从螺旋藻中提取含铁超氧化物歧化酶的方法

文档序号:571099阅读:720来源:国知局
专利名称:从螺旋藻中提取含铁超氧化物歧化酶的方法
技术领域
本发明涉及一种提取超氧化物歧化酶的方法,尤其是一种从钝顶螺旋藻中提取含铁超氧化物歧化酶的方法。
超氧化物歧化酶(SOD)是一类含金属辅基的酶,其催化活性为,H2O2再由过氧化氢酶进一步氧化成H2O+O2。SOD催化清除超氧基团,并和过氧化氢酶等配合作用,有效防御活性氧对生物体的毒害作用。1939年科学家就从牛血红细胞中分离到牛血铜蛋白,但到1969年,才由Mocord和Fridovich发现其酶活性,并命名为超氧化物歧化酶。1970年,Keele等人分离到含锰的SOD,1973年,Yost和Fridovich分离到含铁的SOD。到目前为止,人们从不同生物体内分离得到的SOD大致有三种含铜和锌的Cu、Zn-SOD,主要存在于真核细胞中;含锰的Mn-SOD,主要存在于原核细胞和真核细胞的线粒体中;含铁的Fe-SOD,主要分布于某些蓝藻和细菌中。
经检索,人们从动物的血液、肝脏、乳汁、蚯蚓、植物的根、茎、叶、种子、大豆、玉米、烟草、沙棘等,从中提取分离超氧化物歧化酶,中国授权公告号CNl044132C公开了“烟草超氧化物歧化酶提取方法”,提取含铁超氧化物歧化酶,提取方法原料浸提,选择性酸碱变性,粗酶制备,透析,离子交换柱层析,超过滤,离子交换柱层析。其提取步骤较多。
本发明的目的就是从螺旋藻中提取含铁超氧化物歧化酶的方法。
本发明可以通过以下方式来实现(1)取鲜螺旋藻沥水后,悬浮于抽提缓冲液中,鲜藻与抽提缓冲液的比例为1∶2-5(重量与体积比),冰浴下用超声波破碎细胞(2-5kw,10-30KHZ,超2-6min2次,问歇4-6min),抽提液在8000-12000g(离心力)离心30-60min,取上清液,得粗捉液;(2)根据粗提液的体积,按30-70%饱和度计算(NH4)2SO4用量,将(NH4)2SO4缓慢加入粗提液中,充分搅拌,静置过夜,将沉淀液在8000-12000g离心40-80min,取上清液,将上清液调至高饱和度;(3)酶液在3-8mM,PH值为7.5-8.0的磷酸缓冲液中透析12-30h后,上样到预先用3~8mM,PH值为7.5-8.0的磷酸缓冲液平衡好的DEAE-23柱上,上样速度为15-45ml/h,用磷酸缓冲液进行线性梯度洗脱,收集洗脱峰区酶液;(4)将收集液用PEG20000浓缩,以10~30ml/h的速度上样到预先用3~8mM,PH值为7.5~8.0的磷酸缓冲液平衡好的Sephadex G-75柱上,并用磷酸缓冲液进行线性梯度洗脱,收集洗脱峰区酶液,以上操作在4~10℃进行。抽提缓冲液为30~60Mm,PH值为7.5~8.0的磷酸缓冲液。
螺旋藻是一种生长迅速,遗传稳定的丝状蓝藻,含有丰富的Fe-SOD,本发明从螺旋藻中提取Fe-SOD,具有工艺简便,Fe-SOD纯化到均一程度,并具有较高的比活。Fe-SOD应用于医药、化妆品、保健品和食品等许多领域。
下面结合附图,对本发明作进一步的描述。


图1为本发明DEAE-23柱层析线性梯度洗脱的曲线图。
实施例一(一)材料与方法1、材料鲜螺旋藻。
2、主要试剂DEAE-23(Whatman公司),Sephadex G-75(Pharmacin公司),牛血清白蛋白。
3、主要仪器设备日本岛津UV-2501PC紫外可见分光光度仪,BS-100A型自动部分收集器,核酸蛋白检测仪。
4、蛋白质浓度测定采用紫外光吸收法。配制牛血清白蛋白浓度梯度,以缓冲液为对照,在280nm处测定各浓度的光吸收值,作标准曲线。以同样方法测定样品的A280,在标准曲线上查出样品的蛋白浓度。
5、SOD酶活性分析采用氮蓝四唑(NBT)还原法。SOD的一个活力单位定义为在实验条件下,抑制NBT还原50%所需的SOD量。
(二)实验程序(所有操作均在6℃下进行)1、粗提液的制备取鲜螺旋藻沥水后称得400g,悬浮于1000ml、50Mm、PH值为7.8的磷酸缓冲液中,冰浴条件下用超声波破碎细胞(3kw,20KHZ、5min×2,中间间歇5min),抽提液在10000g离心50min,取上清液,得粗提液1250ml。
2、(NH4)2SO4分级沉淀按55%饱和度缓慢加入300g(NH4)2SO4于粗提液中,充分搅拌,静置过夜。将沉淀液于10000g离心1小时,取上清液,将上清液调至高饱和度。同样条件下离心,分别检测上清液和沉淀的SOD活性。结果表明,SOD活性存在于沉淀中。
3、DEAE-23线性梯度洗脱柱层析酶液在4mM、PH值为7.5的磷酸缓冲液中透析24h后,上样到预先用磷酸缓冲液平衡15h的DEAE-23柱上(20×2.6cm),上样速度为30ml/h,用磷酸缓冲液进行线性梯度洗脱。从
图1可知,洗脱主峰即是唯一的SOD活性峰,活性成分在160~210mM的缓冲液浓度范围内洗脱下来。活性峰尖锐,与A280主峰叠合得很好,说明活性级分相当纯净。收集活性成分,测定蛋白质浓度和酶活力。
4、Sephadex G-75凝胶过滤将收集液用PEG20000浓缩至6.5ml,以15ml/h的速度上样到SephadexG-75柱上(50×1.0cm),用相同磷酸缓冲液洗脱。洗脱曲线中只有唯一,尖锐的洗脱峰,检测酶活性可知,酶的活性峰与洗脱峰完全相符。收集洗脱峰区溶液得酶液22.7ml。
(三)螺旋藻分离纯化Fe-SOD总表
从表看出以400g鲜藻中得到6.37毫克酶,酶比活为每毫克蛋白3953单位。
权利要求
1.一种从螺旋藻中提取含铁超氧化物歧化酶的方法,其特征在于(1)取鲜螺旋藻沥水后,悬浮于抽提缓冲液中,鲜藻与抽提缓冲液的比例为1∶2~5(重量与体积比),冰浴下用超声波破碎细胞(2~5kw,10~30KHZ,超2~6min2次,间歇4~6min),抽提液在8000~12000g(离心力)离心30~60min,取上清液,得粗提液;(2)根据粗提液的体积,按30~70%饱和度计算(NH4)2SO4用量,将(NH4)2SO4缓慢加入粗提液中,充分搅拌,静置过夜,将沉淀液在8000~12000g离心40~80min,取上清液,将上清液调至高饱和度;(3)酶液在3~8mM,PH值为7.5~8.0的磷酸缓冲液中透析12~30h后,上样到预先用3~8mM,PH值为7.5~8.0的磷酸缓冲液平衡好的DEAE-23柱上,上样速度为15~45ml/h,用磷酸缓冲液进行线性梯度洗脱,收集洗脱峰区酶液;(4)将收集液用PEG20000浓缩,以10~30ml/h的速度上样到预先用3~8mM,PH值为7.5~8.0的磷酸缓冲液平衡好的Sephadex G-75柱上,并用磷酸缓冲液进行线性梯度洗脱,收集洗脱峰区酶液,以上操作在4~10℃进行。
2.依权利要求1所述的从螺旋藻中提取含铁超氧化物歧化酶的方法,其特征在于抽提缓冲液为30~60mM,PH值为7.5~8.0的磷酸缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种从螺旋藻中提取含铁氧化物歧化酶的方法,藻体经超声波破碎、硫酸铵分级沉淀、DEAE—23柱层析和Sephadex G—75凝胶过滤提取含铁超氧化物歧化酶,具有工艺简便,Fe—DOS纯化到均一程度,并具有较高的比活。Fe—SOD应用于医药、化妆品、保健品和食品等许多领域。
文档编号C12N9/02GK1298943SQ0110744
公开日2001年6月13日 申请日期2001年1月13日 优先权日2001年1月13日
发明者李江平, 曾文辉, 钱凯先 申请人:广东梅县梅雁蓝藻有限公司
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