专利名称：抗菌肽毕赤酵母的制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。尤其是抗菌肽基因克隆于酵母制备饲料添加剂技术。
柞蚕抗菌肽(Cecropin)是注射大肠杆菌于柞蚕(Antheraea pernyi)蛹诱导产生的天然多肽，已发现有A、B及D等多种，具有广谱杀菌作用。从柞蚕免疫蛹中提取抗菌肽得率低(0.02％以下)，消耗原料较多，工艺复杂，成本高昂，投产有较大困难。提取抗菌肽后的蛹渣及茧壳仍需进行深加工。如1000吨柞蚕茧(1000-1200万元)仅能提取200-250Kg抗菌肽，每Kg成本10万元以上。
柞蚕抗菌肽在医药上应用已有初步成效，如用热激法处理柞蚕蛹，制成“育成蛹粉“作为肾肝宁”药物的原料，是治疗肾炎及肝炎的新药，已投入生产；柞蚕蛹免疫血淋巴制成柞蚕素冻干粉，作为柞蚕素胶囊的原料，作为西药二类治疗乙型肝炎新药进入一期临床试验。抗菌肽作为饲料添加剂有预防及治疗畜禽疾病的功效，但必须降低成本才能实现。
根据柞蚕抗菌肽的氨基酸序列，设计并合成其基因，克隆于大肠杆菌中表达，由于表达后的抗菌肽对宿主有杀灭作用，且表达率较低，未有应用价值；抗菌肽基因与昆虫杆状病毒多角体蛋白基因重组，在昆虫细胞或昆虫体内表达。由于昆虫细胞培养成本高，用虫体表达不易大规模培养。
近年来在畜禽饲料中滥用抗生素导致畜禽的奶、肉、蛋中残留而严重影响人的健康，又因大量使用抗生素而引起耐药性菌株的出现，给治疗带来困难。欧共体已禁止人畜共用的抗生素掺入饲料。用天然杀菌剂代替现有禽畜饲料中所使用的抗生素是禽畜饲料业的需求，也是人们的希望。
本发明的目的是设计合成新型抗菌肽基因，导入毕赤酵母中表达，制备用作为禽畜饲料添加剂，代替目前禽畜饲料中使用的抗生素，以达到预防和治疗禽畜疾病，克服由于滥用抗生素带来的不良后果以及降低生产成本的目的。
本发明是这样实现1．根据柞蚕天然抗菌肽设计抗菌肽AD氨基酸序列， 将第1-11位氨基酸设计为柞蚕抗菌肽A序列，将第12-37位氨基酸设计为蚕抗菌肽D序列；2．用DNA合成仪合成含82个碱基的F1多聚脱氧核糖核苷酸片段和含78个碱基F2多聚脱氧核糖核苷酸片段，它们之间有20个碱基互补；3．设计合成引物1:5′GGATCCGTATGAAATGGAAG 3′
引物2:3′TCATTATTCTTAAGCAGGCTG 5′4．通过F1、F2和引物1、2，用PCR(聚合酶链反应)方法合成具有134个碱基对的抗菌肽AD基因；5．将抗菌肽AD基因与pCRTM2.1质粒(T载体)用T4DNA连接酶连接构建成pCRCAD重组质粒；6．用pCRCAD重组质粒转化大肠杆菌JM109，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和溴氯吲哚半乳糖苷(X-gal)筛选获得含重组质粒pCRCAD的转化子；7．采用点突变方法，使第37位的赖氨酸(AAG)改造成天门冬酰胺(AAC)；8．设计合成引物AB:引物A:5′GAG CTC GAG ATG AAA TGG AAG TTG TTC AAA AAG 3′引物B:3′CGA GTT CGA TGA CGG AAC CGA TTC TTG ATT CTT AAGCCG CCG 5′以pCRCAD质粒为模板加入引物A及B,PCR扩增得到改造后的抗菌肽基因命名为抗菌肽CAD，其DNA序列是M K W K L F K K I E K5′GAG CTC GAG ATG AAA TGG AAG TTG TTC AAA AAG ATT CAA AAG3′CTC GAG CTC TAC TTT ACC TTC AAC AAG TTT TTC TAA GTT TTCK V G Q R V R D A V IAAG GTT GGT CAA AGA GTT AGA GAC GCT GTC ATCTTC CAA CCA GTT TCT CAA TCT CTG CGA CAG GTTS A G P A V A T V A QTCT GCT GGT GCT GCT GTT GCC ACT GTT GCT CAAAGA CGA CCA CGA CGA CAA CGG TGA CAA CGA GTTA T A L A NGCT ACT GCC TTG GCT AAC TAA GAA TTC GGC GGC3′CGA TGA CGG AAC CGA TTG ATT CTT AAG CCG CCG5′9．以抗菌肽CAD基因与pHIL-S1质粒重组转化于大肠杆菌DH5α，在氨苄青霉素抗性基因筛选到转化子pHIL-CAD5，测序结果为141碱基对(bp)；10．将抗菌肽CAD基因与载体质粒pPICZα-A重组，克隆于大肠杆菌TOP10，以Zerocin抗性基因筛选得含重组质粒pACAD5的转化子；11．用锂盐法将重组质粒pACAD5转入毕赤酵母中表达，获得抗菌肽CAD毕赤酵母工程菌GSCAD5；12．将含抗菌肽CAD的毕赤酵母GSCAD5菌株在培养基中摇瓶培养作为菌种培养基配方蛋白胨10-20g酵母提取物5-10gNaCl 5-10g葡萄糖20g加水到1000mL将菌种接入装有培养基的发酵罐中进行发酵，培养基的配方蛋白胨15g酵母粉10gNaCl 5-10g蔗糖 15-20g定容 1000mL发酵条件发酵温度30±1℃培养基pH7～7.3接种量为以10OD浊度的菌种接种30％(体积)
发酵过程发酵罐入加入培养基后，通入汽压蒸汽灭菌30分钟，放冷到37℃，在无菌条件下接种，在30±1℃,pH5.5～6.0，通气量2.4-2.5升/分钟，搅拌速度500转/分钟，培养24小时后，取样检测菌体密度达6OD以上时加入95％甲醇，甲醇加入量1％(占发酵液总量)诱导产生抗菌肽，继续培养72小时后，抽样检测菌体密度达10OD以上，效价5000单位/mL。通入100℃蒸汽，20-30分钟，放料。发酵液离心除去菌体，用升膜式真空浓缩器浓缩原体积的1/10，将浓缩液冷冻干粉，得到冻干物即为抗菌肽毕赤酵母制品。效价50000-58000单位/g。
抗菌肽CAD毕赤酵母的应用抗菌肽CAD毕赤酵母可作为抗生素预防畜禽腹泻病。
仔猪按5000-5500单位/kg拌入饲料中，连续一个月可预防及治疗仔猪腹泻。
小鸡可加入60-100单位/头日于饮水中，连续14天可预防及治疗雏鸡腹泻。
本发明优点1．抗菌肽CAD是一个新的基因，包括抗菌肽A,D的优点，C端为天门冬酰胺与天然的结构一致，提高其杀菌效价及稳定性。
2．克隆于毕赤酵母中表达，达到高密度培养(120-130g湿菌体/L)，效价5000～5500单位/mL。
3．抗菌肽在酵母中表达可以工业化生产，降低成本，比天然提取物降低(100倍以下)，可取代大肠杆菌表达及昆虫杆状病毒系统表达。
4．优化培养基配方及发酵条件，降低成本，缩短生产周期，通过中试后可以工业化生产。
5．应用于畜禽饲料添加剂，代替某些抗生素，预防仔猪及雏鸡的腹泻病。
本发明的实施过程一、抗菌肽毕赤酵母制备1．抗菌肽AD基因的合成根据抗菌肽AD及其基因的设计，用DNA合成仪合成F1(82碱基)及F2(78碱基)，用引物1及引物2作PCR扩增。F1及F2片酸(25mmol/uL)1uL,d NTP(pmol/L)2.5uL,10×PCR缓冲液5uL,双蒸水35.5uL,92℃变性1min，加入Taq DNA聚合酶1uL(3u)，按52℃ 60Sec,70℃ 60Sec,90℃ 30Sec共35次循环，终止后回收PCR产物。以第一次PCR产物为模板，用引物1及引物2作第二次PCR扩增，最后一步延伸72℃延伸10min。PCR产物回收后，在低融点琼脂糖凝胶电泳，得到抗菌肽AD基因，回收后-20℃保存。2．抗菌肽AD基因克隆于大肠杆菌将抗菌肽AD基因与pCRtm2.1(T载体)质粒，用BamHⅠ及SalⅠ酶切后用T4DNA连接酶连接成重组子pCRTMAD，克隆于大肠杆菌JM103，在含异丙基硫代β-半乳糖苷(ITPG)、X-gal及氨苄青霉素的LB培养基上挑选白色菌落，大量培养后制备pCRAD质粒。用BamHⅠ及SalⅠ酶切后电泳得到134bp的抗菌肽AD基因，纯化后在ABI 377DNA自动制序列仪，测定基序列与设计完全一致。3．点突变C-端为酰胺基抗菌肽AD基因C-端为赖氨酸，密码为AAG，用点突度方法改造为天门各酰胺，密码为AAC，设计合成引物A及引物B，以pCRTMAD质粒为模板经PCR扩增为得到C-端为天门冬酰胺的抗菌肽基因ADCAD。
pCRCAD质粒(25m mol/uL)1uL,dNTP(2m mol/L)5uL,引物A(30p mol/uL)1uL，引物B(30pmol/uL)1uL,10×PCR缓冲液5uL，双蒸水36uL,95℃变性1min，加TaqDNA聚合酶1uL(3u),72℃完成第一个循环后，按52℃ 60Sec,70℃ 60Sec,90℃ 30Sec共39次循环，最后一步延伸10min。PCR产物回收后，在低融点琼脂糖凝胶电泳得到141bp的抗菌肽CAD基因。4．抗菌肽CAD基因克隆于大肠杆菌将抗菌肽CAD基因与pHIL-S1质粒经EcoRⅠ酶切后用T4DNA连接酶连接成pHIL-CAD5重组质粒，克隆于大肠杆菌DH5α，用氨苄青霉素抗性基因筛选转化子，提取转化子DNA，用EcoRⅠ酶切，电泳得到141bp的条带，经ABI377 DNA自动测序仪测定基序列与设计完全一致。5．酵母表达载体的构建将含抗菌肽CAD基因的pHIL-CAD5质粒与穿梭质粒pPICZα-A用EcoRⅠ酶切后用T4DNA连接酶连接成pACAD5重组质粒，克隆于大肠杆菌TOP10，经Zerocin抗生素抗性基因筛选而得到酵母表达载体pACAD5。6．抗菌肽CAD基因克隆于毕赤酵母pCAD5质粒用SacⅠ内切酶线性化后，用锂盐法克隆于毕赤酵母。取50μL酵母感受态细胞，离心后加入240μL 50％聚乙二醇4000,36μL 1mol/L氯化锂，25μL(2mg/mL)变性后的线性化pCAD5，充分混合后，30℃静置30min,42℃热激20-25min，冷至室温，5000r/m离心10min，沉淀物悬浮于1mLYEPD培养基中，取200μL涂布于YEPD平板(含Zerocin 100μg/mL),30℃培养3-4天，挑选转化子即为抗菌肽CAD基因转化毕赤酵母。7．毕赤酵母转化子的鉴定提取转基因毕赤酵母的总DNA，用地高辛标记的抗菌肽基因片段作探针，作Southern blot结果呈阳性。转基因毕赤酵母在YEPD培养基中培养，30℃±1℃,pH5.5-6.0，摇瓶200r/min,48hr后，加入培养液体积1％甲醇诱导抗菌肽CAD基因的表达，继续培养至72hr，终止培养。用Hultmark方法测定抗菌活性，达到5000单位/mL水平。二、抗菌肽毕赤酵母饲料添加剂预防及治疗雏鸡腹泻病的试验效果以杂星579鸡品种，体重34-39g/头，用5000单位/kg的剂量混入饲料中饲喂，参比区为恩诺沙星(5mg/kg体重)，对照区不加抗菌素。每处理200头，分4组重复，连续饲养4周，调查发病率及体重增加情况，见表1。
死亡率方差分析X2=611,X0.01=9.2，属极显著水平。
图1为抗菌肽AD氨基酸序列及基因碱基序列，其中M K W K 氨基酸代号；G A G C 脱氧核糖核苷酸代号；F1:82个碱基的DNA片酸；F2:78个碱基的DNA片酸；图2为抗菌肽CAD的氨基酸序列及基因碱基序列，其中M K W K 氨基酸代号；G A G C 脱氧核糖核苷酸代号；N AA C为突变后改造的天门冬酰胺TTG图3为抗菌肽CAD基因克隆于大肠杆菌DH5α示意图pCRCAD含抗菌肽CAD基因的质粒；pHIL-S1穿梭质粒；pHIL-CAD5含抗菌肽CAD的酵母载体；EcoRⅠ为DNA限制性内切酶；T4DNAligaseT4DNA连接酶；5’AOXＩ甲醇氧化酶基因；引物1；引物2见图1；PCR聚合酶链反应；CAD gene改造后的抗菌肽AD，含天冬酰胺残基；MSC多酶切位点；图4为酵母转化载体构建示意图CAD gcne抗菌肽CAD基因；PHIL-CAD5含抗菌肽CAD基因的质粒；PPILCZa-A穿梭质粒；pACAD5含抗菌肽CAD基因的酵母表达转化载体(质粒)；EcoRⅠ(E)DNA限制性内切酶；T4DNA liaseT4DNA连接酶；PCR聚合酶链反应；AOXI甲醇氧化酶基因；Zerocin一种抗生素的抗性基因；MSC多酶切位点。
权利要求
1．抗菌肽毕赤酵母的制备，其特征在于根据柞蚕天然抗菌肽设计抗菌肽AD氨基酸序列， 将第1-11位氨基酸设计为柞蚕抗菌肽A序列，将第12-37位氨基酸设计为柞蚕抗菌肽D序列；用DNA合成仪合成含82个碱基的F1多聚脱氧核糖核苷酸片段和含78个碱基F2多聚脱氧核糖核苷酸片段，它们之间有20个碱基互补；设计合成引物1:5′GGATCCGTATGAAATGGAAG 3′引物2:3′TCATTATTCTTAAGCAGGCTG 5′通过F1、F2和引物1、2，用PCR(聚合酶链反应)方法合成具有134个碱基对的抗菌肽AD基因；将抗菌肽AD基因与pCRTM2.1质粒(T载体)用T4DNA连接酶连接构建成pCRCAD重组质粒；用pCRCAD重组质粒转化大肠杆菌JM109，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和溴氯吲哚半乳糖苷(X-gal)筛选获得含重组质粒pCRCAD的转化子；采用点突变方法，使第37位的赖氨酸(AAG)改造成天门冬酰胺(AAC)；设计合成引物A、B:引物A:5′GAG CTC GAG ATG AAA TGG AAG TTG TTC AAA AAG 3′引物B:3′CGA GTT CGA TGA CGG AAC CGA TTC TTG ATT CTT AAGCCG CCG 5′以pCRCAD质粒为模板加入引物A及B,PCR扩增得到改造后的抗菌肽基因命名为抗菌肽CAD，其DNA序列是M K W K L F K K I E K5′GAG CTC GAG ATG AAA TGG AAG TTG TTC AAA AAG ATT CAA AAG3′CTC GAG CTC TAC TTT ACC TTC AAC AAG TTT TTC TAA GTT TTCK V G Q R V R D A V IAAG GTT GGT CAA AGA GTT AGA GAC GCT GTC ATCTTC CAA CCA GTT TCT CAA TCT CTG CGA CAG GTTS A G P A V A T V A QTCT GCT GGT GCT GCT GTT GCC ACT GTT GCT CAAAGA CGA CCA CGA CGA CAA CGG TGA CAA CGA GTTA T A L A NGCT ACT GCC TTG GCT AAC TAA GAA TTC GGC GGC3′CGA TGA CGG AAC CGA TTG ATT CTT AAG CCG CCG5′以抗菌肽CAD基因与pHIL-S1质粒重组转化于大肠杆菌DH5α，在氨苄青霉素抗性基因筛选到转化子pHIL-CAD5，测序结果为141碱基对(bp)；将抗菌肽CAD基因与载体质粒pPICZα-A重组，克隆于大肠杆菌TOP10，以Zerocin抗性基因筛选得含重组质粒pACAD5的转化子；用锂盐法将重组质粒pACAD5转入毕赤酵母中表达，获得抗菌肽CAD毕赤酵母工程菌GSCAD5；将含抗菌肽CAD的毕赤酵母GSCAD5菌株在培养基中摇瓶培养作为菌种将菌种接入盛有培养基的发酵罐中发酵培养，培养24小时后，取样检测菌体密度达6OD以上时加95％甲醇，甲醇加入量1％(占发酵液总量)诱导产生抗菌肽，继续培养72小时后，抽样检测菌体密度达10OD以上后，通过100℃蒸汽，20-30分钟，放料，发酵液离心，除去菌体，滤液浓缩到原体积的1/10，将浓缩液冻成干粉，即为抗菌肽毕赤酵母制品。
2．根据权利要求1所说的抗菌肽毕赤酵母的制备，其特征在其菌种培养基配方为蛋白胨10-20g酵母提取物5-10gNaCl 5-10g葡萄糖20g加水到1000mL
3．根据权利要求1所说的抗菌肽毕赤酵母的制备，其特征在于发酵培养的培养基配方为蛋白胨 15g酵母糖 10gNaCl5-10g蔗糖15-20g定容1000mL发酵温度30±1℃，培养基pH7-7.3，接种量为以10OD浊度的菌种接种30％(体积)
4．抗菌肽毕赤酵母的应用，其特征在于用5000-5500单位/Kg的毕赤酵母拌入调料中喂养仔猪，可预防及治疗仔猪腹泻。按60-100单位/头、日，加入水中，供小鸡饮水，可预防及治疗雏鸡腹泻。
全文摘要
柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌作用。根据天然抗菌肽A的1－11位氨基酸序列及抗菌肽D的12－37位氨基酸序列,设计抗菌肽AD基因,克隆于毕赤酵母中表达。经优化培养基配方和培养条件,在发酵罐中达到高密度培养及高效表达(5000单位/毫升)。将抗菌肽酵母制品按5000单位/kg添加于仔猪饲料中,或以60－100单位/日·头添加于雏鸡饮水中,能预防与治疗禽畜腹泻,可代替部分抗生素作为饲料添加剂。
文档编号C12N15/12GK1308123SQ0110758
公开日2001年8月15日 申请日期2001年2月28日 优先权日2001年2月28日
发明者黄自然, 黄亚东, 郑青, 姚汝华 申请人:华南农业大学