专利名称：微生物易感性的快速测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速测定微生物对各种物质易感性的方法。
自1920年以来，已有多种方法被提出用于检查微生物对诸如抗微生物素/抗生素等物质的易感性。但是，只有两种方法被广泛接受而成为临床实践的标准方法。这两种方法是稀释易感性试验和纸片扩散试验(见L.M. Prescott等编著1996年Wm.C.Brown出版社在美国波斯顿出版的《微生物学》第三版660-662页)。
在稀释易感性试验中，标准数目的待测微生物被接种于含有一系列浓度抗微生物素/抗生素的肉汤培养管中，然后检查这些被接种管的微生物群体生长状态。在所有不显示微生物生长的管子中，抗微生物素/抗生素浓度最低的那一管即代表最小抑制浓度。微生物生长状况是通过测定培养物的混浊度而确定。这种测定通常需要16到20小时方可显示有显著意义的变化。
在纸片扩散法中，待测微生物被接种于琼脂平板上，然后在其上放置一个含有抗微生物素/抗生素的圆纸片。抗微生物素/抗生素的扩散形成一个抗微生物素/抗生素的浓度梯度最高浓度位于纸片中，最低浓度位于扩散的前缘。在含有有效抗微生物素/抗生素的地方，微生物不能生长而显示出一个环绕纸片的透明圈。在此圈之外，由于抗微生物素/抗生素浓度低于最小抑制浓度，微生物生长而形成菌苔。由于形成肉眼可见的菌苔需要相当长的时间，微生物的易感性通常在培养16-18小时后才可报告。
在纸片扩散法中，位于透明圈边缘的抗微生物素/抗生素浓度不是由纸片扩散法本身得出，而是需要另外进行稀释易感性试验，以得出透明圈与最小抑制浓度关系的标准曲线和表格，然后查图或查表得出该浓度。由于透明圈大小受抗微生物素/抗生素的最初浓度、溶解性和扩散速度、以及琼脂平板的状况等因素影响，如要准确地从纸片扩散法估计最小抑制浓度，标准曲线或标准表格应以同批抗微生物素/抗生素纸片和同批琼脂平板为基准。因此，尽管纸片扩散法比稀释易感性试验容易实施，但它却依赖于后一方法才能获得完整的结果。
所有常规的微生物易感性试验都要求将样本在琼脂平板上进行预培养以观察微生物生长和鉴定微生物，然后进行次级培养富集微生物群体以获得足够的标准数目的微生物用于接种稀释易感性实验的肉汤管或纸片扩散试验的琼脂平板。加上这些准备工作所需的时间，完整的微生物易感性测定通常要两到三天才能完成。常规微生物易感性测定法使用陪氏培养皿和试管进行培养。因此，需用大量的培养基和大量的待测物质。另外，培养和贮存这些器件也要较大的仪器和空间。
近来，一些改良的方法已被提出用于微生物易感性的快速测定。例如美国专利5789173号，微生物易感性快速测定方法。
美国专利5770373号，用针对核糖体RNA前体的寡核甘酸探针对耐药性分枝杆菌进行快速和敏感的检测。
美国专利5738989号，使用核糖体核酸杂交测定微生物对抗微生物物质的敏感性。
美国专利5738988号，用核糖体探针杂交检查样本中未知的微生物和抗微生物的物质。
美国专利5712095号，使用针对核糖体RNA前体的寡核甘酸探针对有耐药性的分枝杆菌进行快速和敏感的检测。
美国专利5948633号，测定化合物对连续培养之微生物的作用。
美国专利5789173号所述的快速微生物易感性试验依赖于对短期培养的样本进行DNA放大以达到早期判定抗生素效率的目的。该法不需要对样本进行预培养。通过对放大后的DNA的进行检测而不是对肉汤管混浊度或平板抑菌圈的进行检测，此法缩短了报告最小抑制浓度(MIC)所需的时间。据称此法全过程可短至12小时。
美国专利5770373号描述一种专门用于检测耐药性分枝杆菌的快速和敏感的方法。通过使用特别设计的能与分枝杆菌核糖体RNA前体(pre-RNA)结合的寡核甘酸探针，此法可检查出分枝杆菌的存在与生长状况。关于分枝杆菌Pre-RNA的检查已于早期的一项发明(美国专利5712095)中介绍。
美国专利5738989号描述一种使用核糖体核酸杂交法确定微生物对抗微生物物质的敏感性测定的方法，该法需要制备仅对某些选定的微生物的核糖体核酸菜一特别亚基的序列能结合的探针。
美国专利5948633号描述一种检测化合物对连续培养的微生物的作用的方法。在该法中，营养和测试化合物被分别以控制的流速加入生长室内，使得测试化合物的浓度逐渐增高。测试化合物对待测微生物的作用通过对流出生长室(恒化器)的细胞密度的测定而得知。当微生物细胞密度不增加时，化合物的浓度即为对该待测微生物的最小抑制浓度。
标准的微生物易感性测定方法消耗时间、人力和材料。已有的改良方法虽然克服了标准方法的一些缺点，但仍有这样或那样的缺陷。
美国专利5789173号所述之方法需要额外的复杂步骤以多聚酶链反应放大DNA、用特别报告分子标记DNA、定量测定所标记的报告分子。该法需要额外的仪器，如热循环机和莹光计。该法还要对所测定的微生物的DNA有一定的知识以设计适当的引物用于DNA放大反应。
美国专利5770373号(连同美国专利5712095号)和美国专利5738989号均要求特别设计的探针和对应的检测探针的仪器。这些方法由于探针的特异性不同而仅适合某一选定范围的微生物。如果放射性同位素被用于标记探针，还需要有特别的仪器、执照和安全培训。
美国专利5948633号所描述的微生物易感性检测法能在单一试验中高准确度地测定某一化合物对微生物的最小抑制浓度。但是为了在同一试验中发现这一最小抑制浓度，微生物的群体密度必须在增加测试化合物浓度的不同时间多次测定。这意味着每个连续培养微生物易感性实验必须运行较长时间。该法需要特别的培养装置和大量的营养培养基和待测化合物。最终该法对培养物细胞密度的测定仍旧依赖于常规方法如显微镜计数，电子颗粒计数，和流动细胞仪。
因此，尽管已有很多努力花在发明其它方法以测定微生物易感性，没有任何新的发明在临床实验室获得接受。常规的微生物易感性测试法仍为日常实践所用的标准方法。
本发明的目的是克服上述常规方法和改良方法的不足而创造一种快速、敏感、特异、简单、经济、易行的微生物易感性测定法。
本发明的目的是通过如下措施来达到(a)使用粘稠液体培养基进行微生物的培养。粘稠液体培养基的使用使接种微生物、加培养基成份、和加待测物质更为方便。也更有利于营养成份、测试物质和微生物之间的混合。更重要的是，它使得来自同一祖先微生物的后代可以呆在一起而形成菌落。
(b)在菌落形成的早期，即微菌落期，就进行微生物对待测物质易感性的观察。微菌落是指仅含数个细胞而只有通过显微镜才可见到的菌落，而不是通常所指的肉眼可见的大菌落。从理论上讲，能被肉眼看见的大菌落需含上百万个细胞。而由一个单细胞繁殖成上百万个细胞需要进行即少十几个生殖周期长时间的培养。与此相比，证实微菌落的形成只需一两个生殖周期的培养就可见分晓。与常规方法和其它改良方法相比，本发明具有以下优点(a)极大地缩短报告微生物易感性所需要的时间。
(b)可排除对预培养的依赖。
(c)允许对含有未知混合微生物的样本进行易感性测试。
(d)允许使用不同的微生物接种浓度。
(e)减少营养物耗竭和产物抑制对测试结果的影响。
(f)允许快速处理大批标本与众多待测物质。
(g)给予高度敏感和特异的测试结果。
(h)提供与原位微生物浓度有关的最小抑制浓度。
(i)极大地减少微生物易感性试验的材料费用。
(j)节省大量的培养和贮存空间。
(k)使用常规操作过程和大多实验室都有的普通仪器。
(l)可实现不同程度的自动化。
(m)便于与其它实验相结合。
(n)便于现场接种。
(o)便于在转送已种培养的过程中进行培养。
(p)便于归类和典藏测试材料。
(q)减少实验室人员对待测微生物的接触。
(r)减少待测物质如抗微生物素/抗生素释放于环境之中。
以上优点将结合以下的实施过程进一步阐述。
本发明的具体实施可通过以下步骤进行(a)加一定组成成份的粘稠液体培养基到空的培养器皿中，(b)加一定浓度的待测物质如抗微生物素/抗生素到已装有培养基的培养器皿中并混合好，(c)接种怀疑含有微生物的标本，(d)在适当条件下培养已接种的培养物，(e)在适当培养时间检查培养物的细胞密度和细胞聚集形式，
(f)通过细胞数增减和微菌落形成的情况来确定微生物对所测物质的易感性。
粘稠液体培养基的制备可通过加入一种粘稠物质如聚乙烯比咯烷酮、甲基纤维糖、明胶于培养基中。加入粘稠物质的时间可在加入待测物质到培养基之前或之后。
使用粘稠液体培养基进行易感性试验克服了肉汤培养和平板培养两者的短处而保留了各自的长处。与固体培养基相比，粘稠液体培养基使得营养成份与待测物质可以充分混匀。它也使得接种待测标本微生物更为容易并形成均匀的微生物群体的初始分布。这将极大地减小由于浓度差别对微生物生长所造成的影响和由于抽样误差而造成的微生物计数方面的偏差。因此它将增加易感性试验的准确性和精确度。微生物群体在常规的液体培养基内生长的结果是形成更多单细胞的混悬液。与此相比，粘稠液体培养基允许从祖先细胞形成微菌落，检测微菌落与检查肉汤培养物混浊度相比更为简单，它可在不采取培养物的情况下进行原位检查。同时，这种检查也更为敏感和准确。因为微菌落可在进行一或两次生殖周期时就可检测到，而且微菌落的形成一定表明微生物群体的生长。
使用粘稠液体培养基进行易感性试验便利于各种类型的标本的接种。如果接种液态的标本，可用一注射器抽取标本并准确地将一定量的标本注入每一个培养器皿内。接种后应用一无菌的接种针或接种环将培养物混匀。如要接种固态标本，先应将标本打碎至能被培养器皿容纳的大小，并应当充分的混匀以正确表现微生物在原始标本的浓度分布。
使用粘稠液体培养基进行易感性试验便利于与各种后续实验检查相结合。这是因为往液体培养基中添加物质较向固体培养基中添加物质更为容易且混合更为均匀。本发明可与多种微生物鉴定反应相结合而达到微生物易感性和分类鉴定在同一实验完成的目的。
液体化的粘稠培养基可以很方便地大批量生产。待测物质也可在所需要的时候加入培养中。这些优越性可使进行微生物易感性试验的人员从繁锁的手工制备培养基中解放出来，并缩短完成试验的总时间。使用同一质量的培养基和待测物质也将减少实验室之间和实验员之间在实验操作上的差异，从而使实验结果更具可比性。
常规的微生物易感性实验通常需要预培养以获得纯培养物作为接种物。对标本中所含微生物的易感性试验的结果需与纯培养物的标准曲线相比较而判定。本发明能对原始标本中所存在的微生物直接进行检查。不管该微生物的种类如何，通过记录细胞和细胞聚集形式的图像的变化而判定其对待测物质的易感性。因此，本发明具有高度的效率，能检查标本中所含的所有的可疑病原菌对抗微生物素/抗生素的敏感性。事实上，所记录的微生物的形态信息也许能对微生物的鉴定提供初步的邦助。
常规的微生物易感性实验需要高浓度标准化的接种物，以在平板上形成菌苔或在肉汤中形成较高的混浊度以获可靠而一致的检查。本发明所具有的高敏感度和高分辫率使得对易感性的检查可在微生物在标本中的原始浓度下进行。
由于早期观察微生物菌落生长可在微观范围内进行，本发明将极大量地减少对微生物标本、微生物培养基和待测物质的需要量。由于本发明可使用比常规方法小得多的器皿进行培养和观察，本发明也极大程度地减少了器皿材料方面的消耗和对培养与贮存空间及仪器设备的需求。
微型化的微生物易感性试验便于将培养基和待测物质制成预装好的密封套合。这种套合完全可以携带至各种现场如医生办公室、外科手术室、或其它边远少医的地方进行现场接种。这种套合可以做得如此之小，以至于在接种后放进便携式培养箱就可在从现场送至检验室的途中进行培养。这些额外的好处将使完成易感性实验的时间更为缩短。
微型化的微生物易感性试验将极大量地减少微生物、待测物质和其它废物及有害物的排放。这一方面有利于环境的保护，一方面也减少处理垃圾废物的开支。如待测物质为抗菌素，减少其向环境的排放也有利于缓解日益严重的微生物耐药性扩散。如待测微生物为有害的病原微生物，试验的微型化和密封化将有效地减少操作人员的感染机会。
对培养物中细胞的密度和细胞聚集的形式的检查，可用各种形式的光学显微技术。可将关闭好的培养装置放在显微镜的载物台上，光线穿过培养井，在不同的聚焦平面获得培养井内容的图像。为了显微图象检查的正确性，应当检查培养物多个不同的地区，这样细胞密度和微菌落的数目的平均数会更接近其在培养物内的真实数目。
显微图象可呈现在显微镜的目镜、与显微镜相联的电视屏幕或计算机屏幕上。显微图象的记录可是不同的信息载体如光感胶片、磁带、磁盘或光盘。对显微图象的识别和判断，可以人工进行也可以自动进行。这种识别和判断可以在实验观察的同时进行，可以在实验观察之后通过检查记录的图象进行。这种识别和判断可以在现场进行，可以在远离实验观察现场的方根据互联网获得的图象信息进行。这种对已存图象的离开显微镜的检查赋予检查人员充分的自由以合理安排工作日程。同时，由于检查可重复进行，甚至可由不同检查人员相互校对，检查的客观性和准确度将增加。使用具有人工智能的计算机软件可对细胞数目自动计算和报告培养物中细胞的聚集形式。使用这样的图像分析软件将极大地降低本发明的人工消耗而使本发明更有效和容易实行。
权利要求
1.一种快速测定微生物易感性的方法，包括(a)在含有一种特定成份的粘稠液体培养基的限定空间内培养微生物，(b)测定培养物内微生物的细胞数目和聚集形式，(c)根据微生物细胞数目和聚集形式的变化判断微生物对待测物质的易感性。
2.权力要求1所指粘稠液体培养基的基本特征在于能有效地限制微生物运动包括被动的布朗运动和主动的游动。
3.权力要求1所指粘稠液体培养基可通过加入粘稠物质制成，这些粘稠物质包括但不限于聚乙烯毗咯烷酮、甲基纤维糖和明胶。
4.权力要求1所指特定成份培养基包含支持待测微生物生长所需的营养成份和生长条件。
5.权力要求1所指特定成份培养基包含特定浓度的某一需测定微生物对其易感性的物质。
6.权力要求5所指待测物质特定浓度包括零浓度作为空白对照。
7.权力要求1所述测定微生物细胞数目和聚集形式的手段包括但不限于显微镜图象检查。
8.权力要求7所述显微镜图象检查包括但不限于检查呈现在显微镜接目镜的图象，检查呈现在与显微镜相连的电视或计算机监视器上的图象，以及检查记录在各种信息载体如照像胶片或电影胶片、录像带、光盘和计算机硬盘与软盘上的图象。
9.权力要求1所述对微生物对待测物质易感性的判断的手段包括但不限于以下所列方式人工识别判断和机器识别判断。
10.权力要求9所述的机器识别判断包括使用电子计算机图象识别分析软件。
全文摘要
本发明阐述一种用于微生物易感性快速测定的方法。待测微生物被接种于含有某一浓度待测物质的粘稠液体培养基中。在培养时间内对细胞数目和细胞聚集形式进行检查。如果细胞数目增加和有微菌落形成,表示微生物群体增长和对待测物质如抗微生物素/抗生素不敏感。待测物质的最小抑制浓度表现为无细胞数目的增加和无微菌落的形成。
文档编号C12Q1/04GK1333374SQ0110328
公开日2002年1月30日 申请日期2001年1月20日 优先权日2001年1月20日
发明者刘实 申请人:刘胜, 刘实