰腺中提取总RNA并纯化mRNA，在每个cDNA的5′末端加上一个特定的连接子(adaptor)，得到人胰或牛胰的、带有特定连接子、可用于快速扩增cDNA末端法(RACE-PCR)的人胰或牛胰cDNA库。根据已公布的DNase-I序列，设计含有DNase I基因的特定5′引物和3′引物。然后用设计合成的5′引物和3′引物及连接子引物，采用RACE-PCR扩增基因，分别得到DNase I的3′RACE片段和5′RACE片段。分别与克隆载体pGEM-T连接。转化并选取抗Amp+的阳性克隆。提取分别含DNase I5′片段和3′片段的两个重组克隆载体，酶切后用DNA连接酶连接两个片段，得到全长序列DNase I基因。将DNase I基因片段与克隆载体pGEM-T连接，得到携带完整DNase I基因的重组克隆。根据DNase I的基因序列和需加入的内切酶序列设计引物，PCR扩增出带有内切酶序列的DNase I基因，酶切后与同组酶切的表达载体pBGI-2连接，得到重组表达载体。转化并选取抗Kan+的阳性克隆。并对所得含有插入片段的重组质粒测序，对表达产物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和活性鉴定。pBGI-2表达载体除含有T7 RNA聚合酶启动子和T7终止子外，含有f1复制起点、核糖体结合位点、卡那霉素抗性基因(Kan+)，且含有His标签的编码序列。
采用检测发酵液光密度值法检验宿主菌株的生长情况，确定噬菌体的加入时间。加入噬菌体的时间可以为重组宿主菌采用间歇培养法培养至O.D.600为0.6-2时。本领域普通技术人员周知可通过流加培养、高密度培养等方法培养重组宿主菌，其加入噬菌体时的培养液O.D.600应相应增高。在本发明的一个实施方案中，当重组宿主菌在培养液中生长至O.D.600＝0.4-0.8时，加入λCE6噬菌体，诱导DNaseI表达。
通常可在加入所述诱导物后继续培养宿主菌株约0.5-20小时，优选地约1-10小时，更优选地约1.5-5小时，直至培养液中的菌体O.D.值开始明显下降，然后收集培养液，采用本领域周知的方法如下所述从培养液中和重组菌菌体中回收DNase I。
通常用离心或膜过滤的方法收获细胞，用于表达蛋白质的微生物细胞的破碎可以用任何便捷的方法，通常用物理、化学的或生物的方法破碎细胞，包括冻融循环、超声波破碎、机械破碎如高压匀浆、高速珠磨，或者使用化学渗透法、酶溶法，这些方法都是本领域的技术人员熟知的。再通过本领域技术人员周知的离心、过滤等方法除取细胞破碎液中的细胞碎片及其它杂质，得到破碎上清液。如重组菌培养液中含有DNase I，则可将细胞破碎液与培养液合并得DNase I粗提液，备下一步纯化。调整离子强度和pH值等溶液性质后，可用如下纯化方法沉淀法如硫酸胺、乙醇、聚乙二醇沉淀法、亲和沉淀法；层析方法如离子交换层析、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、羟基磷灰石层析、反相层析、层析聚焦、亲和层析如DNase I抗体层析法直接回收DNase I。在本发明的一个优选实施方案中，对于用重组表达质粒pBGI-2-DNase转化的DNase I粗提液，采用金属螯和层析纯化表达的含有His标签的DNase I，采用竞争性洗脱方式如用咪唑洗脱，纯化DNase I。还可以采用膜过滤法如微滤、超滤、亲和膜以及双水相萃取法、反胶束法等对DNase进行纯化。在整个纯化过程中微量Ca2+的存在将有利于Dnase I活性的保持。经纯化后的DNaseI不含蛋白酶。
本发明的又一方面，涉及一种含有利用本发明所述方法制备的脱氧核糖核酸酶I的酶制剂。所述酶制剂任选地还包括保持DNase I生物学活性所需的辅因子。本发明所述的酶制剂任选地包括与保持DNaseI生物学活性相容的稳定剂。本发明所述的酶制剂可以呈液体、固体、气雾剂或冷冻干燥品形式。在本发明的一个实施方案中，本发明所述的酶制剂为气雾剂。当呈气雾剂形式时，溶液DNase制品中含有50-300mM NaCl和0.01-10.0mM Ca2+。以含有150mM NaCl和1.0mMCa2+为佳。pH的范围为4-10。冷冻干燥品为溶液DNase制品的冷冻干燥品。DNase制品中还可以含有少量的蛋白质稳定剂如人血白蛋白、单糖如葡萄糖、聚乙二醇等；可以含有蛋白酶等其它的成分。
本发明所述的酶制剂中的DNase I任选地还可经大分子修饰，经修饰后的DNase其活性保持不变，而稳定性得到提高、半衰期延长、抗原性被遮盖。用于修饰DNase的大分子可以是聚乙二醇、聚丙二醇等线性的或分枝聚醇类化合物，也可以是葡聚糖等多糖类化合物。
本发明另一方面涉及如本发明所述方法制备的DNase I用于制备治疗和/缓解患有伴随异常的、粘性的或者含脓的浓缩分泌物的肺部疾病患者的药物的用途。在例如急性的或者慢性的肺支气管疾病(感染性的肺炎、支气管炎或者气管支气管炎、支气管扩张症、肺囊肿性纤维化病变(属遗传性胰腺病)、肺气肿、哮喘症、肺结核或者真菌引起的阻塞性肺疾病)、或由于气管、支气管的影响引起的肺膨胀不全或者支气管切开术引起的并发症中尤其的有效。所述DNase I降解粘痰中的DNA，从而减少病人痰的粘度、清除呼吸道的阻塞物。经本发明制备的DNase I对于脓肿或者严重闭和性的感染(例如积脓症、脑膜炎、脓肿、腹膜炎、窦炎、耳炎、牙周炎、心包炎、胰腺炎、胆石病、心内膜炎以及感染性的关节炎)的辅助性治疗也是有效的，同样对于例如皮肤感染性伤口或者黏膜炎、外伤伤口以及溃烂性伤口等多种脓肿或者感染伤口的局部治疗也是非常有效的。人的DNase I在保持与体腔连接的包括外科的排泄导管、排尿导管、腹腔膜透析端口、以及气管内的输氧管等医疗用的管道的流速方面起到很好的作用。DNA酶可能会提高抗菌剂在治疗感染过程中的效率。
如本发明方法所述制备的DNase I除了用于医疗外，溶液制品或冻干制品还可以用于生物化学、分子生物学的研究和需要除去脱氧核糖核酸的过程如药物制备过程中核酸的去除。DNase I在此类应用中可以游离形式(在溶液中)或以固定化的形式(固定在固相介质上)起到降解DNA的作用。此处所提到的固相介质是指用于层析的各种凝胶介质、硅胶介质、有机合成大分子介质，并包括各种无机膜、有机膜，包括用于动植物细胞培养的各种微载体包括磁性微载体等。
实施例实施例1人胰腺DNase的克隆根据已公布的人胰腺DNase的基因序列(SEQ ID NO.1，编码区位于核苷酸序列的160 1008位，信号肽的编码区位于核苷酸序列的160--225位，SEQ ID NO.3为含信号肽的氨基酸序列)(Shak，S.等，美国国家科学院院报，87(23)9188，1990)设计引物5′正向引物
5′-GCAGCCTTCAACATCCAGACATTTGGGGAG-3′3′反向引物5′-GCTTGTCCACAGGCGGATGGATGACCACTG-3′取冷冻人胰，采用RNeasy Midi系统(Qiagen，美国)从胰腺中提取总RNA。再用Oligotex mRNA系统(Qiagen，美国)纯化mRNA。为了得到用于RACE-PCR克隆技术的人胰cDNA库，还必须在每个cDNA的5′末端加上一个特定的连接子，应用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech，美国)得到了人胰的带有特定连接子的cDNA库。然后用如上所述设计合成的5′正向引物和3′反向引物及连接子引物(MarathoncDNA扩增试剂盒，Clontech)，采用快速扩增cDNA末端法(RACE-PCR)扩增基因，PCR反应条件为95℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延长3分钟。进行35个循环。然后72℃保持7分钟。4℃保存。分别得到DNase I 3′RACE片段和5′RACE片段。经1％琼脂糖凝胶电泳证实片段的存在和大小后，分别与pGEM-T Easy Vector(Promega，美国)连接。用CaCl2转化法转化克隆载体大肠杆菌DH5α。选取抗Amp+的阳性克隆，提取重组的克隆载体并进行酶切鉴定。并对所得含有插入片段的重组质粒测序，确证在PCR过程中目的基因片段的存在且未发生变异或出现差错。提取分别含DNaseI5′片段和3′片段的两个重组T载体，用Nco I和Eco47 III切割DNase I的3′片段，用EcoR I和Eco47 III切割DNase I的5′片段。然后用Qiaquick Gel Extraction(Qiagen)纯化酶切的两个片段，用DNA连接酶连接两个片段，得到全长序列DNase I基因。然后用T4DNA连接酶连接从琼脂糖凝胶电泳回收并纯化的全长DNase基因片段和用Nco I和EcoR I切割过的pGEM-T Easy Vector(Promega，美国)，得到重组克隆载体pT-DNase-h1。用CaCl2转化法转化克隆载体大肠杆菌DH5α。选取抗Amp+的阳性克隆，提取重组的克隆载体并进行酶切鉴定。并对所得含有插入片段的重组质粒测序，确证在PCR过程中目的基因片段未发生变异或出现差错。测序所用的方法为双脱氧终止法。确认所插入的基因片段长度为849bp，为人胰腺DNase I基因(包括信号肽序列)。实施例2牛胰腺DNase的克隆根据已公布的牛胰腺DNase的基因序列(SEQ ID NO.2，编码区位于核苷酸序列的27-812位，SEQ ID NO.4为氨基酸序列)(Worrall和Connolly，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，26521889，1990)设计牛DNase I引物5′正向引物5′-GCAGCCTTCAACATCCGCACCTTTGGGGAG-3′3′反向引物5′-GCTCGTACGCAGGCGGATGGATGACCACTG-3′取冷冻牛胰，采用RNeasy Midi系统(Qiagen，美国)从胰腺中提取总RNA。再用Oligotex mRNA系统(Qiagen，美国)纯化mRNA。为了得到用于RACE-PCR克隆技术的人胰或牛胰cDNA库，还必须在每个cDNA的5′末端加上一个特定的连接子，应用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech，美国)得到了人胰或牛胰的带有特定连接子的cDNA库。然后用设计合成的5′正向引物和3′反向引物及连接子引物(Marathon cDNA扩增试剂盒，Clontech)，采用快速扩增cDNA末端法(RACE-PCR)扩增基因，PCR反应条件为95℃变性1分钟，55C退火1分钟，72℃延长3分钟。进行35个循环。然后72℃保持7分钟。4℃保存。分别得到DNase I3′RACE片段和5′RACE片段。经1％琼脂糖凝胶电泳证实片段的存在和大小后，分别与pGEM-T EasyVector(Promega，美国)连接。用CaCl2转化法转化克隆载体大肠杆菌DH5α。选取抗Amp+的阳性克隆，提取重组的克隆载体并进行酶切鉴定。并对所得含有插入片段的重组质粒测序，确证在PCR过程中目的基因片段的存在且未发生变异或出现差错。提取分别含DNase I5′片段和3′片段的两个重组T载体，用Nco I和Eco47 III切割DNase I的3′片段，用EcoR I和Eco47 III切割DNase I的5′片段。然后用QiaquickGel Extraction(Qiagen)纯化酶切的两个片段，用DNA连接酶连接两个片段，得到全长序列DNase I基因。然后用T4DNA连接酶连接从琼脂糖凝胶电泳回收并纯化的全长DNase基因片段和用Nco I和EcoR I切割过的pGEM-T Easy Vector(Promega，美国)，得到重组克隆载体pT-DNase-b1。用CaCl2转化法转化克隆载体大肠杆菌DH5α。选取抗Amp+的阳性克隆，提取重组的克隆载体并进行酶切鉴定。并对所得含有插入片段的重组质粒测序，确证在PCR过程中目的基因片段未发生变异或出现差错。测序所用的方法为双脱氧终止法。确认所插入的基因片段长度为786 bp，为牛胰腺DNase I基因。实施例3含有人DNase I编码基因的重组表达质粒的构建根据人DNase I的基因序列和加入的内切酶序列Nde I(5′引物)和Xho I(3′引物)设计引物5′正向引物5′-CATATGACTGCAGGTGCCGTGTCC-3′3′反向引物5′-CTCGAGTCACTTCAGCATCACCTCCACTGG-3′从pT-DNase-b1中用PCR法扩增DNase I基因，用1％琼脂糖凝胶电泳回收纯化DNase I基因片段，然后将DNase I基因片段与pGEM-TEasy Vector(Promega，美国)连接，得到重组质粒pT-DNase-h2。用CaCl2转化法转化克隆载体大肠杆菌DH5α。提取pT-DNase-h2，用内切酶Nde I和Xho I酶切，再用1％琼脂糖凝胶电泳回收纯化DNase I基因片段。然后用T4 DNA连接酶将人DNase I基因片段与Nde I和Xho切割后的表达载体pBGI-2连接。所述表达载体pBGI-2是通过利用SphI和HpaI(Promega，美国)以厂商推荐的条件将pET28表达载体(Novagen，美国)中598-1629位核苷酸切除后重新连接获得的，由此破坏了其中的lac I基因。pBGI-2表达载体除含有T7 RNA聚合酶启动子和T7终止子外，还含有f1复制起点、卡那霉素抗性基因(Kan+)和His标签的编码序列。将DNase基因与载体用T4DNA连接酶连接后，得到重组表达载体pBGI-2-hDNase。hDNase I表示人DNase I基因。CaCl2法转化T7 RNA聚合酶基因缺陷的宿主菌如大肠杆菌JM109。经Kan+抗性筛选，获得阳性克隆。对表达产物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和活性鉴定。实施例4含有牛DNase I编码基因的重组表达质粒的构建根据牛DNase I的基因序列和加入的内切酶序列Nde I(5′引物)和Xho I(3′引物)设计引物5′正向引物5′-CATATGAGGGGCACCAGGCTGATG-3′3′反向引物5′-CTCGAGTTATGTCAGCGTCACCTCCACCGG-3′从pT-DNase-b1中用PCR法扩增DNase I基因，用1％琼脂糖凝胶电泳回收纯化DNase I基因片段，然后将DNase I基因片段与pGEM-TEasy Vector(Promega，美国)连接，得到重组质粒pT-DNase-b2。用CaCl2转化法转化克隆载体大肠杆菌DH5α。提取pT-DNase-b2，用内切酶Nde I和Xho I酶切，再用1％琼脂糖凝胶电泳回收纯化DNase I基因片段。然后用T4 DNA连接酶将牛DNase I基因片段与Nde I和Xho切割后的表达载体pBGI-2连接。所述表达载体pBGI-2是通过利用SphI和HpaI(Promega，美国)以厂商推荐的条件将pET28表达载体(Novagen，美国)中598-1629位核苷酸切除后重新连接获得的，由此破坏了其中的lac I基因。pBGI-2表达载体除含有T7 RNA聚合酶启动子和T7终止子外，还含有f1复制起点、卡那霉素抗性基因(Kan+)和His标签的编码序列。将DNase基因与载体用T4DNA连接酶连接后，得到重组表达载体pBGI-2-bDNase。bDNase I表示牛DNase I基因。CaCl2法转化T7 RNA聚合酶基因缺陷的宿主菌如大肠杆菌JM109。经Kan+抗性筛选，获得阳性克隆。对表达产物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和活性鉴定。实施例5DNase I的诱导表达及初步纯化挑取经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和DNase I活性鉴定为DNase I高表达的重组菌落，接入含有10-50μg/ml卡那霉素的灭菌LB培养基中，37℃下280转/分培养过夜。以1％的接种量接入含有卡那霉素的灭菌LB培养基中，37℃培养。当重组菌培养液的O.D.600为0.6时，加入1ml的1M MgSO4、1ml的20％的麦芽糖(配制时需用0.45μm滤膜滤菌)和2ml准备好的λCE6噬菌体菌液进行诱导，37℃继续培养5个小时，直至有溶菌现象出现(O.D.值明显下降)。
将诱导后的细菌培养液4℃、5,000g离心10分钟收集细胞，将上清液调pH和离子强度至与层析平衡缓冲液相同或很相近后备用。加入下步层析的平衡缓冲液，如下步是金属螯和层析则用4℃预冷的10ml上样缓冲液(5mM咪唑、500mM NaCl、20mM Tris-HCl，pH＝7.9)悬浮细胞，冰浴超声破碎(JY92-II型超声波细胞粉碎机，宁波新芝科器研究所)，超声破碎的条件是400W、工作时间8秒、间歇时间10秒、80个循环。4℃、10,000g离心20分钟，收集上清液，并与调过离子强度和pH值的细胞培养上清液合并，即可准备用层析纯化。如实施例9所述用Kunitz法测定合并液的DNase I活性，人DNase I的表达量为2.06×105Kunitz Unit/每升发酵液，牛DNase I的表达量为2.6×105Kunitz Unit/每升发酵液。
λCE6噬菌体菌液的制备方法如下将LE392(一种带有hdsR514(rk-mk+)基因型的大肠杆菌菌株)接种于含0.2％麦芽糖和10mMMgSO4的LB培养基中，37℃，280转/分直至O.D.＝1.0。取5ml菌液加入2×108的λCE6噬菌体(购自Novagen公司)并混合。37℃下保温15分钟(不能摇动)。将以上宿主/噬菌体混合液加入500ml含10mMMgSO4的LB培养基中，37℃，250转/分直至溶菌现象发生。加入5ml氯仿并且再摇10分钟。4℃、10,000g离心10分钟，仔细移出上清液，加入DMSO至终浓度7％。实施例6金属鏊合层析对粗品DNase I的纯化分离纯化带有His标签的DNase I可采用金属鏊合层析方法。层析介质为瑞典安法码西亚生物技术公司的Chelating SepharoseTMFastFlow，层析设备为AKTA Purifier(Pharmacia Biotech AB，瑞典)。
用3倍柱体积的无菌水预平衡填装好的层析柱，再用五倍柱体积的Charging Buffer(50mM NiSO4)平衡层析柱，然后用3倍柱体积的Binding Buffer(5mM咪唑、0.5MNaCl、20mM Tris-HCl，pH7.9)平衡层析柱。实施例2中细胞超声破碎后离心的上清和调过离子强度和pH值的细胞培养上清液为上样样品，流速30cm/小时。上样后，用10倍柱体积的Binding Buffer淋洗，然后用6倍柱体积的WashingBuffer(20mM咪唑、0.5MNaCl、20mM Tris-HCl，pH7.9)除去结合弱的杂蛋白。用6倍柱体积的Elute Buffer(0.5M咪唑、0.5MNaCl、20mM Tris-HCl，pH7.9)，收集洗脱峰，即得表达蛋白DNase I。最后用6倍柱体积Strip Buffer(10mM EDTA、0.5MNaCl、20mM Tris-HCl，pH7.9)脱去Ni2+，用20％乙醇平衡后4℃保存。当层析时流速明显减低或层析介质经填充Ni2+后却不再显蓝绿色时，柱子需再生。经金属鏊合层析纯化的DNase I的纯度大于85％。回收率大于87％。实施例7凝胶过滤层析对DNase I的精制将凝胶过滤层析柱Supredex 75 HR 10/30(瑞典安法玛西亚生物技术公司)用酶制剂溶液(150mM NaCl和10mM Ca2+，pH7.0)充分进行平衡，将经金属螯合层析纯化的人或牛DNase I按小于层析柱柱体积5％的上样，流速为30cm/小时，上样后继续用酶制剂溶液洗脱，收集DNase活性峰。本步层析回收率大于95％。经金属鏊合层析和凝胶过滤层析纯化的重组人DNase I的比活为3200u/mg，纯化的重组牛DNase I的比活为4000u/mg，纯度均大于95％。实施例8DNase I的PEG修饰溶解5克甲氧基聚乙二醇(mPEG)或在聚乙二醇(PEG)在25毫升无水二氧己环中。搅拌加入6mmol溶解于10ml无水丙酮中的N-琥珀酰亚胺氯甲酸酯或N，N-N-二琥珀酰亚胺碳酸酯。再加入6mmol溶解于无水丙酮中的4-二甲基氨基吡啶。继续搅拌反应2或6小时。过滤除沉淀，收集上清。加入二乙基乙酯，得到琥珀酰亚胺碳酸酯化的聚乙二醇(SC-PEG)。将经纯化的重组牛DNase I或人DNase I溶解于0.1M，pH7.5的磷酸盐缓冲液，浓度为1-10mg/ml。搅拌中加入SC-PEG，过夜反应，即得到PEG化的DNase I。经凝胶过滤层析Superdex 75 HR选择具有一定修饰度的PEG-DNase I。实施例9DNase I的活性鉴定(Kunitz，M，1950.普通生理学杂志(J.Gen.Physiol.)33349-362)。
将500μl2倍反应缓冲液(8mM CaCl2、8mM MgCl2、20mM Tris-HCl，pH8.0)、10μl底物(50μg/ml的小牛胸腺DNA钠盐(SigmaD3664，美国))和440μl双蒸水加入比色杯中，室温下混匀。加入50μl待测样品并快速混匀，迅速置入分光光度计中测260nm的光吸收值。以A260对时间作图，得到活性曲线。DNase的活力单位的定义为利用如上所述反应缓冲液和底物，在光程1cm及260nm条件下每分钟使反应物的A260增加0.001的DNase的量定义为1 Kunitz单位。实施例10DNase降低病人痰粘度的实验通过样品的流动性测试，分别对重组的人DNase I和重组牛DNaseI治疗患有肺囊肿性纤维化病变的患者产生的脓痰的效果进行了体外测试。100微升痰样品在Eppendorf测试管中分别与10微升0.01mg/ml、比活为3200u/ml的重组人DNase I和10微升0.01mg/ml、比活为4000u/ml的重组人DNase I进行了温育。在37℃下经过不同时间周期的温育，颠倒试管，在0分(不流动)到5分(沿着管壁顺畅的流动)的测量数值范围内对痰沿着测试管壁流下的能力进行了评估。加入重组人DNase I的痰在10分钟温育后产生3-4分的结果。加入重组牛DNase I的痰在10分钟温育后产生4-5分的结果。未加入DNase I的痰未显示出流动。实验证明纯的不含蛋白酶的重组DNase I能够迅速降解含脓的痰。因此，纯的DNA酶在降低痰的粘性方面是非常有效的。
序列表SEQ ID NO.11 tcctgcacag gcagtgcctt gaagtgcttc ttcagagacc tttcttcata gactactttt61 ttttctttaa gcagcaaaag gagaaaattg tcatcaaagg atattccaga ttcttgacag121 cattctcgtc atctctgagg acatcaccat catctcagga tgaggggcat gaagctgctg181 ggggcgctgc tggcactggc ggccctactg cagggggccg tgtccctgaa gatcgcagcc241 ttcaacatcc agacatttgg ggagaccaag atgtccaatg ccaccctcgt cagctacatt301 gtgcagatcc tgagccgcta tgacatcgcc ctggtccagg aggtcagaga cagccacctg361 actgccgtgg ggaagctgct ggacaacctc aatcaggatg caccagacac ctatcactac421 gtggtcagtg agccactggg acggaacagc tataaggagc gctacctgtt cgtgtacagg481 cctgaccagg tgtctgcggt ggacagctac tactacgatg atggctgcga gccctgcggg541 aacgacacct tcaaccgaga gccagccatt gtcaggttct tctcccggtt cacagaggtc601 agggagtttg ccattgttcc cctgcatgcg gccccggggg acgcagtagc cgagatcgac661 gctctctatg acgtctacct ggatgtccaa gagaaatggg gcttggagga cgtcatgttg721 atgggcgact tcaatgcggg ctgcagctat gtgagaccct cccagtggtc atccatccgc781 ctgtggacaa gccccacctt ccagtggctg atccccgaca gcgctgacac cacagctaca841 cccacgcact gtgcctatga caggatcgtg gttgcaggga tgctgctccg aggcgccgtt901 gttcccgact cggctcttcc ctttaacttc caggctgcct atggcctgag tgaccaactg961 gcccaagcca tcagtgacca ctatccagtg gaggtgatgc tgaagtgagc agcccctccc1021 cacaccagtt gaactgcagSEQ ID NO.21 aattcgattc ctaggaggtg agctctatgc ttaagatcgc tgctttcaac atacgtacct61 tcggtgaatc taaaatgtct aacgctacgc tagcatctta catcgtacgc atcgtacgcc121 gttacgatat cgttctgatc caggaagttc gcgactctca cctggttgca gttggtaaac181 ttctagacta cctgaaccag gacgacccga acacctacca ctacgttgtt tctgaacccc241 tcgggcgtaa ctcttacaaa gaacggtacc tgttcctgtt ccgtccgaac aaagtttcag301 tactggatac ctaccagtac gacgacggat gcgaatcttg cggtaacgac tctttctccc361 gggaaccggc tgttgttaaa ttctcgagcc actctaccaa ggttaaagag ttcgctatcg421 ttgctctgca cagcgcgccg tctgacgctg ttgctgaaat caactctctg tacgacgttt481 acctggacgt tcagcagaaa tggcacctga acgacgtcat gctgatgggt gacttcaacg541 ctgactgctc ttatgtaacc tcttctcagt ggtcatcgat tcgtctgcgc acctcgtcga601 ccttccagtg gctgatcccg gactccgctg acaccaccgc tactagtacc aactgcgctt661 acgaccgtat cgttgttgct ggatccctgc tgcagtcttc tgttgtaccg ggtagcgcgg721 ccccgttcga cttccaggct gcatatggtc tttcgaacga aatggcgctg gccatctctg781 atcactaccc ggttgaggta accctgacct aatagaSEQ ID NO.31 MRGMKLLGAL LALAALLQGA VSLKIAAFNIQTFGETKMSN ATLVSYIVQILSRYDIALVQ
61 EVRDSHLTAV GKLLDNLNQD APDTYHYVVS EPLGRNSYKE RYLFVYRPDQ VSAVDSYYYD121 DGCEPCGNDT FNREPAIVRF FSRFTEVREF AIVPLHAAPG DAVAEIDALY DVYLDVQEKW181 GLEDVMLMGD FNAGCSYVRP SQWSSIRLWT SPTFQWLIPD SADTTATPTH CAYDR1VVAG241 MLLRGAVVPD SALPFNFQAA YGLSDQLAQA ISDHYPVEVM LKSEQ ID NO.41 MLKIAAFNIR TFGESKMSNA TLASYIVRIV RRYDIVLIQE VRDSHLVAVG KLLDYLNQDD61 PNTYHYVVSE PLGRNSYKER YLFLFRPNKV SVLDTYQYDD GCESCGNDSF SREPAVVKFS121 SHSTKVKEFA IVALHSAPSD AVAEINSLYD VYLDVQQKWH LNDVMLMGDF NADCSYVTSS181 QWSSIRLRTS STFQWLIPDS ADTTATSTNC AYDRIVVAGS LLQSSVVPGS AAPFDFQAAY241 GLSNEMALAI SDHYPVEVTL T
权利要求
1.一种制备重组脱氧核糖核酸酶I活性多肽的方法，其包括(1)用含有编码脱氧核糖核酸酶I的核苷酸序列之重组表达载体转化适当的原核宿主细胞；(2)在适于所选原核细胞生长条件下培养经转化的宿主细胞；(3)在适于脱氧核糖核酸酶I表达的条件下诱导宿主细胞产生脱氧核糖核酸酶I；(4)从所得经转化的原核宿主细胞和/或培养液中回收脱氧核糖核酸酶I。
2.权利要求1的方法，其中所述编码脱氧核糖核酸酶I的核苷酸序列如SEQ ID NO1中核苷酸序列226-1008位或SEQ ID NO2中核苷酸序列27-812位所示。
3.权利要求1的方法，其中所述原核宿主细胞为T7 RNA聚合酶缺陷型大肠杆菌。
4.权利要求3的方法，其中从经诱导表达脱氧核糖核酸酶I的大肠杆菌菌体和/或培养液中回收脱氧核糖核酸酶。
5.权利要求1的方法，其中所述重组表达载体中还含有T7启动子。
6.权利要求1的方法，其中所述在所述宿主细胞中脱氧核糖核酸酶I的表达需要通过含有T7 RNA聚合酶基因并具有独立表达T7 RNA聚合酶基因的启动子的噬菌体诱导。
7.权利要求6的方法，其中所述噬菌体为λCE6噬菌体。
8.一种含有如权利要求1的方法制备的脱氧核糖核酸酶I的酶制剂。
9.权利要求8的酶制剂，其中所述脱氧核糖核酸酶I是水溶性的单体、PEG化修饰物或其它衍生物。
10.如权利要求1的方法制备的脱氧核糖核酸酶I用于制备治疗呼吸系统疾病、减少患者痰的粘度、通畅呼吸道的药物的用途。
全文摘要
本发明涉及一种制备具有生物学活性的重组脱氧核糖核酸酶I的方法,其包括(1)用含有编码脱氧核糖核酸酶I的核苷酸序列之核酸构建体转化适当的原核宿主细胞;(2)在适于所选原核细胞生长条件下培养经转化的宿主细胞;(3)在适于脱氧核糖核酸酶I表达的条件下使宿主细胞产生脱氧核糖核酸酶I;(4)从所得大肠杆菌菌体和/或培养液中回收脱氧核糖核酸酶。由本发明方法所制备的脱氧核糖核酸酶I可用于制备治疗呼吸系统疾病、减少患者痰的粘度、通畅呼吸道的药物。
文档编号C12N9/18GK1366042SQ0110165
公开日2002年8月28日 申请日期2001年1月19日 优先权日2001年1月19日
发明者刘斯奇, 冯小黎, 王超, 李宝华, 郝丕良, 任艳, 汪建, 杨焕明 申请人:北京华大基因研究中心