专利名称：从螺旋藻中提取含铁超氧化物歧化酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取超氧化物歧化酶的方法，尤其是一种从钝顶螺旋藻中提取含铁超氧化物歧化酶的方法。
超氧化物歧化酶(SOD)是一类含金属辅基的酶，其催化活性为,H2O2再由过氧化氢酶进一步氧化成H2O+O2。SOD催化清除超氧基团，并和过氧化氢酶等配合作用，有效防御活性氧对生物体的毒害作用。1939年科学家就从牛血红细胞中分离到牛血铜蛋白，但到1969年，才由Mocord和Fridovich发现其酶活性，并命名为超氧化物歧化酶。1970年，Keele等人分离到含锰的SOD,1973年，Yost和Fridovich分离到含铁的SOD。到目前为止，人们从不同生物体内分离得到的SOD大致有三种含铜和锌的Cu、Zn-SOD，主要存在于真核细胞中；含锰的Mn-SOD，主要存在于原核细胞和真核细胞的线粒体中；含铁的Fe-SOD，主要分布于某些蓝藻和细菌中。
经检索，人们从动物的血液、肝脏、乳汁、蚯蚓、植物的根、茎、叶、种子、大豆、玉米、烟草、沙棘等，从中提取分离超氧化物歧化酶，中国授权公告号CNl044132C公开了“烟草超氧化物歧化酶提取方法”，提取含铁超氧化物歧化酶，提取方法原料浸提，选择性酸碱变性，粗酶制备，透析，离子交换柱层析，超过滤，离子交换柱层析。其提取步骤较多。
本发明的目的就是从螺旋藻中提取含铁超氧化物歧化酶的方法。
本发明可以通过以下方式来实现(1)取鲜螺旋藻沥水后，悬浮于抽提缓冲液中，鲜藻与抽提缓冲液的比例为1∶2-5(重量与体积比)，冰浴下用超声波破碎细胞(2-5kw,10-30KHZ，超2-6min2次，问歇4-6min)，抽提液在8000-12000g(离心力)离心30-60min，取上清液，得粗捉液；(2)根据粗提液的体积，按30-70％饱和度计算(NH4)2SO4用量，将(NH4)2SO4缓慢加入粗提液中，充分搅拌，静置过夜，将沉淀液在8000-12000g离心40-80min，取上清液，将上清液调至高饱和度；(3)酶液在3-8mM,PH值为7.5-8.0的磷酸缓冲液中透析12-30h后，上样到预先用3～8mM,PH值为7.5-8.0的磷酸缓冲液平衡好的DEAE-23柱上，上样速度为15-45ml/h，用磷酸缓冲液进行线性梯度洗脱，收集洗脱峰区酶液；(4)将收集液用PEG20000浓缩，以10～30ml/h的速度上样到预先用3～8mM，PH值为7.5～8.0的磷酸缓冲液平衡好的Sephadex G-75柱上，并用磷酸缓冲液进行线性梯度洗脱，收集洗脱峰区酶液，以上操作在4～10℃进行。抽提缓冲液为30～60Mm,PH值为7.5～8.0的磷酸缓冲液。
螺旋藻是一种生长迅速，遗传稳定的丝状蓝藻，含有丰富的Fe-SOD，本发明从螺旋藻中提取Fe-SOD，具有工艺简便，Fe-SOD纯化到均一程度，并具有较高的比活。Fe-SOD应用于医药、化妆品、保健品和食品等许多领域。
下面结合附图，对本发明作进一步的描述。
图1为本发明DEAE-23柱层析线性梯度洗脱的曲线图。
实施例一(一)材料与方法1、材料鲜螺旋藻。
2、主要试剂DEAE-23(Whatman公司)，Sephadex G-75(Pharmacin公司)，牛血清白蛋白。
3、主要仪器设备日本岛津UV-2501PC紫外可见分光光度仪，BS-100A型自动部分收集器，核酸蛋白检测仪。
4、蛋白质浓度测定采用紫外光吸收法。配制牛血清白蛋白浓度梯度，以缓冲液为对照，在280nm处测定各浓度的光吸收值，作标准曲线。以同样方法测定样品的A280，在标准曲线上查出样品的蛋白浓度。
5、SOD酶活性分析采用氮蓝四唑(NBT)还原法。SOD的一个活力单位定义为在实验条件下，抑制NBT还原50％所需的SOD量。
(二)实验程序(所有操作均在6℃下进行)1、粗提液的制备取鲜螺旋藻沥水后称得400g，悬浮于1000ml、50Mm、PH值为7.8的磷酸缓冲液中，冰浴条件下用超声波破碎细胞(3kw,20KHZ、5min×2，中间间歇5min)，抽提液在10000g离心50min，取上清液，得粗提液1250ml。
2、(NH4)2SO4分级沉淀按55％饱和度缓慢加入300g(NH4)2SO4于粗提液中，充分搅拌，静置过夜。将沉淀液于10000g离心1小时，取上清液，将上清液调至高饱和度。同样条件下离心，分别检测上清液和沉淀的SOD活性。结果表明，SOD活性存在于沉淀中。
3、DEAE-23线性梯度洗脱柱层析酶液在4mM、PH值为7.5的磷酸缓冲液中透析24h后，上样到预先用磷酸缓冲液平衡15h的DEAE-23柱上(20×2.6cm)，上样速度为30ml/h，用磷酸缓冲液进行线性梯度洗脱。从
图1可知，洗脱主峰即是唯一的SOD活性峰，活性成分在160～210mM的缓冲液浓度范围内洗脱下来。活性峰尖锐，与A280主峰叠合得很好，说明活性级分相当纯净。收集活性成分，测定蛋白质浓度和酶活力。
4、Sephadex G-75凝胶过滤将收集液用PEG20000浓缩至6.5ml，以15ml/h的速度上样到SephadexG-75柱上(50×1.0cm)，用相同磷酸缓冲液洗脱。洗脱曲线中只有唯一，尖锐的洗脱峰，检测酶活性可知，酶的活性峰与洗脱峰完全相符。收集洗脱峰区溶液得酶液22.7ml。
(三)螺旋藻分离纯化Fe-SOD总表
从表看出以400g鲜藻中得到6.37毫克酶，酶比活为每毫克蛋白3953单位。
权利要求
1.一种从螺旋藻中提取含铁超氧化物歧化酶的方法，其特征在于(1)取鲜螺旋藻沥水后，悬浮于抽提缓冲液中，鲜藻与抽提缓冲液的比例为1∶2～5(重量与体积比)，冰浴下用超声波破碎细胞(2～5kw,10～30KHZ，超2～6min2次，间歇4～6min)，抽提液在8000～12000g(离心力)离心30～60min，取上清液，得粗提液；(2)根据粗提液的体积，按30～70％饱和度计算(NH4)2SO4用量，将(NH4)2SO4缓慢加入粗提液中，充分搅拌，静置过夜，将沉淀液在8000～12000g离心40～80min，取上清液，将上清液调至高饱和度；(3)酶液在3～8mM,PH值为7.5～8.0的磷酸缓冲液中透析12～30h后，上样到预先用3～8mM,PH值为7.5～8.0的磷酸缓冲液平衡好的DEAE-23柱上，上样速度为15～45ml/h，用磷酸缓冲液进行线性梯度洗脱，收集洗脱峰区酶液；(4)将收集液用PEG20000浓缩，以10～30ml/h的速度上样到预先用3～8mM,PH值为7.5～8.0的磷酸缓冲液平衡好的Sephadex G-75柱上，并用磷酸缓冲液进行线性梯度洗脱，收集洗脱峰区酶液，以上操作在4～10℃进行。
2.依权利要求1所述的从螺旋藻中提取含铁超氧化物歧化酶的方法，其特征在于抽提缓冲液为30～60mM,PH值为7.5～8.0的磷酸缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种从螺旋藻中提取含铁氧化物歧化酶的方法,藻体经超声波破碎、硫酸铵分级沉淀、DEAE—23柱层析和Sephadex G—75凝胶过滤提取含铁超氧化物歧化酶,具有工艺简便,Fe—DOS纯化到均一程度,并具有较高的比活。Fe—SOD应用于医药、化妆品、保健品和食品等许多领域。
文档编号C12N9/02GK1298943SQ0110744
公开日2001年6月13日 申请日期2001年1月13日 优先权日2001年1月13日
发明者李江平, 曾文辉, 钱凯先 申请人:广东梅县梅雁蓝藻有限公司